Юрьевна стройлова роль агрегации и образования дисульфидных связей в формировании амилоидных структур естественно развернутыми белками: прионом и казеином автореферат диссертации на соискание ученой с

На правах рукописи

УДК 577.112 ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА СТРОЙЛОВА РОЛЬ АГРЕГАЦИИ И ОБРАЗОВАНИЯ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ В ФОРМИРОВАНИИ АМИЛОИДНЫХ СТРУКТУР ЕСТЕСТВЕННО РАЗВЕРНУТЫМИ БЕЛКАМИ: ПРИОНОМ И КАЗЕИНОМ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

специальность 03.01.04 – Биохимия Москва 2010 Диссертационная работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова и в лаборатории функциональных взаимодействий молочных белков государственного агрономического института в городе Нант Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Владимир Израилевич Муронец профессор Тома Эртле

Официальные оппоненты: доктор химических наук Борис Иванович Курганов доктор биологических наук Николай Николаевич Чернов

Ведущая организация: Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 15 ноября 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» октября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение долгого времени процесс агрегации белков практически не исследовали, считая ее скорее неприятным препятствием, возникающим при изучении белков, однако в последнее время ситуация изменилась. Основной причиной всплеска интереса к этому процессу является то, что накопление белковых агрегатов в клетке ведет к развитию нейродегенеративных заболеваний (Mazzola and Sirover, 2003). Известна связь прионов и их агрегатов с хроническими нейродегенеративными заболеваниями, такими как скрейпи у овец, губчатая энцефалопатия у крупного рогатого скота и болезнь Крейцфельда-Якоба у человека (Prusiner, 1994;

Prusiner, 1998;

Prusiner et al., 1998). Патологическая агрегация прионов в амилоидную форму считается причиной скрейпи (Prusiner and DeArmond, 1991). Такая трансформация сопровождается конформационными изменениями в третичной структуре, увеличением количества -слоев и повышением устойчивости белка к действию протеаз. Причины и механизмы этого процесса являются объектом многочисленных исследований, однако до сих пор не ясны.

В последние годы стало известно, что белки могут быть функционально активны не только в глобулярном, но и в частично или полностью развернутом состоянии (Uversky et al., 2000), причем именно такие белки вовлечены в нейродегенеративные процессы.

Межмолекулярные взаимодействия белковых молекул между собой могут приводить к образованию ассоциатов, аморфных агрегатов, амилоидоподобных и амилоидных фибрилл. Для возникновения таких контактов необходимо наличие гидрофобных участков полипептидной цепи, экспонированных в растворитель. Поэтому агрегация частично или полностью неупорядоченных белков более вероятна по сравнению с глобулярными белками и представляет особый интерес. Таким образом, изучение особенностей агрегации представителей класса естественно развернутых белков, к которым относятся прион и казеины, является актуальной проблемой.

Целью нашей работы было выявление новых факторов, влияющих на агрегацию белков с естественно развернутой структурой.

Для этого нами было выбрано два объекта: овечий прион и казеин.

Овечий прион является частично несвернутым белком (примерно половина последовательности), а казеин считается малоструктурированным белком.

Патологическая агрегация приона и его переход в амилоидную форму вызывают прионную болезнь;

некоторые казеины, в частности, -казеин, в определенных условиях также способны к образованию амилоидных фибрилл.

Таким образом, казеины являются адекватной модельной системой для исследования агрегации неструктурированных белков.

Оба белка содержат более 10% остатков пролина. Сравнение двух этих белков интересно еще и тем, что -казеин формирует мицеллы в нативном состоянии.

Перед нами стояли следующие задачи:

- Исследовать влияние температуры и образования дисульфидных связей на мицеллизацию и структуру казеина;

- Исследовать амилоидогенную агрегацию приона под действием температуры и фосфолипидов;

- Исследовать влияние образования дисульфидных связей при гомоцистеинилировании на агрегацию казеинов и приона.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В данной работе впервые охарактеризовано влияние образования дисульфидных связей на мицеллизацию и агрегацию казеина. Исследование новоприобретённой способности к полимеризации мутантных форм и ее влияния на структуру и мицеллизацию -казеина носит фундаментальный характер.

Результаты, полученные в данной работе, дополняют современные представления о возможных молекулярных причинах спорадических форм прионных заболеваний. В частности, данное исследование позволило установить, что патологическая агрегация приона может быть вызвана изменениями в его липидном окружении.

Показанное в данной работе амилоидогенное влияние гомоцистеинилирования на агрегацию приона позволяет предположить провоцирующее влияние гомоцистеина, опосредованное через гомоцистеинтиолактон, на появление патологических амилоидогенных агрегатов приона.

