Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами ферментных препаратов, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта.

На правах рукописи

ШАСКОЛЬСКИЙ Борис Леонидович КОМПОЗИТНЫЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ С ЧАСТИЦАМИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ВКЛЮЧЁННЫХ В МАТРИЦУ КРИОГЕЛЯ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА.

03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Лаборатории криохимии (био)полимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Лозинский Владимир Иосифович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович, кандидат технических наук, доцент Ефременко Елена Николаевна Ведущая организация Центр “Биоинженерия” РАН

Защита состоится “20” октября 2009 г. в 10 часов 30 минут на заседании объеди нённого диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9) в аудитории 443 (конференц зал)

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204. кандидат технических наук Шакир И.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее эффективных подходов к ста билизации ферментов является их иммобилизация с использованием нераствори мых носителей. Кроме того, такие системы обладают возможностью технически несложного отделения от реагентов, что позволяет применять их многократно и получать незагрязнённый ферментом продукт.

В качестве носителей для иммобилизации ферментов широко используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К носителям предъявляются определённые требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, обладать химической, биологической стойкостью, механической прочностью, не вызывать неспецифической адсорбции и сильных конформационных изменений молекулы белка, легко гранулироваться и активироваться.

Перспективными носителями для иммобилизованных ферментов являются криогели поливинилового спирта – макропористые вязкоупругие полимерные ге левые материалы, получаемые в результате криогенной обработки, то есть после замораживания - выдерживания в замороженном состоянии – оттаивания водных растворов данного полимера. Полимерными криогелями называются гелевые мате риалы, сформированные в неглубоко замороженных растворах полимерных или мономерных предшественников. Неглубоко (умеренно) замороженными считаются системы при температурах не ниже, чем несколько десятков градусов от точки за мерзания чистого растворителя. Подобные системы, как правило, являются двух фазными, они содержат поликристаллы твердой фазы, которые выполняют роль порогенов, и небольшой объем остающегося еще жидким раствора – так называе мую незамерзшую жидкую микрофазу, где концентрируются растворенные веще ства и происходит формирование криогелевой матрицы. Образующиеся криогели обычно имеют макропористую (от 0,1 до 10 мкм) или сверхмакропористую струк туры (от 10 до 1000 мкм) с взаимосвязанными порами, что придает таким материа лам уникальный набор физико-химических свойств, а также позволяет использо вать их для решения ряда биомедицинских и биотехнологических задач.

Наиболее изученными представителями криогелей с макропористой струк турой являются криогели поливинилового спирта (КГПВС). Поливиниловый спирт (ПВС) доступен, является продуктом крупнотоннажного синтеза, каждая его марка стандартизована. Благодаря высокой прочности, выраженной пористости, биосо вместимости и стабильности в биологических средах КГПВС нашли широкое при менение в различных областях биотехнологии. В частности, криогели ПВС были использованы в качестве носителей для ковалентного присоединения белков и ферментов при получении макропористых иммуносорбентов и ряда иммобилизо ванных биокатализаторов, предназначенных для ферментолиза очень высокомоле кулярных субстратов или для работы в маловодных средах. В этом случае емкость криогеля ПВС как носителя, то есть содержание фермента в расчете на единицу массы или объема, составляет порядка 1-10 мг/г(мл), что характерно для крупнопо ристых матриц, существенная часть объёма которых приходится на поры, а коли чество реакционноспособных группировок полимера, расположенных в стенках этих макропор, относительно невелико. В этой связи представляют интерес иммо билизованные системы, в которых биокаталитическое действующее начало (в рас сматриваемом случае – препарат фермента) включено в матрицу макропористого криогеля ПВС в виде частиц дисперсного наполнителя, распределенного по всему объёму носителя, что позволило бы значительно повысить содержание фермента в соответствующем иммобилизованном биокатализаторе. При этом важным услови ем является сохранение хороших физико-механических свойств композитного геля, несмотря на включение в него механически непрочного ферментного наполнителя и отсутствие препятствий в технически несложной методике получения гранулиро ванных гелевых препаратов на основе водных растворов ПВС.

