Модулирование индуцированной устойчивости и восприимчивости картофеля

На правах рукописи

ПАНИНА Яна Сергеевна МОДУЛИРОВАНИЕ ИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И ВОСПРИИМЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ 03.00.04 – биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическпих наук

Москва 2005 2

Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ Ольга Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ПАСЕШНИЧЕНКО Валентина Артуровна доктор биологических наук, профессор ФЕОФИЛОВА Елена Петровна

Ведущая организация: Институт фитопатологии РАСХН

Защита состоится «13» декабря 2005 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу:

119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 2.

C диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, кор. Автореферат разослан «»2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одной из важнейших проблем современного сельскохозяйственного производства является защита растений от патогенов и вредителей, которые ежегодно уносят от 20 до 40 % урожая (данные ФОС, 2004). До сих пор для защиты растений в основном применяются химические методы, среди которых преобладает обработка пестицидами. Пестициды, бесспорно, обладают высокой эффективностью, но вместе с тем имеют ряд серьезных недостатков, к которым относится негативное воздействие на окружающую среду, способность аккумулироваться в тканях растений, а также необходимость многократной обработки для достижения необходимого эффекта.

Альтернативой применению пестицидов являются биологические методы защиты растений, среди которых, в первую очередь, следует назвать индуцирование устойчивости (Cruickshank, Perrin, 1968;

Метлицкий, Озерецковская, 1968, 1985;

Kuc, 1977;

Albertsheim, 1992;

Ryals et al., 1996;

Озерецковская, 2002;

Metraux et al., 2002;

Durrant, Dong, 2004).

Индуцированная устойчивость является временной фенотипической устойчивостью, основанной на экспрессии множества защитных генов и поэтому является неспецифической.

Вещества фитопатогенов, вызывающие такую устойчивость, называются биогенными элиситорами (Keen, 1972). Обработка растений элиситорами нацелена не на уничтожение патогенов, как это имеет место при использовании пестицидов, а на индуцирование защитных свойств самого растения. Однако эффективность действия элиситоров не всегда достигает достаточно высокого уровня индуцирования устойчивости растений, поэтому в последнее время активизировались попытки усовершенствовать их защитное действие, для чего стало необходимым понимание механизмов индукции (Озерецковская и др., 1994;

Тарчевский, 2001;

Озерецковская, 2002;

Тютерев, 2002).

Но для того, чтобы паразитировать, патогенам необходимо подавлять (супрессировать) иммунные ответы своего растения-хозяина. Иммуносупрессия является неотъемлимым свойством паразитизма, а иммуносупрессоры служат естественными антагонистами элиситоров и индуцируют в тканях растений восприимчивость к болезням (Ouchi, Oku, 1981;

Ouchi et al., 1983;

Васюкова и др., 1989;

Озерецковская и др., 2001;

Heath, 2000). Под влиянием иммуносупрессоров ранее устойчивые растения превращаются в восприимчивые и начинают поражаться авирулентными к ним расами паразитов и даже непатогенами данных растений.

Сигнальные системы, которые функционируют между первичными агентами элиситорами и иммуносупрессорами - и конечными защитными ответами, лишь в самое последнее время стали предметом исследования ученых (Тарчевский, 2001, 2002). В наибольшей мере это касалось механизма действия элиситоров, использование которых обещало большие практические перспективы. Возможно, в силу этого ученые в первую очередь сосредоточились на познании механизмов индуцированной устойчивости и на интенсификации защитного действия элиситоров.

Что касается механизмов формирования индуцированной восприимчивости с помощью иммуносупрессоров, то это направление оставалось практически «за бортом» фитоиммунологии. Исключение составляют работы по исследованию расоспецифического иммуносупрессора -1,2--1,6-глюкана и его неспецифического аналога - ламинарина (Леонтьева и др., 1979;

Doke et al., 1979;

Garas et al., 1979;

Васюкова и др., 1981, 1985, 1987, 1989).

Весьма вероятно, что исследование механизмов действия иммуносупрессоров, как антагонистов элиситоров, позволило бы составить полное представление о механизмах, определяющих иммунный статус растения. Кроме того, детальное их изучение могло бы положить начало принципиально новому подходу к биологической защите растений путем блокирования механизмов иммуносупрессии.

Рядом исследователей показано, что в процессе индуцирования устойчивости растений принимает участие салициловая кислота (СК) (Meuwly et al., 1995;

Molders et al., 1996;

Yu et al., 1997;

Coquoz et al., 1998;

Васюкова и др., 1999;

McDowell, Dungl, 2000;

Alvares, 2002;

Тарчевский, 2002). Некоторые исследователи подразделяют пути формирования иммунных ответов растений на СК-зависимые и СК-независимые, которые функционируют в растительных тканях, взаимно влияя друг на друга и составляя комплексную сеть регуляторных взаимоотношений (Сhen, Sylva, 1993;

Lee, Leon, 1995;

Yu, Liu, 1997;

Kunkel et al., 2002;

Nibble et al., 2002). Однако до сих пор не существует достаточно ясных представлений о том, каким образом СК принимает участие в механизмах индуцирования устойчивости, и, тем более, восприимчивости растений (Lawton et al., 1995;

Mur et al., 1996;

Shirasu et al., 1997;

Wees et al., 1997;

Vidal et al., 1998;

Chеn, Klessig, 1999;

Huckelhoven et al., 1999).

