Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной днк
На правах рукописи
Татаринова Ольга Николаевна Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК 03.01.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно исследовательском институте физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России Научные руководители:
доктор химических наук, доцент Позмогова Галина Евгеньевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Торховская Татьяна Ивановна (ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России) кандидат химических наук Липкин Алексей Валерьевич (РНЦ "Курчатовский институт")
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Защита диссертации состоится «» _ 2010 года в _ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.057.01 при ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России по адресу: 119435, Москва, Малая Пироговская д. 1А
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России
Автореферат разослан «» 2010 года
Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук Мурина М.А.
Общая характеристика работы
Актуальность работы. Одной из задач современной генотерапии является избирательная доставка в клетки чужеродного генетического материала. Это свя зано в первую очередь со спецификой его применения в качестве терапевтическо го агента. Уникальные адресующие свойства показаны для белковых переносчи ков ДНК (Rusconi S., 2000;
Uherek C., 2000), интерес к которым особенно возрос в связи с открытием новых перспективных свойств олигонуклеотидов (антисмы словые олигомеры, аптамеры, ДНК/РНК гибриды, siRNA и др.). Представленная работа развивает подход к конструированию самоорганизующихся белково нуклеиновых молекулярных ансамблей, способных избирательно интернализо ваться клетками-мишенями и обеспечивать взаимодействие нуклеиновой компо ненты с внутриклеточными целями. Избирательность таких комплексов в отно шении целевых клеток обеспечивается взаимодействием рецепторсвязывающего домена белковой компоненты с тканеспецифичными поверхностными рецептора ми или рецепторами клеток-мишеней, а интернализация – рецептор опосредованным эндоцитозом.
На сегодняшний день существуют различные подходы к формированию многофункциональных биополимерных струк тур. На рис. 1 А показана схема мультидоменного функционального ком плекса, состоящего из лиганда, отвечающего за узнавание поверхности и обеспечивающего транс порт посредством рецеп- Рис. 1. Схема конструирования белок-нуклеиновых ком плексов: А – мультидоменный рекомбинантный белок в тор-опосредованного эн комплексе с ДНК;
Б – комплекс, состоящий из металличе доцитоза, ДНК- ской наночастицы и адсорбированных на ее поверхности функциональных доменов белков и ДНК.
связывающего домена с нуклеиновой компонентой или непосредственно ДНК (ковалентные ДНК белковые конъюгаты) и возможных дополнительных доменов – эндосомолитиче ских единиц токсинов, сигнальных последовательностей и т.д. Другим подходом может служить конструирование функциональных комплексов на основе твердых платформ, например металлических наночастиц (рис. 1 Б). В этом случае все до мены непосредственно сорбируются на поверхности за счет различных взаимо действий. Однако необходимо доказать, что при сорбции молекул их свойства со хранились, так, ДНК должна сохранять возможность к гибридизации, белки – со хранять структуру и т.д.
С точки зрения практической медицины особый интерес представляют ак тивно пролиферирующие клетки – эмбриональные, стволовые и опухолевые, для которых характерна суперэкспрессия рецепторов факторов роста и альфа фетопротеина (АФП) (Abelev G.I., 1971;
Mizejewski G.J., 1985). АФП и его фраг менты успешно использовались ранее для создания средств направленной достав ки антибиотиков в опухолевые клетки (Гороховец Н.В., 2006). Обнадеживающие результаты были получены и при in vitro испытаниях конъюгатов нативного АФП с тиофосфорильными антисмысловыми олигонуклеотидами, а также для ком плексов полилизинового производного АФП, выделенного из ретроплацентарной сыворотки рожениц, с ДНК (Посыпанова, Г.А., 2005).
Конструирование и исследование функциональных белок-нуклеиновых комплексов на поверхности металлических частиц является одним из направле ний в поиске новых материалов, обладающих заданными функциональными свойствами, что является одной из актуальных задач нанотехнологии. В сравне нии с ранее описанными платформами, наночастицы никеля обладают рядом при влекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными ха рактеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидинилиро ванные белки (Becerril, H., 2006, Лазарев, В.Н., 2007), поэтому их использование в биосенсорах и диагностических системах представляет значительный интерес.
Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и под твердить целостность и функциональность молекул в их составе.
Цель работы состоит в конструировании, получении и исследовании свойств функциональных нуклеопротеиновых комплексов, а также их ассоциатов с наноразмерными частицами никеля.
Для выполнения работы были поставлены следующие задачи.
1. Конструирование на основе альфа-фетопротеина новых белков-векторов, способных ассоциироваться с олигонуклеотидами, их аналогами, а также с плаз мидной ДНК для избирательной доставки генетического материала в целевые клетки.
2. Получение экспрессирующих конструкций, штаммов-продуцентов ре комбинантных белков, наработка целевых полипептидов, подтверждение их пер вичной структуры, исследование комплексообразования с ДНК и транспортных свойств полученных нуклеопротеиновых ассоциатов.
3. Исследование способности наноразмерных частиц никеля ассоциировать ся с молекулами олигонуклеотидов и гистидинилированных белков, подтвержде ние целостности и функциональности биополимеров в составе комплексов с ни келем.
4. Оптимизация методов ВЭЖХ-очистки олигонуклеотидов фосфодиэфир ной, тиофосфорильной природы и несущих метки, а также антисмысловых олиго нуклеотидов, таких как TMO (telomere-mimic oligonucleotide, фрагмент теломер ной ДНК, подавляющий экспрессию гена теломеразы), AS1 (подавляющий экс прессию проонкогена C-myc) и др., структура которых затрудняет очистку по стандартным протоколам.