Результаты, полученные при гомоцистеинилировании приона и -казеина, позволили выявить влияние новообразованных дисульфидных связей на амилоидогенные белки. Проведенные исследования существенно расширяют представления о механизмах взаимодействия гомоцистеинтиолактона со склонными к патологической амилоидоподобной агрегации белками, что существенно для понимания молекулярных механизмов токсичности гомоцистеина. Проведение исследований по влиянию различных факторов (в том числе образования дисульфидных связей) на агрегацию естественно развернутых белков необходимо для понимания процессов, которые происходят с такими белками, формирующими надмолекулярные структуры и склонными к образованию амилоидных структур. Одним из таких белков, имеющим важное практическое значение, является казеин молока. Следует также отметить, что коровье молоко и сыворотка содержат микромолярные концентрации N-связанного с белком гомоцистеина, и, следовательно, такого рода процессы могут иметь важное значение для регуляции потребительских свойств молока (стабильность эмульсионных свойств при хранении, особенности створаживания, эффективность отделении сыворотки и т.д.). Не менее важно учитывать возможное влияние N-связанного с белком гомоцистеина, прежде всего в случае казеина, на особенности переваривания и всасывания других белковых компонентов пищи, включая такие амилоидогенные белки, как прионы.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научном семинаре кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на научных семинарах в лаборатории функциональных взаимодействий молочных белков государственного агрономического института в городе Нант, на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Казань, 2009), Forum des Doctorants de l’Ecole Doctorale de Chimie-Biologie de l’Universit de Nantes (2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, включая 3 статьи и одни тезисы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы» и списка цитируемой литературы.

Работа содержит _ страниц машинописного текста, таблиц и рисунков. Список литературы включает _ отечественных и зарубежных источников.

В работе приняты следующие сокращения:

ДЛС – метод динамического лазерного светорассеяния, ДСН - додецилсульфат натрия, ИК инфракрасная спектроскопия, КД - круговой дихроизм, ФИ - фосфатидилинозитол, ANS натриевая соль 1,8-анилинонафталинсульфоновой кислоты GPI - гликофосфатидилинозитол, MALDI-TOF - Масс-спектрометрия с использованием матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации и времяпролетного детектора, WT - дикий тип.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования были S1-, - и -казеины из коровьего молока, рекомбинантный -казеин и его мутанты, а также рекомбинантный овечий прион.

Экспрессию рекомбинантных -казеинов и приона проводили в E. coli.

Для очистки приона использовали аффинную хроматографию на Ni-связанной сефарозе вследствие наличия у приона сродства к металлам (Rezaei et al., 2000).

Нативные казеины молока разделяли с помощью анионообменной хроматографии (Mercier et al., 1968), рекомбинантный -казеин и его мутанты получали с помощью трехстадийной очистки, включающей две обратно фазовых хроматографии и анионообменную.

Получение олигомерных термоагрегатов приона проводили, используя аппарат для ПЦР (Techne) в диапазоне температуры между 45 и 90°C. Для исследований взаимодействия с фосфатидилинозитолом его растворяли в смеси этанол-хлороформ в концентрации 10 мг/мл.

Для гомоцистеинилирования использовали 100-кратный молярный избыток гомоцистеинтиолактона в расчете на содержание остатков лизина в белке, если не указано иное. Гомоцистеинилирование проводили с 20 мкМ раствором белка в 20 мМ МОРS или 25 мМ фосфатном буфере, рН 7,5.

Свежеприготовленный раствор гомоцистеинтиолактона добавляли к раствору белка и контролировали рН, добавляя NaOH при закислении. Реакционную смесь инкубировали при 37С в течении 20-24 часов в случае приона, при 10, и 50С в случае казеинов. Из литературных данных известно, что за это время непрореагировавший тиолактон полностью гидролизуется.

Для димеризации лиофилизированные рекомбинантные формы казеина (дикий тип и цистеинилированные мутанты) растворяли в 50 мМ Трис HCl буфере, содержащем 80 мМ NaCl, 0,05% азид натрия, рН 8,2, до конечной концентрации 20 мкМ. Для получения преимущественно димерных форм белки инкубировали в присутствии 60 мкМ Н2О2.

Гидродинамический диаметр приона и казеинов в нативном и агрегированном состоянии измеряли на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern). Спектры кругового дихроизма записывали при длине волны от 190 до 250 нм на приборе Jobin Yvon CD Mark 6 (Long-Jumeau, Франция) в кювете с длиной оптического пути 0,01 мм. ИК-спектры записывали на спектрометре Bruker Vector 22 (Bruker GmbH, Германия).

Образцы гомоцистеинилированного и контрольного белка помещали между двумя пластинками из фторида бария с разделителем толщиной 56 нм.

Спектры флуоресценции снимали на спектрофлуориметре FluoroMax- (Horiba Jobin Yvon, Long-Jumeau, Франция).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Димеризация мутантных форм -казеина В лаборатории функциональных взаимодействий белков молока были созданы мутанты -казеина со вставками цистеина на N- и C-концах (Gangnard et al., 2007):

Мы проанализировали способность полученных мутантных форм к димеризации при различных температурах. Анализ геля ДСН-электрофореза (Рис. 1) показывает значительные отличия в скорости димеризации двух изучаемых мутантов. С-концевой мутант обладает значительно более выраженной способностью к димеризации, чем N-концевой в обоих использованных буферах.

Рекомбинантный казеин дикого типа не димеризуется по причине отсутствия цистеина и приведен в качестве контроля. Из рисунка видно, что скорость димеризации растет с увеличением температуры, подчиняясь общему для всех химических реакций уравнению Аррениуса.

А Рис. 1. Результат ДСН-электрофореза, иллюстрирующий димеризацию рекомбинантных казеинов при pH 6,8 и температурах 60°C и 25C А: 60C – фосфатный буфер :

1, 2, 3 – WT, 0, 10 мин, 1 ч.