Целью работы являлось изучение возможности получения композитных биокатализаторов с матрицей из криогеля поливинилового спирта и включённым в неё биокатализатором в виде частиц мелкодисперсного наполнителя. В связи с за явленной целью решались следующие задачи:

1. Исследование физико-химических свойств криогеля поливинилового спирта (морфологических, теплофизических и физико-механических) при разных условиях получения.

2. Изучение разных вариантов формирования дисперсных ферменто содержащих наполнителей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС. Оценка каталитических свойств наполнителей.

3. Изучение физико-механических свойств и ферментативной активности ком позитных биокатализаторов.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В диссертационной работе показана взаимосвязь между концентрацией ПСВ в рас творе и морфологией получившегося в результате криогенной обработки криогеля поливинилового спирта. Впервые показана возможность получения композитных биокатализаторов, состоящих из мелкодисперсных частиц ферментативно активного наполнителя, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта.

Показано, что включениё наполнителя в матрицу КГПВС не приводит к ухудше нию физико-механических характеристик криогеля поливинилового спирта.

Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены в 5 печат ных работах, в том числе 2 статьях в научных журналах, 3 – сборниках статей и ма териалах конференций. Работа была награждена дипломом за лучшее стендовое сообщение на VII научной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. “Ма териалы и технологии XXI века”.

Личный вклад автора в работах, выполненных в соавторстве и включённых в диссертацию, состоял в проведение экспериментальных исследований, обработке, интерпретации и обобщении полученных результатов.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 136 страницах печат ного текста, содержит 17 рисунков, 9 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка ци тируемой литературы (213 наименований) Работа выполнена в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН и явилась продолжением и частью исследований, направленных на создание эффек тивных носителей биотехнологического назначения в рамках проектов по грантам РФФИ 05-04-08018_офи_а, РФФИ 07-04-12132_офи_а и РФФИ 07-03-96682-РА_а.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Некоторые физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта, используемых в качестве носителей для иммобилизации фер ментов.

С целью выяснения характера изменений свойств криогеля ПВС при разных условиях получения и для обеспечения возможности выбора условий, приводящих к формирования матриц данного типа с наиболее подходящими характеристиками для последующего использования в качестве носителя композитного биокатализа тора, были проведены исследования влияния концентрации ПВС на свойства крио гелей, образующихся в результате криотропного гелеобразования. Было показано, что с повышением концентрации гелеобразующего полимера в исходном растворе возрастали жесткость и теплостойкость получающихся криогелей (коэффициенты корреляции параметров условно-мгновенного модуля сдвига (G0) и температуры плавления геля (Tf) в диапазоне концентраций полимера 80-120 г/л оказались рав ными 0.99, т.е. взаимосвязь жесткости и теплостойкости таких КГПВС была очень тесной). В частности повышение начальной концентрации ПВС с 80 до 120 г/л в подвергаемом криогенной обработке растворе полимера приводило к возрастанию сдвигового модуля соответствующих криогелей от 2.6 до 10 кПа, а температура плавления КГВПС повышалась на 5.1оС (таблица 1).

Характерной особенностью строения криогелей ПВС является наличие про тяженных пор со средним сечением 0.18-0.26 мкм. Следствием того, что макропо ры формируются на месте расплавленных кристаллов порообразователя (льда), взаимно соприкасающихся и ограничивающих размер друг друга, является взаимо связанность пор между собой, а также примерно одинаковый размер пор в полу чаемом геля. Вышеперечисленные особенности морфологии криогеля ПВС приво дят к тому, что полученная таким образом матрица не создаёт дополнительных диффузионных затруднений для растворимых соединений. Исследование особен ностей структуры КГПВС с помощью световой микроскопии выявило (таблица 2) некоторые различия в морфологии криогелей, сформированных из растворов с раз ной концентрацией полимера.

Таблица 1. Физико-механические свойства КГПВС, сформированных*) из растворов с различной концентрацией поливинилового спирта.

Концентрация ПВС Температура в исходном плавления G растворе (кПа) КГПВС (С) (г/л) 2.58 ± 0.11 68.4 ± 0. 5.63 ± 0.41 70.9 ± 0. 10.0 ± 1.7 73.5 ± 1. *) Температура замораживания-выдерживания: –20С, время выдерживания в заморожен ном состоянии: 24 ч, скорость оттаивания: 0.3С/мин.

Таблица 2. Данные анализа*) изображений микрофотографий структуры КГПВС.

