Удк 577.152.121 глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов: выделение, свойства и роль в их подвижности

На правах рукописи

Юлия Леонидовна Элькина УДК 577.152.121 ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА ИЗ СПЕРМАТОЗОИДОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА И РОЛЬ В ИХ ПОДВИЖНОСТИ 03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В.И. Муронец

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.Е. Медведев кандидат биологических наук, Т.В. Есакова

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится “18” октября 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д 501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние несколько десятилетий отмечается ухудшение ситуации с мужской фертильностью. По данным Всемирной Организации Здравоохранения на 1990 год 20% семейных пар бесплодны, и в 50% случаев хотя бы частично причина кроется в мужской репродуктивной способности.

Патологии, лежащие в основе мужского бесплодия, можно разделить на несколько категорий. С одной стороны, это нарушения в репродуктивной системе или дефицит половых гормонов, которые хорошо диагностируются и зачастую поддаются коррекции. Следующий уровень – нарушения в количестве и/или морфологии сперматозоидов. С 1938 по 1990 годы согласно данным из 60 независимых центров концентрация сперматозоидов уменьшилась практически в два раза - со 113 до 66 млн/мл (Carlsen E. et al, 1992). На сегодняшний день, согласно инструкции ВОЗ, в качестве нормальной принята концентрация не менее 20 млн/мл.

Отдельной категорией следует выделить нарушения фертильности, связанные с дефектами подвижности сперматозоидов (астенозооспермия).

Если между количеством/морфологией сперматозоидов и фертильностью не всегда существует строгая корреляция, то неподвижные сперматозоиды абсолютно неспособны к зачатию. В современной медицине существуют подходы, такие как интрацитоплазматическое введение сперматозоида, ИКСИ (IntraCytoplazmic Sperm Injection, ICSI), позволяющие «обойти» этот дефект при наличии хотя бы небольшой доли подвижных сперматозоидов.

Однако в силу неизученности молекулярных механизмов, обеспечивающих нормальную подвижность сперматозоидов, медицинских подходов, влияющих на причину подобных патологий, практически не существует.

С другой стороны, знание молекулярных основ процесса подвижности, необходимого для зачатия, позволило бы найти подход к безопасной, целенаправленной и эффективной мужской контрацепции.

Например, это возможно при воздействии на белки, специфичные для сперматозоида и отсутствующие в соматических клетках, но необходимые для подвижности, а, следовательно, и функционирования сперматозоидов.

Таким образом, изучение белков, необходимых для подвижности сперматозоида, представляется актуальной задачей современной биохимии.

Одним из таких белков является сперматозоидная изоформа глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДс), которая встречается только в сперматозоидах и существенно отличается от глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы соматических клеток (ГАФД). Свойства ГАФДс практически не изучены, однако ГАФДс является важным объектом для *Список сокращений: АФК – активные формы кислорода, ГАФД – глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназа, ГАФДс - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из сперматозоидов, ПААГ – полиакриламидный гель, 3-ФГА – глицеральдегид-3-фосфат, ChBD-GAPDS – рекомбинантная форма ГАФДс, содержащая хитинсвязыващий домен вместо N-концевого домена, dN-GAPDS – рекомбинантная форма ГАФДс без N-концевого домена.

исследования в связи с ее ролью в обеспечении подвижности сперматозоидов.

Направленное влияние на активность ГАФДс может быть использовано как для увеличения фертильности, так и для контрацепции.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы было изучение ГАФДс из сперматозоидов человека, а также исследование связи между подвижностью сперматозоидов и активностью ГАФДс.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода выделения ГАФДс и исследование ГАФДс в сравнении с соматической формой фермента. Поиск ингибиторов, специфичных для ГАФДс.

2. Исследование влияния окислителей как потенциальных ингибиторов ГАФДс на подвижность сперматозоидов.

3. Определение активности и содержания ГАФДс в сперме пациентов с астенозооспермией с целью выявления возможной взаимосвязи между неподвижностью сперматозоидов и отсутствием ГАФДс.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе впервые были изучены свойства глицеральдегид-3 фосфат-дегидрогеназы из сперматозоидов человека. Был выделен активный фрагмент ГАФДс из сперматозоидов человека, а также две рекомбинантные формы ГАФДс. Было показано, что ГАФДс из сперматозоидов обладает повышенной стабильностью по сравнению с ГАФД из мышц кролика.

Поскольку подвижность сперматозоида обеспечивается в основном за счет гликолиза, высокая стабильность ГАФДс должна способствовать повышению эффективности оплодотворения. Свойства рекомбинантных форм ГАФДс немного отличаются от соматической изоформы, однако оба изофермента легко окисляются перекисью водорода. Известно, что при воспалительных заболеваниях в сперме повышается уровень лейкоцитов, которые являются продуцентами перекиси водорода. Было показано, что снижение подвижности сперматозоидов в присутствии перекиси водорода коррелирует со снижением активности ГАФДс. Таким образом, было обнаружено, что снижение подвижности сперматозоидов в присутствии перекиси водорода связано с окислением ГАФДс. Была определена активность и содержание ГАФДс в сперматозоидах с дисплазией фиброзного слоя (ДФС). Показано, что содержание ГАФДс в сперматозоидах с ДФС значительно ниже, чем в норме.

Тест на содержание ГАФДс может служить биохимическим критерием для обнаружения данного дефекта.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ (2010), а также на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2006, 2007, 2009, 2010), пятом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.

Овчинникова (Москва, 2008), 33 FEBS Congress “Biochemistry of cell regulation” (Афины, 2008), 4 ESF Conference “Functional Genomics and Disease” (Дрезден, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, включая три журнальные статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 170 стр., содержит 44 рисунка и таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из сперматозоидов человека выделяли по методу Вестхоффа и Кампа (Westhoff W. and Kamp G., 1997) с некоторыми модификациями и последующей очисткой на колонке с фенил сефарозой. Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4.

Клонирование рекомбинантных белков. Клон MGC:26494 со штаммом E.coli, содержавшим плазмиду с кДНК вставкой полной кодирующей последовательности спермоспецифичной глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы человека (GAPDS) был получен через компанию Geneservice Ltd. Фрагмент ДНК, кодирующий GAPDS человека без N концевого домена (68 аминокислотных остатков), был получен методом ПЦР на матрице плазмиды клона MGC:26494 с использованием праймеров GAPDSdF (5’-GTTTCATGAGTG TGGCCCGGGAGCTGAC-3’) и GAPDSR (5’ GTCTCGAGTTCACTT GTCTCGGCTGAACATGTAG). Выделенный фрагмент размером 1020 п.н. после совместного гидролиза рестриктазами BspHI/XhoI был клонирован между сайтами NcoI/XhoI плазмиды pET21d(Novagen, США).

