Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа quorum sensing у морских бактерий. (

На правах рукописи

МАНУХОВ Илья Владимирович СТРУКТУРА LUX-ОПЕРОНОВ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТИПА «QUORUM SENSING» У МОРСКИХ БАКТЕРИЙ.

(03.02.07 – Генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2011 2

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП Государственного научно исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика») Научный консультант доктор биологических наук, профессор Завильгельский ФГУП «ГосНИИгенетика» Геннадий Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор НИИ ФХБ им А. Н. Белозерского Богачёв Александр МГУ имени М.В. Ломоносова Валерьевич Доктор биологических наук, профессор ЗАО «Научно-Исследовательский институт Лившиц Виталий Аджиномото-Генетика» Аркадьевич Доктор биологических наук, профессор Учреждение Российской Академии Наук Колб Вячеслав Институт Белка РАН Адамович.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН

Защита диссертации состоится ““ 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при Федеральном Государственном Унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика») по адресу 117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, дом 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» Автореферат разослан “_” _ 2011 г

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук, доцент Воюшина Т.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В последние 15 лет достигнут значительный прогресс в понимании механизмов регуляции генов по принципу «Quorum Sensing» (QS). QS – система регуляции экспрессии генов в ответ на увеличение плотности популяции клеток. Различные виды бактерий используют QS для скоординированного ответа, согласованного с локальной плотностью их популяции. Системы регуляции генов типа QS играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, животными и растениями, как при патогенезе, так и при симбиозе. Впервые феномен регуляции генов по типу QS был обнаружен в 1970-е годы у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы lux-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979).

Однако термин QS был впервые введен в обиход значительно позже в 1994 г Greenberg E.P. с сотр. (Fuqua W.C., et al 1994). В результате активного изучения было обнаружено, что феномен QS широко распространён среди бактерий. Оказалось, что ряд генов, определяющих вирулентность патогенных микроорганизмов и устойчивость к лекарственным препаратам, регулируется по принципу QS, что имеет особое значение для медицины и поэтому вызывает высокий интерес научного сообщества к данной проблеме.

Lux-оперон морских бактерий Aliivibrio fischeri в настоящее время принято считать модельным в исследованиях QS систем, а по обозначению белка LuxR, регулятора lux оперона было определено семейство LuxR-гомологичных белков – регуляторов QS систем первого типа. В настоящее время остаются открытыми ряд вопросов об эволюционном происхождении феномена биолюминесценции бактерий, а также о механизмах стабилизирующего отбора lux-оперонов у свободноживущих видов бактерий.

Продолжаются поиски новых регуляторных QS систем у бактерий и исследования факторов, модулирующих QS ответ бактерий в зависимости от состояния клетки.

Актуальна также проблема молекулярной биологии и биофизики - фолдинг и рефолдинг белков и роль белков – шаперонов в этих процессах. В диссертационной работе для этой цели впервые используются различающиеся по термостабильности, но гомологичные по аминокислотной последовательности бактериальные люциферазы психрофильных и мезофильных морских люминесцирующих бактерий.

Кодируемые генами бактериальных lux-оперонов люциферазы в настоящее время широко используются в работах по молекулярной генетике (гены - репортеры), при биохимических анализах, в генно-инженерных работах (селекция) и ряде других. Большое распространение приобрели работы по экологическому мониторингу, тестированию токсикантов в пищевых продуктах, а также разработке и тестированию новых медицинских препаратов с помощью цельноклеточных биосенсоров, которые основаны на транскрипционных слияниях генов бактериальных люцифераз с индуцируемыми стрессовыми промоторами.

Цель и задачи исследований.

Целью данной работы являлось изучение механизмов регуляции lux-оперонов морских люминесцирующих мезофильных и психрофильных бактерий, а также исследование роли шаперонов в фолдинге и рефолдинге термолабильных белков на модели различающихся по термостабильности бактериальных люцифераз.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи.

Изолировать штаммы психрофильных люминесцирующих бактерий, Определить видовую принадлежность изолированных штаммов.

Клонировать и секвенировать lux-опероны бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.

Провести сравнение механизмов регуляции lux-оперонов психрофильных и мезофильных бактерий рода Aliivibrio.

Определить влияние на активность регуляторного белка LuxR АТФ-зависимых шаперонов и протеаз.

Исследовать роль N- и С-концевых доменов белка LuxR при взаимодействии с шапероном GroEL/ES и протеазой Lon.

Исследовать in vivo воздействие различных шаперонов на рефолдинг белков, различающихся по термостабильности на модели гомологичных бактериальных люцифераз, изолированных из люминесцирующих бактерий, характеризующихся различным температурным оптимумом роста.

Сконструировать и показать эффективность применения lux-биосенсоров, созданных на основе штаммов E.coli, содержащих гибридные плазмиды с генами бактериальных люцифераз в качестве репортёрных, расположенных под контролем различных индуцируемых (стрессовых) промоторов.

Научная новизна работы.

Впервые определена структура lux-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от lux-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена luxR, в lux-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxR1 и LuxR2 различаются как по аминокислотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий Aliivibrio salmonicida (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

Впервые показано, что АТФ-зависимая протеаза Lon участвует в негативной регуляции систем QS у морских бактерий. Доказано, что шаперонин GroEL/ES участвует в сборке нативной формы белка LuxR.

Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N – домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Lon-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином GroEL, необходимым для сборки нативной структуры LuxR.

Впервые для анализа работы шаперонов были использованы в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.

Показано впервые, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), Hsp (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHsp (IbpAB).

Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

Сконструированы новые формы lux-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1 диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана.

Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и супероксид-анион).

Практическая значимость исследования.

Практически значимым результатом работ по изучению люцифераз, различающихся по термостабильности, явилось создание высокочувствительных специфических lux-биосенсоров. Использование транскрипционных слияний стрессовых и других индуцируемых промоторов с генами бактериальных люцифераз в качестве репортерных позволило создать набор биосенсоров, специфически реагирующих на различные токсиканты и другие биологически активные вещества. Данные биосенсоры в настоящее время применяются для работ по экологическому мониторингу, тестированию медицинских препаратов и для изучения механизмов воздействия на клетку различных токсикантов.

Полученные в работе данные о влиянии шаперонов и протеаз на активность белка LuxR могут быть использованы для создания более чувствительных биосенсоров для детекции аутоиндукторов первого типа. А также бактериальные люциферазы в настоящее время используются в качестве модели для изучения механизмов рефолдинга денатурированных белков.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены и обсуждались на 16-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (16th ISBC April 19–23, 2010, Lyon, France), III съезде Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2001), Объединенном Съезде генетиков и селекционеров России, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина, и Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров.. (ВОГИС с 21 по 28 июня 2009 г. Москва), конференции европейского биохимического общества (FEBS-IUBMB-2005 Conference in Budapest, Hungary) и других конференциях и семинарах. Диссертационная работа была апробирована на секции «Генетика микроорганизмов» Диссертационного совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 24 мая 2011 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликована 21 статья в рецензируемых журналах.

Структура диссертации.

Диссертационная работа включает 6 глав, 151 страницу, 58 рисунков и 4 таблицы. В работе использовано 208 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Бактериальные штаммы и плазмиды. E. coli K12 TG-1;

E. coli МС1061;

E. coli AB – получены из коллекции ВКПМ ГосНИИгенетика;

SKB178;

OFB111 groEL673;

groEL97;

groES::Tn10 - Georgopoulos C.P. et al.,1973;

МG1655 и PK202 – от Элизабет Крэйг (США);

E. coli SG20250 и E. coli SG20100 clpB- получены от S.Gottesman (США). E. coli BW25113, JW3663 ibpB::kan и JW3664 ibpA::kan получены от Машко С.В. (Keio collection). Штаммы A. fischeri MJ-1 и МГУ-6 – получены от А. П. Зарубиной (кафедра микробиологии МГУ им М. В. Ломоносова). Штаммы A. logei: BM1 и BM2 изолированы из кишечника керчака Myoxocephalus scorpius (акватория Белого моря);

KCh1 и KCh2, изолированы из кишечника керчака Myoxocephalus polyacanthocephalus и корюшки Osmerus mordax dentex, соответственно (Камчатка, акватории Охотского и Берингова морей).

Векторы: pUC19, pUC18, pUC12, pACYC184, pBluescript II KS, pGEX-KG, pBR получены из коллекции ВКПМ ГосНИИгенетика;

pDEW201 - получен от T.K. Van Dyk.

