Сравнительное изучение na+-транслоцирующих nadh:хинон оксидоредуктаз из vibrio harveyi, klebsiella pneumoniae и azotobacter vinelandii

На правах рукописи

ФАДЕЕВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ Na+-ТРАНСЛОЦИРУЮЩИХ NADH:ХИНОН ОКСИДОРЕДУКТАЗ ИЗ Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae И Azotobacter vinelandii 03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в отделе Молекулярной энергетики микроорганизмов НИИ физико химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, Александр Валерьевич Богачев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Рената Александровна Звягильская кандидат биологических наук, доцент Вера Георгиевна Гривенникова ФГУП “ГосНИИгенетика”

Ведущая организация:

Защита состоится “31”марта 2008 г. в “15ч. 30мин” часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многие морские и патогенные микроорганизмы содержат уникальный фермент – натрий-транслоцирующую NADH:хинон-оксидоредуктазу (Na+-NQR), который генерирует на цитоплазматической мембране бактерий первичный электрохимический потенциал ионов натрия. Этот белок представляет значительный интерес для биоэнергетики, поскольку его сопрягающим ионом является Na+, а не протон.

Кроме того, Na+-NQR широко распространен среди патогенных микроорганизмов, что делает исследование этого фермента актуальным и с медицинской точки зрения. При изучении Vibrio cholerae была обнаружена взаимосвязь между уровнем мембранного натриевого потенциала, который является следствием работы фермента, и продукцией факторов вирулентности. Поэтому Na+-NQR можно рассматривать как вероятную мишень для создания новых лекарственных препаратов для лечения или предотвращения многих инфекционных заболеваний.

Несмотря на интенсивные исследования Na+-NQR, исследователи еще очень далеки от полного понимания механизма его функционирования. Более того, все имеющиеся на настоящий момент данные о каталитических свойствах этого белка были получены при изучении Na+-NQR из эволюционно очень близких друг к другу организмов – V. alginolyticus, V.

harveyi и V. cholerae. При этом абсолютно ничего не известно о свойствах Na+-NQR из других микроорганизмов, хотя подобная информация была бы исключительно полезна как для понимания физиологической роли фермента в бактериальной клетке, так и для выявления общих структурных характеристик и закономерностей функционирования Na+-NQR.

Цели исследования. Исходя из выше изложенного, основной целью работы являлось сравнительное изучение свойств натрий-транслоцирующих NADH:хинон-оксидоредуктаз из микроорганизмов, обитающих в различных экологических нишах. Особое внимание было уделено определению физиологической роли Na+-NQR, сравнительному изучению кинетических параметров данных ферментов, а также анализу роли их консервативных аминокислотных остатков в функционировании белка.

Научная новизна. В настоящей работе впервые было изучено влияние таких параметров окружающей среды, как концентрации ионов натрия и разобщителя, значений рН среды роста, а также типа субстрата в присутствии и отсутствии кислорода на экспрессию nqr оперонов V. harveyi и _ *Список сокращений: ДМСО – диметилсульфоксид, K3 – менадион (витамин K3), Км – константа Михаэлиса, ОНФГ – о-нитрофенил--D-галактозид, СБЧ – суббактериальные частицы, ТМАО – триметил N-оксид, ЭПР – электронный парамагнитный резонанс, CCCP – м-хлоркарбонилцианид фенилгидразон, DM – н-додецил мальтозид, dNADH – восстановленный никотинамидгипоксантин динуклеотид, HQNO – 2 н-гептил-4-гидроксихинолин N-оксид, Q – убихинон, QH2 – убихинол, Q1 – 2,3-диметокси-5-метил-6 изопренил-1,4-бензохинон;

NDH-1 – бактериальная Н+-транслоцирующая NADH:хинон-оксидоредуктаза, гомолог митохондриального Комплекса I, NDH-2 – бактериальная несопряженная NADH:хинон оксидоредуктаза, Na+-NQR – Na+-транслоцирующая NADH:хинон-оксидоредуктаза.

Klebsiella pneumoniae. Впервые были исследованы каталитические свойства Na+-NQR и влияние ингибиторов на данные ферменты из K. pneumoniae и Azotobacter vinelandii в сравнении с хорошо исследованным ферментом из V.

harveyi. Определены 4 консервативных остатка цистеина, расположенные внутри трансмембранных -спиралей, и показана необходимость этих остатков для правильной сборки и функционирования Na+-NQR Практическая значимость работы. Полученные данные о регуляции экспрессии генов, кодирующих Na+-NQR, у различных бактерий.

Исследование штаммов микроорганизмов, мутантных по этим генам, позволяет приблизиться к пониманию физиологической роли данных ферментов в клетках бактерий. Показано, что значение KM по сопрягающему иону у Na+-NQR коррелирует с концентрацией ионов натрия в экологической нише микроорганизма – источника фермента. Сравнительный анализ геномов исследованных микроорганизмов выявил консервативные остатки, необходимые для функционирования Na+-NQR Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ и на биоэнергетическом семинаре НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ, а также на конференции «Ломоносов-2005» (Москва 2005);

на XIV Европейской биоэнергетической конференции (Москва, Россия, 2006) и на 32м Конгрессе Федерации Европейских Биохимических Сообществ (Австрия, Вена, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 90 страниц, содержит 27 рисунков и 11 таблиц. Список литературы включает 91 источник.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы Штамм V. harveyi дикого типа был получен из музея кафедры микробиологии МГУ. Штамм K. pneumoniae 204 (дикий тип) был получен из коллекции Института стандартизации и контроля биомедицинских препаратов им. Л.А. Тарасевича. Непатогенный штамм V. cholerae 0395N1 toxT::lacZ был получен от др. Хасе. Штамм A. vinelandii AEIV (дикий тип) был любезно предоставлен проф. Нуньес. Остальные штаммы были получены в ходе данной работы. Использованные в данной работе штаммы V. harveyi, V. cholerae, K. pneumoniae и A. vinelandii и плазмиды описаны в табл. 1.

Получение штаммов с нарушенным синтезом генов и nqrA::lacZ штамма K. pneumoniae. Фрагменты генов амплифицировали методом ПЦР с Taq полимеразой и соответствующими праймерами. Амплифицированные фрагменты клонировали в вектор pGEM-T, где в клонированный фрагмент вставляли кассету устойчивости к канамицину, и отбирали конструкцию с одинаковым направлением транскрипции фрагмента гена и кассеты устойчивости. Фрагменты «мутируемый ген::Km» из плазмиды субклонировали в суицидальный вектор pKNOCK-Tc. Полученные плазмиды переносили в клетки с помощью конъюгации с использованием штамма E.

coli SM10pir в качестве донора. С помощью селекции отбирали клон с инактивацией нужного гена за счет события двойного кроссинговера (чувствительный к тетрациклину). Правильность локализации мутации в хромосоме V. harveyi проверяли с помощью ПЦР-анализа.

Сайт-направленный мутагенез. В качестве матрицы для мутагенеза использовали плазмиду pBADnqr4, несущую полный nqr-оперон из V. harveyi под контролем арабинозного промотера [Bogachev et al., 2006]. Для внесения каждой мутации конструировали пару соответствующих праймеров (последовательность прямого праймера для каждой пары приведена в табл.

1). Для облегчения идентификации мутированных плазмид в три пары праймеров были внесены дополнительные сайты рестрикции. Мутагенез осуществляли с помощью набора “QuikChange II XL” (Stratagene).

Мутантные плазмиды идентифицировали с помощью рестрикционного анализа или посредством секвенирования ДНК. Полученные плазмиды вносили в клетки V. cholerae O395N1 toxT::lacZ nqrA-F с помощью электропорации.

Таблица 1. Использованные в данной работе бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры (для сайт-направленного мутагенеза).

