Экология бактерий рода rhodococcus из глубоководных битумных построек озера байкал
На правах рукописи
ЛИХОШВАЙ Александр Викторович Экология бактерий рода Rhodococcus из глубоководных битумных построек озера Байкал 03.02.08 – экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Иркутск – 2011
Работа выполнена в Отделе микробиологии Учреждения Российской академии на ук Лимнологический институт Сибирского отделения РАН, Иркутск.
Научный консультант:
доктор биологических наук Т.И. Земская Научный консультант:
доктор химических наук, академик М.А. Грачев
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Намсараев Баир Бадмабазарович доктор биологических наук, профессор Саловарова Валентина Петровна
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорга низмов Уральского отделения РАН
Защита состоится 27 декабря 2011 г. в 12:00 на заседании совета Д 212.074.07 при при ГОУ ВПО Иркутский государственный университет по адресу: г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. проф. М.М. Кожова (ауд.
219).
Факс (3952) Email: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного университета.
Автореферат разослан 25 ноября 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, к.б.н.
А.А. Приставка
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Бактерии рода Rhodococcus, относящиеся к фи луму Actinobacteria, семейству Nocardiaceae, обитают в почве, соляных шахтах, ан тарктических льдах, морских осадках, сточных водах и многих других экосистемах (Gorlach et al., 1994;
Anan’ina et al., 2011;
Lo Giudice et al., 2007;
Helmke and Weyland, 1984;
Yoon et al., 2000a;
Alvarez, 2010). Отдельные представители данного рода способны использовать в качестве единственного источника углерода широ кий спектр органических веществ, в том числе углеводороды, опасные с точки зре ния экологии, в связи с этим их изучение имеет не только научное, но и прикладное значение (Larkin et al., 2006). Родококки способны окислять высокомолекулярные n-алканы и сложные хлорорганические соединения, которые трудно поддаются биодеградации (De Carvalho, 2004;
Luis et al., 2006). Представители рода Rhodococ cus утилизируют бензол, толуол, нафталин (Liu, 2009), гербициды (De Schrijver and De Mot, 1999) и полихлорбифенилы (Vaillancourt et al., 2003). Отдельные штаммы в настоящее время используются при производстве биопрепаратов, применяемых для биоремедиации при нефтяных загрязнениях (Ovchinnikova, 2009;
Kuyukina et al., 2010).
В озере Байкал при исследовании поверхностных вод в районе естественных нефтепроявлений у м. Горевой Утёс и близ устья р. Большая Зеленовская культи вированием было выявлено микробное сообщество с доминированием бактерий деструкторов нефти из родов Pseudomonas, Micrococcus и Rhodococcus. В отличие от других бактерий, родококки были найдены не только в нефти на водной поверх ности, но и в донных осадках того же района (Павлова и др., 2008а).
Открытие на дне Байкала в районе м. Горевой Утёс битумных построек при погружениях глубоководных обитаемых аппаратов (ГОА) «Мир» в 2008 г., в кото рых участвовал автор настоящей работы, инициировало исследования по изучению механизмов их образования и деструкции. В частности, представляло интерес ис следовать населяющую их микрофлору и оценить наличие микроорганизмов, ак тивно деградирующих нефть.
Цель исследования – изучить микроорганизмы в битумных постройках, расположенных на дне Байкала, и выделить штаммы бактерий, активных деструк торов углеводородов. Были поставлены следующие задачи:
1. Оценить разнообразие микроорганизмов в двух битумных постройках с различ ной активностью разгрузки нефти.
2. Выделить в культуры из образцов битума активные штаммы микроорганизмов деструкторов нефти, в лабораторных условиях изучить их способность к ис пользованию n-алканов в качестве единственного источника углерода.
3. Установить филогенетическую принадлежность выделенных штаммов, иссле довать физиолого-биохимические свойства и морфологию полученных штам мов бактерий рода Rhodococcus.
4. Установить наличие алкан-1-монооксигеназ – ферментов, инициирующих био деструкцию n-алканов, и расшифровать структуру alk-генов у одного из штам мов Rhodococcus.
5. Исследовать способность штаммов рода Rhodococcus к синтезу биосурфактан тов класса гликолипидов.
6. Провести сравнение структур алкан-1-монооксигеназ одного из штаммов рода Rhodococcus, выделенных из битумной постройки, между собой и со структура ми этих генов других представителей.
Научная новизна. Впервые исследована филогенетическая структура мик робных сообществ в двух битумных постройках на дне Байкала, различающихся по химическому составу и интенсивности разгружающихся через них углеводородов.