Полученная плазмида была обозначена pET21/dGAPDS.

ГАФДс с хитинсвязывающим доменом был получен методом ПЦР на матрице плазмиды клона MGC:26494 с использованием праймеров GAPDS_CBF (5’-GTTTCATGAGTGTGG CCC GGGAGCTGAC-3’) и GAPDS-R (5’-GTCTCGAGTTCACTTGTCTCGGCTGAACATGTAG). Выделенный фрагмент размером 1020 п.н. после совместного гидролиза рестриктазами BspHI/XhoI был клонирован между сайтами NcoI/XhoI плазмиды pETmChBD, содержащей модифицированный хитинсвязывающий домен хитиназы А1 B.

circulans с мутацией W44F в хитин-связывающем сайте. Полученная плазмида была названа pETmChBD/dGAPDS.

Клетки E.coli, продуцирующие рекомбинантную глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназу из сперматозоидов человека с заменой N-концевого домена на хитинсвязывающий домен (ChBD-GAPDS) и ГАФДс без N концевого домена (dN-GAPDS) выращивали методом аутоиндукции (Studier F., 2005).

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из сперматозоидов человека с заменой N-концевого домена на хитинсвязывающий домен (ChBD-GAPDS) выделяли из клеток E.coli Rosetta 2(DE3)/pETmChBD/dGAPDHS с последующей очисткой на колонке с хитиновым носителем (Chitin beads, New England Biolabs).

ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS) выделяли из клеток E.coli Rosetta 2(DE3)/pET21/dGAPDS, с последующей очисткой на колонке с КМ целлюлозой.

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методу Скоупса (Scopes and Stoter, 1982) с последующей гель фильтрацией на сефадексе G-100.

Все ферменты хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4.

Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) и спектрофотометрически по поглощению при 280 нм (А 0,1% для ГАФД 1,0;

ChBD-GAPDS – 1,33;

dN-GAPDS – 1,14).

Определение ферментативной активности ГАФД и ГАФДс проводили спектрофотометрически при 22°С, измеряя скорость образования NADH при 340 нм в ходе реакции окисления 3-ФГА. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль NAD+ в минуту.

Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре DASM – 4 (Биоприбор, Пущино, Россия) в кювете объемом 0,47 мл при скорости сканирования 1/мин.

Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) с использованием прибора для электрофореза “Mini-Protean 3” (BioRad).

Голубой нативный гель-электрофорез проводили в градиенте полиакриламидного геля (5,5 - 12%). Электрофорез проводили при 4С.

Вначале использовали голубой катодный буфер (50 мМ трицин, 15 мМ Бис трис, 0,02 %-ный Кумасси голубой G 250, рН 7,0 при 4С ), который через мин меняли на белый - без добавления Кумасси ( Schagger H. et al, 1994).

Электроперенос белков Процесс электропереноса белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану проводили при постоянном напряжении 100V и силе тока 150-250 мА в течение 45 мин (Towbin H. et al, 1979).

Иммунохимическое окрашивание с диаминобензидином. Мембрану инкубировали при постоянном перемешивании в течение 10 мин в растворе 5% обезжиренного сухого молока, затем инкубировали в течение 1 часа с первичными антителами против ГАФДс (1 мкг/мл). Затем мембрану промывали и инкубировали в течение часа в растворе вторичных антител (антитела против антител мыши, конъюгированные с пероксидазой (1 мкг/мл)).

После тщательной отмывки мембрану переносили в раствор хромогенного субстрата, содержавший 3 мг диаминобензидина гидрохлорида, 30 мг семиводного сульфата никеля и 10 мкл 30%-ной перекиси водорода в 10 мл 0, М трис-HCl, рН 7,6.

Изучение влияния различных факторов на подвижность сперматозоидов. Подвижность каждого сперматозоида классифицируют по категориям а, b и с, используя следующие критерии:

а – быстрое поступательное движение или активная прогрессивная подвижность;

b – медленное поступательное движение или слабая прогрессивная подвижность;

c – непоступательное движение, к которому относится очень медленное движение по прямой (5 м/сек) и ротационное движение – движение сперматозоида по окружности с любой ( в том числе и с большой) скоростью.

Образец спермы разбавляли в 2 раза и инкубировали с необходимыми добавками (в зависимости от условий эксперимента) при 37С или при комнатной температуре. Через определённые промежутки времени исследовали подвижность сперматозоидов в камере Горяева. Процент подвижных клеток рассчитывали как отношения клеток с подвижностями a+b к общему числу клеток в большом квадрате камеры Горяева и считали среднее по четырем квадратам.

Определение активности ГАФДс в сперматозоидах. Сперматозоиды из семенной жидкости осаждали центрифугированием. Полученный осадок суспендировали в ~ 100-кратном объеме фосфатно-солевого буфера, затем центрифугировали. К полученному осадку клеток добавляли равный объем мМ калий-фосфатного буфера, pH 7,4, суспензию обрабатывали ультразвуком и центрифугировали. В полученных осадке и экстракте определяли активность ГАФДс.

Метод динамического светорассеяния (ДСР) использовали для определения среднего размера частиц белков. Опыты проводили на приборе «Zetasizer Nano-ZS» (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания), используемом для измерения размеров частиц в диапазоне от 2 до 6000 нм.

Термоинактивацию проводили при 55С и при 70С. Для этого исследуемый белок (ГАФД из мышц кролика, ChBD-GAPDS или dN-GAPDS) инкубировали при указанной температуре в 10мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5). Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для определения ферментативной активности.

Метод электронной микроскопии. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert III Ultracut, окрашивали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Hitachi 700. В каждом образце анализировали не менее 50 поперечных срезов жгутиков сперматозоидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Одной из основных задач нашей работы было выделение ГАФДс и изучение её свойств в сравнении с мышечной изоформой фермента (ГАФД из мышц кролика). Основная проблема, связанная с изучением этого фермента, состоит в сложности его выделения. Поскольку ГАФДс, в отличие от соматического фермента, связана с цитоскелетом, т.е. находится в нерастворимой клеточной фракции, выделение полноразмерного активного фермента в растворимой форме является большой проблемой.