Штаммы Фенотип Ссылки или источник микроорагнизмов получения Дикий тип, RfR V. harveyi R3 получен в ходе данной работы R3, nqrA::Km, KmR RfR V. harveyi R3A10 получен в ходе данной работы R3, ndh::Km, KmR RfR V. harveyi NDKm34 получен в ходе данной работы R3 arcB::Km;

RfR, KmR V. harveyi MFA121 получен в ходе данной работы Непатогенный штамм дикого [Barquera et al., 2002] V. cholerae O395N типа, SmR toxT::lacZ nqr, SmR V. cholerae O395N1 [Barquera et al., 2002] toxT::lacZ nqrA-F Дикий тип, RfR K. pneumoniae R150 [Bogachev and Bertsova, 2004] R150 nqr::lacZ;

RfR, KmR K. pneumoniae LZ102 получен в ходе данной работы R150, nuoB::Cm ndh::Amp, CmR K. pneumoniae KND038 получен в ходе данной ApR RfR работы A. vinelandii AEIV Дикий тип [Nez et al., 2008] ndh::Tc, RifR TcR A. vinelandii DN165 [Bertsova et al., 2001] nqrE::Tn5, SpR A. vinelandii GG4 [Nez et al., 2008] E. coli Sm10 pir thi thr leu tonA lacY supE [Miller & Mekalanos, 1988] recA::RP4-2-Tc::Mu;

KmR Плазмиды Описание Ссылки или источник получения R pUC19 Вектор для клонирования;

Ap Fermentas pGEM-T Вектор для клонирования Promega продуктов ПЦР;

ApR pUC19 (nqrA-lacZ) oriT;

ApR pMobZ1 получена в ходе данной работы pKNOCK-Tc Мобилизуемый суицидальный (Alexeyev 1999) вектор;

TcR pBADnqr4 pBAD с nqr-опероном V. harveyi, [Bogachev et al., 2006] ApR pBAD с nqr-опероном V. harveyi получена в ходе данной pD_C29A с заменой Cys29Ala в работы R субъединице NqrD, Ap pBAD с nqr-опероном V. harveyi получена в ходе данной pD_C112I с заменой Cys112Ile в работы R субъединице NqrD, Ap pBAD с nqr-опероном V. harveyi получена в ходе данной pE_C26G с заменой Cys26Gly в работы субъединице NqrE, ApR pBAD с nqr-опероном V. harveyi получена в ходе данной pE_C120G с заменой Cys120Gly в работы R субъединице NqrE, Ap Праймер Последовательность DC29A_dir 5’-GCTGCAGGTTCTTGGTGTAgcTTCTGCTCT TGCAGTAAC DC112I_dir 5’-GGTCTTATCATCACGAATatTATCGTAATG GGTCGTGCTGAAGC EC26G_dir 5’-GCACTGTCTTTCTTCCTAGGTATGgGTACc TTCCTTGCCGTATC EC120G_dir 5’-CTGATCACAGTAAACgGcGCcATCTTCG GTGGTG Выращивание V. harveyi и V. cholerae. Клетки V. harveyi и V. cholerae выращивали на качалке при 32°С и 250 об./мин в среде FM [Fadeeva et al., 2007]: 30 г/л NaCl, 0,75 г/л KCl, 1 г/л (NH4)2SO4, 1,2 г/л MgSO4, 0,05% дрожжевой экстракт, 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 0,4% глицерин и 0,5 мМ KH2PO4 (для опытов с минимальной средой вместо глицерина добавляли мМ сукцинат). Для измерения -галактозидазной активности клетки растили до середины экспоненциальной фазы роста. Для получения суббактериальных частиц клетки выращивали в течение 12-14 часов.

Выращивание клеток K. pneumoniae проводили при 37°С и об./мин в богатой среде LB или минеральной среде М9. Для измерения галактозидазной активности клетки растили до середины экспоненциальной фазы роста. Для получения суббактериальных частиц клетки выращивали в течение 12-14 часов.

Выращивание клеток A. vinelandii проводили в модифицированной среде Бурка BSN [D’Mello et al., 1994]. Клетки выращивали на качалке при 250 об./мин и температуре 32°С. Для получения суббактериальных частиц клетки растили в течение 12-14 часов.

Выделение Na+-NQR. Cтандартный препарат Na+-NQR из клеток из V.

harveyi получали, как описано в [Zhou et al., 1999]. Рекомбинантный препарат Na+-NQR получали с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе.

Суббактериальные частицы получали, пропуская промытые бактериальные клетки через пресс Френча (16000 p.s.i.). Неразрушенные клетки и крупные обломки осаждали, центрифугируя гомогенат 10 мин при 20000g. Осадок отбрасывали, а супернатант повторно центрифугировали в течение 90 мин при 200 000 g. Осадок суспендировали в той же среде и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера.

ЭПР-спектроскопия. Измерение ЭПР-спектров проводили на спектрометрах ESP-300 (Bruker) и E-109E (Varian) при частоте модуляции 100 кГц. Температура образца поддерживалась с помощью гелиевого криостата ESR 900 и контроллера температуры ITC4 (Oxford Instruments), либо с помощью азотного криостата. Количественная оценка ЭПР-сигналов проводилась с помощью двойного интегрирования спектров, полученных при ненасыщающих мощностях, с использованием Cu2+-ЭДТА в качестве стандарта.

Концентрацию белка измеряли “бицинхониновым методом”, как описано в [Smith et al., 1985], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Концентрацию натрия определяли с помощью пламенной фотометрии.

Измерение -галактозидазной активности проводили, как описано в [Bogachev et al., 1995], используя в качестве субстрата о-нитрофенил--D галактозид (ОНФГ). Концентрацию образовавшегося о-нитрофенола определяли по поглощению при 420 нм.

Регистрацию окисления NADH, NADPH и dNADH проводили на спектрофотометре Hitachi-557 по изменению оптического поглощения при 340 нм при температуре 30°С. Для расчетов использовали коэффициент 6,22х103 М-1 см-1.

340 = молярной экстинкции Окисление пиридиндинуклеотидов проводили в среде, содержавшей 20 мМ HEPES Трис, 5 мМ MgSO4, 100 мМ KCl, 50 мМ NaCl (pH 8.0). Концентрация восстановленных пиридиндинуклеотидов была равна 150 мкМ.

Определение различных металлов в препаратах Na+-NQR проводили с помощью масс-спектрометрического анализа на масс спектрофотометре Agilent 7500C ICP-MS.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Регуляция экспрессии оперонов, кодирующих Na+-транслоцирующую NADH:хинон-оксидоредуктазу у V. harveyi и K. pneumoniae.

Целью данной части нашей работы являлось изучение зависимости экспрессии оперонов nqr морской бактерии V. harveyi и энтеробактерии K.

pneumoniae от концентрации ионов натрия, разобщителя, значения рН среды роста, а также типа субстрата в присутствии и отсутствие кислорода.

В клетках V. harveyi дикого типа активность собственной галактозидазы не детектировалась при всех использованных условиях выращивания этой бактерии. В клетках K. pneumoniae дикого типа активность -галактозидазы могла быть обнаружена только при наличии в среде роста лактозы в качестве основного источника углерода. В присутствии лактозы данная активность была равна ~1 Е/мг белка (мкмоль расщепленного ОНФГ в минуту на мг белка), в то время как в отсутствие лактозы наблюдаемая активность была меньше, чем 0,001 Е. Это позволяет для изучения экспрессии nqr-оперонов измерять -галактозидазные активности клеток V. harveyi и K. pneumoniae, несущих конструкции, которые содержат ген lacZ из E. coli под контролем промоторов оперонов nqr. В случае V.

harveyi lacZ был слит с геном nqrA этой бактерии, и данная конструкция Ф(nqrA-lacZ) была внесена в клетки V. harveyi на плазмиде pMobZ1. В случае K. pneumoniae ген галактозидазы был слит с опероном nqr этого микроорганизма, и данная конструкция была внесена на хромосомальную ДНК (штамм K. pneumoniae LZ102). Так как об экспрессии nqr оперонов V.

harveyi и K. pneumoniae мы судили по косвенному параметру – значению галактозидазных активностей, то проводилась проверка, насколько эти активности соответствуют действительной экспрессии изучаемых генов. Для этого параллельно были измерены -галактозидазные активности клеток V.

harveyi/pMobZ1 и K. pneumoniae LZ102, выращенных при различных условиях, а также dNADH-оксидазные активности (специфическая активность Na+-NQR) СБЧ, выделенных из этих же клеток. Во всех исследованных случаях наблюдалась строгая корреляция между значениями -галактозидазных активностей и специфическими активностями Na+-NQR, что указывает на точность отображения активностями -галактозидазы степени экспрессии nqr оперонов изучаемых штаммов бактерий.

