Георгий владимирович применение лазерной сканирующей микроспектрометрии для решения задач аналитической цитометрии
на правах рукописи
УДК 57.086.2 Шаронов Георгий Владимирович ПРИМЕНЕНИЕ ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ЦИТОМЕТРИИ 03.00.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва – 2006 2 Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).
Научный консультант:
кандидат физико-математических наук, Феофанов Алексей Валерьевич старший научный сотрудник Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, Шайтан Константин Вольдемарович профессор, зам. заведующего Кафедрой биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова доктор биологических наук, профессор, заведующий Лабораторией Деев Сергей Михайлович молекулярной иммунологии ИБХ РАН ФГОУ ВПО "Московская государственная академия ветеринарной
Ведущая организация:
медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина"
Защита состоится «_» _ 200 г. в _ часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9, тел.: (495) 408-57-00, 408-56-27.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).
Автореферат разослан «_»_ 200 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета К 212.156. к.ф.-м.н., доцент Брагин В.Е.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Введение. Актуальность проблемы Известно, что клеточные процессы тонко контролируются множеством биохимических составляющих. Понимание механизмов взаимодействия между этими составляющими позволяет развивать современные знания клеточной биологии и влиять на биологические процессы с помощью биологически активных соединений (БАС). Живую систему с большим числом взаимодействующих компонент практически невозможно воспроизвести в растворе, поэтому наиболее достоверным источником знаний являются живые клетки и организмы.
Основным методом анализа живых клеток уже на протяжении более 300 лет является микроскопия, успехи которой во многом определяют прогресс клеточной биологии.
Стремительное развитие химии флуоресцентных соединений и технологии флуоресцентных белков открывает широкие возможности для изучения БАС в живых объектах. В связи с этим, актуальным является разработка новых информативных методик флуоресцентной микроскопии.
Сегодня микроскопия не ограничивается визуализацией объекта, а является мощным аналитическим инструментом, который позволяет измерять с субклеточным разрешением такие параметры, как резонансный перенос энергии флуоресценции, время жизни флуоресценции и скорость восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. Эти методики дают возможность определять подвижность БАС, выявлять их взаимодействия с компонентами клетки, избирательно регистрировать наличие контактов между двумя БАС, измерять рH и концентрацию ионов в микроокружении БАС, что значительно увеличивает информативность флуоресцентной микроскопии. Еще одной возможностью увеличить информативность является применение в микроскопии спектрального анализа. Метод, который получил название микроспектрометрии, базируется на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта полных спектров флуоресценции. За счет регистрации полных спектров флуоресценции микроспектрометрия позволяет:
- использовать одновременно большое количество флуорофоров;
- избирательно выделять и анализировать спектры отдельных флуорофоров среди множества;
- точно измерять интенсивность флуоресценции и содержание флуорофора в каждой точке объекта;
- выявлять молекулярные взаимодействия флуорофора с компонентами клетки.
Микроспектрометрия не заменяет другие современные методики флуоресцентной микроскопии, а придает им дополнительную точность и информативность. Точное и избирательное измерение спектров флуоресценции позволяет относительно легко идентифицировать в клетке места, в которых присутствует эффект резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя БАС, что также возможно с применением и других, но трудоемких или требующих технически сложной аппаратуры методов флуоресцентной микроскопии. С помощью микроспектрометрии можно измерять физико-химические параметры отдельных клеток, что является задачей цитометрии, и на основании чего нами предложено название метода этих измерений – микроспектроцитометрия (МСЦ). В МСЦ, как и во всех других методиках цитометрии, для получения статистически достоверного результата требуется анализ ограниченной выборки клеток.
Разработка методики МСЦ является одним из путей решения актуальной проблемы увеличения информативности флуоресцентной микроскопии, и будет способствовать новым достижениям в клеточной биологии и молекулярной медицине.
Цель и задачи исследования Целью данной работы является разработка методик МСЦ и их применение для исследования БАС. Для этого были поставлены следующие задачи: (1) разработка универсальных методик расчета внутриклеточных концентраций и анализа внутриклеточного окружения флуоресцирующих БАС, применимых для решения задач аналитической цитометрии;
(2) применение МСЦ для исследования взаимосвязей между структурой и фотобиологическими свойствами фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных производных хлорина р6 (ЦИХЛ) и бактериохлорина р (ЦИБХЛ) и определения ключевых факторов, влияющих на их фотоиндуцированную активность;
(3) применение МСЦ для изучения механизма фотоиндуцированной гибели клеток, содержащих ЦИХЛ;
(4) исследование особенностей апоптоза, индуцированного введением в цитоплазму клеток цитохрома с и его мутантных вариантов;
(5) идентификация первичных мишеней действия иммуномодулятора полиоксидония в лейкоцитах периферической крови человека методом МСЦ;
(6) изучение функциональной активности и механизма действия цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana, Naja haje и Naja kaouthia в отношении опухолевых клеток и клеток крови.
Методы исследования В работе использовался метод микроспектрометрии, а также традиционные методы спектрофотометрии, флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Флуоресцентные изображения анализировали с помощью программ обработки и анализа изображений.
В работе исследовались следующие БАС: ЦИХЛ, ЦИБХЛ, цитохром с и его генно инженерные мутантные формы, цитотоксины из яда кобр Naja hajе, Naja oxiana, Naja kaouthia, иммуномодулятор полиоксидоний. Основными биологическими объектами, на которых проводились исследования, были культуры раковых клеток и клетки крови.
Научная новизна работы Разработан оригинальный метод МСЦ для анализа распределения БАС и физико химических параметров клеток. Этот метод впервые применен для изучения механизма фотодинамической активности новых групп фотосенсибилизаторов и факторов, определяющих их фотодинамическую активность. Сравнительный анализ фотосенсибилизаторов позволил впервые установить связь фотодинамической активности ЦИХЛ и ЦИБХЛ с уровнем и кинетикой внутриклеточного накопления, локализацией внутри клетки и способностью образовывать активные формы кислорода, а также определить боковые заместители, введение которых позволяет добиться наилучших значений этих параметров. Впервые была разработана процедура введения в клетки экзогенного цитохрома с с помощью электропорации, которая не травмирует клетки и позволяет индуцировать апоптоз в 80 % клеток. С использованием этой процедуры и метода МСЦ впервые измерена цитоплазматическая концентрация цитохрома с, необходимая для активации апоптоза, и найдена аминокислотная замена, которая полностью подавляет проапоптотическую активность цитохрома с. Применение МСЦ позволило впервые идентифицировать потенциал чувствительные спектральные изменения родамин 123, на основании которых можно характеризовать трансмембранный потенциал митохондрий точнее, чем на основе интегральной интенсивности флуоресценции. С помощью МСЦ впервые изучен механизм интернализации и локализация цитотоксинов из яда кобр Naja hajе, Naja oxiana, Naja kaouthia в раковых клетках. Разработанная методика измерений в реальном времени на основе МСЦ позволила впервые зарегистрировать эффект резкого усиления связывания цитотоксина на мембране клеток, предшествующего лизису клетки, и предположить взаимосвязь между литической активности цитотоксинов и липидным составом клетки.
Практическая значимость Исследованные в работе фотосенсибилизаторы обладают оптимальными оптическими и функциональными характеристикам, и поэтому являются одними из наиболее перспективных для фотодинамической терапии рака. В настоящее время в МНИОИ им. П.А.
Герцена ведутся исследования ЦИХЛ и ЦИБХЛ на животных. Установленные в настоящей работе связи между структурной и свойствами этих соединений являются основой для оптимизации свойств фотосенсибилизаторов in vivo. Разработанная методика индукции апоптоза экзогенным цитохромом с может служить основой для создания процедуры клинической диагностики молекулярных нарушений апоптоза, ключевого механизма поддержания гомеостаза тканей. Результаты исследования проапоптозной активности цитохрома с и его мутантных вариантов могут быть использованы исследователями, которые изучают функцию и механизм апоптоза in vivo для генно-инженерного регулирования цитохром с-опосредованного механизма апоптоза. Полиоксидоний является препаратом, на основе которого в настоящее время в ГНЦ Институте иммунологии МЗ РФ разрабатываются вакцины нового поколения. Поэтому данные о взаимодействии полиоксидония с клетками крови полезны для разработчиков новых иммуномодулирующих препаратов. Полученные данные о механизме действия цитотоксинов из яда кобр могут быть использованы для управления активностью этих соединений и создания на их основе препаратов направленного действия, например для химиотерапии рака.
Полученные результаты представляют практический интерес при коммерческой разработке отечественного лазерного сканирующего конфокального микроскопа с возможностью спектрального анализа и программного обеспечения к нему. Разработанные подходы могут быть использованы в лабораториях, занимающихся исследованиями БАС с применением методов оптической микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на 20-й Международной конференции по фотохимии (Москва 2001);
Симпозиуме, посвященном оптической диагностике в медицине (Реймс, Франция, 2002);
10-ом Конгрессе Европейского общества фотобиологов (Вена, Австрия, 2003);
9-й Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль, 2003);
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2003);
Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003);
докладывались автором в виде устных сообщений на Международной конференции по супрамолекулярной химии и технологиям (Прага, Чехия, 2004);
Международных конференциях по физико-химической биологии, посвященных памяти академика Ю.А.