Установлено, что в битумных постройках обитают представители двух доменов:
Archaea и Bacteriae, включающие микро-организмы различных таксонов. Установ лено, что колонии из неактивной битумной постройки, способные расти на агаре в присутствии нефти в качестве единственного источника углерода, по морфо физиологическим признакам могут быть отнесены к роду Rhodococcus. Пять штаммов микроорганизмов в лабораторных экспериментах деградировали широ кий спектр n-алканов (С12-С29). Впервые в геноме одного из байкальских штаммов полностью расшифрованы гены, кодирующие ферменты, осуществляющие окисле ние n-алканов. Показано, что структуры этих генов гомологичны структурам генов бактерий рода Rhodococcus, обнаруженных в морской воде и почве, загрязнённой нефтью.
Практическая значимость работы. Получены и охарактеризованы штаммов рода Rhodococcus, изолированных из неактивной битумной постройки на дне (глубина 900 м) озера Байкал. Установлена их способность деградировать нефть и n-алканы, что позволяет рекомендовать их как возможные компоненты биопрепаратов, применяемых для биоремедиации холодноводных водоёмов. Пока зано, что штамм Rhodococcus erythropolis №4 выделяет биосурфактанты гликоли пидной природы. Полученные данные по структуре alk-генов могут быть исполь зованы при разработке структур праймеров необходимых для детекции этих генов у других микроорганизмов.
Работа выполнена в группе по изучению углеводородокисляющих микро организмов, отделе микробиологии Учреждения Российской академии наук Лим нологический институт Сибирского отделения РАН.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Битумные постройки, обнаруженные на дне озера Байкал в районе естественно го нефтепроявления на глубине 900 м, различаются населяющими их микроор ганизмами. Видовой состав микроорганизмов, населяющих активную построй ку, из которой выделялась нефть, и неактивную (нефть не выделялась), различ ный.
2. Из неактивной битумной постройки при культивировании на среде, в которой в качестве единственного источника углерода использовалась нефть, выделены только представители рода Rhodococcus. Комплексный анализ 5 выделенных штаммов микробиологическими, молекулярно-биологическими, электронно микроскопическими и хроматографическим методами показал, что все штаммы относятся к виду Rhodococcus erythropolis. Они способны участвовать в дест рукции природных углеводородов и обладают высокой экологической пластич ностью – способностью к росту в широком диапазоне (от +4 до +37 °C) темпе ратур и при концентрациях NaCl от 3 и 5%.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Но восибирск, 2008), X-ом Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владиво сток, 2009), V-ой Верещагинской байкальской международной конференции (Ир кутск, 2010), 10th International Conference on Gas in Marine Sediments (Листвянка, 2010), 32nd Annual Lorne Genome Conference (Лорн, Австралия, 2011), 3-ем Байкаль ском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорга низмы и вирусы в водных экосистемах» (Иркутск, 2011).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 95 страницах и включает введение, обзор литературы (Глава 1), экологическую и микробиологиче скую характеристику района мыса Горевой Утёс (Глава 2), объекты и методы ис следования (Глава 3), химическое и микробиологическое исследование битума не активной постройки (Глава 4), идентификацию генов у выделенных штаммов Rho dococcus erythropolis, участвующих в деструкции n-алканов (Глава 5), исследова ние выделенных штаммов Rhodococcus erythropolis в лабораторных условиях (Гла ва 6), заключение, выводы и список литературы из 142 источников, из них 109 – зарубежных. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 20 рисунками.
Работа поддержана грантами: РФФИ 09-04-12231-офи_м, 10-05-00681-а, РФ МК-1901.2010.5. Автор выражает благодарность научному руководителю работы д.б.н. Т.И. Земской, научному консультанту д.х.н. академику М.А. Грачёву, к.б.н.
О.Н. Павловой, к.х.н. А.Г. Горшкову, д.б.н. Е.В. Лихошвай, Т.А. Ханаевой, к.б.н.
Н.Л. Бельковой, Е.В. Сухановой, к.б.н. И.Б. Клименкову, к.б.н. Т.А. Щербаковой, Ю.П. Галачьянцу, (Лимнологический институт СО РАН), к.б.н. И.В. Морозову (центр коллективного пользования «Секвенирование ДНК»), д.б.н. Н.В. Равину (центр коллективного пользования «Биоинженерия» РАН) за консультативную и практическую помощь, Т.В. Кашик (Иркутский институт химии им. А.Е. Фавор ского СО РАН).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы Проведен анализ литературы по распространению естественных выходов нефти в водных экосистемах, описано, какие источники углеводородов могут слу жить для представителей рода Rhodococcus в качестве единственного источника углерода, описаны механизмы окисления углеводородов, рассмотрена фермента тивная система, обеспечивающая их деградацию микроорганизмами. Описаны ис тория изучения нефтепроявлений на оз. Байкал и приведены данные по биодест рукции углеводородов, дана геохимическая характеристика недавно открытого района естественных нефтепроявлений у м. Горевой Утёс.