Научная новизна и практическая значимость. На сегодняшний день не существует универсальных избирательных систем доставки ДНК в целевые клет ки. Высокий уровень интернализации чужеродного генетического материала дос тигается при использовании различных подходов, например липофекцией, но в данном случае речь не идет об избирательном транспорте. В то же время нет дан ных о том, какого количества трансформированных клеток необходимо добиться для достижения терапевтического эффекта, однако ряд экспериментов свидетель ствует о том, что эффективной оказывалась трансформация лишь 5-10% поражен ных клеток (Kay M.A., 2000). Использование механизма рецептор опосредованного эндоцитоза позволяет решить ряд проблем, связанных как с из бирательностью доставки, так и с безопасностью его применения в целом. В представленной работе впервые получены 3 рекомбинантных белковых вектора на основе фрагмента альфа-фетопротеина. Экспонирование рецепторов АФП на поверхности клеток служит одним из надежных маркеров ряда опухолей (Abelev G.I., 1971). Новые белковые векторы имеют 2-х доменную структуру: 1) рецепто роспецифичный домен (фрагмент альфа-фетопротеина), отвечающий за узнавание комплекса определенной поверхности и обеспечивающий транспорт комплекса посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, 2) ДНК-связывающий домен, представленный различными олигокатионными последовательностями.
Показано, что полученные рекомбинантные белки самопроизвольно ассо циируются с олигонуклеотидами, олигонуклеотидными дуплексами и плазмидной ДНК с образованием стабильных комплексов, способных избирательно интерна лизоваться клетками, несущими рецепторы АФП. Избирательность полученных нуклеопротеиновых комплексов подтверждена in vitro экспериментами с целевы ми и рецептордефицитными (контрольными) клеточными культурами. Универ сальность белковых векторов в отношении переносимого генетического материа ла подтверждена как исследованием взаимодействий белков с олигомерами, дуп лексами и плазмидной ДНК, так и экспериментами по доставке с их помощью из вестных антисмысловых к таким ключевым генам канцерогенеза, как ген теломе разы и C-myc, олигонуклеотидов тиофосфорильной природы. Полученные ре зультаты важны для понимания механизмов образования и изучения взаимодей ствий молекулярных ДНК-белковых ансамблей. Новые белки могут стать универ сальной основой для разработки эффективных высокоизбирательных ген направленных противоопухолевых лекарств.
В настоящей работе на примере полученных новых рекомбинантных белков на основе АФП исследовано образование протеин-никелевых ассоциатов. В рабо те продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность исполь зования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополи мерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмер ными основами. Показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоцииро ваться с фрагментами однонитевых ДНК с образованием стабильных комплексов.
Впервые показано, что в составе комплексов молекулы биополимеров не дегради рованы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства, это создает основу для их использования, например, в системах селекции аффин ных к белкам аптамеров. Полученные результаты вносят вклад в создание новых биополимер-никелевых наноструктур – исследовательских и диагностических ин струментов в области молекулярной наноэлектроники, биологии и медицины.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доло жены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молеку лярной биологии и генетики ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России (Москва, 12 ноября 2009 года), а так же в ходе следующих конференций:
III Международная конференция "Фундаментальные науки – медицине" (Новоси бирск, 2007), IV Съезд российского общества биохимиков и молекулярных биоло гов (Новосибирск, 2008), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), 1-й Международной научной шко ле Нано-2009 (Москва, 2009), Конференция молодых ученых НИИ ФХМ (Москва, 2009).
Публикации по теме диссертационной работы. По теме диссертации ав тором опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, резуль таты работы представлены на 5 конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора ли тературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, за ключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на страницах печатного текста, содержит 14 рисунков. Список литературы включает 190 источников.
Материалы и методы.
Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы.
В работе были использованы клетки линии DU 145 (human prostate carcinoma), SCOV3 (ovarian carcinoma), наличие в которых рецепторов AFP под тверждали по взаимодействию с флуоресцентным AFP, и лимфоциты, а также бактериальные штаммы E. coli DH5 (F- 80lacZM15 (lacZYA-argF) U169 recA endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 - thi-1 gyrA96 relA1) (Life Technologies, Ве ликобритания), B834 (DE3)(F– ompT hsdSB(rB– mB–) gal dcm met (DE3)) (Novagen, США), BL21(DE3)pLysS (F– ompT hsdSB(rB– mB–) gal dcm (DE3), pLysS, Cmr (Promega), плазмидные векторы pGEM-Т/easy (Promega, США), pET-15b, pET-28b (Novagen, США), pRC-CMV (Invitrogen, США).
Наночастицы никеля.
Наночастицы никеля (20 нм) получены в Институте энергетических про блем химической физики РАН, Россия.
Методы.
Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на хроматографах Waters, Agilent Chemstation 1100 Series в градиенте ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония или 0,1 М триэтиламмоний ацетата на С16, С18 и С4 об ращеннофазовых колонках. Хроматографию белков проводили с использованием FPLC систем Pharmacia (Швеция) или Agilent (США).
Электрофоретическое разделение олигонуклеотидов проводили стандартно в 20% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, ампликонов и плазмид в агарозном геле 2% и 1% соответственно, белков в 12% ПААГ.
Масс-спектры регистрировались на MALDI TOF-спектрометрах UltraFlex и MicroFlex (Bruker, США) с использованием стандартной стальной мишени (MSP polished steel, Bruker, США). В качестве матрицы при анализе олигонуклеотидной составляющей применяли 0,25 М раствор 3-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, США). Для получения масс-спектров белков непосредственно с никелевых нано комплексов последние дважды промывали 0,1 M раствором ацетата аммония в 1% ацетонитриле, водой и ресуспендировали в 0,022 М растворе матрицы (3,5 диметокси-4-оксикоричной кислоты, Aldrich, США), в 50% водном ацетонитриле, содержащем 0,1% трифторуксусной кислоты. Полученную суспензию наносили на мишень и высушивали на воздухе.
Синтез олигонуклеотидов.
Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали твердофазным амидофосфит ным методом на автоматическом синтезаторе ASM (Россия) с использованием стандартных коммерческих реагентов в условиях модифицированных нами про грамм реакционных циклов. Для реакционных циклов с введением 3’ тиофосфорильных звеньев вместо стандартного окислителя, содержащего йод и воду, применяли свежеприготовленный 0,05 М раствор 3H-1,2-бензодитиол-3-он 1,1-диоксида (Glen Research, США) в ацетонитриле. Деблокирование и расщепле ние связи олигомера с носителем осуществляли с использованием стандартных процедур. Полученные препараты олигомеров анализировали методами ВЭЖХ, MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), УФ-спектрофотометрией и электрофорезом в ПААГ.