Овчинникова (Москва, 2002, 2004);
на научных семинарах лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (Москва, 2003 - 2006).
Публикации Основные результаты диссертации изложены в 10 научных статьях и 14 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.
Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и выводов. Общий объем работы составляет страниц текста, включая 41 рисунок, 4 таблицы и список литературы, содержащий наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы В настоящее время описано применение микроспектрометрия для многопараметрического, количественного и спектрального анализа флуорофоров в единичных клетках и срезах тканей. В этих работах использовались как экспериментальные лабораторные установки, так и современные лазерные сканирующие конфокальные микроскопы (ЛСКМ), имеющие в своем составе спектральный модуль. С применением микроспектрометрии измеряли внутриклеточные концентрации свободных ионов кальция и магния, были изучены спектральные характеристик некоторых зондов клеточных органелл.
Микроспектрометрия интенсивно использовалась в исследованиях противоопухолевых препаратов, в том числе фотосенсибилизаторов. Регистрация флуоресценции NADH и липофусцин-подобных пигментов позволила изучать методом микроспектрометрии метаболическую активность и старение клеток. Показана возможность использования микроспектрометрии для регистрации эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции, а также для цитометрического анализа срезов тканей с использованием до флуорофоров одновременно.
Наряду с исследованием БАС в клетках и тканях, многообещающим является использование микроспектрометрии в цитомике, науке, призванной установить связь между генотипом и фенотипом, многопараметрическом иммунофенотипировании, гибридизационном анализе и анализ образцов с высоким уровнем аутофлуоресценции, например, срезов тканей. Проточная цитометрия, лазерная сканирующая цитометрия, цитометрия изображений, микроскопия с использованием ратиометрических красителей, микроскопическое измерение времени жизни флуоресценции, инфракрасная и корреляционная микроскопия сегодня используются для решения отдельных задач в этих областях. Микроспектрометрия сочетает в себе большинство возможностей перечисленных методик, что вызывает нарастающий интерес исследователей к возможности применения микроспектрометрии в аналитической цитометрии.
Глава 2. Материалы и методы ЦИХЛ и ЦИБХЛ были синтезированы в МГАТХТ им. М.В. Ломоносова под руководством профессора А.Ф. Миронова. Флуоресцентные аналоги цитохрома с были приготовлены конъюгированием белка с родамин изотиоционатом по N-концу. Генно инженерные мутанты цитохрома с были получены от профессора Долгих Д.А. (ИБХ РАН).
Цитотоксины из яда кобр Naja hajе, Naja oxiana, Naja kaouthia и их флуоресцентные конъюгаты с родамином B были предоставлены для исследований профессором Уткиным Ю.Н (ИБХ РАН). Флуоресцентный аналог иммуномодулятора полиоксидония был приготовлен в институте иммунологии МЗ РФ.
Разработана методика измерения квантового выхода генерации фотосенсибилизаторами активных форм кислорода (синглетный кислород, гидроксил радикал), которая заключалась в измерении скорости разрушение ловушки активных форм кислорода при облучении светом в присутствии фотосенсибилизатора. Измеренная скорость сравнивалась со скоростью разрушения в присутствии соединения, квантовый выход генерации активных форм которого известен, на основании чего рассчитывалось значение для изучаемого соединения.
В зависимости от задачи в работе использовали несколько разновидностей флуоресцентной микроскопии. В задачах классификации клеток по принципу присутствие/отсутствие характерного окрашивания хорошо известными маркерами использовалась традиционная флуоресцентная микроскопия и цитометрия изображений. К таким задачам относился подсчет числа мертвых/живых/апоптотических клеток.
Для измерения интенсивности флуоресценции, внутриклеточной концентрации флуорофора и его спектральных характеристик в клетке использовался метод микроспектрометрии. Конфокальные микроспектральные измерения проводились при помощи двух приборов: микроспектрографа, собранного в лаборатории ИБХ на базе спектрографа OMARS89 (Dilor, Франция, Рис. 1), и микроспектрографа V-45 (Dilor, Франция). Пространственное разрешение в фокальной плоскости составляло около 0,5 мкм и около 3 мкм вдоль оптической оси. Спектральное разрешение составляло около 1 нм. В результате микроспектральных измерений получали набор спектров из каждой точки образца. В каждом внутриклеточном спектре выделяли спектр определенного флуорофора, который анализировали на предмет изменений во всем образце. Для расчета концентрации флуорофора его спектр (или набор спектров), полученный из полных внутриклеточных спектров, сравнивали со спектрами этого флуорофора в различных растворах. В результате этого анализа устанавливали состояние(я) флуорофора внутри клетки и подбирали для него раствор, обеспечивающий максимально близкое соответствие микроокружению в клетке.
Этот раствор с известной концентрацией флуорофора использовали для калибровки интенсивности внутриклеточной флуоресценции. Для каждого спектра отдельного флуорофора, полученного из внутриклеточных спектров определяли интегральную интенсивность или концентрацию флуорофора в каждой точке и строили карту распределения этой интенсивности/концентрации в образце, называемую спектральным изображением. Измерения, анализ и разложение спектров на линейную комбинацию спектров сравнения осуществляли при помощи программы Labspес (DILOR, Франция).
Рисунок 1. Принципиальная схема экспериментальной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии. АФ- анализирующий фильтр;
ГФ- голографический фильтр;
ДЗ- дихроичное зеркало;
З- зеркало;
ИФ- интерференционный фильтр;
КД- конфокальная диафрагма;
Л- линза;
Р решетка;
С- входная щель спектрографа;
СЗ- сферическое зеркало;
СП- светоделительная пластина (50:50);
ФВ- фильтр возбуждения;
ФНП- фильтр нейтральной плотности.
Отсутствие измерений спектральных характеристик флуорофора в клетке и наличие спектрального диапазона, в котором флуоресцирует исключительно исследуемый флуорофор, позволяло нам проводить количественные измерения без анализа спектров флуоресценции с использованием микроскопов LSM510META (Carl Zeiss, Германия) и ЛСКМ, сконструированного в университете Твента (Голландия) для регистрации единичных молекул в ближней ИК области (ИК-ЛСКМ). Последний использовался в исследованиях ЦИБХЛ. Разрешение в фокальной плоскости и вдоль оптической оси составляло около 0,3 и 1 мкм для LSM510META, и 0,5 и 1 мкм для ИК-ЛСКМ. Преимуществами ЛСКМ по сравнению с микроспектрометрией является большая скорость анализа и детальность флуоресцентных изображений. Было обнаружено, что динамический диапазон регистрации флуоресценции микроскопа Carl Zeiss LSM510META составляет не более 2 порядков, что существенно затрудняет количественный анализ. Для преодоления этого ограничения были детально изучены зависимости динамического диапазона и чувствительности от времени интегрирования и напряжения на фотоэлектронных умножителях. На основании этих зависимостей был подобран режим, обеспечивающий наибольший динамический диапазон (2 порядка величины) и получены выражения, позволяющие пересчитывать интенсивности, измеренные при различных значениях напряжения на фотоэлектронных умножителях.
Принципиальной особенностью аналитической цитометрии является возможность получения статистически достоверного результата, основанного на анализе выборки клеток.
Перечисленные выше методики позволяют измерять флуоресцентные параметры отдельных клеток. В задачи метода МСЦ входит определение выборки клеток и методики измерения этой выборки, анализ и представление полученных результатов. В зависимости от цели эксперимента использовали два подхода МСЦ. В первом, измеряли спектральные изображения, как описано выше. Интенсивность флуоресценции или количество флуорофора усредняли по определенному клеточному компартменту в каждой отдельно взятой клетке с помощью программы анализа изображений ImageJ (National Institutes of Health). Другой подход заключался в предварительном анализе изображений светлого поля и выборе нескольких точек сканирования (2-10) в интересующем компартменте (цитоплазма, плазматическая мембрана) каждой клетки, с определенными морфологическими признаками.
После чего набор спектров анализировали также, как в случае получения спектральных изображений. Для каждой клетки определяли среднюю интенсивность флуоресценции каждого из флуорофоров или их концентрации. Такой подход позволял значительно сократить время измерения и, в случае клеток крови, анализировать только определенную популяцию (эритроциты, лимфоциты, моноциты или гранулоциты). В результате измерений (в обоих подходах), для каждой клетки получали набор значений интенсивностей или концентраций. После этого анализировали распределение соответствующих значений по выборке клеток, строили гистограммы распределения измеренных параметров и вычисляли среднее значение. Анализ гистограмм позволял обнаружить клеточные субпопуляции с различными свойствами и выявить причину или следствие этих отличий при взаимодействии с БАС.
Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Применение микроспектрометрии для измерения внутриклеточной концентрации и идентификации молекулярных взаимодействий фотосенсибилизаторов.