Выделение ГАФДс из сперматозоидов человека.

Из литературных данных известно, что ГАФДс не экстрагируется в раствор при обработке буферными растворами. Однако ГАФДс из сперматозоидов хряка высвобождалась в раствор при обработке трипсином или эластазой (Westhoff D. and Camp G., 1997).

Из результатов иммуноблотинга (рис. 1) видно, что после обработки ультразвуком сперматозоидов человека в осадке преимущественно наблюдается полоса 58 кДа, которая соответствует полноразмерной ГАФДс, а также полоса с молекулярной массой 40кДа (рис. 1, дорожка 1). В экстракте после обработки ультразвуком также присутствуют несколько полос ГАФДс:

58, 48, 47 и 40кДа (рис.1 дорожка 2): полноразмерная ГАФДc 58 кДа и продукты ее протеолитического расщепления. Однако в раствор выходит лишь небольшая часть полноразмерного фермента. После обработки трипсином в экстракте значительно увеличивается интенсивность полосы с молекулярной массой 40 кДа (Рис.1 дорожки 3-6). При этом полоса, соответствующая полноразмерному ферменту, пропадает. Возможно, при трипсинолизе происходит отщепление N-концевого домена, который является связующим звеном между ГАФДс и белками фиброзного слоя.

1- осадок разрушенных клеток после обработки ультразвуком 2 - экстракт после обработки клеток ультразвуком 3-6 – супернатанты после 3, 7, 11, и мин инкубации осадка разрушенных клеток с трипсином при 30° (0,5 мг трипсина на 1 мл осажденных клеток) 7 - осадок разрушенных клеток после мин инкубации с трипсином Рис. 1. Иммуноблоттинг лизатов сперматозоидов человека после обработки ультразвуком и последующей обработки нерастворимого осадка трипсином.

При выделении фермента мы меняли концентрацию трипсина, чтобы подобрать оптимальный вариант для получения очищенного белка с высокой активностью и максимальным выходом.

Для идентификации выделенного белка проводили иммунохимическое окрашивание полученных препаратов ГАФДс. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела против ГАФДс (рис.2).

1 – фрагменты ГАФДс (40 и кДа), (0,2 мг трипсина на 1мл клеток) 2 - фрагмент ГАФДс (40кДа), (0, мг трипсина на 1 мл клеток) 3- фрагменты ГАФДс (29 и 40 кДа) (1 мг трипсина на 1 мл клеток) Рис. 2. Иммунохимическое окрашивание препаратов ГАФДс, полученных в результате инкубации сперматозоидов человека с разными концентрациями трипсина и последующей очистки полученного экстракта на колонке с фенил-сефарозой.

Представлены копии нитроцеллюлозных мембран после окрашивания антителами против ГАФДс.

Из приведенных на рис.2 данных видно, что активные фракции (дорожки 1-3) содержат фрагменты ГАФДс с молекулярными массами 29,40 и ~43 кДа.

На дорожке 3 (рис.2) показан результат выделения ГАФДс при использовании трипсина в концентрации 1мг на 1 мл клеток. При этом происходит более глубокий трипсинолиз и появляется полоса 29 кДа, которая не наблюдается при более низких концентрациях трипсина. Это приводит к снижению активности фермента и ухудшению связывания с субстратом. Поэтому для проведения всех остальных выделений мы использовали более низкую концентрацию трипсина (0,1-0,2 мг на 1 мл клеток).

Чистоту выделенных препаратов ГАФДс оценивали методом Ds-Na электрофореза. На рис. 3 видно, что выделенные препараты не гомогенны, однако полоса 40кДа является основной. По результатам иммуноблотинга (рис.2) можно сказать, что остальные полосы являются примесями, так как не окрашиваются антителами против ГАФДс.

1-3 – образцы ферментов после очистки на колонке с фенил-сефарозой.

1 – 0,1 мг трипсина на 1мл клеток 2 – 0,2 мг трипсина на 1мл клеток 3 – 0,5 мг трипсина на 1мл клеток М- маркеры (60,50,36) Рис. 3. Анализ фракций ГАФДс, полученных в результате нескольких выделений фермента, методом Ds-Na-электрофореза.

Результаты 5 выделений ГАФДс представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты пяти выделений ГАФДС из сперматозоидов человека Трипсин, Белок, Удельная Общая Km Km Выделенные (NAD+), № мг/мл Мг активность, активность, (ФГА), фрагменты осадка Ед/мг ед/мл мМ мМ ГАФДс, клеток экстракта кДа 1 0,1 0,02 19 - 36 0,18-0,31 - - 2 0,1 0,07 10-21 3-4,8 - 1 3 0,2 0,03 50 1,5-11 0,0227 0,77 40, 4 0,5 0,04 19-35 0,8-1,4 - 5 5 1 0,26 13-26 3,3-6,7 - 1,7 40, Из представленных данных видно, что максимальный выход по активности, а также максимальная удельная активность белка наблюдаются при использовании 0,2 мг трипсина на 1 мл осадка клеток. При использовании более высокой концентрации трипсина (0,5 - 1 мг/мл клеток) растет количество выделенного белка, однако активность его падает, а величина Кm для 3-ФГА растет, что говорит об ухудшении связывания субстрата. Таким образом, для выделения ГАФДс оптимальной оказалась концентрация трипсина 0,1-0, мг/мл клеток.

Определение молекулярной массы и олигомерного состава ГАФДс.

Известно, что ГАФД из мышц кролика является тетрамером. Поскольку ГАФДс на 68% гомологична мышечному ферменту, то можно предположить, что ГАФДс тоже тетрамер, однако какие-либо данные по этому поводу отсутствуют.

Для того, чтобы исследовать олигомерную структуру ГАФДс, экстракты сперматозоидов, а также препараты очищенного фрагмента ГАФДс, полученного после обработки сперматозоидов трипсином, исследовали методом голубого нативного электрофореза и SDS-электрофореза.

К осадку клеток добавляли равный объем буфера для лизиса, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали. Из супернатанта брали пробу на электрофорез, а осадок инкубировали с трипсином (0,25 мг/мл осадка) 15 мин при 30°С, центрифугировали и из супернатанта брали пробу для электрофореза (рис.4).

А Б Рис. 4. Анализ ГАФДс методом голубого нативного электрофореза (А) и SDS электрофореза (Б).