Данные морфометрии Концентрация ПВС в Пористость Среднее сечение исходном растворе, (% от общей площади пор (г/л) изображения) (мкм) 80 52.2 0. 100 55.8 0. 120 43.8 0. *) Математическая обработка и анализ изображений выполнены И.И. Курочкиным (Ин ститут системного анализа РАН) и д.х.н. И.Н. Курочкиным (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет).

При этом наблюдалась тенденция к утолщению элементов гелевой фазы при повышении концентрации ПВС в исходном растворе, подвергаемом криообработ ке. Кроме того, нами было обнаружено, что с повышением содержания полимера в системе имеют место изменения общей морфологии препаратов, главным образом, в отношении регулярности их пористой структуры (рис. 1).

Таким образом, проведённые исследования позволяют говорить о наличии взаимосвязи между структурой криогеля ПВС и его физико-механическими свой ствами при изменении концентрации ПВС. Применение такого подхода, как повы а Б в Рисунок 1. Микрофотографии тонких срезов криогелей ПВС, полученных из раствора с концентрацией полимера 80 г/л – а), 100 г/л – б), 120 г/л – в).

шение концентрации исходного полимера, позволяет относительно просто улуч шить механические характеристики получаемого криогеля, что важно для успеш ного использования иммобилизованных биокатализаторов с матрицей из криогеля ПВС.

Ферментативно-активные наполнители Для изучения разных вариантов дисперсных ферменто-содержащих наполни телей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС, и оценки биокаталии ческих свойств наполнителей были получены наполнители трёх типов.

Первый тип наполнителей – препараты фермента, сшитого в растворе совме стно с полимером, обычно синтезируют при добавлении буфункционального сши вающего агента к совместному раствору фермента и полимера, содержащего необ ходимые химические группировки.

Второй тип наполнителей – это поперечно-сшитые ферментные агрегаты (ПСФА). Такие препараты получают при воздействии на раствор фермента би функциональных сшивающих агентов и осадителей, в качестве которых обычно применяются неорганические соли, органические растворители или растворы по лимеров.

Третий тип наполнителей представляет собой какой-либо мелкодисперсный носитель с пришитым ферментом;

далее частицы подобного иммобилизованного препарата могут быть включены в матрицу криогеля ПВС.

В качестве наполнителя первого типа в нашей работе были получены и ис пользованы сшитые глутаровым альдегидом (ГА) гели трипсина с хитозаном. По сле определения критической концентрации гелеобразования для соответствующей системы «хитозан – глутаровый альдегид» (таблица 3) были получены ферменто содержащие дисперсные препараты.

Таблица 3. Зависимость времени образования гелевого препарата хитозана от концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси.

Концентрация ГА в Концентрация хитоза- Время образования реакционной смеси на в реакционной смеси геля (%) (%) 0,01 2,3 Не образуется 0,03 2,2 Не образуется 0,06 2,2 Не образуется 0,12 2,2 Не образуется 0,2 2,1 Более 6 часов 0.3 2,1 100 минут 0,6 2,0 45 минут 0.7 2,0 20 минут 1,2 1,8 5 минут При этом было найдено, что активность трипсина, используемого нами в каче стве модельного фермента, сохраняется в тем большей степени, чем выше концен трация хитозана в реакционной смеси (таблица 4). Этот результат объясняется тем, что при добавлении в систему хитозана и сохранении концентраций трипсина и глутарового альдегида (неблагоприятно влияющего на активность ферментов) воз растает общая концентрация аминогрупп, а доля аминогрупп, приходящихся на фермент, уменьшается пропорционально повышению содержания хитозана в сме си.

Второй тип наполнителя это поперечно-сшитые ферментные агрегаты (ПСФА). Было исследовано влияние режимов сшивки и осаждения трипсина на выход ПСФА и их ферментативную активность. Было найдено, что если первона чальное воздействие ГА на раствор трипсина длилось 5 минут и более, то получить поперечно-сшитые ферментные агрегаты не удавалось. Такой результат можно объяснить тем, что ГА успевал прореагировать с большинством доступных ами ногрупп белка в растворе, в результате чего образование межмолекулярных связей внутри частиц коагулята, осажденного под действием ацетона или изопропанола, оказывалось невозможным. При первоначальном осаждении фермента изопропа нолом или ацетоном, а так же при одновременном прибавлении к водному раство ру фермента раствора ГА в осадителе, выход ПСФА был тем больше, чем выше была концентрация ГА в системе. Поэтому были выбраны условия, обеспечиваю щие количественный выход ПСФА – прибавление к раствору фермента 0,4 М рас твора ГА в ацетоне или изопропаноле с последующей инкубацией реакционной системы на ледяной бане в течение 4 ч с перемешиванием.