Методы генетической инженерии.
Реакции кинирования, лигирования, рестрикции проводили с использовани ем коммерческих ферментов согласно протоколам производителей и другими стандартными методами.
Фрагменты ДНК из агарозного геля выделяли с использованием набора Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, США) согласно инструкции.
Трансформацию, культивирование штаммов E.coli, получение компетент ных клеток и др. проводили согласно инструкции производителя.
Получение, выделение и очистка целевых рекомбинантных белков.
При работе с клеточными линиями использовали стандартные протоколы производителей.
Выделение и очистку белков проводили с помощью металло-хелатной аф финной и ионообменной хроматографий. Предварительно отмытые тельца вклю чения, содержащие целевые полипептиды, разрушали дезинтегратором в буфере, содержащем гуанидин хлорид. После фракционирования хроматографией, фрак ции обессоливали и рехроматографировали. Концентрацию белка определяли по методу ВСА (ВСА-набор, Sigma США). Очищенный белок характеризовали элек трофоретическим анализом в ПААГ и масс-спектрометрически.
Культивирование клеток.
В экспериментах использовали опухолевые клети человека линии DU145 и контрольные клетки. Клетки культивировали в пластиковых культуральных фла конах (Costar, Великобритания) в среде RPMI 1640 (Gibco, США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина при 37°С в ув лажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Клеточные культуры рассевали раза в неделю и высевали в 12-луночные планшеты на покровные стекла или не посредственно в лунки за сутки до эксперимента.
Проточная цитофлуориметрия.
Клетки DU145 и контрольные в логарифмической фазе роста отмывали дважды PBS (pH 7,4) и 2 часа инкубировали в среде DMEM (Sigma, США), не со держащей сыворотки. Далее клетки снимали с пластика и отмывали буфером PBS. Комплексы белков PGA, PGA1 и PGA1-His с флуоресцентномеченными TMO и TMS (соотношение белок:олигонуклеотид от 1:1 до 4:1) в концентрации 200 нM по олигонуклеотидам и 200-800 нМ по белку добавляли к суспензии кле ток на холоду и инкубировали при 37С в течение 1 часа. После окончания инку бации клетки снимали с пластика с помощью раствора 0,05% трипсина в растворе Версена (Sigma, США), промывали и ресуспендировали в PBS. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре EPICS-XL (Beckman Coulter, США), флуоресценцию возбуждали аргоновым лазером (Coherent), возб.
488 нм, исп. 520 нм.
Флуоресцентная микроскопия.
Клетки DU145 высевали на покровные стекла в 24-луночные планшеты за сутки до эксперимента. Комплексы белков с флуоресцентномеченными олиго нуклеотидами (соотношение белок:олигонуклеотид от 1:1 до 5:1) добавляли к клеткам на 24 часа в концентрации 200 нМ по олигонуклеотидам. Клетки отмыва ли PBS и фиксировали 4% параформальдегидом. Ядра клеток окрашивали флуо ресцентным красителем Hoechst 33342 (Sigma, США). Клетки заключали в мови ол и анализировали флуоресценцию с помощью микроскопа Opton IM35 (Carl Zeis, Германия) при увеличении 400х с использованием фильтров: G450, FT510, LP515-565 – для FAM и G365, FT395, LP420 – для Hoechst. Визуализацию изо бражения осуществляли с помощью цифровой камеры DXM 1200 (Nikon, Япо ния).
Получение комплексов ДНК и белков с наночастицами никеля.
Суспензию 10-15 мг порошка наночастиц Ni в 1 мл 0,1 М серной кислоты встряхивали (1 ч, 20С), обрабатывали ультразвуком (22 кГц, 15 мин.), частицы отделяли центрифугированием или магнитной сепарацией. После удаления ки слоты остаток промывали водой до нейтральной реакции. Подготовленные части цы никеля хранили в виде суспензии в 30% водном глицерине в среде гелия или аргона. Взвеси после встряхивания и ультразвуковой обработки были стабильны в течение 1-2 часов.
Для получения изотерм адсорбции олигонуклеотидов и белков из водных растворов наночастицами никеля в пробирки помещали аликвоты приготовлен ной взвеси, промывали PBS (рН 7,4) и добавляли равные объемы растворов оли гонуклеотидов или белков в 0,1 М PBS. Взвеси интенсивно встряхивали в течение оптимального времени, затем фиксировали изменение оптической плотности су пернатанта (260 нм – для олигонуклеотидов, 280 – для белков 3D и PGA, 395 – для GFP). В случае FAM-содержащих олигомеров регистрировали изменение ин тенсивности флуоресценции (возб.=430 нм, исп.=495 нм), для GFP – возб.=490 нм, исп.=512 нм. Молярную концентрацию образовавшегося комплекса рассчитывали по разности исходной и остаточной оптических плотностей растворов. Молярную концентрацию связанного белка рассчитывали по изменению оптической плотно сти с учетом коэффициентов молярной экстинкции белков, (для 3D и PGA – ( нм)=67400, для GFP – (395 нм)=30000).
Получение комплексов ДНК-Ni и белок-Ni проводили аналогично.
Изучение взаимодействия Ni-GFP с ДНК-аптамерами Agfp1 и Agfp2 прово дили следующим образом: аликвоты взвеси ассоциатов Ni-GFP помещали в про бирки, промывали 0,1 М PBS (рН 7,4) и встряхивали с равными объемами раство ров олигонуклеотидов dС30, Agfp1 и Agfp2 (0,2-0,4 О.Е./мл). Оптическую плот ность супернатантов измеряли через 2 часа при 260 нм.
Содержание работы.