4, 5, 6 – С208, 0, 10 мин, 1 ч.

Б 7, 8, 9 – С4, 0, 10 мин, 1 ч.

Б: 25C – фосфатный буфер :

1, 2, 3, 4 – С208, 0, 1 ч, 10 ч, 24 ч.

5, 6, 7, 8 – С4, 0, 1 ч, 10 ч, 24 ч.

9 – WT.

Кинетические кривые димеризации C- и N-концевого мутантов казеина были получены методом интегрирования оптической плотности соответствующих полос на ДСН-электрофорезе с помощью программы OneDScan. Описание полученных данных было проведено методом нелинейной регрессии. Кинетические кривые димеризации аппроксимировались уравнением, соответствующим зависимости концентрации продукта реакции первого порядка от времени: A=a(1-e-kt). Результаты аппроксимации представлены в таблице 1, из которой следует, что при 25С C-концевой мутант димеризуется примерно в 10 раз быстрее, чем N-концевой. При температуре 60С константы скорости димеризации различаются еще сильнее (почти в раз).

Таблица 1. Оценочные значения констант скорости димеризации мутантов казеина при различных температурах.

k, мин- Tемпература, C Мутант С4 Мутант С 25 0,004 0, 60 0,008 0, Таким образом, при температурах 25 и 60C димеризация С-концевого мутанта С208 происходит значительно эффективнее, чем N-концевого мутанта С4. При этом при температуре 4C разница в скорости нивелируется (результат не показан). Логично предположить, что при димеризации N-концевого мутанта С4 взаимодействие молекул будет осложнено электростатическим отталкиванием одноименно заряженных участков, тогда как димеризация С концевого мутанта будет облегчена гидрофобными взаимодействиями. При понижении температуры они ослабляются и скорость димеризации падает (Рис. 2).

Рис. 2. Схема димеризации цистеинилированных мутантов Следует отметить, что двойной мутант -казеина С4-208 обладает высокой реакционной способностью. Уже при растворении белок обнаруживается в различных полимерных формах, а через 2 часа мономерная форма практически исчезает. По всей видимости, такой белок может формировать длинные цепочки, образуя сшитые полимеры c высокой степенью полимеризации (данные не представлены).

2. Влияние димеризации мутантных форм -казеина на его структуру и мицеллизацию Спектры кругового дихроизма нативного и рекомбинантных казеинов имеют типичную для неструктурированных белков форму, свидетельствующую о наличии небольшого количества -спиралей и -слоев. Разложение спектров на составляющие для получения информации о влиянии димеризации и мицеллизации на вторичную структуру -казеина проводили с помощью K2D Интернет-ресурса (http://www.embl-heidelberg.de/~andrade/k2d/). Поскольку данный метод предназначен для структурированных белков, применять его для количественной оценки вторичной структуры развернутых белков следует с осторожностью, трактуя результаты скорее как показатель качественных изменений и тенденций. На Рис. 3 представлено разложение спектров КД для мономерных (при 10С) и мицеллярных (при 38С) форм нативного и рекомбинантных -казеинов. Несмотря на приблизительность количественной оценки, можно сказать, что димеризация и полимеризация приводит к увеличению содержания -спиралей в структуре белка для всех мутантных форм в немицеллярном состоянии. Одновременно снижающееся количество слоев указывает на то, что не происходит структуризации по амилоидному типу, для которой характерно их повышение. При повышении температуры до 38C равновесие между мономерной и мицеллярной формой смещается в сторону мицелл. На Рис. 3 можно видеть, что в мицеллярной форме соотношение количества элементов вторичной структуры у мутантных белков близко к нативной форме -казеина.

% структуры Натив. WT C4 C208 C4- Натив. WT C4 C208 C4- Рис. 3. Разложение КД спектров разных форм -казеина в немицеллярной (слева) и в мицеллярной (справа) форме С помощью метода динамического лазерного светорассеяния было изучено влияние димеризации на формирование казеином мицелл.

Гидродинамический диаметр мономеров казеина составляет около 7 нм, а диаметр образующихся мицелл составляет примерно 24-26 нм (Рис. 4).

Можно видеть, что отсутствие фосфорилирования у рекомбинантного казеина практически не отражается на способности к мицеллизации, незначительно увеличивая температуру перехода в мицеллярное состояние. N концевой мутант С4 демонстрирует отсутствие влияния димеризации на кривую мицеллизации.

При этом димеризация по С-концевому остатку цистеина (мутант С208) приводит к ощутимому облегчению мицеллизации по сравнению с диким типом. Эффект снижения температуры мицеллизации снимается добавлением -меркаптоэтанола.

Двойной мутант эффективно полимеризуется, обнаруживая на электрофорезе различные олигомеры. При этом кривая его мицеллизации значительно сдвинута в сторону меньших температур;

фактически с 10-15C белок представлен в растворе в виде самоассоциатов.

D, нм D, нм Нативный WT H WT H C WT + bME C4+bME 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 Температура, С Температура, С 20 D, нм 15 D, нм WT WT H H 10 C208 C4- C208 +bME C4-208 + bME 5 0 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 0 Температура, С Температура, С Рис. 4. Кривые мицеллизации -казеинов, полученные с помощью метода динамического лазерного светорассеяния.