Исследования ЦИХЛ и ЦИБХЛ показали, что в воде эти фотосенсибилизаторы не флуоресцируют и образуют нерастворимые агрегаты. Поэтому наличие флуоресценции после растворения фотосенсибилизатора в водном растворе, содержащем дополнительные компоненты, свидетельствует о связывании фотосенсибилизатора с этими компонентами, а по интенсивности флуоресценции можно судить о степени связывания. На основании сравнения внутриклеточных спектров флуоресценции со спектрами в различных растворах:
гидрофобных/полярных, кислых/щелочных (для водных растворов), водных растворах, содержащих липидные системы (липосомы, мицеллы, эмульсии) водорастворимые белки и нуклеиновые кислоты мы подбирали раствор, который наиболее точно имитирует микроокружение фотосенсибилизатора в клетках.
Нами была обнаружена флуоресценция ЦИХЛ в водных растворах, содержащих водорастворимые белки или липидные системы, причем наиболее интенсивно фотосенсибилизаторы связывались с липидными системами. Анализ спектров ЦИХЛ в органических растворителях различной гидрофобности и различных водных растворах, содержащих липидные системы, показал, что максимум спектра флуоресценции ЦИХЛ, его кремофор А Липосомы R1 R ЦИХЛ SDS CTAB -COOH -OCOCH NH N -COOCH3 -OCH -COOH -(CH2)2OH N HN H -COOCH3 -OH H3C H ONO 680 720 760 800 710 720 730 740 750 R1 R Д Б ЧСА лизоцим -глобулин кремофор 680 700 720 740 760 Длина волны, нм 680 720 760 800 710 720 730 740 750 В Е кремофор pH 4, pH 7, pH 8, 710 720 730 740 680 720 760 кремофор Г Ж Метанол Этанол Пропанол 680 720 760 800 710 720 730 740 Длина волны, нм Рисунок 2. Моделирование внутриклеточного микроокружения ЦИХЛ1 (структурная формула приведена в правом верхнем углу) и построение спектрального изображения, описывающего распределение ЦИХЛ1 в клетке аденокарциномы легкого человека А549. A – Г: моделирование микроокружения в водных растворах с различными липидными системами (А), белками сыворотки крови (Б), рН (В) и в органических растворителях с различной диэлектрической проницаемостью (Г).
Д: внутриклеточный спектр ЦИХЛ1 (сплошная линия) и его наложение на спектр ЦИХЛ1 в заряженных мицеллах SDS (прерывистая линия). Е: Микрофотография клетки. Ж: Спектральное изображение, описывающее характерное распределение ЦИХЛ1. Шкала справа соответствует концентрации ЦИХЛ1 в мкМ.
полуширина и интегральная интенсивность могут зависеть от степени гидрофобности, присутствия заряженных липидов, pH водной фазы, что проиллюстрировано для 13,15-(N ацетокси)циклоимид хлорина p6 (ЦИХЛ1, Рис. 2) на рисунке 2А-Г. Таким образом, для определения концентрации фотосенсибилизатора в клетке путем сравнения интенсивностей флуоресценции в клетке и растворе с известной концентрацией, необходимо подобрать раствор, максимально близко повторяющий клеточное микроокружение. Это позволяет учесть разгорание или тушение флуоресценции в зависимости от микроокружения.
Исследования методом микроспектрометрии показали, что ЦИХЛ и ЦИБХЛ способны проникать в раковые клетки и присутствуют в них в мономерной фотоактивной форме. Внутриклеточные спектры флуоресценции для всех ЦИХЛ и ЦИХБЛ за исключением ЦИХЛ1 совпадали со спектрами в нейтральной масляной эмульсии Cremophor EL (кремофор). Поэтому в качестве калибровочной кривой интенсивности была взята зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации этих фотосенсибилизаторов в кремофоре. Для ЦИХЛ1 была обнаружена зависимость спектра от заряда липидной системы, что, по-видимому обусловлено наличием ацетильной группы. Внутриклеточные спектры ЦИХЛ1 лучше всего описывались спектрами ЦИХЛ1 в положительно заряженных мицеллах SDS (рис. 2Д). Анализ калибровочных зависимостей показал, что интенсивность флуоресценции фотосенсибилизаторов прямо пропорциональна концентрации, и минимальный порог регистрации составляет от 0,1 до 0,5 мкМ в зависимости от фотохимических свойств фотосенсибилизатора. Сравнение внутриклеточной интенсивности флуоресценции и калибровочной прямой позволило построить спектральные изображения, отражающие концентрацию фотосенсибилизатора в каждой точке (Рис. 2Ж). Средняя цитоплазматическая концентрация ЦИХЛ1, рассчитанная по более чем 20 клеткам, составила 2,3 ± 0,15 мкМ после 2 часов инкубации с 1 мкМ ЦИХЛ1 при 37 0С и 7% сыворотке.
Для проверки количественных возможностей микроспектрометрии средняя цитоплазматическая концентрация была установлена методом экстракции. Для этого плотный монослой клеток во флаконе (3,5 ± 0,5 106 клеток) инкубировали с ЦИХЛ1 при условиях, повторяющих условия инкубации при микроспектральных измерениях. После инкубации клетки отмывали от фотосенсибилизатора, снимали с флакона и лизировали в мкл 1% SDS в течение 30 мин в ультразвуковой ванне. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием, и концентрацию ЦИХЛ1 измеряли спектрофлуорометрически, путем сравнения с интенсивностью флуоресценции раствора с известной концентрацией ЦИХЛ1 в SDS. Средняя концентрация ЦИХЛ1 в экстракте составила 0,5 ± 0,1 мкМ. Перед добавлением SDS от суспензии клеток отобрали аликвоту, которую анализировали методом микроскопии светлого поля. Было установлено, что клетки имеют форму эллипсоида и средний объем клетки и ядра составляет 3,3 ± 0,5 10-6 и 0,3 ± 0,1 10-6 мкл соответственно.
Исходя из этих значений и средней концентрации ЦИХЛ1 в лизате была рассчитана средняя цитоплазматическая концентрация, которая составила 5,2 ± 1,5 мкМ. Полученный результат примерно вдвое превышает результат, полученный методом микроспектрометрии. Можно предположить две причины наблюдаемых отличий. Некоторая фракция фотосенсибилизатора внутри клетки может находиться и агрегированном состоянии и не флуоресцировать. Фотосенсибилизатор в таком состоянии не способен образовывать активные формы кислорода и фотодинамически не активен. Таким образом, методом микроспектрометрии мы измеряем концентрацию только мономерной, фотоактивной формы фотосенсибилизатора. Другой причиной отличий может являться неидеальность микроспектрометра. Разрешение используемого микроспектрографа вдоль оптической оси составляет 3 мкм, что является удвоенным расстоянием, на котором интенсивность от точечного источника снижается с максимального значения в 2,7 раза. На большем расстоянии вдоль оптической оси точечный источник также дает вклад в флуоресценцию, интеграл которого (в соответствии с распределением Гаусса) составляет 19% от интегральной интенсивности в пределах этих 3 мкм. Кроме того, толщина адгезивных клеток на периферии значительно меньше 3 мкм, и слой цитоплазмы клетки занимает лишь небольшую долю микрообъема сканирования. Тем не менее, проведенный эксперимент показал, что микроспектральные измерения позволяют довольно точно оценить концентрацию флуорофора в клетке. При анализе суспензионных клеточных культур и улучшенных конфокальных свойствах микроспектрографа точность анализа возрастает.
3.2. Изучение структурно-функциональных связей ЦИХЛ и ЦИБХЛ В работе исследовано 4 ЦИХЛ (Рис. 2) и 11 ЦИБХЛ (Рис. 3), которые поглощают свет в диапазоне 709 – 714 нм и 780 – 834 нм и флуоресцируют в диапазоне 715 – 723 нм и 794 – 842 нм соответственно (данные для ЦИБХЛ см. в Табл. 1). Были проанализированы ключевые свойства этих соединений, ответственные за фотодинамическую активность:
способность образовывать активные формы кислорода, фотостабильность, внутриклеточное накопление, внутриклеточная локализация. Было показано, что ЦИХЛ и ЦИБХЛ способны образовывать синглетный кислород под действием света, хотя и с разной эффективностью.
Следует отметить, что, несмотря на низкую энергию нижнего возбужденного состояния ЦИБХЛ (до 840 нм, Табл.), большинство ЦИБХЛ сохраняют способность эффективно образовывать синглетный кислород (энергия перехода 3O2 1O2 1270 нм). Как отмечалось выше, ЦИХЛ и ЦИБХЛ проникают в раковые клетки. ЦИБХЛ флуоресцируют в ближней ИК области, что затрудняет их анализ внутри клеток методами традиционной флуоресцентной микроскопии, ЛСКМ и микроспектроскопии. Тем не менее, нам удалось зарегистрировать ЦИБХЛ в клетках методом микроспектрометрии при длительных временах инкубации и высокой концентрации ЦИБХЛ. Поскольку внутриклеточные спектры ЦИБХЛ совпадают со спектрами в кремофоре (см. п. 3.1.), и собственная клеточная флуоресценция в этом спектральном диапазоне отсутствует, то мы 1: H3C O H R H воспользовались МСЦ с использованием ИК- H H ЛСКМ для изучения особенностей NH N NH N накопления этих соединений в клетках.