Настоящая работа посвящена разработке подхода транспорта чужеродной ДНК в клетки с использованием природных механизмов рецептор опосредованного эндоцитоза. Домен белкового вектора, отвечающий за интерна лизцию всего комплекса в целевые клетки, можно рассматривать как модифици рованный лиганд рецепторов клетки, который снабжен олигокатионной последо вательностью, предназначенный для связывания с нуклеиновой компонентой.
Получение белок-нуклеиновых комплексов подразумевает под собой работу в нескольких направлениях, таких как конструирование белковой составляющей комплекса, дальнейшая наработка, очистка и подтверждение структуры, исследо вание комплексообразования и транспортных свойств, эксперименты in vitro по доставке комплексов в клетки, кроме этого получение олигонуклеотидов различ ной природы и флуоресцентномеченных олигонуклеотидов, а также исследование взаимодействия олигонуклеотидов и белков с поверхностью частиц никеля.
1. ДНК-компонента комплексов.
В качестве нуклеиновой компоненты в экспериментах были использованы как кольцевые молекулы плазмид, так и синтетические олигонуклеотиды. Однако использование любого деградируемого материала сталкивается с рядом проблем, касающихся интерпретации результатов. Чтобы избежать некорректных результа тов, в работе были использованы не только фосфодиэфирные олигонуклеотиды, но и их идентичные по нуклеотидной последовательности тиофосфорильные ана логи. Последние устойчивы к биодеградации в биологических жидкостях и при этом сохраняют гибридизационные свойства. Кроме этого для визуализации ин тернализации белок-нуклеиновых комплексов были использованы олигонуклео тиды с флуоресцентной меткой, в таких случаях применение природных аналогов олигонуклеотидов с FAM-меткой1 не дает однозначной оценки, так как, наблюдая за флуоресценцией, нельзя однозначно утверждать, что метка еще входит в состав молекул олигомеров, и делать выводы об ее транслокации. Поэтому в настоящей работе рассмотрены некоторые особенности получения тиофосфорильных олиго нуклеотидов, а также олигомеров, содержащих флуоресцентные метки.
1.1. Синтетические фосфодиэфирные и фосфоротиоатные олигонуклео тиды.
В работе использовались олигонуклеотиды как в качестве нуклеиновой со ставляющей комплексов, так и для получения экспрессирующих конструкций, плазмид, а также как праймеры для полимеразноц цепной реакции (ПЦР) и сик венса.
Среди модификаций сахаро-фосфатного остова, повышающих устойчивость олигонуклеотидов к биодеградации, наиболее подробно изучены особенности применения и метаболизм тиофосфорильных олигонуклеотидов, показана их пер спективность использования в качестве антисмысловых последовательностей (Stein C.A., 1991;
Agrawal S., 1995). В то же время известно, что тиофосфорильные олигонуклеотиды обладают некоторой системной токсичностью, это затрудняет их использование непосредственно при работе с живыми организмами. Однако необходимо иметь ввиду, что рабочие концентрации используемых в эксперимен тах олигонуклеотидов, в виду своей устойчивости к клеточным нуклеазам, могут быть значительно ниже.
FAM – 6-флуоресцеинил-6-карбоксиамидогексил 1.2. Флуоресцентномеченные олигонуклеотиды.
Широкое применение флуоресцентномеченные олигонуклеотиды получили из-за возможности визуализировать ряд процессов, происходящих с исследуемы ми объектами. В представленной работе флуоресцентные производные олигонук леотидов позволили получить данные об интернализации клетками искусствен ных нуклеопротеиновых комплексов, их внутриклеточной локализации и др.
Кроме того, надежность и совершенствование методов получения высокоочи щенных меченых олигонуклеотидов играет большую роль в создании комплекс ных диагностических наборов, которые позволяют одновременно анализировать содержание в пробе нескольких ДНК-мишеней (Probert W.S., 2004;
Ram S., 2005).
Было замечено, что особенности хроматографического поведения таких олигонуклеотидов затрудняют их очистку. Это обусловлено рядом причин, на пример склонностью к внутри- и межмолекулярной агрегации. Соотношение кон формационных форм олигомера зависит от температурного режима хроматогра фии (рис. 2 А и Б) и зачастую различно для разбавленных и концентрированных растворов, и, как оказалось, профили аналитических и препаративных хромато грамм могут содержать разные пики, т.е. условия хроматографии, найденные в аналитическом варианте, неэффективны для препаративной очистки (рис. 2 В).
При оптимизации ВЭЖХ методов очистки олигонуклеотидов фракции, со ответствующие пикам на хроматограммах, собирали и исследовали с помощью MALDI TOF MS (лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс спектрометрия с участием матрицы), UV-VIS-спектрофотометрии, электрофоре тического анализа в ПААГ и сравнивали эффективность их работы в соответст вующих условиях Real-Time PCR.
A Б В Рис. 2. Хроматографические профили разделения (градиент ацетонитрила в 0,1М ацетате аммония) 5’-(6-FAM)-37-mer-3’BQH11 (A), 5'-HEX2-46-mer-3'-Dabsyl3 (Б), 5'-(6-FAM)-35 mer-3'-BQH2 (В) реакционных смесей олигонуклеотидного синтеза. Колонка С16Т 4х мм, Диасорб, Россия (A и В);
Nucleosil 10x250 мм, Teknokroma, Испания (Б).
Учитывая перечисленные свойства, для подбора условий хроматографиче ской очистки олигонуклеотидов использовали реакционные смеси синтеза (в мас штабе 0,1-0,2 мкмоль) олигомеров после удаления аммиака в вакууме, варьируя не только параметры градиента растворителей, но и температуры. Наиболее су щественные для идентификации пиков данные приведены на рис. 2. Из сравни тельного анализа профилей видно, что, например, 5'-(6-FAM)-37-мер-3'-BHQ (рис. 2 A) эффективнее отделяется от примесей при 35oС, а 5'-5'-HEX-46-mer-3' Dabsyl – при 55oС (рис. 2Б).
1.3. Использование в работе терапевтически значимых олигонуклеотидов.