Таблица 4. Ферментативная активность трипсина в составе сшитых гелей трипсина с хитозаном.

Сохранение активности Активность Активность препарата фермента фермента в Концентрация Концентрация Концентрация хитозана трипсина ГА (ед. акт./г (ед. акт./мг составе (мг/г) (мг/г) (мг/г) носителя) белка) ПСФА ( %) 18 0,5 7 0,6 1,2 7 4,3 7 2,4 0,63 Активность ПСФА, оцененная по кинетике гидролиза N--бензоил-L аргинин-4-нитроанилида (БАНА), не зависела от типа осадителя и была примерно одинаковой у препаратов, полученных с использованием ацетона и изопропанола.

Результаты, полученные при скоростях прибавления осадителя от 13,3 мл/с до 0, мл/с (в пересчёте на исходный объёма раствора фермента 4 мл) и температурах осадителя -10°С, или 0°С, или +22°С, приведены в таблице 5.

Выход ПСФА достигал количественного уровня при скорости разбавления от 13 до 0,4 мл/с. Если же добавление осадителя происходило ещё медленнее, то образования ПСФА не наблюдалось. Это объясняется тем, что после взаимодейст вия ГА с большинством аминогрупп растворимого фермента не остаётся аминог рупп, с которыми может провзаимодействовать свободная альдегидная группа глу тарового альдегида, связанная одним концом молекулы с белком. Описанный выше феномен подобен близкому к нулю выходу, который имел место при таком методе получения ПСФА, когда после длительной инкубации раствора фермента с ГА к системе добавляли осадитель.

Таблица 5. Зависимость активности ПСФА от скорости разбавления и температуры осадителя.

Температура Время прибавле- Скорость прибавления Средняя активность осадителя ния осадителя осадителя к раствору ПСФА (ед.акт. на 1 мг (С) (с) (мл/с) белка) 0,052±0, -10 3 13, 0,066±0, 23 1, 0,056±0, 46 0, 0,063±0, 69 0, 0,054±0, 92 0, 600 0,07 не удалось определить 0,088±0, 0 3 13, 0,050±0, 23 1, 0,056±0, 46 0, 0,069±0, 69 0, 0,059±0, 92 0, 600 0,07 не удалось определить 0,054±0, 22 3 13, 0,050±0, 23 1, 0,040±0, 46 0, 0,059±0, 69 0, 0,035±0, 92 0, 600 0,07 не удалось определить Активность ПСФА максимальна при наибольшей скорости добавления оса дителя с температурой 0°С. Температура 0°С обеспечивала наиболее мягкое проте кание реакции, и, как следствие этого, более высокое сохранение ферментативной активности по сравнению с другими температурами.

Так как ферментативная активность трипсина при образовании ПСФА за метно падала, и, учитывая обнаруженное “защитное” влияние добавок хитозана при ковалентной иммобилизации ферментов, данный полиаминосахарид был также дополнительно введен в тот раствор фермента, из которого затем получали ком плексные ПСФА на основе трипсина с добавками хитозана. Иными словами, фер мент соосаждался изопропанолом совместно с хитозаном, а присутствующий в сис теме ГА химически сшивал такой двухкомпонентный коагулят. Данные рис. 2 по казывают, что как и в случае формирования сшитых комплексных гелей трип син/хитозан, увеличение количества добавленного в исходный раствор полиамино сахарида в результате приводит к более высокой ферментативной активности по лучающихся препаратов трипсина, в данном случае – комплексных ПСФА. Вместе с тем вполне понятно, что нецелесообразно существенно повышать концентрацию хитозана в таких препаратах, поскольку это снижает содержание в них действую щего каталитического начала, собственно фермента. Поэтому при последующем включении такого наполнителя в матрицу криогеля ПВС для получения композит ного биокатализатора нами был использован комплексный препарат ПСФА, приго товленный при концентрации хитозана 12,8 мг/г в совместном растворе с трипси ном.