3. Исследование действия гомоцистеинтиолактона на нативные S1-, - и -казеины Полученные мутанты -казеина с внедренными остатками цистеина не демонстрировали склонности к агрегации, поэтому чтобы исследовать влияние образования дисульфидных связей на агрегацию, мы использовали модификацию гомоцистеинтиолактоном. Такая модификация – аминогрупп лизина в белке гомоцистеинтиолактоном приводит к внедрению гомоцистеина в последовательность белка. Особенности гомоцистеинилирования естественно развернутых белков были исследованы нами в данной части работы, в том числе, на примере трех основных молочных казеинов: S1-, - и -казеинов. С одной стороны, все три исследованных нами казеина относятся к группе белков с частично неупорядоченной структурой (Thorn et al., 2008;

Tompa, 2002), а с другой - представляют три принципиально разных класса неупорядоченных белков: S1-казеин не образует мицелл, -казеин хотя и не образует мицелл, но может димеризоваться или олигомеризоваться за счет присутствия сульфгидрильных групп, а -казеин формирует мицеллы благодаря своей амфифильности (Horne, 2002), а также считается "реоморфным", то есть подстраивающим структуру под окружение, белком (Holt and Sawyer, 1988).

Таким образом, использование трех разных классов естественно развернутых белков позволяет оценить вклад структурной организации белковых и надбелковых структур в формирование агрегатов.

При гомоцистеинилировании нативных S1-, - и -казеинов на электрофореграмме (Рис. 5) можно видеть образование различных олигомеров, в том числе крупных агрегатов, едва входящих в концентрирующий гель. При этом практически весь белок обнаруживается в осадке. Поскольку эффект снимается добавлением -меркаптоэтанола, можно сказать, что наблюдаемая агрегация вызвана образованием дисульфидных связей. В процессе модификации раствор становится опалесцирующим, при этом не происходит беспорядочной агрегации по типу преципитации. Полученные частицы имеют размер несколько микрометров, что несколько выходит за рабочий диапазон прибора, используемого для измерения ДЛС (данные не показаны).

Рис. 5. Гомоцистеинилирование S1-казеина (A), -казеина (Б), -казеина (В) было проведено инкубацией казеинов (1 мг/мл) в 25 мМ фосфатном буфере, рН 7,5, с гомоцистеинтиолактоном в течение 24 часов. 1: контрольные казеины, 2: казеины, модифицированные 10-кратным избытком (в расчете на остаток лизина) гомоцистеинтиолактона, 3: казеины, модифицированные 100-кратным избытком (в расчете на остаток лизина) гомоцистеинтиолактона, 4: казеины, модифицированные 100-кратным избытком (в расчете на остаток лизина) гомоцистеинтиолактона с последующим восстановлением -меркаптоэтанолом (720 мМ).

Определение количества остатков гомоцистеина, включенных в -казеин после 120 минутной инкубации с 100-кратным избытком гомоцистеинтиолактоном, проводили с помощью титрования сульфгидрильных групп ДТНБ. Для этого модифицированный -казеин обрабатывали 8М гуанидингидрохлоридом, затем подвергали обессоливанию на колонке PD-10 для удаления остатков свободного гомоцистеина и непрореагировавшего тиолактона. Полученный белок инкубировали в присутствии 2 мМ -меркаптоэтанола в течение часа при температуре 40С для восстановления сульфгидрильных групп остатков гомоцистеина, и снова подвергали обессоливанию.

Было показано, что в этих условиях при гомоцистеинилировании казеина в среднем на молекулу белка приходится 1,5 + 0,1 SH-группы, что свидетельствует о включении около 1,5 остатков гомоцистеина на мономер казеина. Однако, на самом деле эффективность включения может быть несколько выше, так как часть агрегатов не растворяется даже в 8М гуанидингидрохлориде и не может быть проанализирована в этом эксперименте.

Полученные с помощью разных флуоресцентных методов данные также указывают на то, что гомоцистеинилирование приводит к изменениям в структуре казеинов.

Казеины имеют остаток триптофана в С-концевой области (-казеин один в 157 положении, -казеин - один в 97 положении, S1-казеин - два остатка, в 179 и 214 положении), что делает возможным измерение максимума длины волны свечения триптофана (Trp макс). Таким образом, можно наблюдать структурные изменения, связанные с поведением белка в процессе агрегации: смещение в синюю область указывает на изменения в окружении триптофана, которое становится более гидрофобным.

Для анализа влияния мицеллизации на характер модификации было проведено гомоцистеинилирование -казеина при разных температурах (10С мономер, 50С - мицеллы). Препараты S1- и -казеинов не образуют мицелл, но измерение также проводили при двух температурах. S1-Казеин использовали в качестве контроля, а -казеин – с целью более однозначной интерпретации данных по индустриальному -казеину, содержащему примесь -казеина.

Было показано, что в случае S1-казеина сдвиг максимума флуоресценции практически отсутствует при обеих температурах. Для исходного очищенного -казеина характерно более гидрофильное окружение остатков триптофана, что свидетельствует об их экспонировании в раствор, а при гомоцистеинилировании наблюдается сдвиг максимума флуоресценции в синюю область (Рис. 6), особенно при высокой температуре, способствующей мицеллообразованию и формированию крупных агрегатов.

Рис. 6. Расположение максимума собственной флуоресценции триптофана в гомоцистеинилированных казеинах.