А: 1 –маркеры (886, 443, 232, 132, 66, 45 кДа) (электрофореграмма, окрашивание Кумасси R250) 2 – ГАФД из мышц кролика (электрофореграмма, окрашивание Кумасси R250) 3 – супернатант, полученный после обработки сперматозоидов трипсином (копия PVDF мембраны после окрашивания антителами против ГАФДс) 4 – супернатант, полученный после обработки сперматозоидов ультразвуком (копия нитроцеллюлозной мембраны после окрашивания антителами против ГАФДс) 5 – ГАФД из мышц кролика (копия нитроцеллюлозной мембраны после окрашивания антителами 6С5 против цитоплазматической ГАФД) Б: 1 - маркеры (886, 443, 232, 132, 66, 45 кДа) 2 – супернатант, полученный после обработки сперматозоидов ультразвуком 3 – супернатант, полученный после обработки осадка клеток трипсином Из приведенных на рис. 4А результатов видно, что ГАФДс, которая переходит в экстракт после обработки трипсином, при нативном электрофорезе идет одной полосой на одном уровне с ГАФД из мышц кролика и окрашивается антителами к ГАФДс. Известно, что соматическая ГАФД в нативном состоянии существует в виде тетрамера и соответствует молекулярной массе 144 кДа. Следовательно, молекулярная масса растворимого фрагмента ГАФДс, полученного после обработки трипсином, составляет 144-200 кДа (200 кДа по расчёту из калибровочного графика зависимости lgMr от Rf). При SDS-электрофорезе этот же препарат даёт основную полосу с молекулярной массой ~40 кДа (рис. 4Б, дорожка 3).

Следовательно, препарат фермента, полученный путем трипсинолиза, является скорее всего тетрамером. В экстракте, полученном после обработки ультразвуком, ГАФДс также идёт одной полосой (рис.4А, дорожка 4), но чуть выше, чем фермент, полученный при помощи трипсинолиза. Поскольку содержание ГАФДс в экстракте после обработки сперматозоидов ультразвуком ниже, чем после трипсинолиза, данную полосу можно увидеть только после иммуноблотинга. Из рис. 4А (дорожка 4) видно, что полноразмерная ГАФДс также является тетрамером. Ни в экстракте, ни в препарате очищенного фермента при нативном электрофорезе не обнаружено димерных или мономерных форм.

В результате нативного электрофореза экстракта после обработки ультразвуком мы получили одну полосу, а при SDS-электрофорезе тот же экстракт даёт 4 полосы с разными молекулярными массами 58, 48, 47 и 40 кДа (рис. 4Б, дорожка 2). Можно предположить, что олигомер ГАФДс образуется из полипептидных цепей разной длины. Возможно, это связано с тем, что не все субъединицы тетрамера связаны с фиброзным слоем, а одна или две. У оставшихся субъединиц N-конец остаётся свободным и поэтому легко отщепляется протеиназами. В результате при SDS-электрофорезе мы видим одну полосу (58 кДа), которая соответствует полноразмерной ГАФД, закреплённой на фиброзном слое, и ряд полос, соответствующих субъединицам с отщепленным N-концом.

Отщепление N-концевой последовательности не препятствует объединению субъединиц в тетрамер, которое мы видим при нативном электрофорезе.

Таким образом, ГАФДс, полученная в результате обработки сперматозоидов трипсином, является тетрамером.

Выделение рекомбинантной ГАФДс из клеток E.coli. В ходе работы со сперматозоидами человека и выделения ГАФДс из них, мы столкнулись с рядом проблем. Во-первых, для выделения фермента необходимо достаточное количество клеток (желательно 2-3мл), процесс их накопления требует доноров и времени. Во-вторых, как видно из таблицы 1, в результате выделения получается не более 20-66 мкг белка, что очень мало и такого количества белка недостаточно для изучения свойств фермента. Помимо этого препарат ГАФДс получается негомогенным, а многократные очистки привели бы к потере большей части белка. Поэтому мы решили экспрессировать ГАФДс в клетках E.coli.

Сначала в клетках E.coli клонировали полноразмерную последовательность ГАФДс. Однако выделить фермент в растворимом, активном и очищенном виде не удалось. Мы полагаем, что нерастворимость ГАФДс, а также отсутствие активности полноразмерной ГАФД, связано с наличием N-концевого домена. В процессе сперматогенеза происходит формирование фиброзного слоя и одновременное встраивание в него необходимых ферментов. Новосинтезированная ГАФДс встраивается N концевым доменом в растущий фиброзный слой, поэтому N-концевой домен не препятствует сворачиванию белка. При экспрессии полноразмерной ГАФДс в клетках E.coli гидрофобный N-концевой домен остается свободным и способствует агрегации белка. Поэтому было решено экспрессировать в клетках E.coli ГАФДс без N-концевого домена. Как было показано выше, фрагмент ГАФДс после отщепления N-концевого домена трипсином сохраняет активность и переходит в раствор. Следовательно, N-концевой домен не взаимодействует с каталитической частью фермента и может быть удален.

Сначала в молекуле ГАФДс природный N-концевой домен был заменен на близкий по размеру, но менее гидрофобный фрагмент – хитинсвязывающий домен. Мы предположили, что это позволит избежать агрегации фермента и получить растворимую модель ГАФДс.

Выделение ChBD-GAPDS из клеток E.coli Rosetta 2(DE3)/ pETmChBD/dGAPDHS. Клетки E.coli Rosetta 2(DE3)/pETmChBD/dGAPDHS экспрессируют человеческую ГАФДс, N-концевой домен которой заменен на хитинсвязывающий домен (ChBD-GAPDS). На рис. 5 представлена последовательность ChBD-GAPDS в сравнении с полноразмерной ГАФДс.

Рис. 5. Аминокислотные последовательности ГАФДс человека и рекомбинантного белка ChBD-GAPDS. N-концевой и хитинсвязывающий домены выделены.

Мы проанализировали содержание и активность ChBD-GAPDS в осадке и супернатанте разрушенных ультразвуком клеток. В данном случае в экстракте трансформированных клеток наблюдалась дегидрогеназная активность 20,4 Ед/мг (по сравнению с 7,76 Ед/мг в контрольной пробе нетрансформированных клеток). По-видимому, хитинсвязывающий домен отличается меньшей гидрофобностью по сравнению с природным N-концевым доменом фермента и не препятствует сворачиванию белка и его экстракции.

При SDS-электрофорезе экстракт трансформированных клеток давал интенсивную полосу с молекулярной массой около 45 кДа (рис. 6, дорожка 1).