Глава 2. Экологическая и микробиологическая характеристика района мыса Горевой Утёс В ходе совместной экспедиции Лимнологического института СО РАН и Ин ститута океанологии им. П.П. Ширшова РАН с помощью ГОА «Мир» в 2008-09 гг.
при обследовании дна в районе нефтепроявления (Средний Байкал) обнаружены битумные образования (постройки). По данным Горшкова с соавторами (2010), в одной из активных построек (№3) содержание n-алканов составляет 770 мг/г ( %), а гомологический ряд представлен C13-C32 с максимумом при C23, C24, при этом характерным является сужение гомологического ряда по сравнению с нефтью, соб ранной с водной поверхности. Содержание n-алканов в неактивной постройке (№8) ниже – 148 мг/г (15 %), а состав n-алканов с длиной цепи C22-C34 и максимумом при C25, C26, отмечено наличие «нафтенового горба» – смеси высших углеводородов, неразделяемых газовой хроматографией. В байкальской нефти, собранной с водной поверхности, обнаружены уникальные биомаркеры – сесквитеpпаны и гомологиче ский ряд гопанов (Конторович и др., 2007), их наличие указывает на то, что нефть на своём пути из недр осадков (3 км) к их поверхности не претерпевала гидротер мального воздействия свыше 200 °С.
С использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) установлено, что микроорганизмы представлены метанокисляющими и разрушающими высшие уг леводороды бактериями. Выявлены представители альфа-, бета- и гаммапротеобак терий, актинобактерии и Firmicutes, включающие представителей родов Micro monospora, Mycobacterium, Rhodococcus (Ломакина и др., 2009). В водной толще были обнаружены псевдомонады и спорообразующие микроорганизмы, родствен ные представителям широкого класса бактерий, выделенных из донных осадков Охотского моря, Антарктиды, почв, загрязнённых углеводородами и др. (Ломакина и др., 2009). Район нефтепроявлений у м. Горевой Утёс отличается не только уни кальными экологическими условиями, но и особыми свойствами нефти и битума, а также разнообразием местной биоты. Исследователи, которые погружались в дан ном районе на ГОА «Мир», отмечали особенности биотопа: обилие на битумных постройках амфипод, олигохет, моллюсков, плоских червей турбеллярий и даже губок (Хлыстов и др. 2009). В неактивной постройке внутри битума обнаружены белые сгустки, напоминающие вату, внутри которых обитали олигохеты рода Pseudorhynchelmis, нематоды и единичные особи остракод (Хлыстов и др., 2009).
Очевидно, что нефтеокисляющие бактерии могут играть важную роль как первое звено пищевой цепи этих животных.
Глава 3. Объекты и методы исследования В упомянутой выше экспедиции на ГОА «Мир» были отобраны и доставлены в лабораторию для исследований несколько образцов битумных построек. Они представляли собой вязкую бурую битуминоидную массу зернистой структуры, из которой при поднятии на поверхность проступила вода. При комнатной температу ре через некоторое время материал превращался в пластичную гомогенную массу.
Элементный анализ (C, H, N, S, Cl) битума постройки №8 проведен на ана лизаторе Flash EA 1112 (Германия) в Иркутском институте химии имени А.Е. Фа ворского.
Хроматографический анализ битума построек проводили на масс спектрометре Agilent GC 6890 MSD 5973 (Германия) с капиллярной колонкой (DB 17ms, l = 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм). Сквалан и дейтерированные ПАУ (полиароматических углеводородов – нафталин-d8, аценафтен-d10, фенантрен-d10, хризен-d12, перилен-d12) использовали в качестве внутренних стандартов при опре делении n-алканов и ПАУ. Навеску битума растворяли в хлористом метилене ( мг/мл) с добавлением 0,5 мл раствора сквалана в хлороформе (0,3 мг/мл). В колон ку вводили 2 мкл экстракта с разделением потока в инжекторе с соотношением 1:10. В качестве газа-носителя использовали гелий, подаваемый в хроматограф со скоростью истечения 1 мл/мин. Температура инжектора составляла 280 °С. Усло вия хроматографии: первоначально температура колонки составляла 50 °С в тече ние 5 мин, затем следовал градиент температур (15 °С/мин) от 50 до 310 °С и далее изотермический режим при 310 °С в течение 15 мин. Хроматограммы регистриро вали в режиме селективного ионного детектирования по ионам с m/z: 57 и 71. Из мерения проводили в трёх повторностях. Концентрации n-алканов рассчитывали как средние значения для трёх параллельных измерений (погрешность не превы шала 10 %).