Плазмиды: pF1 (получена в 1991 г. Г.Б.Завильгельским и Т.А. Черновой) состоит из вектора pBR322 и BamHI-фрагмента хромосомы A. fischeri с полным lux-опероном.

pAC16 содержит в векторе pACYC184 BamHI-фрагмент хромосомы A. fischeri с полным lux-опероном.

pVFR1 (вектор pDEW201, содержащий luxR ген и регуляторную область lux оперона A. fischeri) является биосенсорной плазмидой: luxCDABE гены Photorhabdus luminescens (термостабильная люцифераза) транскрибируются в присутствии аутоиндуктора N-3-оксогексаноил-лактон L-гомосерина.

pSV16 аналогична pVFR1, но содержит luxR2 ген и регуляторную область lux оперона A. logei KCh1.

pSV17 аналогична pSV16, но содержит luxR2 ген и регуляторную область lux оперона штамма KCh2.

pMV1 аналогична pSV16, но содержит luxR1 ген и регуляторную область lux оперона A. logei KCh1.

pMV2 – ген luxR2 штамма KCh1 клонирован в векторе pACYC184.

Плазмиды pSV10,4 и pSV20 содержат фрагменты ДНК с полными lux-оперонами штаммов A. logei BM1 и A. logei KCh1 соответственно, встроенные в вектор pTZ57R.

pSV18 – luxCD гены A. logei клонированы в вектор pTZ57R под контролем Plac промотора.

pSV19 – тоже что и pSV18, но – luxCD гены из A. salmonicida pBRlon – вектор pBR322, содержит ген lonA – протеазы Lon (от Старковой Е.Н.).

pGroEL/GroES – вектор pACYC184 с генами groEL/ES под собственным промотором (получена от Грагерова А.).

pGEX-KG вектор со встроенным по BamHI/EcoRI-сайтам геном luxR А. fischeri;

Apr.

вектор pGEX-KG содержит 5’ – делетированный фрагмент гена luxR;

Apr. вектор pGEX-KG содержит 3’ – делетированный фрагмент гена luxR;

Apr.

pOMibpAB – вектор pZS33 содержит гены ibpAB, расположенные под промотором PLtetO-1;

Cmr pAlkA-lux – ДНК-фрагмент, содержащий промотор PalkA и регуляторный участок, был получен при помощи ПЦР из генома E. coli K12 MG1655 и встроен в беспромоторный мультикопийный вектор pDEW201.

pRecA-lux – аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена recA.

pKatG-lux – аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена katG.

pSoxS-lux – аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена soxS.

pArsR-lux – аналогична pAlkA-lux, но содержит промотор гена arsR (любезно предоставлена Расторгуевым С.М.).

Среды и условия роста бактерий. Морские светящиеся бактерии растили на среде SWTm, содержащей (%, в./об.): 0.5 триптона, 0.25 дрожжевого экстракта, 1.5 морской соли и 0.3 глицерина. Клетки растили при 150С.

Бактерии E. coli растили в бульоне Луриа-Бертани (LB). Агаризованные среды готовили с 1.5% агаром.

Выделение и очистка хромосомной и плазмидной ДНК, клонирование и рестрикционный анализ проводили стандартными методами согласно (Sambrook J. et al 2001). Определение нуклеотидной последовательности проводили методом Сэнгера (Sanger et al. 1977).

Выделение и очистка белков и электрофорез в полиакриламидном геле.

Выделение белков проводили, используя рекомбинантные плазмиды, полученные на основе вектора pGEX-KG. Синтезируемые белки в этом варианте клонирования соединены чувствительным к тромбину линкером с глутатион -трансферазой. Очистка белков проводилась с помощью аффинной хроматографии на глутатион - агарозе, сорбирующей только GST - содержащие белки, с последующей элюцией раствором восстановленного глутатиона. Контроль за выделением белка осуществляли в 10%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Биолюминесценцию клеток измеряли на планшетном люминометре LMA01 (“Beckman”) или на высокочувствительном кюветном люминометре «Биотокс7М».

Результаты.

Сравнительный анализ “Quorum Sensing” систем у психрофильных и мезофильных светящихся морских бактерий.

Впервые lux-оперон A. fischeri был изолирован и клонирован в клетках E. coli и детально анализирован в работе (Engebrecht J. et al., 1983). На рис.1 приведена структура lux-оперона A. fischeri luxRICDABEG. Оперон состоит из двух частей: luxR с промотором Pl и luxICDABEG с промотором Pr. (Meighen E.A., 1991). Структурные гены luxAB определяют синтез – и - субъединиц люциферазы. Гены luxCDE определяют синтез трех-субъединичной редуктазы жирной кислоты (fatty acid reductase), ведущей восстановление жирной кислоты до альдегида (тетрадеканаль), являющегося субстратом люциферазы. Ген luxG определяет синтез т.н. “probably” флавин-редуктазы, которая, по всей видимости, не активна (Meighen E.A., 1991;

Tu S.-C., and Mager H., 1995).

Рисунок 1. Схема регуляции lux-оперона A. fischeri.

Гены luxI и luxR являются регуляторными. Белок LuxI –ацил-синтаза, ведущая синтез ацильного производного гомосеринлактона (N-AHL), N-(3-оксогексаноил) лактон L-гомосерина (ОHHL). Впервые структура N-AHL была определена в 1981 году (Eberhard A.,. 1981.). Впоследствии все аутоиндукторы – класса ацильных производных лактона L гомосерина получили название аутоиндукторов первого типа (АИ). Низкомолекулярные химические вещества, относящиеся к классу ацильных производных лактона L гомосерина (N-AHL), свободно диффундируют через клеточные мембраны и обеспечивают условия, при которых клетка способна реагировать на изменение внутриклеточной концентрации этих веществ и соответственно включать или выключать те или иные группы генов. Одним из основных результатов настоящей работы является доказательство, что в сборке нативной формы белка LuxR участвуют шаперонин GroEL/ES и протеазы Lon. Эти белки модуляторы внесены в схему, представленную на рисунке1.

На рис. 2 представлены структуры lux-оперонов бактерий A. fischeri (AF) (GenBank AF170104), A. logei (AL) - согласно данным секвенирования 11 т.п.н. фрагментов, содержащих lux-опероны штаммов BM1 и KCh1 (GenBank HQ450520), и A salmonicida (AS) (GenBank AF452135).

Рисунок 2. Структуры lux-оперонов A. fischeri (AF), A. logei, штаммы Kch1 и BM1 (AL), и A. salmonicida (AS) Сравнение структуры lux-оперона штаммов BM1 и KCh1 со структурами lux оперонов бактерий A. fischeri и A. salmonicida показывает полное сходство структур lux оперонов A. logei и A. salmonicida и значительные отличия структур этих lux-оперонов со структурой lux-оперона A. fischeri. В структуре lux-оперонов A. logei и A. salmonicida отсутствует ген luxI перед геном luxC, но непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами luxR2 –luxI. Кроме того, спейсер между первым геном luxR1 и промотором Pr1 значительно превышает таковой у A. fischeri (более 500 н.п. против н.п.). Отметим, что патогенные для лососей бактерии A. salmonicida занимают отличную от A. fischeri и A. logei экологическую нишу и не люминесцируют в природных условиях.

Для изучения QS системы психрофильных бактерий A. logei, были сконструированы гибридные плазмиды, содержащие регуляторные области lux-оперона штамма KCh1: ген luxR1, lux-box и промотор Pr1 (pMV1) и ген luxR2, lux-бокс и промотор Pr2 (pSV16) (рис. 3), слитые с генами luxCDABE, кодирующими термостабильную люциферазу Photorhabdus luminescens. Для сравнения чувствительности к АИ регуляторных областей психрофильных бактерий A. logei с мезофильными использовалась плазмида pVFR1, содержащая регуляторную область lux-оперона A. fischeri. Для конструирования был использован вектор pDEW201, содержащий lux-кассету luxCDABE P. luminescens, полилинкер для клонирования промотора и четыре терминатора транскрипции для снижения фонового протекания клонированных промоторов.

Рисунок 3. Структура транскрипционных слияний регуляторных областей lux-оперонов A.

fischeri и A. logei. Данные плазмиды являются биосенсорными: luxCDABE гены P. luminescens (термостабильная люцифераза) транскрибируются только в присутствии АИ.

pVFR1 - luxR ген и регуляторная область lux-оперона A. fischeri;

pSV16 - luxR2 ген и регуляторная область lux-оперона A. logei KCh1;

pSV17 - luxR2 ген и регуляторная область lux-оперона A. logei штамма KCh2.

pMV1 - luxR1 ген и регуляторная область lux-оперона A. logei KCh1.