Зависимость экспрессии nqr-оперонов V. harveyi и K. pneumoniae от фазы роста этих микроорганизмов.

Как видно на рис. 1А, экспрессия конструкции nqrA::lacZ в клетках V.

harveyi/pMobZ1 практически не меняется в ходе роста данной бактерии. Она максимальна в ранней логарифмической фазе роста и лишь незначительно понижается в поздней логарифмической фазе и в раннем стационаре. В случае K. pneumoniae LZ102 экспрессия nqr::lacZ минимальна в ранней логарифмической фазе роста и значительно повышается в стационарной фазе (рис. 1Б). В дальнейшем для изучения влияния различных факторов на экспрессию nqr клетки V. harveyi и K. pneumoniae отбирались в середине логарифмической фазы роста.

Б A 0, 1 4, -галактозидазная активность, -галактозидазная активность, A A600 0, 3, 3,0 0, 2, Е/мг белка 0, Е/мг белка 2, 0, 1, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 Время, час Время, час Рисунок 1. Зависимость -галактозидазной активности V. harveyi R3/pMobZ1 (А) и K.

pneumoniae LZ102 (Б) от фазы роста этих микроорганизмов. Сплошной линией показано увеличение во времени оптической плотности культуры при 600 нм, пунктирной линией – изменение -галактозидазной активности во время роста культуры. Здесь и далее 1 Е галактозидазной активности соответствует 1 мкмоль расщепленного ОНФГ в минуту.

Зависимость экспрессии nqr-оперонов V. harveyi и K. pneumoniae от концентрации ионов натрия, значений рН среды роста и от присутствия в ней протонофора CCCP.

Большинство микроорганизмов, обладающих Na+-NQR, относятся к морским или патогенным бактериям, т.е. они обитают в среде с высокой концентрацией Na+. В то же время известно, что живые организмы поддерживают низкую внутриклеточную концентрацию ионов натрия.

Поэтому вполне вероятно, что основной функцией Na+-NQR является поддержание низкой внутриклеточной концентрации Na+. Для проверки этого предположения мы изучили влияние концентрации ионов натрия в ростовой среде на экспрессию nqr оперонов V. harveyi и K. pneumoniae.

Было обнаружено, что экспрессия nqrА V. harveyi практически не зависит от концентрации NaCl в среде роста. В то же время, экспрессия nqr оперона K. pneumoniae повышается при увеличении концентрации Na+ от до 150 мМ. Однако необходимо отметить, что данный эффект крайне незначителен и не превышает 1,5-кратного предела.

Высказывались предположения, что Na+-NQR в клетках бактерий может выполнять защитную роль в условиях низкой Н+ на сопрягающей мембране, например при щелочных значениях рН или в присутствии протонофора [Skulachev, 1989]. Для проверки этой гипотезы была исследована экспрессия nqr-оперонов V. harveyi и K. pneumoniae при различных значениях рН ростовой среды и в присутствии различных концентраций разобщителя СССР. Нами были использованы такие значения рН и концентрации СССР, при которых наблюдался стабильный рост бактериальных культур. По результатам исследования, V. harveyi был чуть более устойчив к щелочным значениям рН, тогда как K. pneumoniae способна переносить большую концентрацию разобщителя в среде роста.

Оказалось, что изменение значений рН ростовой среды практически не оказывало влияния на степень экспрессии nqr-генов как V. harveyi, так и K.

pneumoniae. Также не было отмечено какой-либо индукции генов nqr при различных концентрациях разобщителя СССР.

Зависимость экспрессии nqr-оперонов V. harveyi и K. pneumoniae от типа используемого субстрата при росте этих микроорганизмов.

Экспрессия генов различных компонентов бактериальных дыхательных цепей часто зависит от типа используемых при росте источников углерода и энергии, поэтому мы определили влияние некоторых субстратов на степень экспрессии nqr генов (рис. 2).

А Б 3,5 0, Рисунок 2. Зависимость -галактозидазная активность 0, 3, -галактозидазной 0, 2, активности клеток V.

0, Е/мг белка harveyi R3/pMobZ1 (А) и 2, 0, K. pneumoniae LZ102 (Б) 1, 0, от типа используемого 1, 0, субстрата.

0,5 0, 0,0 0, гл трат ма ерин ат ац т ац ат за сах тол за а ци т ха л т а а ма за ма рин за оз а ета о оз тр ин ин то то ет ит о ро ар и юк ци юк ль кц кц ль иц е нн нн иц ма гл су су гл са гл В качестве субстратов для обоих микроорганизмов были взяты глюкоза, мальтоза, сахароза, глицерин, маннитол, ацетат, цитрат и сукцинат.

Как видно на рис. 2, у обеих бактерий экспрессия nqr ниже при росте на таких «богатых» субстратах, как глюкоза, мальтоза или сахароза, по сравнению с ростом клеток на таких “бедных” субстратах, как сукцинат или ацетат. Такая зависимость обычно объясняется тем, что в первом случае клетка получает достаточно энергии за счет гликолиза, тогда как на бедных субстратах основным источником ATP является окислительное фосфорилирование, т.е. в этом случае необходимо активное функционирование дыхательной цепи. Данная зависимость экспрессии оперонов nqr у V. harveyi и K. pneumoniae от источника углерода является типичной для ферментов бактериальных дыхательных цепей [Park et al., 1995;

Bongaerts et al., 1995;

van der Rest et al., 2000]. Также примечательно, что экспрессия оперонов nqr в клетках V. harveyi и K. pneumoniae, выращенных на мальтозе или сахарозе, практически не отличается от экспрессии в клетках, выросших на глюкозе. Этот результат указывает, что экспрессия оперонов nqr этих бактерий не находится под контролем катаболитной репрессии.

Зависимость экспрессии nqr-оперонов V. harveyi и K. pneumoniae от используемых акцепторов электронов дыхательной цепи.

Далее мы изучали влияние различных акцепторов электронов дыхательной цепи на экспрессию оперона nqr. Для этих целей бактерий растили в анаэробиозе с различными акцепторами электронов (фумарат, ТМАО и нитрат для V. harveyi [Proctor and Gunsalus, 2000];

фумарат, ТМАО, DMSO и нитрат для K. pneumoniae) или в присутствии кислорода.

Наблюдалась исключительно мощная репрессия nqrA V. harveyi в анаэробных условиях (рис. 3А) Так, экспрессия nqrA V. harveyi в присутствии O2 была почти в 200 раз выше, чем в анаэробиозе при отсутствии акцепторов электронов. При добавлении фумарата, ТМАО и нитрата были получены промежуточные значения экспрессии nqrA V.

harveyi, которые зависели от окислительно-восстановительного потенциала добавленного акцептора (чем выше редокс-потенциал акцептора, тем выше экспрессия изучаемых генов).

В случае клеток K. pneumoniae также наблюдалась репрессия nqr генов при анаэробных условиях роста (рис. 3Б). Однако, по сравнению с V. harveyi, данная репрессия носила менее выраженный характер, и она не зависела от присутствия в ростовой среде субстратов для анаэробного дыхания этого микроорганизма.

Рисунок 3. Зависимость -галактозидазная активность, Е/мг белка -галактозидазной А Б 1,4 0, активности клеток V.

1,2 0, harveyi R3/pMobZ1 (А) и 1, K. pneumoniae LZ102 (Б) 0, 0, от типа используемых 0, акцепторов электронов 0,6 0, дыхательной цепи.

0,4 0, 0, 0, 0, 0,0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 фу ров ат т фу ов СО AO ат т ра пт з AO ра тр це бе ор О це ез тр ма о ДМ О TM ма ни пт ак б TM ни ак Исследование влияния инактивации гена arcB V. harveyi на экспрессию nqr оперона этого микроорганизма.