Цели и задачи работы. Цель исследования заключалась в сравнительном изучении механизмов действия в тканях клубней картофеля антагонистических иммуномодуляторов – элиситора и иммуносупрессора, а также сопоставление этих механизмов с процессом формирования устойчивости и восприимчивости картофеля, инфицированного совместимыми и несовместимыми расами Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Основное внимание в работе уделяли влиянию инфицирования и обработки иммуномодуляторами на функционирование некоторых компонентов НАД(Ф)Н-оксидазной сигнальной системы.

В работе ставились следующие задачи:

1. Провести скрининг по биологической активности фракций хитозана с различными химическими и физико-химическими характеристиками с целью выявить хитозан с наибольшими элиситорными свойствами.

2. Исследовать влияние процесса индуцирования устойчивости (с помощью элиситора – хитозана и несовместимой расы P. infestans), а также процесса индуцирования восприимчивости (с помощью иммуносупрессора - ламинарина и совместимой расы P.

infestans) на уровень свободной и коньюгированной форм СК в клубнях картофеля.

3. Исследовать влияние процесса индуцирования устойчивости (с помощью элиситора и несовместимой расы P. infestans), а также процесса индуцирования восприимчивости (с помощью иммуносупрессора и совместимой расы P. infestans) на активность каталазы клубней картофеля.

4. Изучить способность экзогенной СК ингибировать активность каталазы клубней картофеля, а также выяснить способность СК ингибировать активность каталаз, выделенных из интактных (контрольных), иммунизированных и иммуносупрессированных клубней.

5. Исследовать на клубнях картофеля индуцирующие свойства перекиси водорода – наиболее стабильной из активных форм кислорода.

6. На основании полученных экспериментальных данных предложить модели функционирования в тканях клубней картофеля механизмов индуцирования фитофтороустойчивости элиситором - хитозаном и индуцирования восприимчивости супрессором - ламинарином.

7. Провести ингибиторный анализ, подтверждающий или опровергающий предположения автора относительно цепи событий, предшествующей формированию индуцированной устойчивости и восприимчивости.

8. Исследовать возможность повышения индуцирующей активности хитозана путем добавления к нему компонентов, участвующих в формировании механизмов устойчивости.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное изучение механизмов формирования индуцированной устойчивости и индуцированной восприимчивости тканей клубней картофеля и сопоставление их с механизмами возникновения устойчивости и восприимчивости при инфицировании возбудителем фитофтороза. Предполагается, что элиситор (хитозан) индуцирует в клетках клубня картофеля окислительный взрыв, способствующий иммунизации, тогда как иммуносупрессор (ламинарин) снижает концентрацию активных форм кислорода, предотвращая тем самым развитие иммунного ответа. Впервые показано, что активность каталазы - основного фермента расходного канала баланса перекиси водорода - в тканях клубней картофеля при развитии устойчивости, вызываемой хитозаном и несовместимой расой P. infestans, снижается, а под действием ламинарина и совместимой расы P. infestans - возрастает. Установлено, что СК является эффективным ингибитором активности каталазы в клубнях картофеля.

Впервые установлено, что применение низкомолекулярного, водорастворимого хитозана в композиции с СК усиливает и ускоряет защитное действие элиситора. Выдвинуто предположение о механизмах элиситорного и супрессорного действия (хитозана и ламинарина) в клубнях картофеля, что подтверждается результатами проведенного ингибиторного анализа.

Теоретическая и прикладная значимость работы. Изучен механизм индуцирования устойчивости в тканях клубней картофеля хитозаном и механизм индуцирования восприимчивости его антагонистом - ламинарином. Разработан композиционный перепарат, сочетающий в себе хитозан и СК, который обладает более сильным и быстрым защитным действием, чем собственно элиситор.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург, Репино, 2003, симпозиальный доклад);

на VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004, симпозиальный доклад).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка публикаций по теме диссертации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследований служили клубни картофеля сорта Истринский с геном фитофтороустойчивости R1 и расы возбудителя фитофтороза P. infestans, две из которых (1. и 1) совместимы с указананным сортом, тогда как две другие (3.4 и 3) – несовместимы.

Фитофтороустойчивость картофеля индуцировали низкомолекулярным, водорастворимым хитозаном со средневязкостной молекулярной массой 2-6 кДа и степенью деацетилирования 85%, который был получен энзиматическим гидролизом хитина крабов.

Ферментативный гидролиз осуществляли комплексом хитиназ из Streptomytes kursanovii (Варламов, Ильина, 2000)*.

*Различные фракции хитозана были получены в Центре «Биоинженерия» РАН и любезно предоставлены нам д.б.н., профессором В.П. Варламовым и к.х.н. А.В. Ильиной.

Для подавления иммунных ответов картофеля использовали неспецифический иммуносупрессор - ламинарин (-1,3--1,6-глюкан) («Sigma»), способность которого подавлять фитофтороустойчивость была показана ранее (Озерецковская и др., 1982).

Испытания биологической активности препаратов проводили на дисках, вырезанных из клубней картофеля (h – 7, d - 16 мм), на поверхность которых наносили по 50 µл испытуемых препаратов, и спустя 2 часа инфицировали зооспорами паразита при нагрузке 104 спор/мл. Контролем служили диски, на поверхность которых наносили воду. При инфицировании дисков несовместимыми расами образовывались некротизированные клетки, число которых через 72 часа после заражения подсчитывали под микроскопом.