Методом МСЦ было установлено, что N HN H N HN H распределение каждого из исследуемых фотосенсибилизаторов в культурах клеток H H ONO OOO аденокарциномы легкого человека А549 и COOCH3 R рака шейки матки человека HeLa довольно COOH R1 R ЦИБХЛ однородно по всем клеткам: коэффициент H3C O вариации не превышал 25%. Отношение средней цитоплазматической ЦИБХЛ H3C OH -OCH концентрации к концентрации в HC O OH инкубационной среде (фактор накопления, К, -OCH 3 O Табл. 1.) после 3 ч инкубации составили от O H 3C O -OCH 0,3 до 13. Для ЦИХЛ и некоторых ЦИБХЛ O OH были получены зависимости накопления от OH -OCH 5 H3 C O OH времени и концентрации фотосенсибилизатора во внешней среде. При H3 C O CH -OCH 6 O длительном времени инкубации и высокой H3 C N OH -OCH концентрации эти зависимости выходят на насыщение. Внеклеточная концентрация H3C O -N(CH3) фотосенсибилизатора, при которой H3C O наблюдается насыщение, зависит от боквых -NH заместителей: с использованием H H3C O N гидрофильных заместителей насыщение N достигалось при концентрациях 1 – 3 мкМ, в O H то время как гидрофобные заместители H3C O N N CH позволяли повышать внутриклеточное O накопление за счет повышения концентрации Рисунок 3. Структурные формулы ЦИБХЛ.
фотосенсибилизатора в инкубационной среде вплоть до 10 мкМ. Показано, что наличие заряженной группировки в положении R1 обеспечивает быстрое накопление и выведение ЦИХЛ из клеток (время полунакопления 5 – 7 мин), а нейтральной - медленное (время полунакопления 40 - 90 мин). С использованием селективных зондов клеточных органелл было установлено, что внутри клеток ЦИХЛ и ЦИБХЛ накапливаются в липидных каплях (ЛК) и аппарате Гольджи. Гидрофобные заместители способствовали накоплению в ЛК, в то время как для соединений с гидрофильными заместителями преобладало накопление в аппарате Гольджи (Рис. 4).
Полученные данные о квантовых выходах генерации синглетного кислорода (, Табл.), эффективности поглощения (, Табл.), и внутриклеточном накоплении (К, Табл.) позволили нам оценить количество синглетного кислорода, образующегося в клетке при облучении светом. Значения были рассчитаны исходя из данных настоящего исследования и данных, полученных в МНИОИ им. П.А. Герцена, о внеклеточной концентрации и световой энергии, необходимой для гибели 90% клеток (ИК90, Табл.). В результате расчетов была получена оценка кумулятивной цитоплазматической концентрации синглетного кислорода, образующейся в клетке за время облучения клеток (15 мин), приводящей к гибели 90% клеток (ИК90(1O2), Табл.). Для разных ЦИБХЛ ИК90(1O2) составила от 0,06 до 0,41 мМ.
Данная величина может служить характеристикой удельной эффективности фотосенсибилизаторов. Поскольку в расчетах не принимались во внимание сайты внутриклеточной локализации ЦИБХЛ, то можно предположить, что ИК90(1O2) является характеристикой чувствительности различных органелл к фотодинамическому воздействию.
Однако удельная эффективность соединений, обладающих сходной внутриклеточной локализацией, может существенно отличаться, как в случае ЦИБХЛ3 и ЦИБХЛ7. В связи с этим можно утверждать, что помимо сайтов внутриклеточного накопления, существуют другие факторы, которые могут существенно влиять на удельную эффективность фотосенсибилизаторов. Этим фактором, вероятно, является близость фотосенсибилизатора к мишеням, окисляемым синглетным кислородом, на молекулярном уровне.
Таблица. Фототоксичность в отношении клеток HeLa, фотохимические и клеточные характеристики ЦИБХЛ ЦИБХЛ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Параметр Qa (нм) 812 778 782 781 782 783 793 821 832 827 б em (нм) 821 794 797 797 797 797 809 831 840 840 (Q) в 10-3 (M-1 см-1) 12 31 29 32 24 28 27 50 15 21 ±10% г 0,27 0,54 0,55 0,54 0,55 0,57 0,51 0,39 0,24 0,19 0, 1050± 440± 500± ИК90д (нM) 60±10 60±10 60±5 60±5 60±5 50±5 90± 130 50 Ке ±5% 0,37 4,7 10,4 8,5 7,9 13,1 2,3 3,8 3,4 1,6 0, ж 37 ± 2 46 ± 3 59 ± 5 52 ± 7 53 ± Tef (мин) ИК90(1O2)з (мM) 0,06 0,18 0,34 0,37 0,22 0,41 0,06 0,18 0,22 0, Локализация ** / *** / *** / *** / * / *** / *** / **** / **** / * / Ли (ЛК/Гольджи) *** ** ** ** **** ** ** * * **** а Положение максимума длинноволновой полосы поглощения (Q-полосы). б Положение максимума флуоресценции. вКоэффициент молярной экстинкции в эмульсии кремофора в максимуме Q-полосы поглощения, Q. гКвантовый выход генерации синглетного кислорода в 0,1-0,3 % эмульсии кремофора.
в Квантовый выход фотообесцвечивания ЦИБХЛ в 0,1-0,3 % эмульсии кремофора. дКонцентрация ЦИБХЛ в среде, вызывающая 90% гибель клеток при стандартных условиях облучения, которое проводится через 3 ч инкубации клеток с фотосенсибилизатором. еФактор накопления – отношение средней цитоплазматической концентрации фотосенсибилизатора к его концентрации во внешней среде, измеренное через 3 ч инкубации клеток с 1 мкМ ЦИБХЛ в полной среде. жВремя полувыведения ЦИБХЛ из клеток. зСуммарная по времени облучения внутриклеточная концентрация синглетного кислорода, вызывающая 90% гибель клеток HeLa. иПредположительно, лизосомальная локализация.
Микрофоторафия Флуоресцентное изобр. Микрофоторафия Флуоресцентное изобр.
N N 2 5 N N N N N N N 7 N N N N N N 10 11 N Рисунок 4. Типичные внутриклеточные распределения соединений ЦИБХЛ2, ЦИБХЛ5, ЦИБХЛ7, ЦИБХЛ8, ЦИБХЛ10 и ЦИБХЛ11 в живых клетках рака шейки матки HeLa, измеренные с помощью МСЦ. Представлены микрофотографии клеток в проходящем белом свете и конфокальные спектральные изображения распределения ЦИБХЛ в клетках. Внутриклеточные распределения соединений ЦИБХЛ3 и ЦИБХЛ4 очень похожи на распределение соединения ЦИБХЛ2. Клетки инкубировали 3 ч с 1 мкМ ЦИБХЛ. N – отмечает ядро;
стрелки указывают на некоторые из липидных капель, метка – 5 мкм. Шкалы интенсивности отражают концентрацию ЦИБХЛ в мкМ.
3.3. Применение МСЦ для выявления апоптоза и его связи с активностью митохондрий после фотоиндуцированного воздействия Аннексин-V (AnV) и пропидий иодид (PI) являются наиболее часто используемыми зондами апоптотических и мертвых клеток соответственно. AnV селективно связывается с фосфатидилсерином, который в процессе апоптоза перераспределяется с внутренней на внешнюю сторону плазматической мембраны и оказывается доступным для АnV.
Необходимость использования PI, который окрашивает ДНК только в том случае, если внешняя мембрана клетки пермиабилизована, обусловлена необходимостью различать апоптотические и мертвые клетки. Применение спектрального подхода позволило нам без труда разделить флуоресценцию фикоэритрин меченного AnV (PE-AnV), PI, а также третьего флуорофора, родамина 123 (Rh123). Rh123 избирательно накапливается в митохондриях за счет трансмембранного потенциала этих органелл и имеет максимум флуоресценции 540 нм.
Использование МСЦ и набора из трех флуоресцентных зондов (PE-AnV, PI и Rh123) позволило нам параллельно изучать механизм гибели клеток и состояние митохондриального потенциала в ходе этого процесса.