Это значение приблизительно соответствует молекулярной массе ChBD GAPDS, равной 43 кДа.

1 – экстракт E.coli после обработки ультразвуком 2 – препарат после очистки на колонке с хитиновым носителем 3 – иммуноокрашивание моноклональными антителами на ГАФДс человека Рис. 6. Анализ фракций ChBD-GAPDS методом Ds-Na-электрофореза (1,2) и иммуноблотинга (3).

Таким образом, при помощи замены N-концевого домена на хитин связывающий удалось получить растворимую рекомбинантную форму ChBD GAPDS.

Рекомбинантный белок ChBD-GAPDS выделяли из экстракта на колонке с хитиновым носителем. Элюат содержал практически чистый белок с молекулярной массой около 45 кДа (рис. 6 дорожка 2), который взаимодействовал с моноклональными антителами к ГАФДс человека (рис. дорожка 3) и проявлял глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназную активность 40-50 Ед/мг.

Поскольку нельзя исключить влияние хитинсвязывающего домена на свойства ГАФДс, был создан другой рекомбинантный белок – ГАФДс без N концевого домена (dN-GAPDS).

ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS). Клетки E.coli Rosetta 2(DE3)/pET21/dGAPDS экспрессировали ГАФДс без N-концевого домена (удалены 68 аминокислот с N-конца), как показано на рис. 7.

MSKRDIVLTN VTVVQLLRQP CPVTRAPPPP EPKAEVEPQP QPEPTPVREE IKPPPPPLPP HPATPPPKMV SVARELTVGI NGFGRIGRLV LRACMEKGVK VVAVNDPFID PEYMVYMFKY DSTHGRYKGS VEFRNGQLVV DNHEISVYQC KEPKQIPWRA VGSPYVVEST GVYLSIQAAS DHISAGAQRV VISAPSPDAP MFVMGVNEND YNPGSMNIVS NASCTTNCLA PLAKVIHERF GIVEGLMTTV HSYTATQKTV DGPSRKAWRD GRVAHQNIIP ASTGAAKAVT KVIPELKGKL TGMAFRVPTP DVSVVDLTCR LAQPAPYSAI KEAVKAAAKG PMAGILAYTE DEVVSTDFLG DTHSSIFDAK AGIALNDNFV KLISWYDNEY GYSHRVVDLL RYMFSRDK Рис. 7. Аминокислотная последовательность ГАФДс человека. Выделен фрагмент из 68 аминокислот, отсутствующий в dN-GAPDS.

Клетки разрушали ультразвуком и анализировали на суперэкспрессию ГАФДс и на активность фермента. После обработки ультразвуком экстракт клеток анализировали методом Ds-Na-электрофореза. В экстракте был обнаружен белок с молекулярной массой приблизительно 40кДа (рис.8, дорожка 1). Это близко к рассчитанной молекулярной массе dN-GAPDS, равной 37 кДа. Практически вся ферментативная активность также была обнаружена в экстракте (24,5 Ед/мг по сравнению с 3,7 Ед/мг в экстракте контрольных нетрансформированных клеток).

Из рис. 8 видно, что в результате выделения был получен гомогенный препарат ГАФДс, который окрашивался моноклональными антителами к ГАФДс. Активность выделенного препарата составляла 45-50 Ед/мг.

1 – исходный экстракт клеток E.coli 2 – белки, которые не связались с КМ-целлюлозой 3 – препарат dN-GAPDS после элюции с КМ-целлюлозы 4 - очищенный препарат dN-GAPDS, окрашенный моноклональными антителами против ГАФДс человека.

Рис. 8. Выделение dN-GAPDS. Анализ фракций методом Ds-Na-электрфоореза (1-3) и иммуноблотинга (4).

Исследование рекомбинантных форм ГАФДс в сравнении с мышечным ферментом ГАФД. В данной работе мы проводили сравнительное исследование рекомбинантных белков ChBD-GAPDS и dN-GAPDS с мышечной изоформой ГАФД. Для этого использовали фермент из мышц кролика, поскольку он на 95% гомологичен ГАФД из мышц человека.

Каталитические свойства рекомбинантных ферментов. Каталитические свойства рекомбинантных форм ГАФДс по сравнению с ГАФД из мышц кролика приведены в таблице 2. Активность ChBD-GAPDS и dN-GAPDS примерно одинаковы и в 1,7- 2 раза ниже активности ГАФД из мышц кролика.

Константа Михаэлиса для 3-ФГА рекомбинантных форм ГАФДс в два раза превышает значение для ГАФД, а константа для NAD+ приблизительно в три раза ниже. Все ферменты проявляют чувствительность к окислению перекисью водорода.

Таким образом, ChBD-GAPDS и dN-GAPDS практически не отличаются друг от друга по своим каталитическим характеристикам, но немного отличаются от мышечной ГАФД.

Таблица 2. Каталитические характеристики ферментов ГАФД из Фермент мышц ChBD-GAPDS dN-GAPDS кролика Оптимум pH 8,9 8,6 8, Удельная активность, 45- 80 40- мкмоль NADH/ мин мг Кm для 3-ФГА, 0,29 ± 0,54 ± 0, 0,485 ± 0, мМ 0, Кm для NAD+, 0,097±0, 0,27±0,1 0,073 ± 0, мМ Окисление 0,54 ± 0, Н2О2, k, мM-1 0,9±0,06 0,6 ± 0, * мин- Анализ размеров частиц. Размеры частиц исследуемых белков определяли методом динамического светорассеяния. Средний диаметр частиц для соматической ГАФД, dN-GAPDS и ChBD-GAPDS равен соответственно 8, нм, 9,3 нм и 9,9 нм (распределение частиц по объему). Так как ГАФД представляет собой тетрамер, близкий размер частиц рекомбинантных белков позволяет говорить о том, что они тоже являются тетрамерами. Увеличение размера молекул рекомбинантных ГАФДс по сравнению с ГАФД по видимому объясняется наличием хитин-связывающего домена (в случае ChBD-GAPDS) и нескольких аминокислотных остатков N-концевого домена (в случае dN-GAPDS), экспонированных в раствор.

Термостабильность рекомбинантных форм ГАФДс. Стабильность белков изучали методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Результаты представлены на рис. 9 и в таблице 3. Как видно из таблицы, значения температуры максимума пика (Tm) и калориметрической энтальпии (Hcal) для ChBD-GAPDS и dN-GAPDS значительно выше, чем для ГАФД. Эти данные свидетельствуют о повышенной термостабильности этих двух ферментов.