В препаратах -казеина триптофан исходно находится в более гидрофобном окружении, чем в двух других казеинах, а введение гидрофильных остатков гомоцистеина приводит к выраженному сдвигу в красную область. Таким образом, гомоцистеинилирование приводит к изменению окружения триптофана у S1- и -казеинов на более гидрофобное.

Флуоресцентный краситель тиофлавин Т является маркером амилоидогенных структур, однако также считается, что он способен связываться с мицеллярными формами белков (Kumar et al., 2008). При гомоцистеинилировании казеинов наблюдается значительное увеличение интенсивности флуоресценции связанного с белком тиофлавина Т (спектры не приведены). Центрифугирование и последующий анализ фракций показывает, что связанная форма значительно преобладает в осадке, то есть в полученных агрегатах, так как интенсивность флуоресценции в супернатанте незначительно отличается от контрольной.

Для связавшегося тиофлавина Т при взаимодействии с амилоидными структурами наблюдается характерный красный сдвиг, причем у казеинов максимум сдвигается сильнее в красную область, по сравнению с известным для амилоидных белков сдвигом максимума флуоресценции до 480 нм (Ban et al., 2003). Полученные с помощью флуоресценции тиофлавина Т данные косвенно свидетельствуют об амилоидоподобном изменении структуры агрегатов казеина при образовании дисульфидных связей.

Известно, что при связывании ароматического хромофора 1-анилино-8 нафталенсульфоната (ANS) с неполярными областями белка его спектр сдвигается в синюю область и интенсивность флуоресценции значительно возрастает (Matulis et al., 1999;

Slavik, 1982). Сильное сродство ANS к белку в состоянии расплавленной глобулы обусловлено потерей третичной структуры (Semisotnov et al., 1991). Из приведенных на Рис. 7 данных следует, что для нативных казеинов наиболее значительное увеличение интенсивности флуоресценции ANS происходит в присутствии нативного S1-казеина.

Гомоцистеинилирование всех исследованных казеинов приводит к выраженному увеличению интенсивности флуоресценции ANS и синему сдвигу максимума испускания (Таблица 2), что свидетельствует о повышении доступности для красителя неполярных областей, и, соответственно, об увеличении вероятности агрегации казеинов.

Таблица 2. Сдвиги максимумов флуоресценции ANS при связывании с гомоцистеинилированными казеинами.

Максимум флуоресценции ANS после связывания с гомоцистеинилированными казеинами.

max ANS + контрольный казеин, max ANS + модиф. при 50C казеин, нм нм S1-казеин 508.4 ± 0.3 500.3 ± 0. - казеин 527.8 ± 0.1 504.3 ± 0. i- казеин 524.5 ± 0.1 505.6 ± 0. -казеин 519.6 ± 0.1 512.5 ± 0. Рис. 7. Значение интенсивности флуоресценции свободного и казеин-связанного ANS при длине волны 480 нм (не максимум).

Известно, что спектр поглощения красителя Конго Красного изменяется при взаимодействии с амилоидными фибриллами – максимум поглощения сдвигается от 498 нм в красную сторону на 40-50 нм (Frid et al., 2007;

Puchtler and Sweat, 1965). Мы исследовали образцы всех казеинов после модификации гомоцистеинтиолактоном.

Было показано, что у всех гомоцистеинилированных в описанных выше условиях казеинов пик свободного Конго Красного пропадает, однако выраженных изменений спектральных характеристик выявить не удается.

Исключением является -казеин, для которого ранее была показана способность к формированию амилоидных фибрилл (Ecroyd et al., 2008;

Lencki, 2007). В течение нескольких часов после начала модификации -казеина гомоцистеинтиолактоном не удается выявить выраженных изменений спектра поглощения Конго Красного. Однако более длительная модификация (24 часа) -казеина приводит к появлению четко выраженного пика поглощения с максимумом около 540 нм (Рис. 8), что указывает на постепенное формирование амилоидных структур.

свободный Конго красный контрольный казеин + Конго красный казеин модиф. 3 часа + Конго красный 0. Оптическая плотность казеин модиф. 24 часа + Конго красный Рис. 8. Спектры поглощения Конго 0. Красного при связывании с гомоцистеинилированным -казеином.

0. 0. 0. 400 450 500 550 600 650 Длина волны, нм Для исследования морфологии полученных после гомоцистеинилирования агрегатов казеинов была использована флуоресцентная микроскопия в присутствии тиофлавина Т и электронная микроскопия.

В случае S1- и -казеинов наблюдаются практически только крупные частицы правильной сферической формы, диаметром 2-3 микрометра (по данным флуоресцентной микроскопии). У -казеина характер агрегации несколько другой: популяция агрегатов более разнородна, наряду с крупными встречаются также более мелкие агрегаты неправильной формы (данные флуоресцентной микроскопии, Рис. 9А). На Рис. 9Б-9Г показаны результаты электронной микроскопии для гомоцистеинилированного -казеина. В данном случае можно видеть разную степень агрегации, от пучка фибрилл длиной несколько сотен нанометров до более крупных агрегатов.

Эти данные позволяют сделать заключение, что агрегация -казеина идет по амилоидному пути, что согласуется с отсутствием сдвига максимума собственной флуоресценции триптофана для этого типа казеина и с данными о формировании после гомоцистеинилирования амилоидных фибрилл (по данным об изменении спектров поглощения Конго Красного).