Известно, что активные формы кислорода, которые образуются при облучении клеток, нагруженных фотосенсибилизатором, способны активировать процесс апоптоза. Мы изучили механизм гибели клеток, нагруженных 131,151-N-(2-гидроксиэтил)циклоимид хлорина р6 (ЦИХЛ2) после облучения светом. Обнаружено, что механизм гибели зависит от дозы фотосенсибилизатора и света. Так, при цитотоксических дозах, т.е. дозах, которые вызывают гибель примерно 95% клеток, преобладает некротический тип гибели, и активации апоптоза не происходит. При субцитотоксических дозах, т.е. дозах, которые вызывают гибель около 50% клеток, преобладает апоптотический тип гибели клеток, о чем свидетельствует возрастание интенсивности PE-AnV на мембране клеток (IАnV, Рис. 5). Облучение клеток с ЦИХЛ2 приводило к существенному снижению митохондриального потенциала (IRh123, Рис. 5). Измерения методом МСЦ развития процесса во времени (1, 2, 3 и 4 ч) показали, что максимальное снижение митохондриального потенциала наблюдается через 1 час после облучения. С течением времени митохондриальный потенциал у части клеток восстанавливался, причем IАnV у этих клеток находится на уровне контрольных клеток, не подвергавшихся облучению. Со временем также возрастает число мертвых клеток, что, вероятно, обусловлено гибелью тех клеток, которые ранее находились в процессе апоптоза.
Облучение клеток, нагруженных ЦИХЛ2 вызывает снижение митохондриального потенциала, что является возможной причиной активации апоптоза. Однако снижение митохондриального потенциала не всегда является достаточным для активации апоптоза, и в некоторых клетках митохондрии восстанавливают свою активность. Апоптоз в этом случае не активируется.
Рисунок 5. Зависимость митохондриальной активности от состояния клетки (апоптоз/некроз), измеренная методом МСЦ.
Каждая сканированная клетка представлена на 150 диаграммах в виде кружка с координатами IAnV, отн.ед.
центра (IRh123;
IАnV). Клетки A459, содержащие в цитоплазме ЦИХЛ2 и облученные светом (11±1 мВт/см2, 15 мин), обозначены полыми кружками. Контрольные клетки, облученные 50 без фотосенсибилизатора, обозначены черными кружками. Клетки, у которых в ядре обнаружен сигнал йодистого пропидия, 0 обозначены соответствующими кружками и 0 20 40 60 80 100 120 140 перечеркнуты крестиками. Они IRh123, отн.ед. классифицировались как мертвые.
3.4. Изучение цитохром с-индуцированного апоптоза Цитохром с в интактных клетках локализован в межмембранном пространстве митохондрий. Известно, что многие апоптотические стимулы вызывают высвобождение цитохрома с в цитозоль, что, в сою очередь, запускает процесс апоптоза. В этой работе мы активировали апоптоз введением экзогенного цитохрома с в цитозоль клетки.
Для изучения цитохром с-индуцированного апоптоза была тщательно оптимизирована процедура введения экзогенного белка в цитоплазму клеток. Эта процедура основывалась на электропорации клеток в гипоосмолярных условиях в присутствии цитохрома с. Оптимизированная процедура позволяет активировать апоптоз в 60 – 80 % клеток мышиной миело-моноциторной линии WEHI-3, при этом сама процедура в отсутствие цитохрома с не вызывала увеличения числа мертвых клеток (5%). Отметим, что описанные до настоящего времени процедуры введения цитохрома с позволяли активировать апоптоз не более чем в 40% клеток, и 20 – 50% клеток при этом погибало в результате самой процедуры.
Для наблюдения введенного в клетку цитохрома с использовали смесь цитохрома с, конъюгированного с родамином, и нативного белка в молярном отношении 3/7. Эту смесь будем обозначать как Rh-цитохром с. После элекропорации клетки были дополнительно окрашены РЕ-AnV и PI, и цитоплазматическая концентрация цитохрома с была рассчитана методом МСЦ. Для Rh-цитохрома с не было обнаружено отличий спектра флуоресценции в клетке и в воде. В то же время, свободный родамин имеет спектр флуоресценции, отличный от конъюгата. МСЦ позволил избирательно регистрировать флуоресценцию целого конъюгата, исключая флуоресценцию свободного родамина (появляющегося при деградации конъюгата), свойства которого заметно отличаются от свойств белка. Средняя цитоплазматическая концентрация цитохрома с была соотнесена с состоянием клетки (апоптотическая/мертвая) (Рис. 6). В анализируемых образцах для каждой клетки измерялись: цитоплазматическая концентрация цитохрома с ([C]цит), интенсивности свечения PE-АnV на мембране (IAnV) и пропидий иодида в ядре (IPI). В результате построения 6% IAnV [отн. ед.] 61% 2 0% 19% 14% 0 2 4 6 8 10 12 14 [C]цит [мкM] Рисунок 6. Анализ состояния клеток WEHI-3, после электропорации с 20 мкМ Rh-цитохрома с.
Средняя интенсивность флуоресценции связанного с мембраной АnV (IAnV) и средняя цитоплазматическая концентрация цитохрома с были измерены методом МСЦ для каждой из сканированных клеток. Каждая сканированная клетка представлена на диаграмме в виде кружка.
Клетки, у которых в ядре обнаружен сигнал йодистого пропидия, обозначены крестиками. Они классифицировались как мертвые. Клетки, для которых IAnV была меньше и больше порогового значения, классифицировались соответственно как живые и апоптозные. Пороговое значение IAnV (обозначено горизонтальной прерывистой линией) соответствовало уровню 3% апоптозных клеток в контроле (клетки без цитохрома с). Минимальная эффективная концентрация цитохрома с обозначена вертикальной прерывистой линией. Цифры на диаграмме соответствуют проценту не мертвых (живых и апоптозных) клеток в каждом квадрате, ограниченном прерывистыми линиями.
Черными кружками отмечены апоптотические клетки, полыми кружками – живые, а крестами – мертвые.
двумерной гистограммы распределения клеток в соответствии со значениями [C]цит и IAnV и исключения из анализа мертвых клеток (высокая IPI) была установлена пороговая интенсивность IAnV, превышение которой указывает на то, что клетка является апоптотической (Рис.4, прерывистая горизонтальная линия). Анализ гистограммы показал, что апоптотическими являются лишь те клетки, цитоплазматическая концентрация цитохрома с в которых превышает 2,7 ± 0,5 мкМ. Из литературных данных известно несколько оценок этой величины, однако точность этих оценок составляет от одного до двух порядков. В нашем исследовании эта величина впервые измерена явно. Отметим, что определение пороговой концентрации цитохрома с, необходимой для активации апоптоза, стало возможным благодаря нескольким уникальным возможностям МСЦ: детального анализа полных внутриклеточных спектров флуоресценции и измерению внутриклеточной концентрации в отдельно взятых клетках.
В эксперименте апоптоз активировали на стадии, которая в естественных условиях следует за инактивацией митохондрий. В связи с этим возник вопрос об участии митохондрий в апоптозе, индуцированном экзогенным цитохромом с. Была исследована связь между цитохром с-индуцированным апоптозом и активностью митохондрий. Для этого использовались методика МСЦ и подходы, опробованные при изучении фотоиндуцированного апоптоза (п. 3.3.). При детальном изучении внутриклеточного спектра флуоресценции Rh123 было обнаружено, что он состоит из двух составляющих: одна имеет максимум флуоресценции 538 нм (Rh538), другая - 543 нм (Rh543). Средняя внутриклеточная интенсивность двух компонентов Rh123 (IRh543, IRh538, Рис. 7), средняя интенсивность флуоресценции связанного с мембраной АnV (IAnV) и интенсивность флуоресценции йодистого пропидия в ядре были измерены для каждой из сканированных клеток. Оказалось, что из двух идентифицированных компонент, Rh543, действительно, чувствительна к потенциалу митохондрий, и интенсивность её флуоресценции снижается примерно в 5 раз в процессе цитохром с-индуцированного апоптоза. Другая компонента, Rh538, оказалась практически нечувствительна к потенциалу митохондрий. Интегральная интенсивность флуоресценции Rh538 составляет примерно 30 % от общей флуоресценции родамина 123 в интактных клетках. Отмеченное свойство Rh123 не было известно до настоящего времени и позволит в будущем корректно применять Rh123 в качестве индикатора трансмембранного потенциала митохондрий.
32 Контроль б а 10 M дикого 16 цитохрома с 10 M IAnV, отн.ед.
K72W Апоптоз 36 M Мертвые 60 M 4 120 M 186 M Контроль 10 M дикого цитохрома с 0, 10 M K72L 20 M 0, 56 M 4 8 16 32 64 128 256 4 8 16 32 100 M IRh543, отн.ед. IRh538, отн.ед 200 M Контроль Рисунок 7. Применение МСЦ для идентификации потенциала 10 M дикого митохондрий в процессе апоптоза, индуцированного цитохрома с экзогенным цитохромом с, введенным в цитоплазму методом 15 M 30 M электропорации. Каждая сканированная клетка представлена K72E 46 M на диаграммах в виде кружка с координатами центра (IRh543;
130 M IAnV) и (IRh543;
IAnV). Клетки WEHI-3, в цитоплазму которых 195 M был введен цитохром с, обозначены черными кружками, и контрольные клетки обозначены полыми кружками. Клетки, у Контроль 10 M дикого которых в ядре обнаружен сигнал йодистого пропидия, цитохрома с обозначены крестиками. Они классифицировались как 10 M мертвые. Клетки, для которых IAnV была меньше и больше K72A 20 M порогового значения классифицировались соответственно как 30 M 44 M живые и апоптозные. Пороговое значение IAnV (обозначено 88 M прерывистой линией) соответствовало уровню 3% 0 10 20 30 40 50 60 70 апоптозных клеток среди контрольных клеток. Параметры Количество клеток [%] IRh543 (а) и IRh538 (б) соответствуют митохондриальному Рисунок 8. Проапоптотические потенциал-чувствительному и цитоплазматическому активности цитохрома с лошади и компонентам Rh123. Из диаграммы (а) видно, что развитие его мутантных вариантов (K72W апоптоза, индуцированного электро-инъекцией цитохрома с, K72L, K72E и К72A). Черные и вызывает значительное снижение потенциала митохондрий, белые столбцы представляют наблюдаемое по уменьшению накопления Rh123 (параметр процент мертвых и апоптотических IRh543) в митохондриях.