Количество некротизированых клеток, меньшее, чем в контрольном варианте, свидетельствовало об индуцировании устойчивости, в то время как число некротизированных клеток, превышающее контрольное значение, являлось признаком ослабления устойчивости или развития восприимчивости (Чаленко и др., 1980). При заражении картофеля совместимыми расами патогена учитывали глубину проникновения его гиф в ткани дисков. Контрольные и опытные диски инкубировали в чашках Петри на увлажненной подложке.

Развитие устойчивости или восприимчивости выражали в % иммуномодулирующего эффекта, при условии, что контроль принимается за 0%. Таким образом, иммунизирующий эффект выражался как положительное значение, а иммуносупрессорный эффект – как отрицательное.

Для определения активности ферментов диски обрабатывали иммуномодулирующими агентами, как описано выше. Через определенные промежутки времени с обработанной поверхности дисков срезали верхний слой ткани (3 мм), из которого получали ацетоновые препараты. В экстратах ацетоновых препаратов определяли активность каталазы и бензоат 2-гидроксилазы (БК-2-Г). Экстракцию проводили, соответственно, с помощью 67 mM К-Na - фосфатного буфера (pH 7.0) и 20 mM ТЭА-буфера (рН 7,4), содержащих 1 mM ЭДТА и 5mM аскорбата натрия (Garcia-Limones, 2002). Экстракты отфильтровывали через двойной слой марли и центрифугировали, а полученные супернатанты использовали для определения активности ферментов.

Активность каталазы (ЕС 1.11.1.6) определяли по падению концентрации перекиси водорода (Luck H., 1965;

Garcia-Limones, 2002). Реакционная среда (конечный объем 0,5 мл) содержала 67 mM К-Na - фосфатного буфера (pH 7.0), 20 mM перекиси водорода, и 30 µл ферментного экстракта. Определения проводили на спектрофотометре «Backman Coulter – 2000» при 240 нм ( = 43,6). Удельную активность каталазы выражали в µМ перекиси водорода на мг белка в минуту.

Реакционная смесь для определения активности БК-2-Г (конечный объем 0.5 мл) содержала 10 µМ ТЭА-буфера (рН 7.4), 1 µМ бензойной кислоты, 1 µМ НАД(Ф)Н и 200 µл ферментного экстракта (Leon еt al., 1993). Смесь инкубировали в течение 30 мин при 300С.

Реакцию останавливали, добавляя 15% ТХУ. Спустя 10 мин осадок удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин. СК дважды экстрагировали смесью этилацетат – циклогексан (1:1 об/об), смесь разделяли на делительной воронке, из органической фазы выделяли СК, количество которой определяли методом ВЭЖХ.

Активность БК-2-Г выражали в нг СК в минуту на мг белка.

Содержание белка определяли по Брэдфорду (Bradford, 1976).

СК экстрагировали из обработанной ткани дисков картофеля в два этапа (Meuwly, Metraux, 1993). На первом этапе проводили экстракцию свободной формы СК. Ткань замораживали жидким азотом, растирали и экстрагировали 70% этанолом. Экстракт центрифугировали, супернатант отделяли, ресуспендируя осадок в 90% этаноле, и вновь центрифугировали при 10000g в течение 15 минут. Супернатанты объединяли. Спирт удаляли под вакуумом, к оставшейся водной фазе добавляли 5% ТХУ. Осадок удаляли центрифугированием, а супернатант дважды экстрагировали смесью этилацетат – циклогексан (1:1 об/об). Верхний циклогексановый слой упаривали под вакуумом, сухой остаток перерастворяли в подвижной фазе, используемой для ВЭЖХ.

Второй этап включал в себя гидролиз коньюгированных форм СК 8N НCl с последующим центрифугированием гидролизной смеси. Из супернатанта смесью этилацетат - циклогексан (1:1 об/об) выделяли фракцию, содержащую СК. Количество СК определяли с помощью ВЭЖХ.

Определение СК с помощью ВЭЖХ проводили на приборе «Стайер» (Россия) на колонке Luna - C 18(2) «Phenomenex» (США) (250мм х 4,6 мм х 5 мкм), петля 50 µл. Для разделения применяли изократическую элюцию с помощью Н3РО4 (0,43 %) и ацетонитрила в соотношении 55: 45%%, соответственно.

Для ингибиторного анализа диски клубней картофеля обрабатывали следующими веществами (50 µл на диск): 5 µM дифенилениодиниум хлорида (ДПИ) (Alvares et al., 1998), µM апоцинина* (4-гидрокси-2-метоксиацетофенон) 2,5 (оба вещества - ингибиторы НАД(Ф)Н-оксидазы), а также 10 mM 3-амино-1,2,4-триазола (АТ) - ингибитора каталазы;

и 30 mM 1,3-диметил-2-тиомочевины (ДМТМ) - вещества, которое связывает перекись водорода в тканях растения и которое условно можно называть «перехватчиком» перекиси водорода (Van Den Worm, 2001;

Raymond et al., 2003).

* Апоцинин был предоставлен нам д.б.н., профессором Ю.А. Лабасом;

ДМТМ, ДПИ и АТ д.б.н., профессором А.А. Аверьяновым, которым мы выражаем искреннюю признательность После обработки ингибиторами ткани клубней заражали зооспорами P. infestans и оценивали результаты инфицирования.