По характеру зависимости экспрессии nqr генов V. harveyi от потенциала акцептора электронов дыхательной цепи можно было предположить, что данный оперон находится под контролем регуляторной системы ArcAB [Manukhov et al., 2000;

Georgellis et al., 2001;

Malpica et al., 2006]. Ранее на данной бактерии никогда не проводили исследования этой регуляторной системы. В частично прочитанном геноме V. harveyi с помощью программы BLAST были обнаружены два гена с высокой степенью гомологии к генам arcA и arcB из E. coli. В геноме K. pneumoniae гены, гомологичные генам arcA и arcB из E. coli, отсутствовали. Этот факт может объяснять отсутствие зависимости экспрессии nqr оперона от редокс потенциала акцептора электрона при анаэробном росте данной бактерии.

Для проверки предположения об участии регуляторной системы ArcAB в анаэробной репрессии nqr генов у V. harveyi был получен мутантный штамм V. harveyi MFA121 с нарушенным синтезом этого белка. Известно, что индукция хинолоксидазы bd-типа E. coli в микроаэробных условиях роста осуществляется за счет функционирования Arc-системы. Поэтому, для проверки полученного нами штамма V. harveyi MFA121 была исследована индукция цитохрома bd этой бактерии при микроаэробных условиях роста.

Как видно на рис. 4, разностный (восстановленный минус окисленный) спектр СБЧ, полученных из клеток мутантного штамма V. harveyi MFA121, в отличие от СБЧ из клеток дикого типа не содержит характерных для цитохрома bd пиков при 595 и 630 нм и провала при 650 нм. Таким образом, инактивация клонированного нами гена приводит к нарушению индукции хинолоксидазы bd-типа в микроаэробных условиях роста. Данный результат доказывает, что мутация была внесена именно в ген arcВ V. harveyi, а также функциональную активность Arc-системы в клетках этой бактерии.

553 nm Рисунок 4. Разностные 560 nm (восстановленные дитионитом минус окисленные воздухом) спектры СБЧ, полученных из V.

630 nm 595 nm harveyi дикого типа и мутантного дикий тип A = 0, 650 nm штамма MFA121 (arcB::Km).

Клетки растили в микроаэробных arcB::Km условиях, спектры нормированы на концентрацию белка 5 мг/мл.

500 550 600 650 Длина волны, нм На полученном нами штамме была также изучена регуляция экспрессии nqr генов в зависимости от типа используемого клетками конечного акцептора электронов для дыхательной цепи. Было показано, что инактивация ArcAB системы не сказывается на характере анаэробной репрессии nqr генов V.

harveyi. Поэтому можно сделать вывод, что Arc-система не участвует в регуляции экспрессии nqr оперона у этого микроорганизма.

Каталитические свойства натрий-транслоцирующих NADH:хинон оксидоредуктаз из V. harveyi, K. pneumoniae и A. vinelandii Известно, что дыхательная цепь V. harveyi наряду с Na+-NQR содержит также дополнительную NADH-дегидрогеназу NDH-2 типа [Hayashi et al., 1992], а в дыхательной цепи K. pneumoniae и A. vinelandii кроме Na+-NQR функционируют также ферменты как NDH-1, так и NDH-2 типа [Bertsova & Bogachev, 2004;

Nez et al., 2008]. В ходе данной работы нами был получен штамм V. harveyi с инактивированным ферментом NDH-2 типа (NDKm34), а также штамм K. pneumoniae с инактивированными генами ферментов как NDH-1, так и NDH-2 типа (KND038). Таким образом, СБЧ из этих штаммов окисляют NADH исключительно за счет активности соответствующих Na+ NQR, что делает их удобной моделью для исследования каталитических свойств данных ферментов.

В случае A. vinelandii мы использовали полученный ранее штамм DN165, не содержащий фермента типа NDH-2 [Bertsova et al., 2001]. В клетках данного штамма присутствуют две различные NADH-дегидрогеназы (NDH-1 и Na+-NQR). Как видно на рис. 5, dNADH-оксидазная активность СБЧ из штамма A. vinelandii дикого типа лишь частично чувствительна к действию роллиниастатина (специфического ингибитора ферментов типа NDH-1). В тоже время, dNADH-оксидазная активность СБЧ из штамма A.

vinelandii с инактивированным Na+-NQR полностью чувствительна к этому ингибитору. Это свидетельствует о том, что у A. vinelandii использованные низкие концентрации роллиниастатина избирательно подавляют dNADH оксидазную активность NDH-1 и не влияют на dNADH-оксидазную активность Na+-NQR. Таким образом, для измерения специфической активности Na+-NQR на СБЧ из A. vinelandii DN165 все измерения скоростей окисления пиридиндинуклеотидов проводили в присутствии 4 мкМ роллиниастатина.

Рисунок 5. Зависимость dNADH оксидазной активности штамма dNADH-оксидазная активность, % A. vinelandii AEIV (дикий тип) (), мутантного штамма A.

vinelandii GG4, не содержащего Na+-NQR () и ревертанта по Na+-NQR A. vinelandii CN14 () от концентрации роллиниа статина.

0 1 2 3 роллиниастатин, мкМ Специфичность Na+-NQR из V. harveyi, K. pneumoniae и A. vinelandii по отношению к различным восстановленным пиридиндинуклеотидам.

Известно, что Na+-NQR из различных вибрионов окисляют как NADH, так и dNADH, но не способны с измеримыми скоростями окислять NADPH [Bourne & Rich, 1992;

Zhou et al., 1999]. Как видно из табл. 2, аналогичная картина наблюдалась и для Na+-NQR из K. pneumoniae и A. vinelandii, т.е. все исследованные в данной работе ферменты типа Na+-NQR обладают сходной субстратной специфичностью по отношению к пиридиндинуклеотидам.

Таблица 2. NADH-, dNADH- и NADPH-оксидазные активности Na+-NQR, измеренные на СБЧ, полученных из разных бактерий. Значения активности даны в мкмоль окисленного (d)NAD(P)H в минуту на мг белка.

Источник СБЧ активность NADH dNADH NADPH 0,8 0,9 0, V. harveyi 0,24 0,26 0, K. pneumoniae 1,1 1,2 0, A. vinelandii Зависимость активности Na+-NQR из различных микроорганизмов от концентрации ионов натрия.

Na+-NQR абсолютно специфична по отношению к Na+, и в отсутствии этого иона не способна к восстановлению хинона [Hayashi et al., 2001;

Bogachev & Verkhovsky, 2005]. Известно, что при физиологических условиях (т.е. при высоких значениях ионной силы) величина KМ по натрию для этого фермента 3 мМ. Однако данные значения KМ определялись лишь для Na+ NQR из различных морских вибрионов [Unemoto et al., 1977;

Bogachev et al., 2001] или из патогенной бактерии Haemophilus influenzae [Hayashi et al., 1996], т.е. для микроорганизмов, живущих при высокой концентрации Na+. В то же время, энтеробактерия K. pneumoniae и, особенно, почвенная бактерия A. vinelandii обитают в условиях, при которых концентрация Na+ может быть очень низкой. Поэтому было интересно сравнить значения KМNa для Na+-NQR из всех трех рассматриваемых микроорганизмов.

Как видно на рис. 6, зависимость активностей Na+-NQR из всех исследованных бактерий от концентрации ионов натрия представляет собой гиперболу. Величина кажущейся KМNa для Na+-NQR из V. harveyi составляла 2,7 мМ. В то же время, значение кажущейся KМNa у Na+-NQR из K.

pneumoniae снижается до 0,67 мМ, а Na+-NQR из A. vinelandii обладает наибольшим сродством к этому иону с кажущимся KМ 0,1 мМ. Таким образом, наблюдается корреляция между величиной кажущейся KМNa и концентрацией Na+ в характерной для каждого микроорганизма среде обитания, т.е. Na+-NQR из трех изученных бактерий адаптирована к соответствующим условиям функционирования in vivo.

Рисунок 6. Зависимость активность Na -NQR, % активности Na+-NQR из V.

harveyi (), K. pneumoniae (), и A. vinelandii () от концентрации + ионов натрия. Максимальные значения активности (100%) представлены в таблице 2.