Black hole quenchers 4,7,2’,4’,5’,7’-гексахлор-флуоресцеинил-6-карбоксиамидогексил 4-(диметиламино)азобензен-4'-сульфонил В работе использовался широкий круг олигонуклеотидов, в том числе тера певтически значимых. Известно из литературы, что TMO (telomeric mimic oli gonucleotide) и его тиоаналог TMS ингибируют активность теломеразы (Sun D., 1997;
Wang E.S., 2004), процесс происходит, по-видимому, за счет связывания их с каталитической белковой субъединицей белка, хотя точный механизм ингиби рования теломеразной активности мимик-олигонуклеотидами не вполне ясен.
Также в работе использовались хорошо изученные антисмысловые олигомеры к генам С-myc, Bcl-II и др. (Dias N., 2002;
Manoharan M., 2002;
Kurreck J., 2003, Wang E.S., 2004), действие которых вызывает апоптоз опухолевых клеток. В рабо те были использованы фосфодиэфирные олигонуклеотиды, их тиоаналоги и не сущие флуоресцентые метки олигонуклеотиды.
2. Рекомбинантные белковые векторы.
Наиболее перспективный, гибкий и доступный способ получения новых белков сегодня – это химико-ферментативный синтез гена, получение штамма продуцента и биотехнологическая наработка рекомбинантного полипептида. Ис пользование белковых векторов для доставки чужеродной ДНК в клетки рассмот рено в литературном обзоре настоящей диссертации.
Оригинальность белковых конструкций, полученных в настоящей работе (совместно с лабораторией биотехнологии ММА им. И.М. Сеченова), состоит в том, что в качестве рецептор-узнающего домена белок содержит фрагмент альфа фетопротеина (3D), который обеспечивает взаимодействие всего комплекса в це лом с рецепторами клеточной поверхности. Суперэкспрессия рецепторов АФП характерна для многих типов опухолевых клеток (Ницветов М.Б., 2005). Природ ный АФП, выделенный из ретроплацентарной сыворотки рожениц, и его реком бинантный фрагмент (3D) зарекомендовали себя как эффективные адресующие агенты, обеспечивающие избирательность в отношении многих активно пролифе рирующих клеток (Гороховец Н.В., 2006). Для создания на основе доступного ре комбинантного белка 3D белковых векторов-переносчиков ДНК его последова тельность дополняли ДНК-связывающими фрагментами, в состав которых был введен известный мотив сигнала ядерной локализации (рис. 3). В ряде работ пока зано, что NLS-домен в составе белков не только способен удерживать ДНК, но и придает кариофильность их нуклеопротеиновым комплексам (Keller M., 2003;
Позмогова Г.Е., 2007).
2.1. Дизайн белковых векторов на основе альфа-фетопротеина.
Известно, что С-концевая модификация 3D-фрагмента АФП не препятству ет его связыванию с рецептором. Однако в ряде случаев именно N-концевое по ложение ДНК-связывающих последовательностей в составе векторов оказывалось предпочтительным (Uherek C., 2000;
Kircheis R., 2002). Поэтому при создании но вых белков были предусмотрены оба варианта расположения доменов. В составе PGA 3D-фрагмент модифицирован по N-концу, а в составе PGA1 и PGA1-His – по С-концу (рис. 3). Кроме того, из состава белка PGA1 удален технологический (His)6 сайт, предназначенный только для увеличения эффективность металло хелатной хроматографии. Схема строения белков-векторов PGA, PGA1 и PGA1 His на основе рецепторсвязывающего фрагмента АФП приведены на рис. 3.
Рис. 3. Схематичное расположение функциональных доменов белковых векторов PGA, PGA1 и PGA1-His. NLS – фрагмент, отвечающий за связывание белка с ДНК, 3D – домен альфа-фетопротеина, ответственный за узнавание и связывание белка с AFP-рецепторами клеток, HHHHHH – полигистидиновый таг (His)6, предназначенный для выделения белка с помощью иминодиацетата сефарозы, заряженной ионами Ni(2+).
2.2. Получение белков PGA, PGA1 и PGA1-His.
Наработку белков с использованием штаммов-продуцентов E.coli проводи ли см. Материалы и методы. При выделении из биомассы рекомбинантных бел ков, содержащих полигистидиновую последовательность, в качестве альтернати вы выделения с помощью иминодиацетате сефарозы, насыщенный ионами Ni(2+), использовали частицы никеля, как описано в работе (Лазарев В.Н., 2007). При выделении белка PGA1, последовательность которого не содержала олигогисти дин, стадию с использованием металло-хелатной аффинной хроматографии про пускали и проводили сразу выделение ионообменной хроматографией. Такой подход увеличивал выход конечного белкового препарата при меньших времен ных и материальных затратах. Профиль элюции белка PGA приведен на рис. 4А.
Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, обессоливали и рехроматогра фировали на той же колонке (рис. 4Б).
А Б Рис. 4. Хроматографические профили разделения белка PGA ионообменной хромато графией из обогащенного концентрата (А – время удерживания 30-33 мин) и рехрома тография фракций, содержащих целевой продукт (Б – время удерживания 19-21 мин).
Колонка – Protein Pak DEAE 8HR (8 х 350 мм);
линейный градиент буфера, содержаще го NaCl, поток элюента – 1 мл/мин;
УФ-детекция – 280 нм.
Очищенные белки характеризовали электрофоретическим анализом в ПА АГ (рис. 5 А) и масс-спектрометрически (рис. 5 Б).
А Б Рис. 5. Анализ чистоты полученного белкового препарата (белок PGA) А: 12% ПААГ (1 – маркер молекулярной массы, 2 – белок PGA после очистки), Б: масс-спектр белка PGA (М.м.PGA=29025Да), полученный на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре UltraFlex II (Bruker, Германия).
Первичную последовательность белков подтверждали методом масс спектрометрического анализа их триптических гидролизатов. В результате были определены фрагменты последовательностей белков, совпавшие с идентифициро ванными пептидами (на 73% для белка PGA, на 82% для PGA1 и на 84% для PGA1-His).