Сравнение чувствительности к АИ штаммов E. coli, содержащих биосенсорные плазмиды с генами, кодирующими белки LuxR1 и LuxR2 (плазмиды pMV1 и pSV16), показало, что амплитуда ответа биосенсора с LuxR2 на добавление АИ значительно ниже, чем амплитуда ответа у биосенсора с LuxR1.

А Б Рисунок 4. Зависимость интенсивности биолюминесценции (I) от времени инкубации (мин) клеток E. coli MG1655 с гибридными плазмидами (А) pSV16 и (Б) pMV при добавлении различных концентраций АИ в среду. Различными цветами обозначены различные концентрации АИ (сверху: 0, 10-8М, 10-7М, 10-6М и 10-5М). Инкубация клеток и измерение интенсивности биолюминесценции проводились при комнатной температуре.

Люминесценция, отн. ед.

luxR fischeri luxR 100 luxR 1E-11 1E-10 1E-09 1E-08 1E-07 0,000001 0,00001 0, Концентрация АИ, М Рисунок 5. Зависимость активации Pr промоторов lux оперонов A. fischeri и A. logei (luxR2 и luxR1) от концентрации АИ в среде. Ночную культуру клеток E. coli c плазмидами pVFR1 (fischeri), pSV16 (luxR2 – синие ромбики), pSV17 (luxR2 – голубые крестики) и pMV1 (luxR1) инокулировали с начальной OD = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 280С до средней логарифмической фазы (OD = 0,4-0,5). Затем инкубировали 30 мин при 420С и после добавления различных концентраций АИ продолжали инкубацию без перемешивания при 220С. Через час инкубации измеряли интенсивность биолюминесценции.

Данные рисунков 4 и 5 свидетельствуют о том, что активация основного Pr промотора, с которого транскрибируются структурные гены luxCDABEG A. logei с помощью белка LuxR1, возможна лишь при высоких концентрациях АИ, весьма редко возникающих в природных условиях. При этом активация белком LuxR2 промотора Pr2, с которого считывается luxI ген, кодирующий синтетазу АИ, характеризуется высокой амплитудой ответа на появление АИ в среде, а также способностью к активации, начиная с концентраций АИ 10-9М. Для проверки возможности активации промотора Pr1 белком LuxR2 штамм E. coli с биосенсорной плазмидой pMV1, содержащей luxR1 c основным Pr промотором, был трансформирован совместимой плазмидой pMV2 (на основе ori p15) с геном luxR2 под собственным промотором (рис. 6). Оказалось, что промотор Pr активируется как LuxR1 так и LuxR2, причём чувствительность к АИ и амплитуда ответа промотора Pr1 определяется в основном белком LuxR2 (рис. 7).

Рисунок 6. Целевые конструкции в плазмидах pMV1 и pMV2, используемые для проверки эффекта комплементации активности Pr1 промотора lux оперона A. logei в присутствии гена luxR2.

Люминесценция, отн.ед.

luxR luxR2+АИ luxR luxR1+АИ luxR2 +luxR luxR2 +luxR1+АИ 0 50 100 Время, мин Рисунок 7. Комплементация активности Pr промотора lux оперона A. logei (luxR1) в присутствии гена luxR2. Зависимость люминесценции клеток E. coli MC1061 c плазмидами pSV16, pMV1 или комбинацией плазмид pMV1 и pMV2 от времени инкубации с АИ 10-7М и в отсутствие АИ.

luxR2 - pSV luxR1 - pMV luxR2+ luxR1 - pMV1 и pMV Сравнительный анализ lux-оперонов A. salmonicida и A. logei.

В работах (Fidopiastis P.M et al 1999;

Nelson E.J. et al 2007) было показано, что A. salmonicida является криптически люминесцирующим видом бактерий светится лишь при добавлении в среду субстрата люциферазной реакции n-деканаля. Авторы предположили, что этот феномен определяется структурой lux-оперона: в результате транскрипции гена luxR2 появляется антисенс РНК, критически снижающая транскрипцию белка LuxE. Внастоящей работе показано, что структура lux-оперона A. logei практически идентична структуре A. salmonicida (см рис. 2). Однако при этом показано, что бактерии A. logei ярко светят в условиях QS. Поэтому гипотеза авторов о снижении эффективности транскрипции гена luxE антисенс-РНК гена luxR2 была поставлена под сомнение. Проведённый анализ нуклеотидных последовательностей lux оперонов показал наличие делеции размером 17 н.п. в начале гена luxD A. salmonicida (по сравнению с luxD A. fischeri). Эта делеция затрагивает АТГ кодон гена luxD (рис. 8), в результате белкок LuxD укорочен с N-конца на 47 аминокислотнх остатка новый. Как видим делеция размером 6 н.п. в начале гена luxD A. logei не затрагивает АТГ кодон и сохраняет рамку считывания luxD гена.

Рисунок 8. Сравнение нуклеотидной последовательности между luxC и luxD генами в A. fischeri (AF), A. logei (AL KCh1) и A. salmonicida (AS). Идентичные нуклеотиды отмечены серым цветом. ATG-и stop- кодоны подчёркнуты.

Для проверки гипотезы о том, что причиной криптической люминесценции патогенных микроорганизмов A. salmonicida является деффект в гене luxD, были сконструированы плазмиды pSV18 и pSV19, в которых luxCD гены из A. logei и A. salmonicida соответственно были клонированы в вектор pTZ57R под контроем Plac промотора. Данными плазмидами был трансформирован штамм E. coli МС1061, в котором находилась плазмида pF6 (ori p15), содержащая гены luxABE из A. fischeri.

Оказалось, что при инкубации клеток при пониженной температуре 15-180С (гены luxCD, взятые из психрофильных бактерий, кодируют чувствительные к повышению температуры более 200С белки) недостаток в n-деканале восполнялся наличием в клетке luxCD генов из A. logei, но не luxCD генов из A. salmonicida (рис. 9). Следовательно, причиной криптической люминесценции патогенных микроорганизмов A. salmonicida является деффект в гене luxD.

Рисунок 9. Комплементация генов luxABE A. fischeri генами luxCD из A. logei KCh и A. salmonicida. Клетки E. coli TG1 с гибридными плазмидами растили до OD 0,2 при 370C с качанием, затем инкубировали при температуре 160С и измеряли люминесценцию.

Кружки - E. coli TG1 (pF6), Треугольники - E. coli TG1 (pF6, pSV18), Квадраты - E. coli TG1 (pF6, pSV19). Полые знаки – без добавления n-деканаля, заполненные – с добавлением. Плазмиды: pF6 – luxABE гены A. fischeri на ori p15, pSV18 – luxCD гены A. logei KCh1, pSV19 – luxCD гены A. salmonicida KCh1.

Итоги сравнительного анализа “quorum sensing” систем и структуры lux-оперонов у психрофильных и мезофильных светящихся морских бактерий.

• Проведено сравнение QS систем lux-оперонов психрофильных бактерий A. logei и A. salmonicida и мезофильных бактерий A. fischeri.

• В структуре lux-оперонов A. logei и A. salmonicida отсутствует ген luxI перед геном luxC, но непосредственно за геном luxG расположен второй регуляторный локус с генами luxR2 –luxI.

• Показано, что LuxR1 A. logei на несколько порядков менее чувствительный к аутоиндуктору, по сравнению с LuxR2.

• Показано, что причиной криптической люминесценции патогенных микроорганизмов A. salmonicida является деффект в гене luxD.

Влияние шаперонов и протеаз на QS систему lux-оперона A. fischeri На рис. 10 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции (I) от концентрации (OD) клеток E. coli SKB178 gro+ и мутантных по генам groEL и groES, содержащих гибридную плазмиду pF1 с генами luxRICDABE V. fischeri. Клетки росли в среде LB при 280С. В клетках, мутантных по генам groEL и groES интенсивность биолюминесценции значительно снижена. Введение в клетки мутантного штамма groE гибридной плазмиды pGroEL/GroES приводит к восстановлению интенсивности биолюминесценции (рис.10, кривая +pGroEL/ES), - превышение интенсивности биолюминесценции по сравнению с биолюминесценцией клеток groE+ определяется дозой гена. Следовательно, GroEL/GroES необходим для эффективной экспрессии генов lux оперона V. fischeri.

Рисунок 10. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток E. coli от OD. Клетки (все используемые штаммы содержали плазмиду pF1 с lux-опероном A. fischeri) инокулировали при начальной OD=0,01 и растили в среде LB с ампициллином ( мкг/мл), в варианте +pGroESL c ампициллином и тетрациклином (15 мкг/мл) с аэрацией при 280С.