Рис. 9. Флуоресцентная (А) и электронная (Б-Г) микроскопия гомоцистеинилированного -казеина Т после 24-часовой реакции с гомоцистеинтиолактоном при 37С 4. Исследование действия различных концентраций фосфатидилинозитола на мономерную и олигомерную форму приона В данной части работы мы попытались исследовать, по какому пути идет агрегация в случае термообработки и при взаимодействии прионов с фосфолипидами.

Из литературы известно, что при определенных условиях термообработки должны образовываться промежуточные малые олигомеры приона, проявляющие нейротоксичные свойства (Silveira et al., 2005;

Simoneau et al., 2007). С помощью метода ДЛС было показано, что при термообработке при 65C в течении часа 60мкM раствора приона в 20мМ MOPS буфере, pH 7,2, образуются термоагрегаты размером около 7,5 нм (Рис.10, слева).

Интенсивность флуоресценции термоагрегат приона 2.5x мономер приона 2.0x 4,8 нм Число частиц, % 1.5x термоагрегат приона 7,5 нм 25 1.0x мономер приона 5.0x 10 0. 460 480 500 520 540 560 580 Длина волны, нм 0 10 20 Гидродинамический диаметр, нм Рис. 10. Характеристика используемых малых олигомеров приона. Показаны гидродинамический диаметр (слева, ДЛС) и спектры флуоресценции тиофлавина Т (справа) условных единицах) для нативного (пунктирная линия) и термоагрегированного при 65C в течении часа 60мкM приона в 20мМ MOPS буфере, pH 7,2.

Как уже было сказано, одним из методов, свидетельствующих об амилоидогенности белка, является флуоресценция связанного тиофлавина Т. На Рис. 10 можно видеть, что термоагрегированные малые олигомеры приона связывают тиофлавин Т и вызывают его флуоресценцию.

Для исследования взаимодействий приона и липидов был выбран фосфатидилинозитол, заметно стимулирующий агрегацию приона. Было исследовано влияние концентрации фосфатидилинозитола на размеры таких агрегатов. Было установлено, что 0,5 мкМ ФИ не изменяет размер олигомеров.

Инкубация приона с 5 или 500 мкМ фосфатидилинозитола вызывает увеличение размера частиц до 200 и 250 нм, соответственно (рис. 11).

Инкубация с 500 мкМ ФИ приводит к существенному росту наблюдаемого размера мицелл с 8,7 до 50 нм (рис. 11). Таким образом, при инкубации с высокими концентрациями фосфатидилинозитола образуются смешанные мицеллы, предохраняющие прион от избыточной агрегации.

Рис. 11. Гидродинамический диаметр частиц, образующихся при взаимодействии нативного мономера приона (слева) и малых олигомеров приона (справа) с фосфатидилинозитолом (ФИ) в разных концентрациях.

Изучение вторичной структуры агрегатов приона показало практически полное сохранение -спиральных структур в крупных агрегатах, получаемых при взаимодействии приона с 0,5 или 5 мкМ фосфатидилинозитола. Напротив, небольшие агрегаты, получаемые в присутствии 500 мкМ ФИ демонстрируют повышенное содержание -структур (Таблица 3), характерное для амилоидных форм приона. Таким образом, обширная агрегация в случае применения 0,5 или 5 мкМ фосфатидилинозитола ингибирует образование элементов -структуры, либо дестабилизирует ее. Образование элементов -структуры более эффективно происходит в небольших агрегатах. Это может быть общим свойством приона, поскольку такой же структурный переход наблюдается у небольших агрегатов приона, связанных с медью (Tsiroulnikov et al., 2006).

Таблица 3. Характеристическое для -слоев соотношение 218нм/207нм для системы прион - фосфатидилинозитол.

Концентрация 218нм/207нм фосфатидилинозитола, мкM 0 0, 0,5 0, 5 1, 500 1, Полученные результаты показывают, что в зависимости от концентрации, фосфолипиды могут совершенно по-разному влиять на образование амилоидных структур.

5. Модификация приона гомоцистеинтиолактоном В данной части работы перед нами стояла задача проверить, вызывает ли гомоцистеинилирование амилоидогенную агрегацию приона, а также изучить влияние образования дисульфидных связей на агрегацию приона.

Рис. 12. Электрофореграмма фракций приона при гомоцистеинилировании 100 кратным избытком тиолактона.

1 – нативный прион до модификации, 2 – супернатант после модификации, 3 – осадок после модификации, 4 – осадок после модификации при обработке -меркаптоэтанолом Нами было показано, что при добавлении гомоцистеинтиолактона к раствору приона происходит его агрегация, проявляющаяся в увеличении мутности раствора. На Рис. 12 можно видеть, что при анализе осадка с помощью ДСН-электрофореза по Лэммли в невосстанавливающих условиях (дорожка 3) прион обнаруживается в виде мономеров, димеров и других олигомеров. В то же время, в супернатанте прион остается в такой же мономерной форме, как и в контрольном образце. Эти данные свидетельствуют о том, что при гомоцистеинилировании приона происходит ассоциация белковых молекул за счет образования дисульфидных связей между SH группами включенных в состав белка остатков гомоцистеина. В аминокислотной последовательности приона насчитывается 10 остатков лизина, следовательно, можно предполагать множественное гомоцистеинилирование. Все полученные эффекты исчезают при добавлении в пробы для электрофореза -меркаптоэтанола.