Рисунок 2. Зависимость относи тельной активности трипсина, входящего в состав трипсин хитозановых сшитых агрегатов, от концентрации хитозана в реакци онной смеси, подвергаемой осаж дению.

Невысокий уровень сохранения ферментативной активности при получении трипсиновых ПСФА, вероятно, объясняется взаимодействием ГА с активным цен тром трипсина. Подобное действие глутарового альдегида при получении ПСФА известно из литературы но, поскольку наша задача состояла не в получение кон кретного иммобилизованного биоктализатора, а в разработке подходов, позволяю щих сформировать удобные в применении композитные иммобилизованные биока тализаторы, обладающие высокой ёмкостью по биокаталитическому началу, то дальнейшая оптимизация условий получения иммобилизованного трипсина была признана нецелесообразной.

Третий тип нерастворимых препаратов трипсина, использовавшихся в каче стве дисперсных наполнителей при получении композитных биокатализаторов, это – фермент, химически пришитый к мелким полимерным частицам. Для формиро вания такого наполнителя сначала были получены ковалентно-сшитые гели ПВС (таблица 6) при взаимодействии водных растворов ПВС и ГА в сильнокислой сре де. Наиболее удобными в работе оказались образцы, при получении которых от ношение количества мономерных звеньев ПВС к количеству молекул ГА составля ло 1,32;

это соотношение использовали в дальнейшей работе. После введения в сшитый гель ПВС дополнительных альдегидных группировок и последующего присоединения фермента были получены препараты с ёмкостью носителя 25,2 мг белка на 1 г влажного веса препарата;

а его ферментативная активность была 0, ед. акт./мг.

Таблица 6. Концентрации ГА и ПВС в реакционной смеси и мольные соотношения звеньев ПВС и ГА при получении сшитых гелей ПВС.

Концентрация ПВС Концентрация Мольное отношение Результат взаимо в реакционной сме- ГА в реакцион- количества моно- действия ГА и ПВС си ной смеси мерных звеньев ПВС в указанных кон (%) (%) к количеству ГА центрациях 2,27 0,98 5,26 Образование геля 2,23 1,92 2,64 Образование геля 2,16 3,70 1,32 Образование геля 2,02 6,90 0,66 Образование геля 1,79 12,12 0,33 Образование геля Композитные биокатализаторы Для формирования композитных биокатализаторов применялась однотипная методика: соответствующий препарат трипсина измельчали до частиц размером 5 25 мкм, суспендировали в растворе ПВС и затем из этой суспензии на установке для получения замороженных гранул формировали композитный биокатализатор в виде частиц, близких по форме к сферическим. В работе были получены гранулы диаметром 0,7-1,5 мм (рис. 3).

а б Рисунок 3. Микрофотографии гранул криогеля поливинилового спирта:

а) ненаполненных и б) содержащих включённые частицы измельчённых поперечно-сшитых ферментных агрегатов.

Пористая морфология полимерного криогеля обеспечивает диффузионно незатрудненный транспорт субстратов и продуктов биокаталитического процесса.

Подтверждением этого служат приведённые на рис. 4 кривые изменения оптиче ского поглощения раствора пара-нитроанилина, выделяющегося при гидролизе хромогенного субстрата БАНА эквивалентными количествами трипсина, входяще го в состав ПСФА и композитного биокатализатора, состоящего из ПСФА, вклю чённых в макропористую матрицу криогеля поливинилового спирта. Видно, что несмотря на наличие некоторого индукционного периода на начальных участках соответствующих кинетических кривых, связанного с необходимостью начальной диффузии субстрата через поры геля к каталитически-активным частицам, прямо линейные участки кривых имели практически одинаковый наклон, что свидетель ствует об отсутствии препятствий со стороны матрицы криогеля ПВС для массопе реноса субстрата и продуктов реакции.

Рисунок 4. Оптическое поглощение при 405 нм реакционных растворов при гидролизе хромогенного субстарата (БАНА) одинаковым количеством трипсина в составе поперечно-сшитых ферментных агрегатов и композитного биокатализатора, полученного путём включения поперечно-сшитых фер ментных агрегатов в матрицу криогеля поливинилового спирта.