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерного анализа по программе “STRAZ” (Сагитов, Перевертин, 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В первую очередь, нами был проведен скрининг фракций низкомолекулярного водорастворимого хитозана по их способности индуцировать в тканях картофеля защитные механизмы. Скрининг осуществлялся с учетом наличия у молекул хитозана восстанавливающего или невосстанавливающего конца, степени деацетилирования (СД) по аминогруппе, а также средневязкостной молекулярной массы.

Рис. Индуцирующие свойства восстанавливающего и невосстанавливающего хитозана СН2OH О СН2OH Иммуномодулирующий эффект, % от контроля HО О 25 О 20 NH2 OH NH OH n СОО—СН Фрагмент молекулы восстанавливающего 250 100 хитозана (наличие у молекулы Концентрация, мкг/мл восстанавливающего конца препятствует проявлению элиситорной активности).

Хитозан (восстанавливающий) Хитозан (невосстанавливающий) Показано, что при наличии у молекулы хитозана восстанавливающего конца его активность несколько снижалась (рис. 1). Вероятно, это объясняется тем, что присутствие свободного гликозильного гидроксила делает хитозан более реакционноспособным – в том числе к реакциям с другими углеводами, что может приводить к снижению или потере его индуцирующей активности.

На следующем этапе скрининга сравнивали индуцирующую активность хитозанов, различающихся по СД по аминогруппе. Было установлено, что индуцирующие свойства хитозана с большей СД (85%) превосходили таковые у хитозана с меньшей СД (42%) (рис.

2). Таким образом, на основании полученных данных для скрининга по молекулярной массе мы использовали только нередуцирующие фракции хитозана со СД 85%.

Рис. Влияние СД на индуцирующие свойства хитозана СН2OH 30 О СН2OH Иммуномодулирующий эффект, % от контроля H О 25 О 20 NH2 OH NH OH n СОО--СН 250 100 50 Фрагмент молекулы невосстанавливающего хитозана Концентрация, мкг/мл (более высокая СД по аминогруппе усиливает элиситорные свойства СД хитозана 42% СД хитозана 85% хитозана).

На следующем этапе анализировали индуцирующую активность хитозанов с различной средневязкостной молекулярной массой. Установлено, что наибольшей индуцирующей активностью обладали хитозаны с молекулярной массой 2 и 5 кДа (табл. 1).

Таким образом, в результате скрининга было установлено, что наиболее эффективным индуктором фитофтороустойчивости клубней картофеля являлся низкомолекулярный, водорастворимый, нередуцирующий хитозан со средневязкостной молекулярной массой 2 и кДа и степенью деацетилирования 85% в концентрации 100µг/мл (табл. 1).

В качестве иммуносупрессора клубней картофеля использовали ламинарин (рис. 3), -1,3--1,6-глюканов который, как упоминалось выше, является аналогом – иммуносупрессоров, обладающих специфической активностью к различным расам P.

infestans, поскольку вышеназванные глюканы ингибировали защитные механизмы картофеля только в том случае, если были изолированы из совместимых с исследуемым сортом картофеля рас возбудителя фитофтороза (Озерецковская и др., 1982;

Васюкова и др., 1989).

По строению ламинарин (степень полимеризации около 30 глюкозных единиц) подобен этим глюканам, однако, в отличие от них, не обладает расоспецифичностью. Ламинарин подавляет защитные реакции картофеля (синтез фитоалексинов, ингибиторов протеиназ, процессы раневой репарации), поэтому его относят к разряду иммуносупрессоров.

Таблица Индуцирующая активность хитозанов с различной средневязкостной молекулярной массой Концентрация Некротизиро- Иммуномодулирующий, µг/мл Вариант ванные эффект, % от контроля клетки, М + Контроль - 15,6 ± 0,8 250 13,1 ± 0,9 Хитозан, 100 11,9 ± 0,8 2 кДа 10 12,3 ± 0,9 1 12,5 ± 1,2 0,1 13,2 ± 1,4 250 13,1 ± 0,7 Хитозан, 100 11,9 ± 0,8 5 кДа 10 12,0 ± 0,8 1 12,3 ± 1,1 0,1 12,5 ± 0,9 250 14,8 ± 0,9 Хитозан, 100 13,2 ± 1,2 6 кДа 50 13,2 ± 0,7 10 13,2 ± 1,4 1 14,5 ± 1,5 250 15,0 ± 1,2 Хитозан, 100 15,1 ± 1,2 7 кДа 10 14,2 ± 1,1 1 14,0 ± 1,2 0,1 12,6 ± 1,2 250 14,2 ± 0,9 Хитозан, 100 14,2 ± 1,2 10,7 кДа 50 12,6 ± 0,7 10 12,5 ± 1,4 1 13,4 ± 1,3 Рис. Строение ламинарина – супрессора иммунных ответов картофеля При изучении иммуносупрессорных свойств оказалось, что наибольшую иммуносупрессирующую активность ламинарин проявляет в концентрации 300 µг/мл (табл.

2, 3). При обработке ламинарином усиливается степень поражения клубней картофеля совместимыми расами патогена (табл. 2). Под действием супрессора клубни начинают поражаться несовместимыми расами P. infestans (табл. 3) и даже непатогенами картофеля (Медведева и др., 1985). Показано также, что ламинарин обладает антиэлиситорным действием: индуцирование устойчивости элиситором в его присутствии затруднено (данные не приводятся).