0 2 4 6 8 10 [NaCl], мМ Ингибирование Na+-NQR из V. harveyi, K. pneumoniae и A. vinelandii под действием HQNO Одним из наиболее часто применяемых ингибиторов Na+-NQR является HQNO. Несмотря на то, что это соединение способно ингибировать многие хинон-оксидоредуктазы, Na+-NQR из различных вибрионов чувствительна к очень низким концентрациям HQNO, что позволяет использовать данное вещество в качестве специфического ингибитора этого класса ферментов [Tokuda & Unemoto, 1984;

Zhou et al., 1999;

Barquera et al., 2002]. В соответствии с полученными ранее данными, субмикромолярные концентрации HQNO ингибировали Na+-NQR из V. harveyi (I0,5 0,13 мкМ, рис. 7). Na+-NQR из K. pneumoniae также чувствительна к низким концентрациям HQNO, хотя у данного фермента сродство к этому ингибитору несколько хуже (I0,5 0,55 мкМ). В то же время, в присутствии роллиниастатина NADH-оксидазная активность СБЧ из A. vinelandii DN ингибировалась лишь в микромолярной области концентраций HQNO (рис.

7). Те же концентрации HQNO ингибировали NADH-оксидазную активность СБЧ из A. vinelandii штамма GG4, не содержащего фермента типа Na+-NQR (данные не представлены). Таким образом, Na+-NQR из A. vinelandii, в отличие от ферментов этого типа из V. harveyi и K. pneumoniae, устойчива к действию низких концентраций HQNO.

активность Na -NQR, % Рисунок 7. Влияние HQNO на активности Na+ + NQR из V. harveyi (), K.

pneumoniae () и A.

vinelandii ().

0 1 2 3 4 5 [HQNO], мкМ Ингибирование Na+-NQR из V. harveyi, K. pneumoniae и A. vinelandii ионами серебра и N-этилмалеимидом.

Известно, что Na+-NQR из V. alginolyticus чувствительна к субмикромолярным концентрациям Ag+ [Asano et al., 1985], а так же к некоторым другим ионам тяжелых металлов [Bourne & Rich, 1992]. В соответствии с этим, как видно на рис. 8, NADH-оксидазная активность СБЧ из V. harveyi NDKm34 (ndh) полностью подавляется при добавлении 1 мкМ Ag+. В то же время, NADH-оксидазная активность СБЧ из V. harveyi R3A (nqr) полностью устойчива к этой концентрации ионов серебра. В использованных нами экспериментальных условиях Na+-NQR из V. harveyi ингибировался под действием Ag+ с кажущейся I0,5 0,1 мкМ.

В то же время, активность Na+-NQR из A. vinelandii намного менее чувствительна к действию ионов серебра. Добавление 1 мкМ Ag+ приводило лишь к частичному и очень медленному подавлению соответствующей NADH-оксидазной активности (см. рис. 8). Как видно на рис. 8, Na+-NQR из K. pneumoniae оказалась полностью устойчивой к действию этого ингибитора.

Аналогичные результаты были получены и при изучении действия модификатора SH-групп – N-этилмалеимида (NEM): активность Na+-NQR из V. harveyi быстро подавлялась в присутствии 5 мМ N-этилмалеимида (NEM).

В тоже время, 5 мМ NEM ингибировал Na+-NQR из A. vinelandii очень медленно и лишь частично, и это соединение не оказывало действия на фермент из K. pneumoniae.

Рисунок 8. Ингибирование ионами СБЧ СБЧ СБЧ СБЧ a г Ag+ в б NADH-оксидазных активностей на (a) СБЧ, полученных из V. harveyi R3A + Ag + Ag (nqr);

(б) СБЧ, полученных из V.

+ Ag harveyi NDKm34 (ndh);

(г) СБЧ, полученных из K. pneumoniae OD340 = 0, KND038 (nuo ndh);

или (в) СБЧ, + Ag полученных из A. vinelandii DN (ndh), к которым был добавлен роллиниастатин. Добавки: AgNO3, 2 мин 1 мкM.

Ингибирование Na+-NQR из V. harveyi, K. pneumoniae и A. vinelandii под действием дифенилиодониума.

Известно, что дифенилиодониум (DPI) способен ингибировать различные флавин-содержащие оксидоредуктазы за счет ковалентной модификации изоаллоксазинового кольца флавиновой простетической группы. Данная модификация DPI происходит лишь с восстановленной, но не с окисленной формой флавина.

Действие DPI на Na+-NQR никогда ранее не изучалось. Нами показано, что хинон-редуктазная активность Na+-NQR из V. harveyi быстро ингибируется в присутствии 50 мкМ DPI. Этот ингибитор сходным образом инактивировал также Na+-NQR из K. pneumoniae и A. vinelandii. Для более подробного изучения действия DPI на Na+-NQR нами использовались СБЧ из V. harveyi, а также очищенный препарат этого белка.

Известно, что Na+-NQR содержит по крайней мере три различных флавиновых простетических группы – нековалентно связанный FAD в NADH-дегидрогеназном участке белка (в субъединице NqrF), а также два ковалентно связанных остатка FMN (в субъединицах NqrB и NqrC) [Hayashi et al., 2001;

Bogachev & Verkhovsky, 2005]. Поэтому было важно установить, какой из этих флавинов подвержен модификации под действием DPI. Как видно на рис. 9, скорость инактивации NADH-оксидазной активности СБЧ из V. harveyi NDKm34 (ndh) линейно зависит от концентрации DPI с константой скорости ингибирования равной 420 М-1 сек-1. В то же время, NADH-дегидрогеназная активность этих же СБЧ ингибируется в присутствии DPI значительно медленнее, с константой скорости ингибирования, равной лишь 80 М-1 сек-1. Эти данные могут указывать на то, что основное место действия DPI расположено после NADH-дегидрогеназного участка этого белка. Однако, соотношение NADH-дегидрогеназной и хинон-редуктазной активностей Na+-NQR не изменялось во времени при инкубации фермента в присутствии NADH и дифенилиодониума, то есть в этом случае происходила одновременная параллельная инактивация обеих этих активностей (см. рис.

9). Эти данные означают, что место действия дифенилиодониума локализовано в NADH-дегидрогеназном участке Na+-NQR, а различие констант скоростей инактивации NADH-дегидрогеназной и хинон редуктазной активностей Na+-NQR связано лишь с различным стационарным уровнем восстановленности этого фермента при катализе данных активностей. Таким образом, по-видимому, основной мишенью для DPI в Na+-NQR является нековалентно связанный FAD. Это хорошо согласуется с тем, что данный кофактор принимает электроны непосредственно с NADH, т.е. он должен быть хорошо доступен к водной фазе.

Также были исследованы ЭПР-спектры модифицированных + дифенилиодониумом препаратов Na -NQR. Показано, что полная инактивация ферментативных активностей Na+-NQR под действием DPI не приводит к изменению величины радикальных сигналов как в окисленном, так и в восстановленном дитионитом ферменте (данные не представлены).

Таким образом, дифенилиодониум, по-видимому, не способен к модификации ковалентно связанных остатков FMN.

DPI K3 СБЧ DPI СБЧ Б 0, A - скорость ингибирования, с 0, 0, K 0, 0, 0, 0, OD340 = 0, 0, 0, 0, 0, 1 мин 0, 0 50 100 150 [DPI], мкМ Рисунок 9. Ингибирование активностей Na+-NQR из V. harveyi под действием DPI. (A) Зависимость скорости ингибирования NADH-оксидазной (), и NADH-дегидрогеназной () активностей Na+-NQR от концентрации DPI. (Б) NADH-оксидазная и NADH:K оксидоредуктазная активности СБЧ из V. harveyi NDKm34. Добавки: K3, 50 мкM;

DPI, мкM. Изменения оптической плотности, вызванные добавкой K3, вычитали для большей наглядности. Значения показывают специфические активности Na+-NQR в нмоль окисленного NADH в мин на мг белка.

Сайт-направленный мутагенез консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы Na+ Анализ первичных последовательностей субъединиц транслоцирующих NADH:хинон-оксидоредуктаз и родственных им белков.