Для выяснения вопроса о том не ухудшаются ли физико-механические свой ства композитной системы “криогель ПВС – наполнитель” по сравнению с кон трольным криогелем ПВС был приготовлен ряд препаратов с включением частиц наименее жёстких из использованных нами наполнителей – ПСФА на основе трип сина и ПСФА с хитозаном. Для этих композитов затем измерили величину услов но-мгновенного сдвигового модуля (G0 – характеризует упругие свойства материа ла) и сдвигового модуля за 30 мин действия нагрузки (G30 – характеризует пласти ческие свойства испытуемого объекта). Полученные результаты суммированы в таблице 7.

Анализ данных этой таблицы показывает, что при включении подобных на полнителей в матрицу криогеля ПВС физико-механические свойства сформиро ванных таким образом композитов не только не ухудшались, а имело место даже заметное повышение жесткости соответствующих препаратов. При этом, если в случае ненаполненных (контрольных) криогелей увеличение концентрации ПВС в исходном растворе приводило к систематическому повышению значений G0 и G30, то для композитных криогелей абсолютная величина упрочняющего эффекта еще зависела и от концентрации наполнителя, и от его типа.

Отсюда следует, что, во-первых, ухудшения прочностных показателей геле вого носителя не следует опасаться и, во-вторых, при разработке композитных биокатализаторов этого вида необходимо проводить оптимизацию такого парамет Таблица 7. Физико-механические свойства композитной системы «криогель ПВС – наполнитель» и контрольных образцов криогеля ПВС.

Состав исходной композиции Физико механические ха ПВС (г) Наполнитель (ПСФА) Вода рактеристики крио (мл) геля Тип Количество G0 (кПа) G30 (кПа) (г) 7,5 – – 100 3,3 ± 0,2 2,9 ± 0, ПСФА 22,9 100 8,3 ± 1,0 5,3 ± 0, 8 – – 100 4,4 ± 0,3 2,3 ± 0, ПСФА 25 100 7,6 ± 0,4 5,2 ± 0, ПСФА 34,4 100 6,6 ± 1,4 4,5 ± 0, 9 – – 100 5,6 ± 0,4 3,8 ± 0, ПСФА 22,2 100 9,5 ± 0,7 5,6 ± 0, 8 – – 100 3,3 ± 0,2 2,3 ± 0, ПСФА с 33,3 100 4,8 ± 0,2 1,8 ± 0, хитозаном ра, как степень наполнения, чтобы в результате получить препараты с желаемым сочетанием упругих и пластических свойств.

Ферментативная активность поперечно-сшитых ферментных агрегатов Ферментативная активность композитных биокатализаторов с включенными в криогель ПВС частицами различных наполнителей была определена в отношении гидролиза специфического для трипсина субстрата – БАНА. Поскольку содержа ние фермента в композитных препаратах было разным для разных наполнителей, то мы вычислили как значения общей активности каждого иммобилизованного биокатализатора в расчете на единицу массы влажного образца, так и, когда это удалось определить экспериментально, значения удельной активности в расчете на 1 мг трипсина. Полученные данные суммированы в таблице 8.

Было найдено, что активность, проявляемая композитными биокатализато рами, зависела, во-первых, от ферментативной активности включаемого в матрицу криогеля ПВС наполнителя, во-вторых, от степени наполнения, и, в третьих, от удельной активности собственно трипсина в составе его соответствующего нерас творимого препарата. Согласно этим данным, наибольшей суммарной активностью обладал композитный биокатализатор, содержавший в качестве наполнителя ПСФА на основе трипсина без добавок, а наибольшая удельная активность самого фермента сохранялась в случае композитного биокатализатора с включенными в матрицу криогеля ПВС частицами наполнителя на основе комплексного ПСФА “трипсин-хитозан”.

Таблица 8. Ферментативная активность композитных биокатализаторов.