клеток соответственно.
Исчезновение митохондриального потенциала может являться следствием, а не причиной развития апоптоза, и происходить уже на терминальной стадии процесса. На основании полученных данных остается неясным, вносит ли вклад в развитие апоптоза эндогенный митохондриальный цитохром с. Для проверки этого мы использовали циклоспорин А, ингибитор активности белка, который вызывает переход мембраны митохондрий в состояние высокой проницаемости (permeability transition pore). Инкубация клеток после электропорации в присутствии 20 мкМ циклоспорина А снижала эффективность индукции апоптоза в 1,3 – 1,5 раза. Это указывает на то, что при активации экзогенным цитохромом с происходит высвобождение митохондриального цитохрома с, что способствует развитию апоптоза.
Метод индукции и регистрации апоптоза был использован для того, чтобы впервые определить в живых клетках проапоптотическую активность четырех мутантных вариантов цитохрома с, которые несут точечные замены лизина в 72 положении на аланин (K72А), лейцин (K72L), глутаминовую кислоту (K72E) и триптофан (K72W). Эти исследования показали, что замена лизина на аланин, лейцин и глутаминовую кислоту снижает проапоптозную активность цитохрома с в 5, 70 и 15 раз соответственно, а введение триптофана полностью подавляет проапоптотическую функцию (Рис. 8.).
3.5. Анализ мишеней воздействия иммуномодулятора полиоксидония на клетки периферической крови человека.
Полиоксидоний – это иммуномодулирующий препарат, который применяется при лечении вторичных иммунодефицитных состояний. Однако механизм воздействия полиоксидония на клетки иммунной системы не известен. Для определения способности полиоксидония взаимодействовать с клетками крови и выявления первичных мишеней воздействия нами был использован метод МСЦ. Для классификации клеток крови на лимфоциты и клетки фагоцитарного ряда (нейтрофилы, моноциты, макрофаги, тучные клетки) была использована возможность предварительного визуального анализа клеток и их классификации на основании морфологических признаков.
Мы обнаружили, что полиоксидоний представляет смесь полимеров различной молекулярной массы. Перед исследованиями флуоресцеин-меченный полиокисдоний (Ф ПО) разделяли на две фракции: с молекулярной массой более 5 кДа и менее 5 кДа при помощи фильтрации через мембрану, пропускающую белки менее 5 кДа. Распределение полиоксидония между фракциями было примерно поровну. На основании анализа изображений в проходящем свете среди клеток крови выбирали лимфоциты и гранулоциты.
После этого сканировали цитоплазмы клеток одной из этих популяций и результаты для каждой популяции анализировали отдельно. Внутриклеточные спектры полиоксидония совпадали с его спектрами в воде, однако спектр свободного флуоресцеина сдвинут на 4 нм по сравнению со спектром Ф-ПО. Это позволило исключить возможность ошибочной регистрации деградировавшего красителя как исследуемого препарата. Обнаружено, что низкомолекулярная фракция проникает в фагоциты и лимфоциты намного интенсивнее, чем высокомолекулярная фракция. Расчет фактора накопления (К - отношение внутриклеточный концентрации к концентрации в инкубационной среде) дал значения К низкомолекулярной фракции 0,019 ± 0,008 и 0,011 ± 0,004 для фагоцитов и лимфоцитов соответственно.
Коэффициент накопления фракция полиоксидония с массой более 5 кДа составил не более 0,001. Полученные результаты указывают на то, что в фагоциты и лимфоциты способен проникать преимущественно низкомолекулярный полиоксидоний, хотя и с невысокой эффективностью. Действие высокомолекулярного полиоксидония ограничено воздействием на плазму крови и плазматическую мембрану клеток крови.
3.6. Применение МСЦ для изучения механизма действия цитотоксина 2 из яда кобры Naja oxiana Цитотоксины (ЦТ) из яда кобр являются основным белковым компонентом яда и представляют собой катионные амфифильные пептиды и гликопептиды длиной 60 - аминокислотных остатков. Известно, что цитотоксины обладают литической активностью в отношении клеток крови. Большинство исследователей сходятся в том, что цитотоксины также способны вызывать повышение концентрации Са++ в цитоплазме, что является причиной их кардиотоксичности, однако предполагаемые механизмы противоречивы.
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что мишенями цитотоксина могут быть цвитерионные фосфолипиды, Са++-каналы, белки с молекулярной массой 92, 77 и 68 кДа, природа которых не установлена, сульфатированные галактозил церамиды, митохондрии и -интегрины. Задачей настоящего исследования являлось выяснение активностей и механизмов действия цитотоксинов 1 и 2 из Naja hajе, 1 и 2 из Naja oxiana и цитотоксина 3 из Naja kaouthia с помощью методов оптической микроскопии.
Нами было установлено, что цитотоксичность всех исследованных токсинов, за исключением ЦТ 1 из Naja Oxiana, в отношении лейкоцитов крови в 10 и 100 раз (для ЦТ из Naja Oxiana в 320 и 9000 раз) меньше, чем в отношении клеток A549 и клеток лейкоза человека HL60 соответственно (Рис. 9.). При этом, воздействие на опухолевые клетки имело ярко выраженную положительную кооперативность (коэффициент Хилла 1,5 – 2,8), в то время как взаимодействие с лейкоцитами имело небольшую отрицательную кооперативность (коэффициент Хилла 0,4 – 0,8). Существенное отличие активности в отношении раковых клеток и клеток крови позволяет рассматривать эти соединения в качестве возможных химиотерапевтических препаратов. Для улучшения избирательности в отношении опухолевых клеток и предотвращения побочных эффектов, например, кардиотоксичности необходимо детальное понимание механизма этих активностей, чему и были посвящены дальнейшие исследования.
A. Лейкоциты крови. Б. Клетки A549 B. Клетки HL CT1No Цитотоксичность, % CT2No 75 CT3Nk CT1Nh CT2Nh 50 25 0 0.01 0.1 1 0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 Концентрация ЦТ, мкM Рисунок 9. Цитотоксичность цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana (ЦТ1No и ЦТ2No), Naja haje (ЦТ1Nh и ЦT2Nh) и Naja kaouthia (ЦТ3Nk) в отношении лейкоцитов периферической крови (А) клеток А549 (Б) и HL60 (В) после 3 часов инкубации. Представлены зависимости процента мертвых клеток от концентрации токсина.
Было установлено, что все цитотоксины накапливаются внутри клеток в гранулярных структурах. Методом микроспектрометрии с использованием флуоресцентно меченных токсинов в концентрациях, не убивающих клетку (субцитотоксические концентрации), и селективных зондов клеточных органелл было выявлено, что ЦТ накапливается преимущественно в эндосомах и лизосомах. Понижение температуры до 20 0С и использование ингибиторов эндоцитоза метил--циклодекстрина и хлорпромазина снижало накопление токсина в клетках, как было установлено методом МСЦ. Это свидетельствует о том, что цитотоксин накапливается в лизосомах и эндосомах путем эндоцитоза. Признаков мембранного связывания на клетках A549 обнаружено не было, а на мембране многих клеток HL60 наблюдалось связывание токсина в отдельных точках. Отметим, что после экстракции холестерина из плазматической мембраны метил--циклодекстрином, клетки HL60, но не A549, обретали способность связывать ЦТ по всей поверхности плазматической мембраны.
Лизосомальная локализация ЦТ позволяет предположить, что лизосомы являются первичной мишенью воздействия токсина. Разрушение лизосом может вызывать гибель клеток за счет высвобождения токсина и лизосомальных протеиназ в цитоплазму, а также за счет понижения pH цитозоля. Для проверки этих предположений встала необходимость повысить концентрацию до цитотоксической, т.е. убивающей большую часть клеток.