WT – SKB178 gro+ groEL- – три мутантных варианта: groEL673;

groEL97 и groES::Tn pGroELS – groEL97 с плазмидой pGroEL/GroES В отличие от GroEL/GroES, АТР-зависимая сериновая протеаза Lon участвует в негативном контроле экспрессии lux-оперона. ATФ - зависимая сериновая Lon - протеаза играет важную роль в деградации неправильных и короткоживущих белков в клетке (Gottesman S., 1999;

Wickner S. et al., 1999). Нами показано, что Lon - протеаза E. coli участвует в негативной регуляции транскрипции lux-оперона A. fischeri, осуществляя протеолиз белка LuxR. Интенсивность биолюминесценции клеток мутантного штамма AB1899 превышает примерно на три порядка таковую для AB1157 (рис.11, кривые WT и lon-). Введение плазмиды pBRlon с полноразмерным геном lonA, кодирующим активную Lon - протеазу, в клетки AB1899 (pAC16) полностью снимает эффект мутации lon (рис.11, кривая +pLon). Более того, лаг-период в кривой индукции люминесценции у AB1899 (pAC16, pBRlon) заметно увеличен по сравнению с таковым у штамма AB (pAC16), что может быть объяснено увеличением числа копий гена lonA в клетках с плазмидой pBRlon.

Рисунок 11. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток E. coli от OD. Клетки инокулировали при начальной OD=0,01 и растили в среде LB с хлорамфениколом ( мкг/мл), в варианте +pLon с хлорамфениколом и ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 280С.

lon- - AB1899 lonA1 (pAC16) WT – AB1157 lon+ (pAC16) +pLon – AB1899 lonA1 (pAC16, pBRlon) Для получения белка LuxR in vitro была сконструирована гибридная плазмида на базе вектора pGEX-KG, несущая трансляционное слияние 5’-конца гена luxR c геном gst, кодирующим глутатион-S-трансферазу (GST, мол. масса 26 кД). В результате аффинной очистки химерного белка GST-LuxR на колонке с глутатион-сефарозой с последующей детекцией изолированных белков методом масс-спектрометрии пептидов после трипсинолиза было показано, что GST-LuxR белок сопровождается при выделении GroEL белком (рис. 12). При выделении из мутантного штамма OFB111 groEL673 белок GST LuxR сопровождался помимо полипептида GroEL также белком Lon. Полученные данные прямо доказывают, что GST-LuxR эффективно связывается с белками GroEL и Lon.

groEL673 groEL97 WT Рисунок 12. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (12%) белковой фракции клеток E. coli (pGEX-LuxR), полученной в результате аффинной хроматографии на колонке с глутатион-агарозой. Дорожки:

1 -- E. coli OFB111groEL673;

2 – E. coli groEL97;

3 – E. coli SKB178 gro+;

4 – белки-маркеры.

Отметим, что согласно данным, представленным на рисунке 12, белок GroEL выделяется вместе с химерным белком GST-LuxR не только из клеток дикого типа, но и из мутантных по гену gro клеток. По-видимому, использованные в настоящей работе gro мутанты, выделенные C.P. Georgopoulos и соавт. (Georgopoulos C.P., et al.,1973) и относящиеся к группе миссенс-мутантов с одиночными аминокислотными заменами, не теряют способности связывать белки-мишени, но не могут вести их правильную сборку (фолдинг).

Белок LuxR состоит из двух доменов: С - концевой домен (88 аминокислотных остатков) определяет контакт белка с lux-боксом в ДНК (ДНК - связывающий домен), а N концевой домен (162 аминокислотных остатков) отвечает за связывание с АИ.

Так как LuxR состоит из двух доменов с различными функциями, было проведено сравнительное исследование влияния шаперонина GroEL на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов lux-оперона A. fischeri в клетках E. coli. Для этой цели использовались сконструированные гибридные плазмиды pGST-LuxR (GST слит с полноразмерным белком LuxR) или pGST-CTD (GST слит с С-концевым доменом белка LuxR) (рис. 13). Полученные конструкции характеризуются тем, что GST не мешает активности как полноразмерного LuxR (активирует промотор в АИ зависимой манере), так и С-концевого домена белка LuxR (открывает промотор независимо от концентрации АИ).

На рисунке 14 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции от времени инкубации клеток E. coli SKB178 gro+ и OFB111 groEL673, содержащих плазмиду pOM (содержит гены luxCDABEG, промотором Pr, но без гена luxR) и плазмиду pGST LuxR (GST слит с полноразмерным белком LuxR) или плазмиду pGST-CTD (продуцирует GST слитый с C – доменом белка LuxR). В такой комбинации отсутствует эффект положительной обратной связи, которая возникает при экспрессии с промотора Pr гена luxI, что позволяет прямо оценивать влияние мутаций в генах, кодирующих шапероны и протеазы, на активность LuxR и его делетированных форм.

Рисунок 13. Структура конструкций химерных белков: GST-luxR (белок LuxR с глутатион-трансферазой), GST- CTD (С-концевой домен LuxR с глутатион-трансферазой) и GST-NTD (N-концевой домен LuxR c глутатион-трансферазой).

Как видно из рисунка 14, наличие в клетках E. coli SKB178 gro+(pOM) дополнительной плазмиды pGST-LuxR или pGST-CTD приводит к резкому увеличению интенсивности биолюминесценции в связи с активацией транскрипции генов luxICDABE с промотора Pr. Мутация groEL673 резко снижает интенсивность биолюминесценции в бактериях, содержащих плазмиду pGST-LuxR. Однако, если в качестве активатора транскрипции используется С – домен белка LuxR (плазмида pGST-CTD), то мутация groEL673 не влияет на экспрессию генов luxICDABE. Данные, представленные на рисунке 14, указывают на то, что активность С – концевого домена белка LuxR не зависит от шаперонина GroEL/ES. Предполагается, что шаперонин GroEL/ES необходим для правильной сборки N- концевого домена.

Люминесценция отн. ед.

GroEL673 LuxR WT LuxR GroEL673 C-домен 100 WT C-домен 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 Время, мин Рисунок 14. Влияние шаперонина GroEL на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов lux-оперона A. fischeri.

Отдельные колонии клеток, выросших на агаризованной среде при 370С, переводили в L-бульон и дважды отмывали центрифугированием, добавляли АИ 10-6М. Затем клетки ресуспендировали в 200 мкл LB и измеряли биолюминесценцию.

groEL673 pLuxR – OFB111 groEL673(pGST-LuxR, pOM), WT LuxR – SKB178 gro+(pLuxR, pOM), groEL673 C-домен – OFB111 groEL673(pGST-CTD, pOM), WT C-домен – SKB178 gro+(pGST-CTD, pOM) Для проверки этой гипотезы использовали гибридные плазмиды, кодирующие химерные белки GST-NTD (N-концевой домен, слитый с GST), GST-CTD и GST-LuxR (рис. 13). Была проведена очистка этих химерных белков с целью выяснить, с какими из них связывается GroEL при выделении с помощью аффинной хроматографии.

На рисунке 15 представлены данные SDS - электорофореза белковых фракций в 12% полиакриламидном геле. Белки GST-LuxR и GST-CTD и GST-NTD выделены с помощью аффинной хроматографии на колонке с глутатион агарозой. Как видно из рисунка 15, при аффинной очистке вместе с полноразмерным белком GST-LuxR и его N-доменом (GST NTD) выделяется дополнительный белок (полоса в 60 кДа). Однако, при аффинной очистке С - домена белка LuxR (GST-CTD) эта полоса отсутствует.

Масс-спектрометрический анализ показал, что белок, выделенный из полосы 60 кДa, по составу и распределению пептидных фингерпринтов согласно базе данных SWISS PROT является шаперонином GroEL.

kDa 1 GroEL GST-LuxR GST-NTD 36 GST-CTD Рисунок 15. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (12%) белковой фракции, полученной в результате аффинной хроматографии на колонке с глутатион-агарозой.

Белковую фракцию выделяли из клеток штаммов E. coli TG-1 содержащих: pGST-CTD (дорожка 1), pGST-LuxR (дорожка 2) и pGST-NTD (дорожка 3) На дорожках 1 и 3 так же присутствует полоса глицерол – киназы (56,2 кДа), а на дорожке 1 и 2 полоса элонгационного фактора EF-Tu (43,3 кДа) (согласно масс-спектрометрическому анализу эти полосы соответствуют глицерол – киназе и элонгационному фактору EF-Tu). Эти белки сопровождают GST белок при мягких условиях отмывки.

Таким образом, было показано, что в условиях in vivo GroEL шаперонин связывается с полноразмерным LuxR и его N-доменом, но не связывается с С-доменом LuxR.