Рис. 9. Кривые теплопоглощения ГАФД из мышц кролика (1), dNGAPDS (2) и ChBD Cp, кДж/ моль * K GAPDS (3).

40 50 60 70 80 90 о Т, С Таблица 3. Параметры, характеризующие стабильность ChBD-GAPDS и dN-GAPDS в сравнении с соматической ГАФД Tm, C Hcal, Термоинактивация Денатурация в присутствии kobs, мин- кДж/моль гуанидингидрохлорида (20С) kobs, мин- 55С 70С Без добавок + 50мМ ДТТ ГАФД 2125 60,8 0,26 ± 0,96 ± 0,14 2,45 ± 0,018 – 0, ChBD- 3314 67,7 0,0118 ± – 0,133 ± 0,0076 0,134 ± 0, GAPDS 0, dN- 2536 67,4 Не 0,226± 0,02 0,118 ± 0,008 0,095 ± 0, GAPDS инактивиру ется Результаты согласуются с данными, полученными в ходе термоинактивации при 55С (рис. 10). Исследуемые белки термостатировали при 55С и через определенные промежутки времени отбирали пробы для определения активности. На рис. 10 видно, что ГАФД из мышц кролика при этой температуре инактивируется значительно быстрее, чем рекомбинантные формы ГАФДс. В таблице 3 приведены значения наблюдаемых констант инактивации при 55С для двух ферментов: ГАФД и ChBD-GAPDS. Константа инактивации ГАФД в 22 раза выше, чем ChBD-GAPDS. Для dN-GAPDS константу инактивации не определяли, поскольку этот белок инактивируется при 55С только на 20% (рис. 10, кривая 3). Такая значительная разница еще раз подтверждает, что обе рекомбинантные формы ГАФДс стабильнее соматической ГАФД.

Поскольку dN-GAPDS не инактивируется полностью при 55С, мы увеличили температуру инкубации до 70°С. Наблюдаемая константа инактивации dN-GAPDS в 4,2 раза ниже, чем константа инактивации соматической ГАФД (табл. 3).

Рис. 10. Термоинактивация ChBD-GAPDS (1), ГАФД из мышц кролика (2) и dN-GAPDS (3) при 55С.

Активность, % 0 50 100 150 Время, мин Устойчивость к денатурации. Мы проводили денатурацию исследуемых белков в присутствии 4 М гуанидингидрохлорида. Константа инактивации ChBD-GAPDS и dN-GAPDS в 4 М растворе гуанидингидрохлорида приблизительно в 20 раз ниже, чем для ГАФД (0,133±0,0076, 0,118±0,008 и 2,450±0,018 мин-1, соответственно, данные представлены в табл. 3).

Следовательно, рекомбинантные формы ГАФДс значительно устойчивее их соматической изоформы.

Возможность стабилизации GAPDS дисульфидными связями. Мы исследовали возможность стабилизации рекомбинантных белков дисульфидными мостиками. ChBD-GAPDS содержит три остатка цистеина, отсутствующих в составе соматической ГАФД: C34, расположенный в хитин связывающем домене, а также C83 и C139, соответствующие остаткам C94 и C150 в полноразмерной человеческой GAPDS. Эти остатки могут быть вовлечены в образование дисульфидных связей, оказывающих стабилизирующий эффект на структуру белка. Для проверки этой гипотезы было исследовано влияние восстанавливающего агента дитиотреитола (ДТТ) на денатурацию ChBD-GAPDS и dN-GAPDS. Было показано, что инкубация белков в присутствии 50 мМ ДТТ не влияет на скорость инактивации ферментов (см. табл. 3). Кроме того все шесть остатков цистеина, приходящиеся на субъединицу, реагировали с ДТНБ в присутствии гуанидингидрохлорида (рис. 11). Таким образом, дополнительные остатки цистеина ChBD-GAPDS не образуют дисульфидных связей, и повышенная стабильность белка обусловлена другими причинами.

Рис. 11. Кривая титрования SH-групп ChBD-GAPDS в присутствии ДТНБ.

Заключение. По данному разделу можно сделать следующее заключение. Из сперматозоидов человека был выделен растворимый и активный фрагмент ГАФДс (~ 150 кДа по данным голубого нативного электрофореза и ~40 кДа по данным SDS-электрофореза) путем частичного отщепления N-концевого домена. Этот фрагмент ГАФДс является тетрамером, отщепление N концевого домена позволяет экстрагировать его в раствор. Для изучения свойств и каталитических характеристик ГАФДс мы использовали рекомбинантные ферменты, выделенные из экстрактов трансформированных клеток E.coli: ГАФДс без N-концевого домена (dN-GAPDS) и ГАФДс с заменой N-концевого домена на хитинсвязывающий домен (ChBD-GAPDS).

Мы показали, что наличие хитинсвязывающего домена не влияет на свойства и активность фермента. Оба рекомбинантных фермента являются тетрамерами и обладают повышенной стабильностью по сравнению с соматической ГАФД. С чем связана повышенная стабильность ГАФДс пока не ясно. Поскольку ГАФДс локализована в жгутике сперматозоида и обеспечивает энергией движение сперматозоида, повышенная стабильность фермента может быть необходима для сохранения способности сперматозоидов к успешному оплодотворению в течение всего срока их функционирования.

Исследование роли ГАФДс в подвижности сперматозоидов.

Определение активности ГАФДс в сперматозоидах с высокой и низкой подвижностью. ГАФДс необходима для обеспечения подвижности сперматозоида: разрушение гена Gapds у мышей приводит к утрате подвижности сперматозоидов (Miki K. et al, 2004). Было сделано предположение, что при отсутствии каких-либо наследственных дефектов подвижность сперматозоидов может снижаться вследствие снижения активности ГАФДс.

Для проверки этого предположения, мы определяли активность ГАФДс в сперматозоидах с высокой и низкой подвижностью. Для этого исследовали подвижность сперматозоидов в образцах человеческой спермы и определяли активность ГАФДс в каждом образце.

Клетки разрушали ультразвуком, осадок разрушенных клеток отделяли центрифугированием и определяли активность ГАФДс отдельно в осадке и в экстракте. Результаты представлены на диаграмме (рис. 12).

Из представленных на рис. 12 данных видно, что активность ГАФДс в экстрактах одинакова в сперматозоидах с высокой и низкой подвижностью.