3. Получение и исследование ассоциатов наночастиц никеля с олиго нуклеотидами и гистидинилированными белками.
Наночастицы никеля способны избирательно связывать гистидинилирован ные (His-tagged) белки, что стало основой технологии эффективного выделения последних из биомассы. Важно отметить, что сорбция белков носит обратимый характер, а очищенные полипептиды, например GFP (зеленый флуоресцирующий белок) и цитохром Р450 из Mycobacterium tuberculosis не теряли своих биологиче ских свойств (Лазарев В.Н., 2007).
Возможность модификации поверхности частиц никеля делает их чрезвы чайно привлекательными и перспективными для придания такой магнитной осно ве разнообразных заданных свойств, как совершенно новых, так и присущих уже известным наноструктурам (Chang-Cheng Y., 2007). Наночастицы никеля вполне могут стать связующим звеном в многокомпонентных полифункциональных кон струкциях, содержащих как различные белки, так и белки в сочетании с ДНК.
В настоящей работе проводились исследования закономерностей взаимо действий наночастиц никеля с одноцепочечными фрагментами ДНК (ssДНК) раз личной длины и состава, в том числе с тиофосфорильными олигодезоксирибонук леотидами, а также с гистидинилированными рекомбинантными белками. Цель такого исследования – показать, что молекулы белков, содержащие полигистиди новые последовательности, могут обратимо сорбироваться на поверхности нике ля, определить характеристики такой сорбции, а также доказать, что адсорбиро ванные молекулы как минимум частично сохраняют свои конформационные свойства.
3.1. Взаимодействие поверхности частиц никеля с олигонуклеотидами.
Для того чтобы охарактеризовать общий процесс образования комплексов из биомолекул и наночастиц никеля, были использованы различные олигонуклео тиды. Первоначально необходимо было изучить возможность и условия их ад сорбции.
В результате ряда экспериментов показана способность агрегатов наночастиц никеля ас- социироваться с фраг- dA C2/C1, % dC ментами однонитевых dG dN ДНК как фосфодиэфир- FAM-T TelP ной, так и тиофосфо- Тио-T Тио-TelP рильнойприроды с об- T разованием ста бильных 0 200 400 600 800 1000 комплексов (рис. 6).
Ni, мкг Рис. 6. Изотермы адсорбции (20oС) серии олигонуклеотидов Анализ изотерм на поверхности частиц Ni, C1 – общая концентрация олиго адсорбции ряда олиго- нуклеотида, С2 – концентрация комплекса Ni-ДНК.
нуклеотидов свидетель ствует о зависимости параметров связывания олигомеров от их длины, нуклео тидного состава и природы межнуклеотидных связей.
Важно было понять, какие оптимальные условия образования комплексов из биомолекул и металлических частиц. Было изучено влияние ряда параметров на процесс сорбции (рН, ионной силы буферного раствора и влияние имидазола, который вытесняет биополиме ры с поверхности частиц за счет образования координаци онных связей с Ni) и подобра ны условия для сорбции.
C2/C1, % dC 3.2. Исследование функ- dA циональности адсорбирован ных фрагментов ДНК на по верхности наночастиц никеля. 0 200 400 600 Известно, что непосредствен- T30-Ni, мкг Рис. 7. Изотермы адсорбции (20oС) ассоциатами ная металлизация ДНК на по- dТ30-Ni комплементарного (dA30) и некомплемен тарного (dC30) олигонуклеотидов. C1 – суммарная верхности металлических час концентрация олигонуклеотида, С2 – концентрация тиц способствует потере гиб- комплексов Ni-ДНК.
ридизационных свойств(Becerril H.A., 2005). Поэтому были проведены экспери менты по гибридизации Ni-олигонуклеотидных комплексов и показано, что Ni связанные олигомеры способны избирательно удерживать комплементарные по следовательности. Для исследования взаимодействий адсорбированных на по верхности Ni олигонуклеотидов (на примере dT30) с их комплементарными фрагментами использовали комплементарный олигомер dA30 и отрицательный контроль dC30. По данным на изотермах видно, что происходит удерживание комплементарного олигомера dA30, в то время как сорбции некомплементарного dC30 почти не наблюдается (рис.7).
3.3 Сорбция гистидинилированных белков на поверхности частиц никеля.
В ходе работы было исследовано образование Ni-белковых ассоциатов.
Частицы никеля модифицировали рядом белков, например рекомбинантными гис тидинилированными GFP, 3D и PGA, далее определяли пара метры сорбции. Были найдены четкие закономерности взаимо C2/C1, % GFP действия гистидинилированных 3D белков с Ni. Изотермы, пред PGA ставленые на рис. 8, были полу чены, как описано выше. Пока- зано, что Ni высокоэффективно связывал рекомбинантные гис- 0 500 1000 1500 Ni, мкг тидинилированные белки 3D Рис. 8. Изотермы адсорбции (20oС) частицами Ni ре комбинантных гистидинилированных белков GFP, (рецепторсвязывающий домен 3D и PGA. C1 – суммарная концентрация белка, С2 – альфа-фетопротеина), получен- концентрация комплексов Ni-белок.
ный рекомбинантный PGA и GFP, что соответствует и литературным данным (Лазарев В.Н., 2007). По подсчетам, сделанным на основании анализа кривых ас социации белков с частицами никеля, приведенных на рис. 8, удельная нагрузка белка достигала ~10-20 молекул на частицу. Можно предположить, что белки об разуют довольно плотное покрытие частиц, практически полностью модифицируя их поверхность. При этом сохраняется целостность (по данным масс спектрометрии) и, вероятно, конформация белковой компоненты, поскольку спектр флуоресценции GFP, высвобожденного из GFP-Ni ассоциата обработкой 500 мМ раствором имидазола, соответствовал спектру исходного белка.
Некоторые взаимодействия биомолекул с металлическими поверхностями могут приводить как к потере конформационных свойств, так и к разрушению первичной структуры. В этой связи необходимо было подтвердить, что молекулы не подвергаются таким воздействиям.