Было показано, что в этих условиях при гомоцистеинилировании приона в среднем на молекулу белка приходится 1,9+0,1 SH-группы, что свидетельствует о включении около 2 остатков гомоцистеина на мономер казеина. Однако, на самом деле эффективность включения может быть несколько выше, так как часть агрегатов не растворяется даже в 8М гуанидингидрохлориде и не может быть проанализирована в этом эксперименте. Проведение аналогичных манипуляций с контрольным немодифицированным прионом показало, что восстановление 5 мМ меркаптоэтанолом не приводит к восстановлению внутренней дисульфидной связи между двумя собственными цистеинами в составе приона.

Для подтверждения включения гомоцистеина в молекулы приона был проанализирован димерный продукт реакции гомоцистеинилирования в сравнении с контролем методом масс-спектрометрического анализа (MALDI TOF). Результаты анализа представлены на Рис.13. Для модифицированного приона после расщепления трипсином предполагали наличие пептидов с массой, отличающейся от такого же контрольного на массу гомоцистеина.

Рис. 13. Подтверждение наличия модификации с помощью масс-спектрометрии.

Анализ последовательности овечьего приона (база данных SwissProt, № P23907) [www.expasy.org] с помощью полученных после MALDI-TOF фрагментов.

Все возможные сайты расщепления трипсином указаны стрелками. Лизины отмечены серым цветом, модифицированный 197 остаток лизина обведен. Последовательность 41-159 а.о., недоступная для анализа вследствие ограничений данного метода, подчеркнута.

В связи с ограничениями метода, из присутствующих в прионе остатков при данном методическом подходе можно определить гомоцистеинилирование только 5 остатков – 26, 29 и 188, 197, 207.

Нами было обнаружено гомоцистеинилирование по 197, 207 и, возможно, 188 остаткам лизина, причем модификации подвергалась только часть остатков в популяции молекул приона. Очевидно, что такая модификация является достаточной для образования димеров, которые были подвергнуты анализу.

Возможно, что более крупные ассоциаты гомоцистеинилированных прионов подвергаются более полной модификации.

Агрегацию приона исследовали методом ДЛС. На Рис. 14. можно видеть, что модификация в условиях 100-кратного избытка гомоцистеинтиолактона на остаток лизина белка ведет к образованию крупных (с гидродинамическим диаметром около 1000 нм) агрегатов приона. Образование агрегатов не является следствием изменения окружения белковых молекул, так как использование в качестве контроля аналогичных количеств цистеина не привело к увеличению размера частиц (данные не показаны). При использовании более низких концентраций (50-кратный избыток гомоцистеинтиолактона на остаток лизина белка) реагента, размер агрегатов несколько уменьшается (до нескольких сотен нанометров), а при использовании 25-кратного избытка в кинетике реакции появляется лаг-период, то есть агрегаты начинают появляться только после часа инкубации с реагентом.

При исследовании поведения приона в условиях 10-кратного избытка реагента на остаток лизина, было показано, что в таких условиях не происходит агрегации.

Рис. 14. Гидродинамический диаметр Гидродинамический диаметр, нм гомоцистеинилированного при разных концентрациях гомоцистеинтиолактона (1 10-кратный избыток в расчете на остаток лизина белка, 2 - 25-кратный, 3 - 50-кратный, 4 - 100-кратный) приона, полученный с помощью метода динамического светорассеяния.

0 20 40 60 80 Время, мин 6. Исследование амилоидогенной конверсии, вызванной гомоцистеинилированием Для детекции изменений в структуре модифицированного приона был использован метод инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (Рис. 15). В спектре белка анализировали первую амидную полосу 1610 1690 см-1, которая соответствует колебаниям связи С=О. Из полученных спектров видно, что нативный прион дает широкий пик с максимумом на см-1, что соответствует наличию -спиралей и неорганизованной структуры.

На спектре гомоцистеинилированного приона появляются две полосы, расположенные на 1617 и 1678 см-1, которые показывают наличие антипараллельных -слоев. В то же время интенсивность полосы, характеризующей -спирали и неорганизованную структуры, снижается.

Расположение пика ниже 1620 см-1 говорит о формировании более сильных водородных связей в межмолекулярных -слоях, что является характеристичным признаком для амилоидных структур (Nilsson, 2004).

Модификация 10-кратным избытком гомоцистеинтиолактона ведет к значительным изменениям во вторичной структуре белка.

- длина волны /см - 1.5x 2,5x Поглощение Интенсивность флуоресценции - 1.0x Термоагрегированный прион 2,0x10 Прион + 100-кратный реагент - 5.0x 1,5x 0. - 3.0x 1,0x Прион + 10-кратный реагент 2 производная Прион 5,0x 0. 0, 460 480 500 520 540 560 580 - -3.0x HCys HCys - длина волны /см Рис. 15. Характеристика амилоидогенных изменений в структуре гомоцистеинилированного приона. Показаны ИК-спектры (слева, модифицированный прион показан толстой линией) и спектры флуоресценции тиофлавина Т (справа) для нативного и модифицированного приона.