Субъединица NqrF NQR-комплекса из V. harveyi содержит 8 остатков цистеина. Известно, что четыре из них (Cys-69, Cys-75, Cys-78 и Cys-110) вовлечены в формирование 2Fe-2S кластера [Barquera et al., 2004]. Из оставшихся четырех остатков цистеина лишь один (Cys-377) является консервативным и присутствует во всех известных последовательностях субъединиц NqrF. Так как данная субъединица ответственна лишь за натрий независимую NADH-дегидрогеназную функцию фермента [Turk et al., 2004, Barquera et al., 2004], мы далее не исследовали роль этого консервативного цистеинового остатка. Субъединицы NqrA, NqrB и NqrC Na+-NQR-комплекса из V. harveyi содержат 5, 2 и 1 остаток цистеина, соответственно. Однако все они не являются консервативными и отсутствуют у многих представителей этого класса ферментов. В тоже время, субъединицы NqrD и NqrE содержат по два абсолютно консервативных остатка цистеина (Cys-29 и Cys-112 в субъединице NqrD, Cys-26 и Cys-120 в субъединице NqrE). Более того, данные остатки присутствуют также и в последовательностях всех известных на сегодняшний день гомологичных NQR ферментативных комплексах, например, в субъединицах RnfE и RnfA комплекса RNF из различных бактерий, а также в субъединицах MA0662 и MA0663 натрий-зависимой ферредоксин:метанофеназин-оксидоредуктазы из археи Methanosarcina acetivorans.

Согласно полученным топологическим моделям субъединиц RnfE и RnfA [Saaf et al., 1999], а также субъединиц NqrD и NqrE [Duffy & Barquera, 2006], все четыре консервативных остатка цистеина этих белков расположены внутри трансмембранных -спиралей, Таким образом, in vivo в пространственной структуре белкового комплекса они могут занимать соседнее положение и оказаться способными к связыванию какого-то иона металла или к образованию дисульфидных мостиков.

Анализ содержания ионов металлов в Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазе из V. harveyi.

В ходе данной работы было проведено исследование содержания ионов металлов в различных препаратах Na+-NQR из V. harveyi с помощью масс-спектрометрического анализа. В соответствии с тем, что Na+-NQR содержит 2Fe-2S кластер в качестве простетической группы, в различных препаратах этого белка определялось большое количество железа (650-780 нг Fe на мг белка), что соответствует 2,5-3,0 атомам железа на один Na+-NQR комплекс. Все остальные исследованные металлы (Сo, Ni, Cr, Zn, Ti, Cd, Mn, Mo, Ag, W, V, Sc) присутствовали в Na+-NQR в крайне низких количествах ( 0,05 атома металла на один Na+-NQR-комплекс).

Известно, что в состав Fe-S кластера Na+-NQR входят два атома железа [Turk et al., 2004, Barquera et al., 2004], в то время как в данной работе определялось присутствие 2,5-3,0 атомов железа на один комплекс Na+-NQR.

Таким образом, Na+-NQR теоретически может содержать дополнительную простетическую группу, содержащую один атом железа, наподобие Fe-S центра рубредоксина. Данный центр в окисленном состоянии обладает характерным спектром ЭПР с основным ромбическим сигналом при g=4,3, а также линиями при g9 [Peisach et al., 1971].

ЭПР спектр окисленного препарата Na+-NQR наряду с радикальным сигналом при g=2,00 также содержит ромбический сигнал в области g=4, (но не в области g=9, данные не представлены). Однако концентрация спина в этом сигнале была значительно меньше, чем в радикальном сигнале (для приведенного спектра с соотношением меньшим, чем 1:10;

концентрацию спина в радикальном сигнале определяли при мощности 10 мкВт). Также данное соотношение варьировало для различных препаратов белка. Эти данные позволяют нам описать сигнал с g=4,3 как примесное железо (junk iron), и, таким образом, заключить, что Na+-NQR содержит лишь одну металл-содержащую простетическую группу – 2Fe-2S кластер.

Сайт-направленный мутагенез консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы из V. harveyi.

Для проверки функциональной роли четырех консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE была проведена сайт специфическая замена этих остатков. В дыхательной цепи морских вибрионов присутствуют две различные NADH:хинон-оксидоредуктазы – NQR и NDH-2 [Hayashi et al., 1992;

Fadeeva et al., 2007]. Известно, что различные Na+-транслоцирующие NADH:хинон-оксидоредуктазы способны окислять как NADH, так и его аналог – dNADH, в то время как несопряженные NADH-дегидрогеназы (NDH-2) окисляют только NADH (но не dNADH) [Bertsova & Bogachev, 2004]. Таким образом, dNADH оксидазную и dNADH:К3-оксидоредуктазную активности СБЧ из бактерий рода Vibrio можно использовать для определения хинон-редуктазной и NADH-дегидрогеназной активностей Na+-NQR, соответственно.

Как видно из табл. 3, СБЧ из V. cholerae дикого типа катализируют dNADH:К3-оксидоредуктазную и dNADH-оксидазную реакции, причем последняя активность стимулируется ионами натрия и полностью чувствительна к специфическому ингибитору Na+-NQR – HQNO.

Соотношение dNADH:К3-оксидоредуктазной и dNADH-оксидазной активностей составляло приблизительно 1,8:1. В то же время, мутантный штамм V. cholerae, не содержащий генов nqr-оперона, уже не был способен к окислению dNADH при сохранении нормальной NADH-оксидазной активности. Введение в данный штамм плазмиды pBADnqr4, несущей шесть генов nqr-оперона из V. harveyi приводило к частичному восстановлению dNADH:К3-оксидоредуктазной активности, а также Na+-зависимой и HQNO чувствительной dNADH-оксидазной активности. Так как nqr-оперон на плазмиде pBADnqr4 находится под контролем арабинозного промотера, то добавление L-арабинозы к ростовой среде приводило к значительному увеличению dNADH:К3-оксидоредуктазной и dNADH-оксидазной активностей. Однако, в этом случае соотношение данных активностей было уже очень высоким (9,2:1), что указывает на то, что сверхэкспрессия nqr оперона приводит лишь к частичной правильной сборке изучаемого ферментативного комплекса.

Как видно из табл. 3, СБЧ из nqr штамма V. cholerae с плазмидами pD_C29A, pD_C112I, pE_C26G или pE_C120G, несущими nqr-опероны V.

harveyi с мутированными остатками цистеина (Cys-29 и Cys-112 в субъединице NqrD, Cys-26 и Cys-120 в субъединице NqrE, соответственно) способны к осуществлению dNADH:К3-оксидоредуктазной активности, но не dNADH-оксидазной активности. Выращивание этих штаммов в присутствии L-арабинозы приводило к значительному увеличению dNADH:К3 оксидоредуктазной активности. Также, после индукции L-арабинозой наблюдалась и небольшая dNADH-оксидазная активность. Однако, как видно из табл. 3, эта активность не стимулировалась ионами натрия и не подавлялась в присутствии HQNO. Таким образом, замены консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE приводят к нарушению Na+ зависимой и HQNO-чувствительной хинон-редуктазной активности фермента, не затрагивая его способности к взаимодействию с (d)NADH и К3.

В качестве отрицательного контроля можно рассмотреть полученных нами мутантов, у которых была проведена сайт-специфическая замена консервативных остатков Е143D и N389G в субъединице NqrB. Скорости окисления NADH и dNADH суббактериальными частицами, выделенными из полученных мутантов, и стимуляция dNADH-оксидазной активности ионами натрия были идентичными скоростям, полученным на штамме V. cholerae nqr/ pBADnqr4. Эти результаты означают, что данные остатки не являются критическими при функционировании фермента.

Таблица 3. Скорости окисления NADH и dNADH суббактериальными частицами, выделенными из различных штаммов V. cholerae.