Таблица Влияние ламинарина на инфицирование клубней картофеля совместимыми расами P. infestans Обработка дисков Расы Глубина проникновения гриба P. infestans картофеля Ряды клеток от Иммуномоду поверхности лирующий инфицирования, эффект, % от контроля М± 25,3 + 2, Контроль (вода) 1 33,4 + 3, Ламинарин (300 µг/мл) 1 - 20,3 + 1, Контроль (вода) 1,3 24,5 + 1, Ламинарин (300 µг/мл) 1,3 - Таблица Влияние ламинарина на инфицирование клубней картофеля несовместимыми расами P. infestans Обработка дисков Расы Некротизированные клетки P.

картофеля Число, Иммуномоду infestans лирую щий эффект, % М± от контроля 15,7 + 1, Контроль (вода) 3,4 19,5 + 0, Ламинарин (300 µг/мл) 3,4 - 13,9 + 0, Контроль (вода) 3 16,3 + 1, Ламинарин (300 µг/мл) 3 - Выше уже упоминалось, что одним из участников сигнальных систем, ответственных за формирование фитоиммунитета, является СК (Сhen, Sylva, 1993;

Lee et al., 1995;

Yu et al., 1997;

Nibble et al., 2002). В растениях СК находится как в свободной, так и в связанных формах, среди которых преобладает ее О--D-глюкозид. Особо следует подчеркнуть, что СК участвует в индуцировании устойчивости только в свободной форме;

связанные формы СК таким свойством не обладают, но выступают неким резервом, обеспечивающим запас СК в тканях (Raskin, 1992;

Lee et al., 1995). Что касается формирования иммуносупрессии, то роль СК в этом процессе до сих пор остается неясной.

Нами было исследовано влияние инфицирования совместимыми и несовместимыми расами P.infestans на уровень свободной и связанной форм СК в тканях клубней картофеля.

На рис. 4 представлены фотографии клеток клубней картофеля, пораженных несовместимой и совместимой расами возбудителя фитофтороза, а выше – их схематическое изображение.

Рис. Содержание СК в тканях клубней картофеля, инфицированных P.infestans Инфицирование Инфицирование несовместимой расой совместимой расой СК (свободная форма), % от 185,0 169, контроля 416,0 СК (связанная форма), % от 13, контроля В несовместимой комбинации хозяина и паразита в области заражения содержатся отмершие клетки, погибшие в процессе сверхчувствительной реакции, с остатками разрушенных гиф патогенного оомицета. Наибольшее их количество сосредоточено в поверхностных слоях инфицированной ткани. Согласно полученным данным, в несовместимой комбинации СК накапливается вокруг СВЧ-области. Известно, что образующаяся в результате биосинтеза СК довольно быстро превращается в связанную форму, что согласуется с наблюдаемой одновременной аккумуляцией как свободных, так и конъюгированных форм СК (Raskin, 1992).

При развитии восприимчивости (в совместимой комбинации хозяина и паразита) клетки картофеля заполнены живыми, хорошо развитыми гифами P.infestans, которые к моменту исследования достигают 10-15 рядов клеток, считая от поверхности инфицирования. Согласно полученным данным, при развитии восприимчивости наблюдалось снижение общего уровня СК, которое выражалось, прежде всего, в уменьшении концентрации ее связанных форм (рис. 4).

Что касается уровня СК в клубнях картофеля, обработанных иммуномодуляторами, то оказалось, что под воздействием хитозана содержание свободной СК значительно возрастало, тогда как под влиянием ламинарина – практически не изменялось (рис. 5). Концентрация же конъюгироваванной формы СК, напротив, снижалась значительно под воздействием хитозана, и лишь слегка уменьшалась под влиянием ламинарина (рис. 6) Рис. 5 Рис. Изменение уровня связанной формы Изменение уровня свободной формы СК в тканях клубней картофеля СК в тканях клубней картофеля под под действием иммуномодуляторов действием иммуномодуляторов Количество СК, нг/г сырой ткани Количество СК, нг/г сырой ткани 350 300 150 100 Поскольку в результате индуцирования устойчивости клубней картофеля с помощью хитозана возрастание уровня свободной СК сопровождалось снижением количества ее связанной формы, возникает вопрос, является ли аккумуляция СК результатом гидролиза конъюгатов, или же наряду с процессом гидролиза происходит и ее синтез de novo. Для ответа на этот вопрос определяли активность фермента, ответственного за синтез СК из бензойной кислоты – бензоат-2-гидроксилазы (БК-2-Г). Согласно полученным данным, индуцирование устойчивости картофеля хитозаном сопровождалось возрастанием, а индуцирование восприимчивости ламинарином - снижением активности БК-2-Г (табл. 4). Из этого следует, что в процессе элиситации активизируется как высвобождение СК из связанных форм путем их гидролиза, так и ее непосредственный синтез из бензойной кислоты, в то время как при развитии иммуносупрессии оба процесса подавлены.

Таблица Активность БК-2-Г в клубнях картофеля под действием иммуномодуляторов.

Активность БК-2-Г, нг СК х мг белка-1 х мин- Вариант 64 ± 2, Вода (контроль) Хитозан (100 µг/мл) 76 ± 3, Ламинарин (300 µг/мл) 46 ± 2, Предполагается, что механизм участия СК в индуцировании устойчивости растений связан с ее способностью ингибировать активность некоторых растительных каталаз (Chen et al., 1992;

Ruffer et al., 1995;

Tenhaken, Rubel, 1997), в результате чего в клетках накапливается перекись водорода, способная активировать экспрессию защитных генов (Doke et al., 1996;

Alvarez et al., 1998;

Suzuki et al., 2005).