Десорбированные белки и белки непосредственно на поверхности никеля исследовали методами MALDI TOF масс-спектрометрии, что позволило получать молекулярные характеристики органических доменов в составе Ni-комплексов и подтвердить их целостность.
3.4. Взаимодействие Ni-GFP с ДНК-аптамерами Agfp1 и Agfp2. Важно бы ло не только сохранить неизменной аминокислотную последовательность белко вых молекул, но и их структурную организацию.
А Б 60 Agfp Agfp С2/С1, % C2/C1, % dC 40 Agfp Agfp 0 50 100 150 0 50 100 150 GFP-Ni, мкг GFP-Ni, мкг Рис. 9. А – Изотермы адсорбции (20oС) ассоциатов GFP-Ni с GFP-аптамерами Agfp1 – 5' ATCCGCCTGATTAGCGATACTCAGAAGGAT, Agfp2 – 5'-GCTGTTGAGTTCTATGGCTATG TGACCGTA и dC30. С1 – суммарная концентрация связанного и свободного олигонуклеотида, С2 – концентрация ДНК-Ni комплексов;
Б – изотермы адсорбции ассоциатов GFP-Ni с апта мерами Agfp1 и Agfp2 за вычетом поправки на неспецифическое связывание.
Для получениия характеристик архитектуры белка GFP в составе протеин Ni комплексов были использованы аптамеры к GFP (Stanlis K.K., 2003). В работе Stanlis K. было найдено и описано 2 аптамера к белку, показано, что они имели различную степень сродства к белковой молекуле. Мы использовали оба олиго нуклеотида (Agfp1 и Agfp2) для подтверждения функциональности адсорбиро ванных белковых молекул. Изотермы представлены на рис. 9.
Стоит отметить, что при проведении экспериментов и анализе их результа тов мы старались выявить и снизить вклад неспецифической сорбции аптамеров.
Так, например, для экранирования (кепирования) поверхностей частиц никеля, не несущих белок, GFP-Ni ассоциаты выдерживали в растворе олигонуклеотида тио Т15 и промывали буфером. При этом (по данным флуоресцентного анализа супер натантов) десорбции белка не наблюдалось. Природа погрешностей другого типа могла быть связана со слабыми неспецифическими взаимодействиями олигомеров с белковой компонентой ассоциата, поэтому при интерпретации данных мы учи тывали и результаты контрольного опыта, например с олигомером dС30 (рис. 9А).
В итоге были получены кривые насыщения, представленные на рис. 9Б.
Оказалось, что аптамер Agfp1, как и в работе Stanlis K.K., значительно лучше (Kдисс.~300 нМ) ассоциировался с GFP-Ni в сравнении с Agfp2 (Kдисс. ~700 нМ).
Данные свидетельствуют о том, что по отношению к взаимодействию с аптаме рами Agfp1 и Agfp2 белок GFP в составе ассоциата с частицами никеля проявлял свойства, гомологичные свойствам несвязанного GFP.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в составе ассоциатов биополимеры могут частично или полностью сохранять функциональные свойст ва.
4. Комплексы белков с олигонуклеотидами и плазмидной ДНК.
Для исследования комплексообразования белков PGA, PGA1 и PGA1-His с молекулами ДНК были проведены эксперименты по торможению в геле. Извест но, что в неденатурирующих условиях электрофореза в ПААГ подвижность ком плекса белок-ДНК значительно отличается от подвижности свободных компонен тов комплекса. Эксперименты по комплексообразованию были проведены с бел ком PGA1 и одноцепочечным фрагментом ДНК ss48, его дуплексом – ds 48 и плазмидой pRC-CMV (рис. 10). На рис. 10 четко наблюдается корреляция между существенным изменением подвижности ДНК, особенно в случае олигонуклеоти дов (рис. 10 А и Б), и увеличением избытка белка. Наличие нескольких новых по лос в электрофореграммах позволяет предположить, что в состав ассоциатов мо жет включаться одна или несколько белковых молекул.
Рис. 10. Электрофореграмма смесей флуоресцентномеченного олигонуклеотида (А), оли гонуклеотидного дуплекса (Б) и плазмидной ДНК (В) с различными избытками белка PGA1.
А: водные растворы олигонуклеотида ss48 смешивали с раствором белка PGA1 до ре зультирующей концентрации ss48, равной 31 нМ и PGA1: 1) 0, 2) 6 мкМ, 3) 15 мкМ.
Б: водные растворы олигонуклеотидного дуплекса ds48, смешивали с раствором белка PGA1 до результирующей концентрации дуплекса ds48 равной 31 нМ и PGA1 1) 0, 2) мкМ, 3) 15 мкМ. Смеси анализировали с помощью электрофореза в 8% ПААГ (неденату рирующие условия, сканер флуоресценции Tyfoon Amersham возб. – 495 нм, исп. – нм).
В: водные растворы плазмиды pRC-CMV смешивали с раствором белка PGA1 до резуль тирующей концентрации ДНК, равной 2,5 нМ и белка PGA1: 1) 0, 2) 2,5 мкМ, 3) 5 мкМ, 4) 10 мкМ, 5) 15 мкМ. Электрофоретическое разделение смесей проводили в 0,8% агаро зе.
5. Транспортные свойства белков PGA, PAG1 и PGA1-His.
Исследование интернализации нуклеопротеиновых комплексов клетками проводили с использованием флуоресцентномеченных олигонуклеотидов. Для то го чтобы убедиться в универсальности белковых векторов в отношении состава переносимой ДНК, использовали тиофосфорильные модифицированные (FTelP5, FAS1, FTMS) и вырожденный FN23T олигомеры.
Об избирательности в отношении клеток-мишеней свидетельствуют данные распределения флуоресценции целевых DU145 (рис. 11, кривые 1-6) и рецептор дефицитных контрольных клеток (кривая 7) после их инкубирования с комплек сами, состоящими из флуоресцентномеченных терапевтически значимых анти смысловых олигомеров и белков (PGA – кривые 1, 4, 5, 6, 7, PGA1 – кривая 2, PGA1-His – 3).