Полученные данные доказывают, что N-концевой домен LuxR белка является мишенью для GroEL шаперонина при фолдинге. Можно сделать предположение, что GroEL шаперонин необходим для фолдинга только N-концевого домена белка LuxR. Достоверно показано, что С-концевой домен LuxR белка (88 аминокислот) не требует GroEL/ES шаперонин для фолдинга.

Для оценки действия Lon протеазы на LuxR и его С-домен гибридные плазмиды pGST-LuxR или pGST-CTD были введены в клетки штаммов E. coli AB1157 и E. coli AB1899 lonA. Штаммы также содержали сенсорную плазмиду pOM, позволяющую оценивать активность LuxR in vivo.

Люминесценция отн.ед.

WT LuxR lon- LuxR WT C-домен lon- C-домен 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 Время, мин Риcунок 16. Зависимость интенсивности биолюминесценции (I, отн.ед.) клеток штаммов AB1157 lon+ и AB1899 lonA, содержащих плазмиды pGST-LuxR и pOM или pGST-CTD и pOM, от времени инкубации. Отдельные колонии клеток, выросших на агаризованной среде при 370С, переводили в LB и дважды отмывали центрифугированием, добавляли АИ 10-7М. Затем клетки ресуспендировали в 200 мкл L бульона и измеряли биолюминесценцию при комнатной температуре.

WT LuxR – АВ1157 (pGST-LuxR, pOM) lon LuxR – АВ1899 lonA (pGST-LuxR, pOM) WT C-домен – АВ1157 (pGST-CTD, pOM) lon- C-домен – АВ1899 lonA (pGST-CTD, pOM) Как видим, на рисунке 16, интенсивность биолюминесценции клеток АВ1899 lonA (pGST-LuxR, pOM) быстро нарастает уже в течение первых 15 мин с момента добавления АИ, что указывает на наличие в клетках в момент начала индукции (0-минут) достаточного для активации Pr промотора lux-оперона количества молекул LuxR. В тоже время, в клетках штамма АВ1157 (pGST-LuxR, pOM) индукция транскрипции генов lux оперона начинается лишь через 70 мин после добавления АИ (10-7M), что объясняется деградацией белка LuxR протеазой Lon и подтверждает данные, приведённые для полного lux-оперона A. fischeri на рисунке 10. В варианте, когда в клетки введена плазмида pGST CTD, кодирующая С-домен белка LuxR, экспрессия lux-генов, расположенных на плазмиде pOM, не зависит от добавления АИ и наличия в клетках активной Lon протеазы.

Следовательно, лишь цельный белок LuxR, но не его С-домен, является мишенью для Lon протеазы.

Для протеазы ClpXP также показано участие в негативной регуляции QS системы A. fischeri. Мутации по генам сlpP и сlpX снижают активационный барьер для срабатывания QS системы A. fischeri, хотя и с меньшей эффективностью, по сравнению с мутацией в гене lonA.

Итоги исследования роли шаперонов и протеаз в регуляции QS системы lux оперона A. fischeri.

• Lon протеаза участвует в негативной регуляции экспрессии генов lux оперона A. fischeri, снижая активность белка LuxR.

• Показано, что шаперонин GroEL/ES необходим для сборки нативного белка LuxR • Показано, что химерный белок GST-LuxR при выделении эффективно связывается с белками GroEL и Lon • Показано, что лишь цельный белок LuxR, но не его С-домен, является мишенью для Lon протеазы.

• Совокупность данных in vivo и соочистка белка GroEL с LuxR и его делетированными формами доказывают, что N-концевой домен белка LuxR является мишенью для GroEL шаперонина при фолдинге.

Исследование активности шаперонов с помощью бактериальных люцифераз.

Для формирования нативной структуры белковой молекулы как в процессе синтеза на рибосомах (фолдинг), так и при ренатурации денатурированных полипептидов (рефолдинг) требуется участие специальных белков-шаперонов. В настоящее время в бактериях E. coli детально изучены четыре семейства шаперонов: Hsp60 (GroELS), Hsp (DnaK-DnaJ-GrpE), Hsp100 (ClpA, ClpB) и малые шапероны sHsp (IbpAB) (Bukau B., Horwich A.L., 1998;

Hartl F.-U., 1996;

Ellis R.J. and Hartl F.U., 1999). Мы впервые применили для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.

Для этой цели были клонированы гены lux-оперонов luxAB, кодирующих две субъединицы люциферазы, из геномов различных люминесцирующих бактерий A. fischeri, Photobacterium phosphoreum, Vibrio harveyi и P. luminescens. Анализ термоинактивации и рефолдинга люцифераз проведен как in vitro с использованием очищенных препаратов ферментов, так и in vivo в бактериальных клетках E. coli, как дикого типа, так и несущих мутации по генам, кодирующим белки-шапероны.

Рисунок 17. Кинетика термоинактивации бактериальных люцифераз in vivo. A. Люциферазы P. phosphoreum (1) и A. fischeri (2), температура инактивации 36oC;

Б. – люциферазы A. fischer (1) i, V. harveyi (2) и P. luminescens (3), температура инактивации 43,5oC. По оси ординат указана активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс – время термоинактивации.

На рисунке 17 показана кинетика термоинактивации in vitro четырёх бактериальных люцифераз. Гены люцифераз были клонированы в клетках E. coli из бактерий, различающихся по своему температурному оптимуму роста. Как видно из рисунка, наиболее термочувствительной оказалась люцифераза P. phosphoreum, что соответствует самому низкому температурному оптимуму роста психрофильных бактерий данного вида. Далее по возрастанию темостабильности следуют люциферазы A. fischeri, V. harveyi и P. luminescens.

Данные по DnaKJE-зависимому рефолдингу тероминактивированных люцифераз in vivo представлены на рисунке 18. Наиболее полный рефолдинг (до 100 % от начальной активности) демонстрируют термочувствительные люциферазы. У более термостабильных люцифераз V. harveyi и P. luminescens восстановление активности достигает лишь 10-15%. Причём самая термостабильная люцифераза из P. luminescens обладает самым слабым рефолдингом. Эти данные совпадают с экспериментом, представленным на рисунке 20, где сравнивается эффективность рефолдинга (скорость и уровень) люцифераз из A. fischeri и P. luminescens в зависимости от времени инактивации люциферазы.

Рисунок 18. Кинетика рефолдинга термоинактивированных люцифераз в клетках E.coli. a Люциферазы P. phosphoreum (круги) и A. fischeri (треугольники);

б - V. harveyi (круги) и P. luminescens (треугольники). Светлые символы - рефолдинг в клетках штамма MG1644, тёмные символы в клетках штамма PK202 dnaKJ. По оси ординат указана активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс – время выдерживания образца при температуре, оптимальной для данного вида люциферазы (200С – P. phosphoreum, 250С - A. fischeri, 280С – V. harveyi, 340С - P. luminescens).

С увеличением времени термоинактивации увеличивается количество необратимых белковых агрегатов в клетке, что приводит к уменьшению уровня и скорости рефолдинга термоинактивированных люцифераз. Однако наиболее круциально этот процесс идёт у термостабильных люцифераз: через 40-50 минут инактивации на 460С рефолдинг не детектируется. В отличие от термостабильной люциферазы P. luminescens термолабильная люцифераза A. fischeri при тех же условиях инактивации сохраняет способность к рефолдингу и восстанавливает до 10% изначальной активности.

Кроме того на рисунках 18 и 19 представлены данные экспериментов по влиянию мутации в генах по шаперонам семейств Hsp70 (DnakJE) и Hsp100 (ClpB). Показано, что мутация по гену dnaK полностью снимает способность люцифераз к рефолдингу, а мутация по гену вспомогательного шаперона ClpB, который по данным in vitro помогает комплексу DnaKJE дезагригировать белки, снижает рефолдинг до нескольких процентов от изначальной активности.

Рисунок 19. Кинетика рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri в клетках E. coli SG20250 clpB+ (1) и CG22100 clpB- (2). По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс – время инкубации образца при 250С.

A. C.

B.

100 % of Native Luciferase Activit y %, Maximal Refolding - - - - -3 - 0 5 10 20 40 60 0 5 10 20 40 60 90 30 50 10 Time (min) Time (min) Time (min) Рисунок 20. Зависимость рефолдинга тероинактивированных на 460С люцифераз A.

fischeri (А) и P. luminescens (B) от времени инкубации клеток при 220С () - 15 мин инактивации() - 30 минут инактивации, () – 1 час инактивации. (C) – зависимость эффективности рефолдинга люциферазы A. fischeri () и P. luminescens () от времени инкубации клеток при 460С Белок семейства HSP100 – ClpA был описан в экспериментах in vitro как шаперон, защищающий белки от агрегации. Однако данных in vivo получить не удавалось.