На Рис. 15 (справа) представлены спектры флуоресценции тиофлавина Т гомоцистеинилированных белков при возбуждении светом с длиной волны нм. В случае модификации приона 100-кратным избытком гомоцистеинтиолактона в расчете на остаток лизина можно видеть интенсивность флуоресценции, сопоставимую с контрольной, то есть можно сделать вывод, что гомоцистеинилирование приводит к амилоидогенной конверсии белка.

Протеолиз протеиназой К является одним из индикаторов перехода приона в патологическую конформацию, так как обогащенная -слоями форма демонстрирует повышенную устойчивость к расщеплению этим ферментом.

Мы исследовали активность расщепления протеиназой К гомоцистеинилированного приона в сравнении с термоагрегированным, также как в случае измерения флуоресценции тиофлавина Т. Было показано, что модификация приона приводит к заметному увеличению устойчивости белка (Рис. 16) Рис. 16. Устойчивость гомоцистеинилированного приона к расщеплению протеиназой К При анализе трехмерной структуры структурированной части последовательности приона обнаружено, что все остатки лизина экспонированы в раствор и доступны для модификации. Два из них участвуют в поддержании структуры белка - лизин 207 образует солевой мостик с глутаматом 207, повышая стабильность 3-ей спирали (Рис. 17). Лизин взаимодействует с глутаматом 199, поддерживая конформацию петли. Сравнив структуры мономерной и димерной формы приона, можно предположить, что при димеризации изменяется конформация именно этой петли. Таким образом, модификация лизина 197 должна приводить к дестабилизации нативной конформации приона и облегчать ее переход в патологическую форму.

Учитывая важность 197 и 207 лизинов в поддержании нативной структуры приона и полученные масс-спектрометрические данные, подтверждающие наличие модификации 197 и 207 лизинов, можно предположить, что возможный механизм перехода приона в амилоидную форму при гомоцистеинилировании включает участие этих остатков.

Рис. 17. Трехмерная структура структурированного участка приона (PDB ID 1uw3) ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе было охарактеризовано влияние образования дисульфидных связей на агрегацию и структуру естественно развернутых белков приона и казеина.

В экспериментах с очищенными препаратами рекомбинантных форм казеина было показано, что при внедрении цистеина -казеин приобретает способность к димеризации, причем С-концевой мутант димеризуется легче, чем N-концевой. Использование гомоцистеинилирования, как инструмента для внедрения большего количества цистеинов, позволило выявить особый характер агрегации казеинов, являющихся представителями группы естественно развернутых белков. Так, при гомоцистеинилировании -казеин демонстрирует амилоидный тип агрегации и формирует фибриллы.

Для рекомбинантного овечьего приона было проведено исследование агрегации под действием таких факторов, как температура, различные концентрации фосфолипидов и гомоцистеинилирование. Данное исследование позволило установить, что, в зависимости от концентрации, фосфолипиды способны направлять агрегацию приона по разным путям: как с патологическим изменением структуры, так и без возникновения изменений такого рода.

Показанное в данной работе амилоидогенное влияние гомоцистеинилирования на агрегацию приона позволяет предположить провоцирующее влияние гомоцистеина, опосредованное через гомоцистеинтиолактон, на появление патологических амилоидогенных агрегатов приона.

ВЫВОДЫ 1. При введении остатков цистеина в -казеин он приобретает способность к димеризации, причем С-концевой мутант С208 димеризуется более эффективно, чем N-концевой С4.

2. Гомоцистеинилирование нативных S1- и -казеинов приводит к формированию крупных сферических агрегатов, содержащих казеины с измененной структурой, а гомоцистеинилированный -казеин демонстрирует амилоидоподобные свойства и формирует фибриллы.

3. Термоагрегация приона приводит к амилоидогенной трансформации через образование малых олигомеров.

4. В зависимости от концентрации, фосфатидилинозитол может либо приводить к амилоидогенной агрегации приона в случае мицеллярных концентраций (500 мкМ), либо вызывать образование крупных аморфных агрегатов с неизмененной структурой для концентраций 0,5 – 50 мкМ.

5. Гомоцистеинилирование приона приводит к агрегации, сопровождающейся изменениями структуры амилоидогенного характера.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ТО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Tsiroulnikov K., Shchutskaya Y., Muronetz V., Chobert J.M., Haertle T.

(2009). Phospholipids influence the aggregation of recombinant ovine prions. From rapid extensive aggregation to amyloidogenic conversion. Biochim Biophys Acta, 1794(3), 506-511.

Yousefi R., Shchutskaya Y.Y., Zimny J., Gaudin J.C., Moosavi-Movahedi A.A., Muronetz V.I., Zuev Y.F., Chobert J.M., Haertle T. (2009). Chaperone-like activities of different molecular forms of beta-casein. Importance of polarity of N terminal hydrophilic domain. Biopolymers, 91(8), 623-632.

Gaudin J.C., Le Parc A., Castrec B., Ropers M.H., Choiset Y., Shchutskaya J., Yousefi R., Muronetz V.I., Zuev Y., Chobert J.M., Haertle T. (2009). Engineering of caseins and modulation of their structures and interactions. Biotechnol Adv, 27(6), 1124-1131.

Щуцкая Ю.Ю., Эртле Т., Муронец В.И. Гомоцистеинилирование как физиологическая модификация приона с амилоидогенным эффектом. (2009) Тезисы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, с. 367.