Оказалось, что все белки образо Интенсивность флуоресценции, у.е.
вывали транспортные комплексы, спо- собные избирательно поглощаться клетками-мишенями. В то же время, в ряде экспериментов наблюдалось не- большое (5-15%) преимущество С- модифицированных белков PAG1 и PGA1-His (см. кривые 2-3).
На рис. 12 представлены микро- 0 200 400 600 Концентрация белка, нМ фотографии опухолевых клеток линии Рис. 11. Кривые распределения флуоресцен DU145 через 24 часа инкубации со сме- ции клеток DU145 (кривые 1-6) и рецепторо дефицитных клеток (кривая 7) после 1 часа сью флуоресцентномеченного тиофос- инкубации с флуоресцентномеченными оли гонуклеотидами в присутствии рекомбинант форильного олигонуклеотида FTMS и ных белковых векторов. Комплексы с PGA – белка PGA. Отметим, что в приведен- кривые 1, 4-7, с PGA1 – 2 и с PGA-His – 3. За висимости 2-7 получены для тиофосфориль ном эксперименте наблюдалась пре ных олигомеров: FN23T (кривые 2-4,7), TelP имущественная локализация переноси- (5) и AS1 (6);
кривая 1 – для фосфодиэфирно го олигонуклеотида FTMO.
мой ДНК в области эндоплазматиче ского ретикулума клеток.
A Б В Г Рис. 12. Флуоресцентные микрофотографии клеток линии DU145 (карцинома простаты) после инкубации в течение 24 часов в присутствии белка PGA и флуоресцентного оли гомера FTMS (соотношение 3:1). А – зеленая флуоресценция олигомера FTMS, Б – го лубая флуоресценция окрашенных Hoechst 33342 ядер, В – инверсионная фотография, Г – суперпозиция кадров А-В.
Таким образом, в результате работы были получены новые белковые векто ры, способные образовывать устойчивые комплексы с одноцепочечными олиго нуклеотдами, их дуплексами и плазмидной ДНК и избирательно доставлять гене тический материал в целевые клетки.
В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспектив ность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональ ных биополимерных структур, которые могут найти применение в разработке биосенсеров, диагностических систем, конструировании новых материалов, поис ке аптамеров для различных белков и др.
Выводы.
1. С использованием оптимизированых методов ВЭЖХ-очистки (снижаю щих влияние эффектов самоассоциации) получен ряд антисмысловых олигонук леотидов, в том числе снабженных флуорофорами (FAM, HEX), а также фрагмен ты ДНК для сборки генетических конструкций.
2. Методами химико-ферментативного синтеза и генетической инженерии получены новые рекомбинантные белки PGA, PGA1 и PGA1-His, несущие рецеп торсвязывающий домен альфа-фетопротеина человека и олигокатионные после довательности.
3. Показано, что белки PGA, PGA1 и PGA1-His способны самопроизвольно образовывать с плазмидной ДНК, фосфодиэфирными и тиофосфорильными оли гонуклеотидами стабильные транспортные комплексы.
4. Продемонстрирована избирательная доставка чужеродной ДНК в составе комплексов с белками PGA, PGA1 и PGA1-His в клетки, несущие рецепторы аль фа-фетопротеина.
5. Показана способность наночастиц никеля ассоциироваться с гистидини лированными рекомбинантными белками (на примере PGA, PGA1-His, 3D и белка зеленой флуоресценции) и с олигонуклеотидами с образованием стабильных ком плексов. Найдено, что взаимодействие с наночастицами никеля не приводило к деструкции биополимеров. На примере двух конструкций продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц ни келя в качестве платформы для сборки многофункциональных нуклеопротеино вых структур.
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
1. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Смирнов И.П., Зайцева М.А., Татарино ва О.Н., Говорун В.М. Получение и свойства ассоциатов наночастиц никеля с ss ДНК и белками. // Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3. №5-6. С. 148-154.
2. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Веремеев К.Ю., Кар пов В.А., Чувилин А.Н., Петрунин Д.Д., Позмогова Г.Е. Влияние способов очист ки олигодезоксирибонуклеотидных зондов на эффективность генодиагностики методом PCR в режиме реального времени. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2008.
Т. 145. №3. С. 275-280.
3. Татаринова О.Н., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Се ребрякова М.В., Позмогова Г.Е.. Новые белковые векторы на основе фрагмента альфафетопротеина для направленного транспорта ДНК в опухолевые клетки. // Вестник РАМН. 2010. №1. С. 3-8.
4. Татаринова О.Н., Лукьянова Т.Н., Зайцева М.А., Карпов В.А., Чувилин А.Н., Позмогова Г.Е. Специфика обращено-фазовой ВЭЖХ олигодезоксирибо нуклеотидных зондов для Real-Time PCR генодиагностики. // Тез. докл. III Межд.
конф. "Фундаментальные науки - медицине". 2 - 8 сент. 2007. Новосибирск. С.
143.
5. Позмогова Г.Е., Татаринова О.Н., Смирнов И.П. Формирование нук леопротеиновых ассоциатов на основе наночастиц никеля. // Сб. трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 2008. Новоси бирск. С. 206.
6. Татаринова О.Н., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е. Самосборка ассоциа тов наночастиц никеля с олигодезоксирибонуклеотидами и гистидинилирован ными белками. // Тез. докл. XV Межд. конф. ст., асп. и мол. уч. «Ломоносов», разд. «Биоинженерия и биоинформатика». 8 – 11 апр. 2008. Москва. С. 51.
7. Татаринова О.Н., Гороховец Н.В., Макаров В.А., Посыпанова Г.А., Позмогова Г.Е. Направленный транспорт олигонуклеотидов в опухолевые клетки с помощью белковых векторов на основе фрагмента альфафетопротеина. // Тез.
докл. 1-й межд. науч. шк. Нано-2009. 29июня-4июля. 2009. Москва. С. 345-346.