Активности1 Соотно шение Штамм dNADH-оксидаза dNADH:К3- NADH оксидоредуктаза оксидаза V. cholerae дикий тип 1,9 (+)*(+)** 3,5 2,5 1, V. cholerae nqr 0 0,008 0,56 Без добавления арабинозы V. cholerae nqr/ pBADnqr4 0,018 (+)*(+)** 0,045 2,0 2, V. cholerae nqr/ pD_C29A 0 0,055 1,7 V. cholerae nqr/ pD_C112I 0 0,10 0,83 V. cholerae nqr/ pE_C26G 0 0,095 0,42 V. cholerae nqr/ pE_C120G 0 0,11 0,70 С добавлением арабинозы V. cholerae nqr/ pBADnqr4 0,59 (+)*(+)** 5,4 1,8 9, V. cholerae nqr/ pD_C29A 0,013 (-)*(-)** 2,8 0,70 V. cholerae nqr/ pD_C112I 0,019 (-)*(-)** 3,1 0,67 V. cholerae nqr/ pE_C26G 0,017 (-)*(-)** 3,1 0,65 V. cholerae nqr/ pE_C120G 0,042 (-)*(-)** 5,1 1,0 * стимуляция активности ионами натрия ** чувствительность активности к HQNO (4 мкМ) значения активностей представлены в мкмоль окисленного (d)NADH за 1 мин на 1 мг белка Соотношение dNADH:К3-оксидоредуктазной и dNADH-оксидазной активностей.

Na+-транслоцирующей Характеризация выделенных препаратов NADH:хинон-оксидоредуктазы с заменами консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE.

С помощью аффинной хроматографии препараты Na+-NQR V. harveyi (как дикого типа, так и мутантных по консервативным остаткам цистеина белков) были выделены из СБЧ соответствующих клеток V. cholerae, выращенных как в присутствии, так и в отсутствии L-арабинозы. В соответствии с полученными ранее результатами [Nakayama et al., 2000;

Barquera al., 2002], Na+-NQR дикого типа содержал ковалентно связанные флавины. Как видно на рис. 10, ЭПР-спектры данного белка выявляют присутствие в нем двух радикальных сигналов от разных флавосемихинонов (один в окисленном, другой в восстановленном препарате), а также линии от 2Fe-2S кластера. Важно отметить, что при выращивании клеток V. cholerae / pBADnqr4 в присутствии арабинозы, в выделенном белке соотношение концентраций спина в сигналах от 2Fe-2S кластера и радикала было 1, т.е.

наблюдался избыток Fe-S кластера по отношению к флавосемихинонам.

Данных факт подтверждает сделанное выше заключение о том, что сверхэкспрессия Na+-NQR приводит лишь к частичной правильной сборке данного ферментативного комплекса.

Рисунок 10. ЭПР спектры препарата Na+-NQR с заменой Cys112Ile в субъединице NqrD (a) в сравнении с A Б g = 2,0 препаратом Na+-NQR дикого типа (b).

g = 2,0 g = 2,0 0 g = 1,9 (А) – окисленные препараты, (Б) – b b восстановленные дитионитом препараты. Условия ЭПР: частота – 9,414 ГГц;

мощность – 100 мкВт;

g = 2,0 2 g = 1,9 температура образца – 45 K;

амплитуда a a модуляции – 6,7 Гаусс. Спектры нормированы на концентрацию белка 3200 3300 3400 3500 3600 3200 3300 3400 3500 мг на 1 мл.

М агни тн ое поле, Г аусс М агн и тн ое п оле, Г аусс При выращивании клеток V. cholerae в присутствии L-арабинозы, выделенные мутантные препараты Na+-NQR содержали ковалентно связанные флавины, однако в количествах, заметно меньших по сравнению с белком дикого типа. В то же время, эти препараты не демонстрировали радикальных ЭПР-сигналов ни в окисленном, ни в восстановленном состоянии, и из ЭПР-видимых простетических групп в них детектировался только сигнал от 2Fe-2S кластера (рис. 10). Таким образом, замена консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE сопровождается потерей возможности ковалентно связанных флавинов Na+ NQR стабилизировать флавосемихинонное состояние, т.е. приводит к неправильной сборке ферментативного комплекса.

В препаратах Na+-NQR, содержащих замены консервативных остатков цистеина субъединиц NqrD и NqrE, выделенных из неиндуцированных клеток V. cholerae (выращенных в отсутствии L арабинозы), ковалентно связанные флавины не детектировались. Более того, в этих препаратах наблюдалось пониженное содержание субъединиц NqrB и NqrC. То есть, данные замены также приводят и к значительному ускорению деградации изучаемого белка.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что изученные консервативные остатки цистеина субъединиц NqrD и NqrE необходимы для осуществления Na+-зависимой активности Na+-NQR. Однако на сегодняшний день невозможно установить, связано ли это с участием данных остатков в формировании дополнительной редокс-активной простетической группы Na+-NQR или с их ролью в процессе сборки и стабильности этого ферментативного комплекса. Таким образом, необходимы дальнейшие работы для выявления роли консервативных цистеиновых остатков Na+-NQR в электронном транспорте и транслокации ионов натрия.

ОБСУЖДЕНИЕ До настоящего времени остается неясной физиологическая функция + Na -NQR, а именно причина появления у некоторых микроорганизмов первичных натриевых помп, в то время как у большинства других бактерий натриевый потенциал формируется за счет вторичных процессов (Na+/H+ антипортеров). В данной работе мы решили исследовать влияние различных факторов на регуляцию экспрессии генов Na+-NQR морской бактерии V.

harveyi и энтеробактерии K. pneumoniae и, таким образом, проверить различные гипотезы о физиологической роли Na+-NQR.

Считается, что метаболизм прокариот в основном регулируется на уровне экспрессии генов, то есть соответствующие белки синтезируются только в тех условиях, при которых они необходимы для жизнедеятельности клетки. Поэтому изучение зависимости экспрессии гена, кодирующего какой-то белок, от условий окружающей среды может помочь в понимании физиологической роли данного белка в бактериальной клетке. В данной работе проведено исследование зависимости экспрессии nqr-оперона V.

harveyi от условий роста этого микроорганизма. Показано, что такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию изучаемых генов. В то же время экспрессия nqr V. harveyi в значительной степени зависит от того, какой субстрат используется этой бактерией в качестве основного источника энергии. Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V. harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов. Подобный характер регуляции типичен для генов, кодирующих компоненты бактериальных электрон-транспортных цепей. Таким образом, по-видимому, основной функцией Na+-NQR у V. harveyi является запасание энергии при окислении NADH дыхательной цепью. У большинства бактерий данная функция выполняется не Na+-NQR, а протон-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазой (NDH-1). Интересно отметить, что характер регуляции экспрессии генов NDH-1 у E. coli [Bongaerts et al., 1995] очень похож на описанные в данной работе условия индукции/репрессии Na+-NQR у V. harveyi, что также может указывать на сходные функции, выполняемые этими двумя ферментами.

Иными словами, нам не удалось найти каких-то специфических условий индукции Na+-NQR, отличающих этот фермент от других NADH:хинон оксидоредуктаз дыхательных цепей прокариот. Возможно, это связано с тем, что Na+-NQR является единственным энергозапасающим ферментом NADH-дегидрогеназного участка дыхательной цепи этой бактерии, что может ограничивать его регуляцию при различных условиях роста. Поэтому в качестве второго объекта наших исследований мы использовали энтеробактерию K. pneumoniae, так как дыхательная цепь этого микроорганизма содержит представителей всех трех основных типов NADH:хинон-оксидоредуктаз – Na+-NQR, NDH-1 и NDH-2 [Bertsova & Bogachev, 2004]. Однако, регуляция экспрессии nqr-оперона K. pneumoniae в общих чертах оказалась весьма сходной с таковой у V. harveyi.

Наибольшее влияние на экспрессию nqr обоих исследованных микроорганизмов оказывала доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи. Характер анаэробной репрессии nqrA V. harveyi указывал на возможное участие в этом процессе регуляторной Arc-системы, поэтому в геноме V. harveyi был найден и инактивирован ген, гомологичный гену arcB из E. coli. Оказалось, что инактивация рецепторного белка ArcB этого микроорганизма никак не сказывалась на экспрессии изучаемого гена. Таким образом, данная анаэробная репрессия nqr осуществляется за счет активности какой-то другой, еще не установленной регуляторной системы, идентификация которой должна быть предметом дальнейших работ.