Применение бактериальных люцифераз для исследования данного шаперона позволило показать, что ClpA участвует в рефолдинге более крупных белковых агрегатов, образующихся при длительной термоинактивации (рис. 21).

I, отн.ед.

0, 0 5 10 15 20 25 30 t, мин Рисунок 21. Зависимость уровня рефолдинга люциферазы A. fischeri от времени инкубации различных штаммов E. coli MG1655 с плазмидой pF2 при 460С.

Штаммы: () - MG1655 clpA+, () - MG1655 clpP::cat, (О) - MG1655 clpA::kan.

Согласно данным, полученным в опытах in vitro, наличие IbpAB в смеси с белком субстратом защищает белки от термоденатурации, снижая уровень агрегации, что фиксируется методом светорассеяния (Mogk A., et al.,2003). В нашей работе впервые было показано, что малые шапероны IbpAB оказывают влияние на рефолдинг термоинактивированных люцифераз также, как и белок семейства Hsp100 ClpA, при пролонгированной инкубации на 460С (рис. 22 и 23). Однако комплементировать недостаток ClpA белками IbpAB в клетке не удаётся. Клонированные на плазмиде гены ibpAB усиливают рефолдинг люцифераз при продолжительной (60 мин) термоинактивации до значений, превосходящих контрольные в штамме дикого типа (рис.

23), но не могут восстановить хоть сколько-нибудь значимо рефолдинг, сниженный в мутанте по гену сlpA (рис. 24).

.

активность,% - 0 5 10 15 20 25 30 t, мин Рисунок 22. Влияние мутаций в гене ibpB на кинетику и уровень DnaKJE зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri. Кинетика рефолдинга люциферазы A. fischeri после инкубации клеток 60 мин при 460С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс отложено время рефолдинга люциферазы при 250С.

( ) - BW25113 ibpA+ ibpB+ dnaK+(pF2), ( ) - JW3663 ibpB::kan (pF2), ( ) - JW3663 ibpB::kan (pF2, pOMibpAB).

Уровень рефолдинга, % 80 WT ibpB pIbpAB 0 20 40 60 Время инактивации, мин Рисунок 23. Зависимость уровня рефолдинга люциферазы A. fischeri от времени инкубации различных штаммов E. coli MG1655 с плазмидой pF2 при 460С.

Штаммы: WT - BW25113 ibpA+ ibpB+ dnaK+(pF2), ibpB- - JW3663 ibpB::kan (pF2), pibpAB JW3663 ibpB::kan (pF2, pOMibpAB).

активность,% 0, 0 5 10 15 20 25 30 t, мин Рисунок 24. Влияние плазмиды pOMibpAB на кинетику и уровень DnaKJE – зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri в клетках MG1655 clpA::kan после 60 мин инкубации клеток при температуре 460С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс – время рефолдинга люциферазы при 250С.

( ) - MG1655 clpA+(pF2);

( ) - MG1655 clpA::kan(pF2);

( ) - MG1655 clpA::kan (pF2,pOMibpAB).

Итоги исследований шаперонов с помощью бактериальных люцифераз.

• Применение для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальных люцифераз, гомологичных по аминокислотной последовательности, но значительно различающихся по термостабильности, оказалось весьма перспективным и в настоящее время принято во многих лабораториях мира.

• Показано, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз, являющихся гетеродимерами, происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), Hsp100 (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHspP (IbpAB).

• Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термолабильных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

Биосенсоры: применение lux-биосенсоров для детекции токсических агентов, антибиотиков, аутоиндукторов и других биологически активных веществ.

Проведённые в процессе выполнения диссератационной работы исследования, (в частности, клонирование набора генов, кодирующих люциферазы, и индуцируемых стрессовых промоторов) позволили сконструировать специфические, высокочувствительные lux-биосенсоры. Выполнен ряд договоров и контрактов хозяйственного назначения по темам, связанным с экологией, определением механизмов токсического воздействия веществ на бактериальную клетку, тестированием разрабатывающихся медицинских препаратов (доклиника) и др.

Lux-биосенсоры широко используются в работах по генетической инженерии и биотехнологии, а также для мониторинга окружающей среды. Lux-биосенсор – это бактериальная клетка, содержащая гибридную плазмиду, в состав которой встроены два основных элемента: регуляторный участок (промотор и оператор и, при необходимости, ген регулятор) и ген (гены)-репортер (рис. 25). В качестве генов-репортеров используются гены luxCDABE, кодирующие люциферазу и редуктазу. В качестве регуляторных элементов используются различные индуцируемые промоторы, сформированные в процессе эволюции и специфически реагирующие на наличие в среде определенного вида химического вещества. Данная группа биосенсоров характеризуется как специфичностью, так и высокой чувствительностью, что определяется особенностью взаимодействия белка - рецептора (репрессора или активатора транскрипции) с химическим веществом. Сконструированы новые формы lux-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. В таблице приведены основные характеристики lux-биосенсоров, применяющихся для детекции токсикантов, экологического мониторинга и определения механизмов токсического воздействия на клетку. Пример временной зависимости активации люминесценции биосенсора E.coli MG1655 pAlkA-lux в ответ на добавление токсиканта (N-метил-N-нитро-N нитрозогуанидина) приведён на рисунке 25.

Таблица. Основные характеристики lux-биосенсоров Биосенсор Токсический агент Промо Амплитуд Пороговая tm, E.coli: тор а ответа концентрация мин 10-11 M As pArsR-lux As, Sb 500 arsR 10-10 M Hg pMerR-lux Hg,Cd 500 merR - pCopA-lux Cu, Ag 20 - Cu 5x10 M Cu;

copA 2x10-7 M Ag 30 - Ag pTetR-lux тетрациклин 1000 0.5 нг/мл tetA 10-9 M pColD-lux ДНК -повреждающие cda 1000 агенты: УФ, митомицин С митомицин С, 4-НХО 10-8 M МННГ pAlkA-lux Алкилирующие 300 alkA агенты: МННГ, ММС, нитрозо мочевина pIbpA-lux этанол, температура, 100 0,3% этанол ibpA пентахлорфенол 10 мг/л пентахлорфено л pFabA-lux тритон Х-100, фенол 3 0,2 мг/л тритон fabA и его производные Х- 10-6 M H2O pKatG-lux H2O2 100 katG 10-6 M pSoxS-lux супероксид-анион 100 soxS паракват Рисунок 25. Схема специфического lux-биосенсора, сконструированного с применением репортерных генов luxCDABE, индуцируемого промотора ParsR и регуляторного arsR гена, реагирующего ионы мышьяка. Приведена зависимость интенсивности биолюминесценции биосенсора E. coli (pArsR-lux) от концентрации ионов мышьяка (NaAsO2). Пунктиром обзначена кривая инактивации люминесценции контрольных клеток, в которых гены luxCDABE находятся под контролем конститутивного промотора.

Люминисценция, отн.ед.

Контроль 5мкг/мл 1мкг/мл 0,1мкг/мл 0,01мкг/мл 1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 97 105 113 Время, мин.

Рисунок 26. Клетки E. coli MС1061 (pAlkA-lux) выращивали до ранней логарифмической фазы, добавляли к аликвотам (по 200 мкл) N-метил-N-нитро-N нитрозогуанидина до конечных концентраций 5, 1, 0,1,и 0,01 мкг/мл. Измеряли люминесценцию образцов в течение 2 часов. На графике показана зависимость люминесценции образцов от времени инкубации.

С помощью подобных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) (НДМГ) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

Рисунок 27. Зависимость интенсивности люминесценции клеток биосенсора E. coli MG1655 pKatG-lux от времени инкубации (А) и от концентрации (В) в среде 1, диметилгидразина (НДМГ).

() – контроль () - + НДМГ 3 мМ () - + перекись водорода 0,5 мМ () - + каталаза, + НДМГ 3 мМ На рисунках 27 и 28 представлены данные, свидетельствующие о том, что основное генотоксическое действие НДМГ на бактериальную клетку связано с образованием активных форм кислорода в процессе восстановления атмосферного кислорода.

Добавление каталазы в икубационную среду полностью снимает как окислительный стресс (рис. 27 (А)), так и SOS –ответ бактериальных клеток (рис. 28) Рисунок 28. Кинетика индукции (усиления) биолюминесценции биосенсора E. coli MG1655 (pRecA-lux) в зависимости от времени инкубации с НДМГ (концентрация НДМГ = 5 мкМ).