Тип наполни- Ферментативная Содержание Ферментативная ) теля активность наполнителя * наполнителя активность композита *) в композите (г / г влажно ед.акт. / г ед.акт. / мг ед.акт. / г ед.акт. / го препарата) влажного белка мг препарата влажного белка препарата Сшитые гели 2,5 0,58 0,176 0,79 0, трипсина с хи тозаном Трипсиновые 7.2 0,07 0,189 1,19 0, ПСФА Трипсиновые 4,3 0,52 0,236 0,85 0, ПСФА с хито заном Трипсин, им- 7,7 0,31 0,196 0,32 0, мобилизован ный на сши тых гелях ПВС *) в реакции гидролиза БАНА Также для композитных биокатализаторов, содержащих в качестве наполни телей трипсиновые ПСФА, были изучены зависимости каталитической активности от рН среды и температуры ферментативной реакции. Оказалось, что по сравнению с трипсином в растворе рН-оптимум для ПСФА и композитных биокатализаторов с включенным в криогель ПВС частицами таких наполнителей несколько расширя ется и сдвигается в щелочную область, соответственно, примерно на одну и две единицы (рис. 5 и 6). что скорее всего, связано с изменением баланса зарядов груп пировок активного центра белковой молекулы, когда они химически модифициру ются в реакциях фермента с реакционноспособным носителем или кросс-агентом.

При этом, для ПСФА без добавок и соответствующего композита (рис. 6) на блюдался больший сдвиг в щелочную область рН-оптимума, чем для ПСФА с хи тозаном и композитного биокатализатора с таким наполнителем (рис. 5), что скорее всего свидетельствует о меньшей степени модификации группировок фермента, трансформируемого в ПСФА в присутствии хитозана. Кроме того, было обнаруже но, что переведение трипсина в форму ПСФА очень сильно повышает термоста бильность фермента, и это свойство присуще также и композитным биокатализато рам с подобными наполнителями (рисунки 7, 8).

При изучении кинетических характеристик тех же препаратов трипсина бы ло найдено (таблица 9), что для иммобилизованных биокатализаторов с такими на полнителями, как поперечно-сшитые агрегаты, характерно менее эффективное свя зывание субстрата по сравнению с растворимым ферментом, так как у иммобили зованных биокатализаторов значения константы Михаэлиса (0,63 и 0,31 ммоль/л, соответственно) были больше значения Km = 0,86 ммоль/л, найденного для раство римого трипсина.

Кроме того, для иммобилизованных препаратов наблюдалось заметное сни жение каталитической константы, что могло быть следствием конкуренции за суб страт собственно в пределах каждой высококонцентрированной по ферменту час тицы ПСФА. В пользу этого предположения свидетельствует значение kcat = 5, мин-1 у композитного биокатализатора с наполнителем из трипсиновых ПСФА по сравнению с kcat = 9,1 мин-1 для композита с наполнителем из трипсиновых ПСФА с хитозаном, поскольку в первом случае локальная концентрация трипсина в час тицах ПСФА выше, чем во втором случае, где фермент как бы “разбавлен” хитоза ном.

Рисунок 5. Зависимость ферментативной Рисунок 6. Зависимость ферментативной ак активности ПСФА с хитозаном, соответст- тивности ПСФА, композитного биокатали вующего композитного биокатализатора и затора и растворимого трипсина от рН среды растворимого трипсина от рН среды фер- ферментативной реакции.

ментативной реакции Рисунок 7. Зависимость фермента-тивной Рисунок 8. Зависимость ферментативной ак активности ПСФА, композитного биоката- тивности ПСФА с хитозаном, соответст лизатора и растворимого трипсина от тем- вующего композитного биокатализатора и пературы ферментативной реакции растворимого трипсина от температуры ферментативной реакции.

Также было найдено, что при хранении все композитные препараты облада ли хорошей стабильностью, сохраняя практически 90% активности после 6-ти ме сяцев выдерживания при 4-6 °С.

Таблица 9. Кинетические характеристики растворимого трипсина и композитных иммобилизованных биокатализаторов на основе трипсиновых ПСФА и трипсиновых ПСФА с хитозаном.

kcat/Km Km Vmax kcat (мин-1) Образец (ммоль/л) (мкмоль/мин) (л/ммоль·мин) Растворимый трипсин 0,86 62 69 80, Композитный биокатализатор на основе трип синовых ПСФА, включенных в криогель ПВС 0,63 8,9 5 7, Композитный биокатализатор на основе трип синовых ПСФА с хитозаном, вклю ченных в крио гель ПВС 0,31 2,5 9,1 29, ВЫВОДЫ 1. Исследовано влияние концентрации поливинилового спирта на физико механические и теплофизические свойства, а также структуру гелей (криогелей), получаемых при криогенной обработке водных растворов данного полимера. Пока зано, что повышение концентрации полимера в растворе, подвергаемом заморажи ванию – выдерживанию в замороженном состоянии – оттаиванию, приводит к воз растанию жёсткости сформированных образцов, повышению температуры их плавления, к утолщению элементов гелевой фазы и к более упорядоченной макро пористой морфологии образующихся криогелей.