Рис. При инфицировании клубней Удельная активность каталазы в тканях картофеля несовместимой расой P.

клубней картофеля, инфицированных P.

infestans было показано снижение infestans 140 активности каталазы в тканях Активность каталазы, % растения по сравнению с от контроля контролем, что, возможно, приводило к накоплению перекиси 40 водорода. При заражении же P. infestans совместимой расой активность каталазы клубней 15 ч 24 ч 48 ч Раса 3. Раса 1.3 Экспозиция, ч картофеля по сравнению с контролем мало изменялась Рис. Удельная активность каталазы в тканях Что касается изменений клубней картофеля, обработанных активности каталазы при иммуномодуляторами 300 индуцировании устойчивости и 250 восприимчивости картофеле, Активность каталазы, % от контроля обработанном иммуно модуляторами, то было установлено, что уже через 5 ч после воздействия хитозана активность каталазы значительно 5 15 хитозан ламинарин Экспозиция снижалась по сравнению с контролем, тогда как под воздействием ламинарина, напротив, несколько возрастала (рис. 8). Особенно ярко эта тенденция проявлялась при экспозиции ч, где наблюдалось максимальное снижение активности каталазы в иммунизированных тканях и наибольшее возрастание ее активности под воздействием иммуносупрессора.

Из данных литературы известно, что СК, ее химические производные и миметики обладают способностью ингибировать активность железосодержащих ферментов, в том числе некоторых (но далеко не всех) растительных каталаз (Chen et al., 1992;

Ruffer et al., 1995;

Tenhaken, Rubel, 1997). Имеются данные о том, что янтарная кислота (ЯК), которая является естественным миметиком СК, обладает одинаковой с СК способностью ингибировать активность каталазы печени быка (Тарчевский и др., 2000).

Таблица Ингибирование активности каталазы клубней картофеля СК Проведенные нами исследования Концентрация Степень ингибирования, % показали, что СК является эффективным СК, М 5 10 20 30 40 мин мин мин мин мин мин ингибитором каталазы, выделенной из 7,2 х 10-3 93 93 94 93 93 интактных клубней картофеля, причем 5,8 х 10-3 90 90 90 90 90 3,6 х 10-3 80 95 95 95 95 95 экспозиция, необходимая для 7,2 х 10-5 67 88 93 95 95 ингибирования активности каталазы, 7,2 х 10-7 67 78 88 91 93 7,2 х 10-9 73 79 83 82 90 93 обратно пропорциональна концентрации 7,2 х 10-11 68 84 86 87 81 СК (табл.5).

7,2 х 10-13 71 76 78 78 76 Таблица Ингибирование активности каталазы клубней картофеля ЯК Что касается ЯК, то эта кислота также Концентрация Степень ингибирования, % обладала способностью ингибировать ЯК, М 5 10 20 30 40 активность каталазы клубней картофеля, мин мин мин мин мин мин 8,5 х 10-3 75 85 89 90 94 хотя значительно уступала в этом СК 4,2 х 10-3 73 85 87 89 90 8,5 х 10-5 48 53 57 74 82 92 при близких концентрациях обеих кислот 8,5 х 10-7 49 58 66 55 67 ЯК требовалась значительно большая 8,5 х 10-9 61 67 85 81 83 8,5 х 10-11 экспозиция для того, чтобы достигнуть 77 64 64 70 72 8,5 х 10-13 57 45 57 76 75 определенной степени ингибирования (табл. 6, рис. 9).

Рис. Вероятно, именно значительно большая Ингибирование активности эффективность СК как ингибитора активности каталазы клубней картофеля СК и каталазы определяет ее участие в процессе ЯК формирования индуцированной устойчивости картофеля.

Степень ингибирования, % 100 Таким образом, согласно полученным данным, в процессе индуцирования устойчивости аккумуляция СК закономерно сопровождалась снижением активности каталазы. При исследовании процесса индуцирования восприимчивости мы столкнулись с противоречием – содержание 5 10 20 30 40 СК изменялось мало, тогда как активность Экспозиция, мин ЯК СК каталазы значительно возрастала.

Таблица Ингибирование салициловой кислотой каталаз, выделенных из тканей клубней картофеля, обработанных иммуномодуляторами Чтобы разрешить это противоречие, была проверена О бработка К он ц ен трац и я С теп ен ь ин ги би ров ани я кл убн ей С К, г/мл акти в н ости каталазы, % способность салицилата 10 20 30 ингибировать активность ми н ми н ми н ми н. -6 каталаз, выделенных из 84 82 84 7,2 К он троль. - 86 80 95 7,2 10 контрольных, иммунизирован. - 84 84 83 7,2 10 ных и иммуносупрессированных Хи тозан. - 88 91 90 7,2 10 клубней. Оказалось, что. - 64 62 67 7,2 Л ами н арин чувствительность к СК у. - 68 71 80 7,2 каталазы, выделенной из иммунизированных хитозаном клубней, была значительно выше, чем чувствительность этого фермента, выделенного из клубней, обработанных ламинарином (табл. 7). Возможно, что под воздействием ламинарина происходила интенсификация экспрессии гена изоформы каталазы, обладающей пониженной чувствительностью к СК.