() – контроль () - НДМГ 3 мМ () - перекись водорода 0,5 мМ () - каталаза, + НДМГ 3 мМ () - митомицин С 10-5М Однако токсическое действие НДМГ на живую клетку не ограничивается воздействием активных форм кислорода, возникающих в процессе окисления НДМГ в аэробных условиях. В процессе окисления возникают промежуточные формы окисленного НДМГ, в том числе, нитрозодиметиламин, который является алкилирующим агентом для ДНК. На рисунке 29 представлены данные по активации промотора PalkA как чистым НДМГ, так и продуктами его окисления, возникающими при обработке перекисью водорода. Показано, что чистый, не окисленный НДМГ, не обладает алкилирующим действием на ДНК. Восстановление атмосферного кислорода НДМГ с образованием перекиси водорода достаточно, чтобы возник SOS-ответ клетки, в первые, часы инкубации в растворе с НДМГ (рис 28). В случае если происходит более глубокое окисление НДМГ в присутствии экзогенно добавленной перекиси водорода, возникают продукты окисления, которые были охарактеризованы как при помощи биосенсоров так и на хроматомасс-спектрометре. Показано, что продукты окисления НДМГ перекисью водорода обладают высокой алкилирующей способностью и вызывают активацию PalkA промотора (рис. 29). Максимальная амплитуда ответа биосенсора наблюдается в случае, когда концентрации НДМГ и перекиси водорода эквимолярны. Перекись водорода не вызывает индукцию PalkA промотора, так как не может являться алкилирующим агентом, и PalkA не индуцируется окислительным стрессом, однако в случае больших концентраций Н2О2 избыток перекиси водорода приводит к гибели клеток, уменьшая наблюдаемую биолюминесценцию.

Контроль Люминисценция, отн.ед.

20ммоль 10ммоль 7,5ммоль 100 5ммоль 2,5ммоль 1ммоль 0,5ммоль 0 ммоль 0 50 100 150 200 Время, мин.

Рисунок 29. Зависимость люминесценции E. coli MC1061 (pAlkA-lux) от времени инкубации в присутствии несимметричного диметилгидразина (НДМГ) и перекиси водорода.

К клеткам E. coli MС1061 pAlkA-lux добавляли НДМГ 7,5 мМ и различные концентрации окислителя - перекиси водорода (20;

10;

7.5;

5;

2.5;

1;

0.5 мМ). Измеряли люминисценцию образцов в течение 4 часов.

Итоги прикладных исследований диссертационной таботы.

• Сконструированы lux-биосенсоры, отличающиеся высокой чувствительностью чувствительность и амплитудой ответа, при этом специфично реагирующие на различные классы токсических и биологически активных веществ.

• С помощью lux-биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

Обсуждение Анализ биолюминесцентных, биохимических и генетических характеристик психрофильных светящихся бактерий штаммов BM1, BM2, KCh1 и KCh2 рода Aliivibrio (изоляты акваторий Белого, Берингова и Охотского морей) показал, что эти штаммы принадлежат виду A. logei. Отметим, что в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей бактерии данного вида изолированы впервые. Фенотипически бактерии вида A. logei очень близки бактериям вида A. fischeri, однако, в отличие от бактерий A. fischeri являются ярко выраженными психрофилами, так как растут при 40С и не растут при 300С, что первоначально и послужило выделению этих бактерий в отдельный вид (Bang S.S., et al 1978). На близость видов A. logei и A. fischeri указывает также тот факт, что сравнительно часто бактерии этих видов находят в качестве совместных симбионтов в фотофорах кальмаров рода Sepiola (Fidopiastis P.M. et al 1998.). Однако наиболее близкий генетически A. logei является не светящийся, патогенный для промыслового атлантического лосося вид A. salmonicida. На основе сравнения фенотипических характеристик и данных секвенирования (филогенетические исследования проводились по пяти «домашним» генам, 16S рРНК и luxAB), можно предположить, что эволюционно близкие виды A. logei и A. salmonicida, заняв разные экологические ниши, приобрели заметные различия в фенотипах (в том числе потеря способности к люминесценции A. salmonicida). И наоборот, сходство фенотипических признаков A. logei и A. fischeri возникло в результате существования этих видов в сходных экологических нишах. При этом сохраняется главное отличие (разные температурные оптимумы роста), позволяющее избегать конкуренции бактериям A. logei и A. fischeri.

Основное отличие QS систем психрофильных штаммов по сравнению с мезофильными заключается в наличии двух luxR регуляторных генов. Филогенетический анализ штаммов A. logei показывает, что спейсерная часть между геном luxR1 и последовательностью Шайна-Дальгарно luxC гена подвержена высокой скорости перестроек ДНК (гомология между различными штаммами составляет около 75-85 %), в тоже время последовательности обоих генов luxR (как и структурных генов всего оперона) практически идентичны (гомология 98-100%). Тот факт, что дупликация гена luxR подвержена стабилизирующему отбору (как правило, при возникновении дупликаций одна из копий гена быстро теряется или перестаёт экспрессироваться) в lux-оперонах психрофильных бактерий свидетельствует о необходимости обоих генов для штатной работы QS системы. Предполагается, что наличие двух регуляторных генов в lux-оперонах психрофильных бактерий может быть связано с необходимостью активировать QS в условиях низких температур.

Исследования шаперонина GroEL/ES и протеазы Lon как модуляторов QS A. fischeri позволяют предположить следующую последовательность событий получения нативной формы белка LuxR. На первой стадии в результате синтеза на рибосоме образуется структура с полностью сформированным С-доменом и слабо упакованным («рыхлым») N-доменом белка LuxR. На второй стадии N-домен LuxR контактирует с шаперонином GroEL/ES, что обеспечивает последующий процесс фолдинга белка, завершаемый формированием компактной структурой N-домена белка LuxR. Или контактирует с Lon-протеазой, в случае если по какой-то причине не может связаться с GroEL/ES и подвергается протеолизу. Такой белок LuxR еще не способен активировать транскрипцию lux-генов, так как N-домен частично закрывает C-домен, блокируя формирование комплекса C-домена с lux-боксом. На третьей стадии N-домен белка LuxR образует комплекс с молекулой АИ, что обеспечивает мономерам белка способность к формированию активного димера (LuxR-АИ)2, в котором N-домены обеспечивают контакт мономеров между собой и с -субъединиц РНК-полимеразы, а открытые C-домены формируют комплекс с lux-боксом. Такой комплекс (LuxR-АИ)2 уже резистентен к действию Lon протеазы.

Необходимо отметить, что N-домен белка LuxR характеризуется очень низкой константой диссоциации при комплексировании с АИ: пороговая концентрация АИ, при которой активируется экспрессия lux-генов, составляет порядка 10-9М (что соответствует примерно 3-4 молекулам АИ в расчете на объем бактериальной клетки).

В настоящей работе показано, дефицит GroEL может быть скомпенсирован высокой концентрацией АИ (10-7М против концентрации 10-9М характерной для штамма gro+).

Однако концентрации АИ порядка 10-7М имеют место лишь при полном открытии системы QS. Следовательно, в природных условиях нормальный процесс формирования нативной формы LuxR происходит двухэтапно: в начале с участием шаперонина groEL, а затем молекулы АИ. Поэтому можно считать роль шаперонинов GroEL/ES и протеазы Lon ключевой в регуляции QS систем первого типа.

Результаты этого раздела позволяют предположить неслучайное возникновение механизма протеолитического контроля и шаперонного ОТК для N-концевого регуляторного домена белка LuxR, который, по-видимому, критичен для оценки целого ряда параметров, в том числе стрессового состояния клетки. Позднее зарубежными авторами были получены данные об участии Lon протеазы и шаперонов Hsp60 в регуляции QS у ряда других бактерий (Bertani I et al 2007;

Pinto UM and Winans SC 2009).

Применение для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальных люцифераз, гомологичных по аминокислотной последовательности, но значительно различающихся по термостабильности, оказалось весьма перспективным и в настоящее время принято во многих лабораториях мира. С помощью этого метода в настоящей работе было показано, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз, являющихся гетеродимерами, происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), Hsp100 (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHspP (IbpAB).

Показано также, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термолабильных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%. Можно предположить, что более протяжённое гидрофобное ядро термостабильной люциферазы P. luminescens определяет термодинамическую выгоду от взаимодействия с подобными белками (самоассоциация и формирование агрегатов) по сравнению с взаимодействием с белками - шаперонами DnaKJE. В случае термолабильной люциферазы A. fischeri, по-видимому, денатурированным молекулам выгоднее взаимодействовать с белками -шаперонами, что и обеспечивает высокий уровень рефолдинга даже при длительном выдерживании бактерий при высокой температуре (460С).