Также интересно отметить, что концентрации NaCl, использованные для обеих бактерий, заметно отличались. Морская бактерия V. harveyi способна расти при очень высоких концентрациях NaCl (вплоть до 1М), но не переносит уменьшения концентрации ионов натрия ниже 150 мМ. Другие соли, например, KCl, не могут заменить эффекта хлористого натрия. В тоже время энтеробактерия K. pneumoniae способна расти при очень низких концентрациях натрия (вплоть до микромолярных значений, присутствующих в других компонентах среды в качестве примесей), но практически останавливала рост при концентрации этого иона выше 300 мМ.

Исторически сложилось так, что все данные о структурных и кинетических характеристиках Na+-NQR были получены на ферментах из V.

alginolyticus, V. harveyi и V. cholerae, которые эволюционно очень близки друг к другу, и данные о свойствах одного фермента, по-видимому, можно отнести и к Na+-NQR из двух других бактерий. Однако не ясно, насколько отличаются друг от друга свойства Na+-NQR (например, КМ по натрию) из более эволюционно отдаленных микроорганизмов, обитающих в различных экологических нишах с сильно отличающимися концентрациями натрия в среде обитания.

Поэтому на следующем этапом нашего исследования был проведен сравнительный анализ каталитических свойств Na+-NQR из морской бактерии V. harveyi, энтеробактерии K. pneumoniae и почвенного микроорганизма A. vinelandii. Было показано, что сродство ферментов к ионам натрия увеличивается в ряду V. harveyi, K. pneumoniae и A. vinelandii.

Так, самое низкое сродство (КМ= 2,7 мМ) к Na+ характерно для Na+-NQR, выделенного из бактерии V. harveyi, обитающей в среде с концентрацией этого иона, равной 0,5 М. Сродство фермента из энтеробактерии K.

pneumoniae заметно выше – КМ=0,67 мМ. Еще выше сродство к ионам натрия у Na+-NQR, выделенного из почвенной бактерии A. vinelandi (КМ=0,1 мМ).

Также показано, что ферменты из различных бактерий значительно различаются по чувствительности к ингибиторам. Так, Na+-NQR из A.

vinelandii практически не чувствителен к HQNO, а Na+-NQR из K. pneumoniae полностью устойчив к действию Ag+ и NEM. Ранее было показано, что и такой высокоаффинный ингибитор Na+-NQR из V. harveyi как корормицин не оказывает действия на гомологичный фермент из H. influenzae [Hayashi et al., 2002]. Все исследованные ферменты типа Na+-NQR оказались чувствительны к DPI, который ковалентно модифицирует FAD на субъединице NqrF, при этом модификации FMN, принадлежащих субъединицам NqrB и NqrС, не происходит. Однако данный ингибитор малоспецифичен. Так, известно, что аналог DPI хорошо взаимодействует также с ферментами NDH-1 и NDH- типа [Majander et al., 1994;

Roberts et al, 1995]. Таким образом, основным уникальным свойством Na+-NQR, отличающим его от остальных NADH дегидрогеназ, является специфическая зависимость активности данного фермента от концентрации ионов натрия. Однако важно отметить, что и данное свойство Na+-NQR может быть труднодетектируемым, так как сродство к ионам натрия у этого белка может оказаться очень высоким, особенно у бактерий, живущих при низкой концентрации этого иона.

Ранее в нашей группе было установлено, что редокс-потенциалы всех оптически детектируемых кофакторов не зависят от концентрации ионов натрия. Это противоречило тому факту, что сродство к Na+ зависело от степени восстановленности фермента: восстановленный фермент обладал примерно в 1000 раз более высоким сродством по сравнению с окисленным ферментов (30 мкМ по сравнению с 24 мМ). Для объяснения полученных результатов нами было выдвинуто предположение, что Na+-NQR содержит какую-то дополнительную простетическую группу с натрий-зависимым редокс потенциалом. Изменение редокс состояния данной группы должно приводить к очень незначительным изменениям поглощения света в видимом диапазоне. Прежде всего, такими оптическими свойствами обладают некоторые металлы с переходной валентностью, связывание которых с белками чаще всего осуществляется за счет остатков цистеина, а также данные остатки, способные к образованию дисульфидных мостиков. При анализе первичных последовательностей субъединиц Na+-NQR из разных организмов были определены 4 консервативных остатка цистеина, расположенные внутри трансмембранных -спиралей.

Нами предполагалось, что изученные консервативные остатки цистеина могут принимать участие в формировании дополнительной редокс активной простетической группы Na+-NQR. Однако, эти остатки оказались необходимы для правильной сборки и (или) стабильности этого фермента, что подтверждает их важность в функционировании фермента. Поэтому гипотезу о том, что данные остатки цистеина могут играть роль дополнительного невидимого спектрально редокс кофактора, оказалось невозможно проверить напрямую с помощью сайт-специфического мутагенеза. Таким образом, необходимы дальнейшие работы для выявления роли этих остатков в электронном транспорте и транслокации ионов натрия.

ВЫВОДЫ Такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие 1.

разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию nqr генов V. harveyi и K. pneumoniae, кодирующих Na+ транслоцирующую NADH:хинон-оксидоредуктазу.

Экспрессия nqr V. harveyi и K. pneumoniae в значительной степени 2.

зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии. Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V. harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно восстановительных потенциалов. Установлено, что система ArcAB не участвует в регуляции экспрессии генов nqr V. harveyi.

Определены кинетические характеристики Na+-транслоцирующих 3.

NADH:хинон-оксидоредуктаз из V. harveyi, K. pneumoniae и A.

vinelandii: константы Михаэлиса по ионам натрия, а также параметры ингибирования этих ферментов дыхательным ингибитором 2-гептил- гидроксихинолин-N-оксидом. Показано различие действия SH реагентов (ионов серебра и N-этилмалеимида) на ферменты из этих бактерий.

Дифенилиодониум модифицирует только нековалентно 4.

присоединенный FAD, расположенный на субъединице NqrF, при этом не происходит модификации остатков FMN, принадлежащих субъединицам NqrB и NqrС.

При анализе первичных последовательностей субъединиц Na+-NQR из 5.

разных организмов определены 4 консервативных остатка цистеина, расположенные внутри трансмембранных -спиралей. С помощью сайт-направленного мутагенеза показана необходимость этих остатков для правильной сборки и функционирования Na+-транслоцирующей NADH:хинон-оксидоредуктазы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Фадеева М. С. (2005). Анализ мембранной топологии субъединицы NqrC натрийтранслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы.

Сборник тезисов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Секция Биоинженерии и Биоинформатики, Подсекция Биоинженерии, Москва, 12 – 15 апреля, с.

49 – 50.

2. Фадеева М. С. (2005). Исследование зависимости экспрессии NQR оперонов Vibrio harveyi и Klebsiella pneumoniae от условий внешней среды. Системная биология и биоинженерия. Материалы международной школы-конференции молодых ученых. Москва, ноября – 2 декабря, с. 66-68.

3. Fadeeva M.S., Yakovtseva Y.A., Bertsova Y.V., Bogachev A.V. (2006) Expression regulation of the nqr-operons in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae. Biochim. Biophys. Acta, Suppl. S, pp. 160-161.

4. Fadeeva M.S., Yakovtseva Y.A., Bertsova Y.V., Bogachev A.V. (2007).

Regulation of the nqr-operons expression in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae. FEBS J., 274, Suppl. 1, p. 226.

5. Fadeeva M.S., Yakovtseva E.A., Belevich G.A., Bertsova Y.V., and Bogachev AV. (2007) Regulation of expression of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase genes in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae. Arch. Microbiol., 188, 341-348.

6. Fadeeva M.S., Nez C., Bertsova Y.V., Espn G., and Bogachev A.V.

(2008). Catalytic properties of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductases from Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae, and Azotobacter vinelandii. FEMS Microbiol. Lett., 279, 116–123.

7. Фадеева М.С., Берцова Ю.В., Верховский М.И., Богачев А.В. (2008).

Сайт-направленный мутагенез консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE Na+-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы. Биохимия, 73, 154-161.