Так как ГАФДс связана с фиброзным слоем, то после обработки ультразвуком большая часть белка остаётся в нерастворимой фракции. Как видно из рис. 12, активность в осадке сперматозоидов с низкой подвижностью в 2-3 раза ниже, чем активность сперматозоидов с высокой подвижностью. Эти данные говорят о том, что именно ГАФДс, прочно ассоциированная с фиброзным слоем, которая не экстрагируется в раствор, имеет значение для обеспечения подвижности сперматозоидов, поэтому в дальнейших экспериментах для определения активности ГАФДс в сперматозоидах использовали только осадки разрушенных клеток.

45-55% поступательной подвижности 2-15% поступательной подвижности 0, осадок * 0, Активность, Ед/мл спермы Рис. 12. Активность ГАФДс в экстрактах и осадках 0, сперматозоидов с высокой и низкой подвижностью.

осадок 0, супернатант супернатант * 0, 0, Высокая подвижность Низкая подвижность Влияние Н2О2 и других окислителей на подвижность сперматозоидов.

Было сделано предположение, что снижение подвижности сперматозоидов может происходить в результате окисления ГАФДс активными формами кислорода (АФК). В литературе пагубный эффект АФК на подвижность сперматозоидов связывают с перекисным окислением жиров в плазматической мембране (Williams A. and Ford W., 2005), а именно с потерей проницаемости плазматической мембраны из-за перекисного окисления мембранных фосфолипидов. Однако остается непонятным, почему снижается подвижность сперматозоидов. Возможно, АФК влияют также на активность ГАФДс, окисляя SH-группы фермента, что способствует снижению подвижности сперматозоидов. Для проверки возможности окисления ГАФДс исследовали действие перекиси водорода на подвижность сперматозоидов с последующим определением активности ГАФДс в осадке разрушенных клеток после обработки ультразвуком. По результатам были построены диаграммы, которые представлены на рис. 13. Из приведенных данных следует, что подвижность сперматозоидов несколько снижается при инкубации в отсутствие окислителей, а добавление перекиси водорода вызывает существенное уменьшение их подвижности вплоть до полного обездвиживания. Уменьшение активности ГАФД коррелирует со снижением подвижности сперматозоидов.

А Активность ГАФДс, ед/мг х n= 70 Подвижность Рис. 13. Соотношение Активность ГАФДс подвижности сперматозоидов 60 и активности ГАФДс после Подвижность, % n= 50 инкубации образцов спермы в присутствии перекиси 40 водорода (коэффициент 30 n= корреляции Пирсона 0,97).

20 10 n= 0 2 мМ 7 мМ Н2О До инкубации Без добавок Н2О Заключение. Показано, что в сперматозоидах с высокой подвижностью активность ГАФДс выше, чем в сперматозоидах с низкой подвижностью.

Обнаружено, что в присутствии перекиси водорода подвижность сперматозоидов значительно снижается, причем снижение подвижности коррелирует со снижением активности ГАФДс. Вероятно, одной из причин снижения подвижности сперматозоидов в присутствии АФК является окисление ГАФДс. Эти данные свидетельствуют о необходимости ГАФДс для обеспечения подвижности сперматозоидов и ее возможной роли в качестве мишени для активных форм кислорода, которые продуцируются как самими сперматозоидами, так и лейкоцитами.

Исследование содержания ГАФДс в сперматозоидах пациентов с астенозооспермией.

Существуют многочисленные наследственные дефекты сперматозоидов, приводящие к их полной неподвижности (астенозооспермия), которая исключает возможность естественного оплодотворения. Одним из таких дефектов является нарушение структуры жгутика сперматозоида, которое описано в литературе как дисплазия фиброзного слоя жгутиков (ДФС). При этом заболевании сперматозоиды формируются с укороченными, несгибаемыми и неподвижными жгутиками с гипертрофированным и неорганизованным фиброзным слоем (рис. 14). ДФС приводит к почти к полной неподвижности сперматозоида, но ядерная и акросомная структуры могут быть не повреждены (Chemes H. et al, 1998). Дисплазия фиброзного слоя - это одно из редких нарушений, связанных генетическими дефектами жгутика сперматозоида. Как и другие генетические дефекты, ДФС часто носит фамильный характер, однако до сих пор не выявлен ген, ответственный за развитие этого дефекта. Возможно, ДФС – это мультигенное заболевание, вызванное изменениями продуктов нескольких разных генов.

Любая информация относительно изменения белкового состава фиброзного слоя при ДФС может оказаться полезной для установления причин этого дефекта. Поскольку ГАФДс связана с фиброзным слоем, мы предположили, что нарушения в формировании этого компонента жгутика может приводить к нарушению связывания ГАФДс и, как следствие, к снижению ее содержания.

Мы изучали активность ГАФДс в сперматозоидах пациентов с ДФС в сравнении с нормальными сперматозоидами. Образцы спермы пациентов с астенозооспермией исследовали при помощи электронной микроскопии. На рис. 14 Б показаны характерные особенности ультраструктуры жгутиков сперматозоидов пациентов с астенозооспермией. Все эти особенности позволяют сделать вывод, что наблюдаемые дефекты жгутиков связаны с ДФС.

А Б Рис. 14. Продольные срезы через средний и основной отделы жгутиков нормального сперматозоида (А) и с ДФС (Б). Сперматозоид с ДФС с коротким широким митохондриальным слоем и неорганизованным основным участком жгутика.

НПФ – наружные плотные фибриллы, МТХ – митохондриальный слой, ПР – поперечные рёбра, ЦМ – центральная микротрубочка, Г- головка сперматозоида, ФС – фиброзный слой.

На рис. 15 показано распределение активности ГАФДс между нерастворимой и растворимой фракциями после разрушения сперматозоидов ультразвуком в норме и при ДФС. Основная часть активности ГАФДс в нормальных сперматозоидах ассоциирована с нерастворимой фракцией. Это связано с тем, что ГАФДс находится в фиброзном слое и не экстрагируется водными растворами. В случае сперматозоидов с ДФС, в обеих фракциях образцов была низкая активность. Из рис. 15 видно также, что активность ГАФДс в сперматозоидах с ДФС приблизительно одинакова в супернатанте и осадке. Эти данные не совпадают с нормой, где активность фермента в осадке значительно выше, чем в супернатанте. Это наблюдение указывает на то, что в случае ДФС фермент легче экстрагируется в раствор по сравнению с нормой, следовательно, есть нарушения связывания ГАФДс с белками фиброзного слоя.