Cконструированные в ходе выполнения диссертационной работы lux-биосенсоры на основе lux- генов и специфически регулируемых промоторов применимы для экологического мониторинга, а также для выполнения специальных задач (детекция токсичного компонента ракетного горючего – 1,1-диметилгидразина ( гептила) и его производных, детекция диоксина и его производных в пищевой промышленности, антибиотиков – в молочной промышленности, тяжелых металлов и металлоидов – при экологическом мониторинге и детекции ОВ и др.) Полученные экспериментально данные по оценке чувствительности сконструированных биосенсоров при действии на бактериальные клетки контрольными химическими препаратами показали, что lux-биосенсоры характеризуются высокой чувствительностью и одновременно специфичностью. Сконструированные lux биосенсоры по характеру ответа на действие токсических веществ можно разбить на две группы: 1) высоко специфичные биосенсоры, реагирующие на очень ограниченный круг химических веществ. К ним относятся биосенсоры с промоторами PtetR, ParsR, PmerR, PluxR, PkatG, PsoxS. В механизме работы этих биосенсоров задействованы белки репрессоры или активаторы транскрипции генов, инактивирующиеся при реакции с химическими веществами строго определенной природы, например, только с ионами мышьяка, ртути, антибиотика тетрациклина, перекиси водорода, супероксид-анион радикала, или активируемые при специфическом комплексировании с химическим соединением, как, например. LuxR-АИ-1;

и 2) биосенсоры, реагирующие на более широкий спектр химических веществ, но также с достаточно высокой степенью избирательности. К ним относятся биосенсоры с промоторами PrecA, PrpoE, PgrpE,PcolD, PfabA. Эти биосенсоры «отвечают» на действие более широких по химическим свойствам групп токсических веществ. Например, только на агенты, повреждающие ДНК, или только на агенты, повреждающие белки, или только на агенты, повреждающие мембраны клетки.

Обе группы lux-биосенсоров имеют свои области применения. Например, важно дифференцировать на какие компоненты клетки действует токсикант, содержащийся в среде – на генетический аппарат (ДНК) или на белки. В этом случае необходимо использовать для детекции биосенсоры с промоторами PcolD, PrecA, PrpoE, PgrpE. Если же стоит задача – уточнить природу ОВ в среде или наличие тяжелого металла, то необходимо использовать узко специфические биосенсоры с промоторами типа PcopA, ParsR, PmerR.

Выводы 1. Впервые определена структура lux-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от lux-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена luxR, в lux-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена luxR, причём белки LuxR1 и LuxR2 различаются как по аминокслотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.

2. Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий Aliivibrio salmonicida (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.

3. Показано, что АТФ-зависимая протеаза Lon участвует в негативной регуляции систем QS у морских бактерий. Доказано, что шаперонин GroEL/ES участвует в сборке нативной формы белка LuxR.

4. Основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N – домен ( аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Lon-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином GroEL, необходимым для сборки нативной структуры LuxR.

5. Впервые для анализа работы шаперонов были использованы в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.

6. Рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), Hsp100 (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHsp (IbpAB).

7. Термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

8. Сконструированы новые формы lux-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1 диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана.

Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

Список публикаций.

1) Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. "Ouorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом. // Мол. Биол. 2001 Т. 35 №2. С. 268-277.

2) Г. Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, М. М. Мажуль, И. В. Манухов Роль шаперонов Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE) и Hsp100 (ClpA и ClpB) в рефолдинге и повышенной термостабильности бактериальных люцифераз в клетках Escherichia coli. // Биохимия 2002 67(9):986-92., 3) Г. Б. Завильгельский, А. П. Зарубина, И. В. Манухов Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности Lux-оперона Photorhabdus luminescens, штамм ZM1. ERIC – элементы как предполагаемые «горячие» точки рекомбинации. // Молекулярная биология 2002 36(5):792-804., 4) Завильгельский, В. Ю. Котова, И. В. Манухов. Влияние регуляторных белков RcsA и RcsB на экспрессию lux-опреона Vibrio fischeri в Escherichia coli. // Молекулярная биология 2003 37(4):704-11.

5) Г.Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, М. М. Мажуль, И. В. Манухов. Влияние белков семейства Сlp на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальных люцифераз. // Молекулярная биология 2004 38(3):507-14.

6). Manukhov IV, Mamaeva DV, Rastorguev SM, Faleev NG, Morozova EA, Demidkina TV, Zavilgelsky GB. A gene encoding L-methionine gamma-lyase is present in Enterobacteriaceae family genomes: identification and characterization of Citrobacter freundii L methionine gamma-lyase. // J Bacteriol. 2005 187(11):3889- 7) И. В. Манухов, В.Ю. Котова, Г.Б. Завильгельский. Роль шаперонов GroEL/GroES и протеазы Lon в регуляции экспрессии lux-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. // Молекулярная биология 2006 40(2);

277-83.

8) Манухов И. В., Мамаева Д. В., Морозова Е. А., Расторгуев С. М., Фалеев Н. Г., Демидкина Т. В., Завильгельский Г. Б. L-метионин-гамма-лиаза. // Биохимия 2006 71(4);

842-851.Citrobacter freundii: клонирование гена и кинетические параметры фермента.

9) И. В. Манухов, В.Ю. Котова, Г.Б. Завильгельский. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии lux-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. // Микробиология 2006 75(4): 525-31.

10) Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., and Manukhov I.V. Action of asymmetric 1,1 dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide. // Mutation Research.

2007 634(1-2):172-6.

11) И. В. Манухов, В. Ю. Котова, Д. Г. Мальдов, А. В. Ильичев, А. П. Бельков, Г. Б. Завильгельский. Индукция окислительного стресса и SOS-ответа в бактериях Escherichia coli растительными экстрактами: роль гидроперекисей и эффект синергизма при совместном действии с цисплатиной. // Микробиология 2008 Т.77, № 5, с. 1–8.

12) Манухов И. В., Балабанов В.П., Котова В.Ю., Хрульнова С.А., Мелькина О.Е., Крайнов А.А., Пустовойт К.С., Кречетов П.П., Королёва Т.В., Шатров Т.Я., Чалкин С.Ф., Завильгельский Г. Б. Использование Lux-биосенсоров для детекции НДМГ в почве.

// Двойные технологии 2008 44(3): с. 50- 13) В.Ю. Котова, И. В. Манухов, О. Е. Мелькина, Г.Б. Завильгельский. Мутация clpA::kan в гене, кодирующем шаперон семейства Hsp100, уменьшает эффективность DnaK-зависимого рефолдинга белков в клетках Escherichia coli. // Молекулярная биология 2008 42(5);

1018-22.

14) Манухов И. В., Котова В.Ю., Завильгельский Г. Б. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса. // Биотехнология 2009, №6, С. 16-25.

15) С.А. Хрульнова, И.В. Манухов, А. П. Зарубина, Г. Б. Завильгельский.

Aliivibrio logei, штамм KCh1 (изолят Камчатка): биохимические и люминесцентные характеристики, клонирование lux-оперона. // Микробиология. 2010, №. 79, С 349–355.

16) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. Протеолитический контроль экспрессии генов lux-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. // Генетика 2010, том 46, № 8, с. 1–6.

17) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. С - домен LuxR, активатора транскрипции lux-оперона Vibrio fischeri, не является мишенью для Lon протеазы. // Молекулярная биология 2010 т.44 № 3 С. 1-5.

18) Ilya V. Manukhov, Ol’ga E. Melkina, Ignatii I. Goryanin, Ancha V. Baranova, and Gennadii B. Zavilgelsky. The N-terminal domain of the Aliivibrio fischeri LuxR is a target of the GroEL chaperonin. // Journal of Bacteriology 2010, Vol. 192, No. 20 p. 549-51.

19) В.Ю. Котова И.В. Манухов Г.Б. Завильгельский, Использование специфических индуцируемых Lux-биосенсоров для определения механизма токсичности наночастиц. // Нанотехника 2010, №4(24) С.35- 20) Г.Б. Завильгельский, В.Ю. Котова, И.В. Манухов, Наночастицы диоксида титана (TiO2) индуцируют в бактериях стрессовые реакции, фиксируемые специфическими lux-биосенсорами. // Российские Нанотехнологии 2011, т 6 №5–6 С. 401 405.

21) Manukhov IV, Khrul'nova SA, Baranova A, Zavilgelsky GB. Comparative analysis of the lux operons in Aliivibrio logei KCh1 (Kamchatka isolate) and Aliivibrio salmonicida. // J Bacteriol. 2011 193(15):3998-4001.