Единственным способом измерений в этих условиях является измерение в реальном времени. Для этого был предложен метод измерения в реальном времени методом МСЦ (МСЦ-РВ): количественной анализ зоны, содержащей большое количество (20-100) клеток через короткие промежутки времени (20-100 с). С применением метода МСЦ-РВ нами не было обнаружено четких признаков разрушения лизосом в клетках под действием субцитотоксических и цитотоксических концентраций наиболее активного цитотоксина 2 из Naja Oxiana (ЦТ2No): не наблюдалось изменений в картине окрашивания лизосом акридином оранжевым, внутриклеточный pH оставался на прежнем уровне (анализ при помощи pH чувствительного флуоресцентного зонда), в цитоплазме не появлялись активные лизосомальные протеазы (анализ при помощи флуорогенного субстрата протеаз). Метод МСЦ-РВ позволил нам установить локализацию флуоресцентно-меченного ЦN2No (Rh ЦT2No) непосредственно перед гибелью клетки. При цитотоксических концентрациях, помимо эндосомального и лизосомального накопления, перед гибелью клетки на плазматической мембране резко возрастала концентрация Rh-ЦT2No, после чего, в течение 10 с - 2 мин происходила её пермеабилизация (Рис. 10). Пороговый характер связывания говорит о высокой положительной кооперативности связывания. Гибель клеток сопровождалась лизисом мембраны и наблюдалась уже после нескольких секунд инкубации при концентрациях Rh-ЦT2No 10 мкМ и более.
Было отмечено, что воздействию ЦT2No в первую очередь подвержены клетки с высоким содержанием липидных капель. Для доказательства этой связи мы использовали возможности МСЦ-РВ (Рис. 11). Содержание липидных капель выявляли при помощи нильского красного (НК). Поскольку НК помимо липидных капель окрашивает и другие цитоплазматические структуры, то для избирательной идентификации липидных капель мы 25 с 50 с 75 с 100 с Рисунок 10. МСЦ-РВ, описывающая локализацию Rh-ЦT2No (средний ряд) и целостность плазматической мембраны (октакарбоксифталоцианин алюминия, окрашивающий ядра только клеток с разрушенной мембраной: нижний ряд) в клетках A549. К клеткам на предметном столе микроскопа вносили 10 мкМ Rh-ЦT2No и 5 мкМ октакарбоксифталоцианина алюминия.
Представлены изображения в проходящем свете (верхний ряд) и флуоресцентные конфокальные изображения полученные через 25 с, 50 с, 75 с и 100 после внесения Rh-ЦТ2No. (средний и нижний ряды).
фильтровали флуоресцентные изображения. Фильтрация заключалась в сглаживании флуоресцентных изображений НК, в результате чего удалялись интенсивные гранулярные структуры, которые соответствуют липидным каплям. После этого сглаженные изображения вычитали из исходных, и получали изображения, соответствующие исключительно липидным каплям. Повышенное содержание липидных капель в клетке свидетельствует о нарушенном липидном обмене клетки, а, следовательно, и измененном липидном составе мембраны, что, вероятно, является причиной повышенной чувствительности одних клеток по сравнению с другими.
Рисунок 11. Соотношение количества липидных капель Интенсивность флуоресценции НК и времени гибели клеток А549 в присутствии 10 мкМ 7% 30 36% ЦТ2No, выявленное методом МСЦ-РВ. Каждая анализируемая клетка представлена на гистограмме в в липидных каплях виде точки. Клетки инкубировали с 1 мкМ НК в течение 1 ч, после чего в инкубационную среду вносили 10 мкМ ЦТ2No и 5 мкМ октакарбоксифталоцианина алюминия.
Содержание липидных капель установлено на момент внесения цитотоксина как средняя интенсивность НК в липидных каплях одной клетки (см. текст). Эта величина отложена по оси ординат. Момент гибели клетки идентифицировали как момент появления 0 21% 36% октакарбоксифталоцианина алюминия в ядре. Момент 1 10 100 гибели клетки определяет положение точки на оси Выжившие Врeмя гибели, мин клетки абсцисс. Измерения проводили в течение 40 мин. Все выжившие за это время клетки представлены справа от вертикальной прерывистой линии.
Горизонтальная линия условно разделяет клетки с «высоким» и «низким» содержанием липидных капель. В каждой зоне, ограниченной прерывистыми линиями, указано количество клеток в этой зоне.
Обнаружено влияние субцитотоксических концентраций токсина на количество липидных капель в клетке. Так, ЦТ2No в концентрации 10 нМ за 3 ч инкубации вызывал увеличение числа клеток HL60, содержащих более 6 липидных капель на клетку, с 21 до 68%.
На основании совокупности полученных данных было сделано предположение о механизме действия цитотоксинов. Мы обнаружили, что цитотоксины интенсивно интернализуются преимущественно по механизму эндоцитоза. Как предполагают, одной из основных функций липидных капель является поддержание липидного состава плазматической мембраны, в частности содержания жирных кислот и холестерина. Обмен липидами между этими двумя структурами регулируется кавеолином, белком, который находится на мембране клеток, на поверхности липидных капель и в эндоплазматическом ретикулуме. На поверхности клеток кавеолин локализован в кавеолоах. Связывание цитотоксинов с компонентами кавеол может нарушать их структуру, изменять активность кавеолоина, и, таким образом влиять на липидный состав клетки. Можно предположить и обратную зависимость. Клетки с нарушенным обменом липидов имеют отличный от других клеток состав кавеол, который может способствовать более интенсивному связыванию токсина. Недавние данные свидетельствуют о том, что кавеолы также являются внутриклеточными депо Ca++ и могут регулировать активность протеин-киназы С, т.е.
предложенный механизм хорошо объясняет активности, описанные в литературе.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе решения задач настоящей работы метод МСЦ проходил апробацию и в результате был оптимизирован для решения широкого спектра задач цитометрии. Измерение внутриклеточных концентраций и анализ внутриклеточного окружения флуоресцирующих БАС с помощью МСЦ были отработаны при изучении ЦИХЛ и затем использованы для выявления структурно-функциональных взаимосвязей четырех ЦИХЛ и одиннадцати ЦИБХЛ. Возможность точного разделения сигналов нескольких флуорофоров с перекрывающимися спектрами была использована при анализе механизма фотоиндуцированной гибели клеток, содержащих ЦИБХЛ. В этих же исследованиях были сформулированы подходы к анализу гетерогенных клеточных популяций и определению связи между активностью органелл и состоянием клетки. С использованием оптимизированной методики введения цитохромома с в цитоплазму клеток методом МСЦ были детально изучены особенности цитохром с-индуцированного апоптоза, и измерены активности 4 мутантных вариантов цитохрома с. Благодаря возможности морфологического анализа методика МСЦ была эффективно использована для определения накопления и локализации полиоксидония в различных популяциях лейкоцитов крови. При регистрации методом МСЦ в реальном времени взаимодействий цитотоксинов из яда кобр с раковыми клетками был установлены механизм цитотоксичности и причина различной чувствительности клеток к токсину.
ВЫВОДЫ 1. На основе лазерной сканирующей конфокальной микроспектрометрии предложена универсальная методика расчета внутриклеточных концентраций и анализа внутриклеточного окружения флуоресцирующих биологически-активных соединений, применимая для решения широкого спектра задач аналитической цитометрии.
2. Разработанные методики успешно применены для анализа структурно функциональных связей фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных производных хлорина р6 и бактериохлорина р и определения ключевых факторов, влияющих на их активность, в том числе на внутриклеточное накопление и локализацию.
3. Обнаружена гибель клеток по механизму апоптоза при облучении клеток, содержащих циклоимидное производное хлорина р6. На основе потенциал чувствительных спектральных особенностей родамина 123 охарактеризовано изменение активности митохондрий при индукции апоптоза.
4. Разработана оптимизированная процедура электропорации клеток WEHI-3 с цитохромом с, которая позволила эффективно вводить белок в цитоплазму, не вызывая гибели клеток за счет самой процедуры, и изучать проапоптозную активность мутантов цитохрома с в живых клетках. Оценена пороговая цитоплазматическая концентрация цитохрома с, необходимая для активации апоптоза. Обнаружено, что замена K72W полностью подавляет про-апоптозную активность цитохрома с.
5. Выявлено, что фракция полиоксидония с молекулярной массой менее 5 кДа способна накапливаться в лейкоцитах крови, хотя и с невысокой эффективностью, причем уровень накопления в клетках гранулоцитарного ряда примерно 1,7 раза выше, чем в лимфоцитах. Уровень накопления фракции полиоксидония с молекулярной массой более 5 кДа в лейкоцитах крови как минимум в 15 раз ниже, чем низкомолекулярной фракции.
6. Установлено, что цитотоксин 2 из яда кобры Naja oxiana при субцитотоксических концентрациях интернализуется путем клатрин-зависимого эндоцитоза, а при токсических концентрациях связывается на плазматической мембране с высокой кооперативностью и лизирует мембрану. Показано, что связывание токсина на мембране клетки зависит от метаболизма липидов в клетке и липидного состава мембраны.
Материалы диссертации изложены в следующих работах:
1. Sharonov G.V., Karmakova T.A., Kassies R., Pljutinskaya A.D., Grin M.A., Refregiers M., Yakubovskaja R.I., Mironov A.F., Maurizot J.-C., Vigny P., Otto C.,. Feofanov A.F, Cycloimide bacteriochlorin p derivatives: photodynamic properties and cellular and tissue distribution. // Free Radic. Biol. Med., 2006, 40(3), 407-419.