0, Активность ГАФДс, Ед/мл спермы супернатант Рис. 15. Активность ГАФДс в осадок общая активность 0, разных клеточных фракциях сперматозоидов 0, в норме и при ДФС.

(*p0,01 согласно U-тесту 0, Манна-Уитни).

0, * 0, * 0, ДФС Норма Поскольку общая активность ГАФДс в сперматозоидах с ДФС намного ниже, чем в норме, это может быть связано со снижением содержания этого фермента в фиброзном слое. Чтобы это проверить, мы проанализировали содержание ГАФДс в нерастворимых фракциях разрушенных сперматозоидов с ДФС методом иммуноблотинга. Мембрану окрашивали моноклональными антителами против ГАФДс. Было исследовано 5 образцов спермы с ДФС.

Контролем служили образцы нормальных сперматозоидов. Интенсивность полос, соответствующих ГАФДс, в случае образцов с ДФС во много раз ниже контроля, а в некоторых случаях полоса ГАФДс вообще отсутствует.

Соотношение интенсивности полос показано на рис. 16.

Рис. 16. A:

Иммуноокрашивание осадков нормальных сперматозоидов (К) и сперматозоидов с ДФС (1-5) моноклональными антителами к ГАФДс.

Б: Относительная интенсивность окрашивания образцов с Б Оптическая плотность, % ДФС по отношению к контролю (в каждом эксперименте оптическую плотность полосы в контрольном образце принимали за 100%).

К ДФС1 2 3 4 Таким образом, мы можем заключить, что в сперматозоидах с ДФС наблюдается дефицит ГАФДс по сравнению с нормой.

Можно было бы предположить, что нарушение формирования фиброзного слоя может быть связано именно с недостаточностью ГАФДс.

Однако ранее было показано, что при разрушении гена Gapds у мышей блокируется поступательное движение сперматозоидов у мутантов, но не нарушается формирование фиброзного слоя (Miki K. et al, 2004). Таким образом, недостаточность ГАФДс в сперматозоидах пациентов с ДФС является не причиной, а следствием ДФС.

Заключение. Дисплазия фиброзного слоя жгутиков сперматозоидов характеризуется почти полным отсутствием подвижности сперматозоидов в связи с серьезными нарушениями в формировании фиброзного слоя.

Поскольку ГАФДс связана своим N-концевым доменом с фиброзным слоем, изменения в его формировании приводят к нарушению включения фермента в фиброзный слой на стадии спермиогенеза. Возможно, что свободный фермент легче подвергается деградации. В результате количество фермента в сперматозоидах с ДФС значительно ниже, чем в норме. Известно, что процесс формирования фиброзного слоя и встраивания в него ферментов очень строго регулируется. Нарушения регуляции формирования фиброзного слоя могут быть связаны с недостаточностью неизвестного белка, ответственного за связывание ГАФДс, что и приводит к снижению содержания ГАФДс в сперме пациентов с ДФС.

ВЫВОДЫ 1. Из сперматозоидов человека выделена растворимая и активная ГАФДс без N-концевого домена с удельной активностью 10-50 Ед/мг. Показано, что выделенная ГАФДс является тетрамером.

2. Выделены растворимые гомогенные препараты рекомбинантной ГАФДс (ChBD-GAPDs), содержащий хитин-связывающий домен вместо N концевого домена, и рекомбинантной ГАФДс без N-концевого домена (dN GAPDs) с удельными активностями 40-50 Ед/мг.

3. Показано, что оба рекомбинантных фермента (ChBD-GAPDs и dN-GAPDs) являются тетрамерами и обладают повышенной стабильностью по сравнению с соматической ГАФД.

4. Показано, что в сперматозоидах с высокой подвижностью активность ГАФДс выше, чем в сперматозоидах с низкой подвижностью.

5. Показано, что в присутствии перекиси водорода подвижность сперматозоидов значительно снижается, что коррелирует со снижением активности ГАФДс.

6. Показано, что при астенозооспермии, связанной с дисплазией фиброзного слоя жгутиков сперматозоидов, значительно снижается содержание и активность ГАФДс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Щуцкая Ю.Ю., Элькина Ю.Л. Выделение и характеристика глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из сперматозоидов человека.

Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», 2006, с. 260.

2. Элькина Ю.Л. Роль глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в регуляции подвижности сперматозоидов. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007», 2007, с. 40.

3. Щуцкая Ю.Ю., Элькина Ю.Л., Куравский М.Л., Брагина Е.Е. и Шмальгаузен Е.В. Исследование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из сперматозоидов человека. Биохимия, 2008, 73(2), с.228-237.

4. Шмальгаузен Е.В., Элькина Ю.Л., Брагина Е.Е., Шилейко Л.В., Черных В.Б., Курило Л.Ф. Ультраструктурные и биохимические нарушения жгутика сперматозоидов при астенозооспермии. Андрология и генитальная хирургия, 2008, 3, с.25-31.

5. Elkina Y.L., Bragina E.E., Schmalhausen E.V. Effect of different factors on the motility of human sperm. Materials of 33 FEBS Congress “Biochemistry of cell regulation”, FEBS Journal (supplement), 2008, 275 (1), 398.

6. Элькина Ю.Л. (2008) Препараты, регулирующие подвижность сперматозоидов путем изменения активности спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, 2008, с. 351-352.

7. Куравский М.Л., Элькина Ю.Л., Эльдаров М.А. Сперматозоидная глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа человека: выделение, очистка и исследование влияния на её активность различных факторов. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», 2009, с. 53.

8. Elkina Yu.L., Bragina E.E., Schmalhausen E.V. (2010) Deficiency in the glycolytic enzyme GAPDS in sperms with dysplasia of fibrous sheath. 4th ESF Conference on Functional Genomics and Disease, Germany, Drezden, New Biotechnology, 2010, 27 (1), 65.

9. Куравский М.Л., Элькина Ю.Л. (2010) Специфическое ингибирование сперматозоидной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», 2010, с. 15.

10. Elkina Yu.L., Kuravsky M.L., El'darov M.A., Stogov S.V., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. Recombinant Human Sperm-Specific Glyceraldehyde-3 Phosphate Dehydrogenase: Structural Basis for Enhanced Stability. Biochim.

Biophys. Acta, 2010, DOI:10.1016/j.bbapap.2010.09.002.