Результатом ингибирования активности каталазы СК в тканях клубней картофеля, по видимому, является накопление перекиси водорода – наиболее стабильной из всех АФК.

Рис. 10.

Поскольку предполагается, что перекись Индуцирующая активность перекиси водорода выполняет в тканях растений водорода роль вторичного мессенджера (Гамалей, Иммуномодулирующий Клюбин, 2000;

Suzuki et al., 2004) эффект, % от контроля 40 индуцирующего каскад защитных реакций, то возникает вопрос, обладает ли перекись водорода самостоятельной индуцирующей активностью. Согласно полученным данным, обработка тканей 0 клубней картофеля перекисью водорода в 5 25 50 испытанных нами концентрациях Концентрация перекиси водорода, мкМ вызывала иммунный ответ (рис. 10), что подтверждает необходимость накопления перекиси водорода для индуцирования устойчивости.

Основываясь на полученных данных, мы попытались предположить гипотетическую модель индуцирования устойчивости с помощью хитозана (рис. 11) и восприимчивости – с помощью ламинарина. Согласно модели индуцирования устойчивости, при иммунизации тканей клубней картофеля хитозаном функционирует следующая регуляторная цепочка: в процессе элиситации происходит накопление свободной формы СК, которая ингибирует активность каталазы, в результате чего происходит накопление перекиси водорода («окислительный взрыв»), и формируется индуцированная устойчивость (рис. 11).

При индуцировании восприимчивости ламинарином не происходит накопления СК, чувствительность каталазы к СК снижается, и активность фермента возрастает. В результате процесс формирования индуцированной восприимчивости не сопровождается накоплением перекиси водорода, более того – за счет возрастания активности каталазы уровень ее несколько понижается. Снижение концентрации АФК в клетках не позволяет развиться устойчивости, и клубни становятся восприимчивыми к патогенам.

С целью проверить справедливость предложенных моделей индуцирования устойчивости и восприимчивости клубней картофеля нами был проведен ингибиторный анализ (табл. 8). Оказалось, что после обработки ингибиторами НАДФ(Н)-оксидазы в тканях картофеля индуцировалась восприимчивость к патогену, причем более специфичный ингибитор (апоцинин) провоцировал гораздо более сильную супрессию иммунных ответов, чем менее специфичный ДПИ. Блокирование активности НАДФ(Н)-оксидазы приводило к снижению уровня АФК в тканях, и, как следствие, к индуцированию восприимчивости тканей картофеля к фитофторозу.

Рис. Гипотетическая модель индуцирования устойчивости клубней картофеля ЭЛИСИТОР (ХИТОЗАН) первичный сигнал ПЛ Активация НАД(Ф)Н-оксидазной сигнальной системы Гидролиз Активация связанных БК-2-Г НАД(Ф)Н форм СК оксидазаact О2 О СОД СК рН-ПО кс Каталазаinh Н2О Каталаза ДАО Ингибирование АПО КО, ГО ГлР и др. ПО ГвПО и др. ПО ПК ФРТ Экспрессия защитных генов ИНДУЦИРОВАННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ СК-салициловая кислота;

ПК-протеинкиназы;

ПЛ – плазмалемма;

ФРТ - факторы регуляции транскрипции;

ферменты, продуцирующие Н2О2: СОД – супероксиддисмутаза, рН ПО кс – рН-зависимая пероксидаза клеточной стенки, КО – ксантиноксидаза, ГО гликолатоксидаза, ДАО - диоаминооксидаза;

ферменты, продуцирующие Н2О2: АПО аскорбатпероксидаза, ГлР- глутатионредуктаза, ГвПО – гваяколпероксидаза;

ПО-пероксидазы Таблица Воздействие ингибиторов на устойчивость клубней картофеля к P. infestans Вариант Концентрации Некротизированные Иммуномодулирующий клетки, М ± эффект,% от контроля 10,4 ± 0,4 Контроль (вода) 13,0 ± 0, 100 - Апоцинин (ингибитор 12,8 ± 0, 50 - НАД(Ф)Н 17,0 ± 0, 25 - оксидазы) 17,2 ± 0, 2,5 - 17,3 ± 0, 1 - 10,7 ± 0, 100 - ДПИ (ингибитор 11,1 ± 0, 50 - НАД(Ф)Н 10,6 ± 0, 25 - оксидазы) 10,9 ± 0, 2,5 - 12,4 ± 0, 1 - 9,9 ± 0, 100 АТ (ингибитор 7,9 ± 0, 10 активности 8,4 ± 0, 1 каталазы) 8,7 ± 0, 0,1 11,4 ± 0, 300 - ДМТМ («перехватчик» 11,6 ± 0, 30 - перекиси) 11,2 ± 0, 3 - 11,2 ± 0, 0,3 - Ингибирование активности каталазы с помощью АТ приводило к индуцированию устойчивости тканей клубня к возбудителю фитофтороза, что свидетельствует об участии перекиси водорода в процессе иммунизации. Доказательством этому также служила обработка тканей ДМТМ - перехватчиком перекиси водорода - которая способствовала индуцированию восприимчивости.