2. Назарова А.И., Феофанов А.В., Кармакова Т.А., Шаронов Г.В., Плютинская А.Д., Якубовкая Р.И., Лебедева В.С., Миронов А.Ф., Маризо Ж.-К., Вини П., Влияние заместителей на фотохимические и биологические свойства 13,15-N-циклоимидных производных хлорина p6. // Биоорг. Химия, 2005, 31(5), 535-548.
3. Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Astapova M.V., Dedukhova V.I., Chernyak B.V., Dolgikh D.A., Arseniev A.S., Skulachev V.P., Kirpichnikov M.P., Comparative analysis of proapoptotic activity of cytochrome c mutants in living cells. // Apoptosis, 2005, 10, 797-808.
4. Feofanov A.V., Sharonov G.V., Astapova M.V., Rodionov D.I., Utkin Y.N., Arseniev A.S., Cancer cell injury by cytotoxines from cobra venom is mediated through lysosomal damage. // Biochem J., 2005, 390, 11-18.
5. Феофанов А.В., Шаронов Г.В., М.А. Дубинский, М.В. Астапова, И.А. Куделина, П.В.
Дубовский, Д.И. Родионов, Ю.Н. Уткин, А.С. Арсеньев. Сравнительное исследование структуры и активности цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana, Naja kaouthia, и Naja haje. // Биохимия, 2004, 69(10), 1410-1421.
6. Feofanov A., Sharonov G., Grichine A., Karmakova T., Pljutinskaya A., Lebedeva V., Ruziyev R., Yakubovskaya R., Mironov A., Refregier M., Maurizot J-C., Vigny P. Comparative study of photodynamic properties of 13,15-N-cycloimide derivatives of chlorin p6. // Photochem.
Photobiol., 2004, 79(2), 172-188.
7. Дьяконова В.А., Бураков В.В., Шаронов Г.В., Пинегин Б.В. Изучение клеточных и молекулярных аспектов механизма взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками иммунной системы человека. // Иммунология, 2004, 3, 145-152.
8. Дьяконова В.А., Дамбаева С.В., Голубева Н.М., Бураков В.В., Шаронов Г.В., Комогорова Е.Э., Пинегин Б.В. Изучение механизма действия иммуномодулятора полиоксидония на клеточном и молекулярном уровнях на клетках периферической крови человека в условиях in vitro. // Физиология и патология иммунной системы, 2004, 8, 105-115.
9. Filatov A.V., Shmigol I.B., Sharonov G.V., Feofanov A.V., Volkov Y. Direct and indirect antibody induced TX-100 resistance of cell surface antigen. // Immunol. Lett., 2003, 85(3), 287 295.
10. Filatov A.V., Shmigol I.B., Kuzin I.I., Sharonov G.V., Feofanov A.V. Resistance of cellular membrane antigens to solubilization with Triton X-100 as a marker of their association with lipid rafts - analysis by flow cytometry. // J. Immunol. Meth., 2003, 278, 211-219.
11. Sharonov G.V., Karmakova T.A., Kassies R., Plutinskaja A.D., Grin M.A., Yakubovskaja R.I., Mironov A.F., Refregiers M., Maurizot J.-C., Vigny P., Otto C., Feofanov F.V. Cellular – and tissue distribution of near infrared photosensitizers based on cycloimide derivatives of bacteriochlorin. (Устный доклад) //
Abstract
Book of International Conference On Supramolecular Science & Technology, Chem. Listy, 98, s17, 2004.
12. Шаронов Г.В., Феофанов А.В., Бочарова О.В., Астапова М.В., Долгих Д.А., Арсеньев А.С., Кирпичников М.П. Сравнительный анализ проапоптозной активности мутантов цитохрома с в живых клетках. // Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 2004 г., с. 63.
13. Шаронов Г.В., Кармакова Т.А., Кассиес Р., Плютинская А.Д., Мёрфи К., Грин М.А., Филлипс Д., Якубовская Р.И., Миронов А.Ф., Отто С., Феофанов А.В. Клеточное и тканевое распределение фотосенсибилизаторов ближнего инфракрасного диапазона на основе циклоимидных производных бактериохлорина. // Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 2004 г., с. 100.
14. Феофанов А.В., Шаронов Г.В., Астапова М.В., Григал П.П., Уткин Ю.Н., Арсеньев А.С.
Лизосомальная локализация цитотоксинов из яда кобр и её роль в цитотокическом эффекте. // Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 2004 г., с. 63.
15. Астапова М.В., Шаронов Г.В., Арсеньев А.С., Уткин Ю.Н., Феофанов А.В. Особенности взаимодействия цитотоксинов из яда змей с клетками промиелоцитарного лейкоза человека HL60. Тезисы докладов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Ред.: Соркина Т.И., ИБХ РАН, Москва, 2003, c. 35.
16. Шаронов Г.В., Астапова М.В., Бочарова О.В., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Феофанов А.В. Новый количественный метод определения апоптозной активности белков в живых клетках и его применение к цитохрому с и его мутантным вариантам. // Тезисы стендовых сообщений Российского симпозиума по химии и биологии пептидов.
Ред.: Соркина Т.И., ИБХ РАН, Москва, 2003, c. 50.
17. Шаронов Г.В., Гришин А.И., Кармакова Т.А., А.В. Феофанов, А.Д. Плютинская, Р.И.
Якубовская, А.А. Аксенова, Ю.Л. Себякин, А.Ф. Миронов, Ж.-К. Маризо, П. Вини Углеводные производные пирофеофорбида а: спектральные, фотодинамические и биологические свойства. // Труды 9-ой международной конференции по химии порфиринов и их аналогов. Ред.: Агеева Т.А.;
Иваново, 2003, с. 331-343.
18. Феофанов А.В,, Шаронов Г.В., Назарова А.И., Кармакова Т.А., Гришин А.И., Плютинская А.Д., Якубовская Р.И., Лебедева В.С., Рузиев Р.Д., Миронов А.Ф., Маризо Ж.-К., Вини П. Оптимизация структуры циклоимидных производных хлорина р6 для фотодинамической терапии рака. // Труды 9-ой международной конференции по химии порфиринов и их аналогов. Ред.: Агеева Т.А.;
Иваново, 2003, с. 339-341.
19. Феофанов А.В., Шаронов Г.В., Кармакова Т.А., Плютинская А.Д., Якубовская Р.И., Грин М.А., Ципровский А.Г., Миронов А.Ф., Гришин А.И., Моризо Ж.-К., Вини П., Кассис И.Р., Отто К. Новые ИК-фотосенсибилизаторы на основе циклоимидных производных бактериохлорина. // Труды 9-ой международной конференции по химии порфиринов и их аналогов. Редю: Агеева Т.А.;
Иваново, 2003, с. 332-334.
20. Karmakova T.A., Sharonov G.V., Grichine A.I., Plyutinskaya A.D., Nazarova A.I., Feofanov A.V., Kazachkina N.I., Yakubovskaya R.I., Lebedeva V.S., Ruziev R.D., Mironov A.F., Refregiers M., Maurizot J.-C. and Vigny P. Cycloimide derivatives of chlorin p6 – novel near IR photosensitizers. // The 10th Congress of the European Society for Photobiology, Vienna, Austria, September 6-11, 2003.
21. Кармакова Т., Шаронов Г., Гришин A., Плютинская А., Филясова A., Феофанов А., Якубовская Р., Казачкина Н., Лебедева В., Рузиев Р., Миронов А., Вини П. Структурно функциональные взаимосвязи фотосенсибилизаторов на примере циклоимидных производных хлорина р6. // Труды Российской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Российский биотерапевтический журнал, 2003, Т. 1, № 1, с. 25.
22. Шаронов Г.В., Филясова А.И., Плютинская А.Д., Кармакова Т.А., Феофанов А.В., Якубовская Р.И., Лебедева В.С., Миронов А.Ф., Вини П. Изучение влияния структуры боковых заместителей на свойства, определяющие фотодинамическую активность циклоимидных производных хлорина р6. (Устный доклад) // Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 2002 г., с. 29.
23. Grichine, G. Charonov, A. Filyasova, A. Pljutinskaya, T. Karmakova, A. Feofanov, R.
Yakubovskaya, V. Lebedeva, A. Mironov, M. Refregiers, M. Egret-Charlier, and P. Vigny.
Structure-functional relations of cycloimide derivatives of chlorin p6 as studied with the confocal spectral imaging (CSI) technique. // Proc. of the II Int. Symp. Shedding light on disease. Optical diagnostics for the new millenium. Eds. G.D. Sockalingum, M. Manfait, Reims, France, 2002, p. 68.
24. A. Feofanov, G. Sharonov, A. Grichine, A. Aksenova, A. Mironov, M. Egret-Charlier and P.
Vigny. Influence of sugar substituents on the photodynamic activity of naturally derived chlorins. // Book of Abstracts of the XX-th Intern. Conf. on Photochemistry, Ed. A. Chibisov, 2001, p. 489-490.