2. Проведено изучение процессов формирования сшитых гелей трипсина с хи тозаном, поперечно-сшитых ферментных агрегатов трипсина, поперечно-сшитых ферментных агрегатов трипсина с хитозаном и препаратов трипсина, иммобилизо ванного на сшитых гелях поливинилового спирта. Найдено, что выход поперечно сшитых ферментных агрегатов значительно уменьшается при низких скоростях разбавления раствора фермента раствором осадителя-сшивателя или при больших временных интервалах между прибавлением к системе сшивателя и осаждением белка;

такой результат объясняется довольно быстрой модификацией аминогрупп белка, способных участвовать в реакциях межмолекулярной сшивки. Отмечено значительное стабилизирующее влияние хитозана на сохранение активности трип сина при его иммобилизации с помощью глутарового альдегида как в составе ком плексных поперечно-сшитых ферментных агрегатов, так и в составе триспин хитозановых гелей.

3. Продемонстрирована возможность получения композитных биокатализато ров на основе дисперсных ферментосодержащих препаратов, включённых в матри цу криогеля поливинилового спирта. Показано, что матрица композитного биока тализатора не создаёт серьёзных препятствий для протекания катализируемых ферментом реакций.

4. При изучении влияния ферментных наполнителей на физико-механические свойства композитных биокатализаторов найдено, что включение в матрицу крио геля поливинилового спирта дисперсных частиц ферментосодержащих наполните лей приводит к заметному повышению жёсткости сформированных композитных криогелей.

5. Показано, что композитные иммобилизованные биокатализаторы обладают повышенной температурной и рН стабильностью, а также сохраняют свою актив ность при длительном хранении.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах 1. Лозинский В.И. Изучение криоструктурирования полимерных систем. 27.

Физико–химические свойства криогелей поливинилового спирта и особенности их макропористой морфологии / В.И. Лозинский, Л.Г. Дамшкалн, Б.Л. Шаскольский, Т.А. Бабушкина, И.Н. Курочкин, И.И. Курочкин // Коллоидный журнал. – (2007) – Т. 69 – № 6. – C. 798-816.

2. Шаскольский Б.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотех нологии. VII. Композитные иммобилизованные биокатализаторы с частицами фер ментного препарата, включенного в матрицу криогеля поливинилового спирта / Б.Л. Шаскольский, М.С. Фогораси, М.Д. Станеску, В.И. Лозинский // Биотехноло гия. – (2009) – № 1. – С. 71-82.

3. Шаскольский Б.Л.. Поперечно-сшитые ферментные агрегаты, включённые в криогель поливинилового спирта / Б.Л. Шаскольский, Т.В. Бурова, В.Я. Гринберг, Н.В. Гринберг, В.И. Лозинский // Тез. докл. Междунар. научн. конф. “Фундамен тальные и прикладные современной химии в исследовании молодых учёных”. Аст рахань – 2006. – С. 45.

4. Шаскольский Б.Л.. Разработка полимерных криогелей для получения мате риалов биотехнологического назначения / Б.Л. Шаскольский, Р.В. Иванов // Тез.

докл. VII Научн. конф. молодых учёных, аспирантов и студентов “Материалы и технологии XXI века”. Казань, 2007. – С. 137.

5. Шаскольский Б.Л. Композитные ферментные иммобилизованные биокатали заторы с матрицей из криогеля поливинилового спирта / Б.Л. Шаскольский, В.И.

Лозинский // Материалы Международной научно-практической конференции “Но вые технологи в экспериментальной биологии и медицине”. Ростов-на-Дону, 2007.

– С. 158.

Заказ № Объем п.л. Тираж 100 экз.

Издательский центр РХТУ им. Д.И. Менделеева