Вторым подтверждением предложенной модели служит создание композиционного препарата, сочетающего в себе хитозан и СК (10-8 г/мл). Оказалось, что композиционный препарат усиливает и (что не менее важно) ускоряет возникновение иммунизирующего эффекта (рис. 12). Так, при обработке композиционным препаратом защитный эффект в центре клубня картофеля развивался уже на 2-е сутки, в то время как при обработке хитозаном – лишь на 6-е сутки (рис. 12). Кроме того, добавление СК позволяет снизить эффективную концентрацию хитозана, необходимую для иммунизации клубней: если ранее использовался хитозан в концентрации 100 µг/мл, то при добавлении СК достаточно применить концентрацию 10 µг/мл (рис. 13).

Рис. 12 Рис. Индуцирование устойчивости клубней картофеля композиционным препаратом Индуцирующая активность 50 композиционного препарата Иммуномодулирующий эффект, % от контроля Иммуномодулирующий эффект, % от контроля 0 0 2 4 6 10 Экспозиция, сутки Концентрация хитозана, мкг/мл СК Хитозан СК + Хитозан Хитозан Хитозан + СК Мы проанализировали уровень СК и активность каталазы в клубнях картофеля, обработанных композиционным препаратом хитозана с СК и выяснили, что под его воздействием интенсифицируются аккумуляция СК и снижается активности каталазы (рис.

14, 15). СК без хитозана такого эффекта не вызывала даже при применении ее в концентрациях на порядок выше, чем 10-8 г/мл.

Рис. 14 Рис. Активность каталазы под влиянием Уровень свободной формы СК в тканях клубней композиционного препарата картофеля под действием композиционного препарата Количество СК, нг/г сырой ткани Активность каталазы, 400 % от контроля 0 5 15 Экспозиция, ч хитозан СК хитозан + СК Таким образом, исследование механизмов формирования индуцированной устойчивости с помощью хитозана и индуцированной восприимчивости с помощью ламинарина, позволило нам предложить модель их функционирования и подтвердить ее существование ингибиторным анализом и созданием композиционного препарата с более эффективным, чем у собственно хитозана, защитным действием.

ВЫВОДЫ 1. Процессы, происходящие в клубнях картофеля под влиянием элиситора и иммуносупрессора, в целом соответствуют процессам, имеющим место при инфицировании картофеля несовместимой и совместимой расами P. infestans, соответственно.

2. В процессе индуцирования устойчивости в тканях клубней картофеля происходит накопление СК. Аккумуляция свободной формы СК происходит в результате интенсификации ее биосинтеза de novo и возможного гидролиза связанных форм СК.

3. В процессе индуцирования восприимчивости происходит снижение интенсивности биосинтеза СК из бензойной кислоты, но существует вероятность некоторого пополнения «пула» свободной СК за счет разложения ее связанных форм.

4. При индуцировании устойчивости активность каталазы клубней картофеля снижается, результатом чего, по-видимому, является накопление перекиси водорода («окислительный взрыв»).

5. При индуцировании восприимчивости активность каталазы клубней картофеля возрастает, следствием чего является снижение уровня перекиси водорода (предотвращение «окислительного взрыва»).

6. СК является эффективным ингибитором активности каталазы в контрольных и иммунизированных клубнях картофеля. В процессе индуцирования восприимчивости способность каталазы клубней ингибироваться СК снижается.

7. Показана способность экзогенной перекиси водорода индуцировать фитофтороустойчивость клубней картофеля в установленных концентрациях.

8. Предлагаемая модель индуцирования устойчивости клубней картофеля хитозаном и восприимчивости - ламинарином подтверждается:

А. Результатами ингибиторного анализа Б. Усилением защитного эффекта хитозана путем создания его композиционного препарата с СК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Валуева Т.А., Герасимова Н.Г., Панина Я.С., Озерецковская О.Л. Регуляция иммунных ответов картофеля ламинарином. Прикл.биохимия и микробиол. 2003. №6.С.697- 2. Васюкова Н.И., Зиновьева С.В., Удалова Ж.В., Панина Я.С., Озерецковская О.Л..

Участие салициловой кислоты в системной нематодоустойчивости томатов. Доклады АН.

2003. Т. 391, С. 343-345.

3. Васюкова Н.И., Панина Я.С., Зиновьева С.В, Удалова Ж.В., Озерецковская О.Л., Участие салициловой кислоты в системной устойчивости томатов к Meloidogyne incognita.

Материалы седьмой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». С.- Петербург, Репино, 15-18 сентабря 2003 г. ВНИРО. С.

73-76.

4. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Изменение активности каталазы клубней картофеля под действием иммунорегуляторов. Доклады АН. 2004. Т. 395. №5. С.

348-352.

5. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Ингибирование активности каталазы клубней картофеля салициловой и янтарной кислотами. Доклады АН. 2004. Т. 397.

С. 307-311.

6. Озерецковская О.Л., Варламов В.П., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Панина Я.С. Воздействие системных сигнальных молекул на скорость распространения по тканям картофеля иммунизирующего эффекта элиситоров. Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. №1. С. 252-256.

7. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Озерецковская О.Л. Салициловая кислота и индуцированная устойчивость растений. Материалы 6-го симпозиума по фенольным соединениям. Москва, 28-30 апреля 2004 г., с. 8. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Свободная и коньюгированные формы салициловой кислоты: содержание и роль в картофеле. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. №3. С. 1-4.

9. Панина Я.С, Герасимова Н.Г., Чаленко Г.И., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л.

Салициловая кислота и фенилалаланин-аммиак-лиаза в картофеле, инфицированном возбудителем фитофтороза. Физиология растений. 2005. Т. 52. №4. С. 573-577.