Выделение штаммов микроорганизмов. Образцы (1 г) битумной постройки смешали с нефтью (100 мкл) из месторождения Юргинское (Западная Сибирь), стерилизованной через поликарбонатные GTTP фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (Millipore), и равномерно распределили по поверхности агаризованной среды Рай монда в чашках Петри (Raymond, 1961) (г/л): KH2PO4 – 2,0;
CaCl2·2H2O – 0,01;
MgSO4·7H2O – 0,2;
FeSO4 – 0,01;
NH4NO3 – 2,0;
MnSO4·5H2O – 0,02;
Na2HPO4 – 3,0;
Na2CO3 – 0,1;
агар – 1,5;
pH = 7,2. После инкубирования чашек при комнатной тем пературе в течение 168 ч на поверхности среды появилось множество одинаковых мелких колоний, пять из которых было отобрано случайным образом. Они были перенесены в пробирки с питательной агаризованной средой РПА (рыбо пептонный агар) для дальнейшего культивирования при комнатной температуре, чистые культуры были получены путём многократного пересева на этой же среде.
Колоний на стерильной нефти без добавления битума выявлено не было. Получен ные штаммы пронумеровали от 1 до 5 и законсервировали в 1,5 мл пробирках типа «Eppendorf», их хранили при 4 °С до последующих манипуляций. Штаммы также законсервированы в 50 % растворе глицерина и хранятся при -70 °С.
Физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов микроорганиз мов исследовали на основании морфологических и физиолого-биохимических при знаков по определителю бактерий Берджи (Bergey's Manual of determinative bacteri ology, 1994).
Чистоту штаммов проверяли под световым микроскопом «Axiostar Plus» при увеличении 10010, окраску по Граму проводили по общепринятой методике (Романенко, 1974).
Морфологические свойства одного из штаммов (№2) изучали с использова нием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) Philips SEM 525-M. Ультра тонкие срезы (5 нм) были получены на микротоме Leica Ultracut R (Германия) и ис следованы с использованием трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ) LEO 906E. Для СЭМ клетки бактерий фиксировали в 2,5 %-м растворе глутараль дегида, нанесли на столик, высушили и покрыли золотом. Для ТЭМ клетки фикси ровали в 2,5 %-м растворе глутаральдегида и контрастировали OsO4, после чего за ливали в эпоксидную смолу (Araldite M 502 Kit SPI, USA). Далее были сделаны ультратонкие срезы образцов, которые закрепляли на специальные сеточки.
Выделение ДНК штаммов микроорганизмов проводили по модифицирован ной методике ферментативного лизиса с последующей фенол-хлороформной экс тракцией (Sambrook, Fritsch, 1989). ПЦР ДНК штаммов проводили в режиме ( циклов): активация полимеразы – 94 °С, 2 мин;
денатурация – 92 °C, 45 сек;
отжиг – 52 °С, 45 сек;
амплификация – 72 °С, 60 сек;
элонгация – 72 °С, 60 сек;
финальная элонгация – 72 °С, 2 мин (1 цикл). Использовали праймеры 27f, 1350r, комплемен тарные наиболее консервативным участкам гена 16S рРНК (Brosius et al., 1981;
Де нисова и др., 1999). Размер и чистоту продуктов ПЦР всех штаммов проверяли электрофорезом в 1,5 %-м агарозном геле. Секвенирование проводили с теми же праймерами, длина нуклеотидных последовательностей – 895-1118 п.о. Сравни тельный анализ проводили с использованием международной базы данных NCBI в программе BLASTN и ClustalW v.1.4, построение филогенетических деревьев осу ществляли с помощью пакета программ МЕGA v.4.0 с использованием алгоритма группирования «neighbor-joining». Статистическую достоверность ветвления оце нивали с помощью «bootstrap-анализа» с использованием соответствующей функ ции той же программы. Наличие химерных структур определяли анализом после довательностей с помощью программы PINTAIL (http://www.cardiff.ac.uk/biosi/research/biosoft).
Идентификация alk-генов штаммов проводили с использованием ПЦР программы, описанной выше, и с тремя наборами праймеров alkB-1, alkB-2 и alkB- (Sei et al., 2003).
Последовательности зарегистрированы в международной системе NCBI под следующими номерами: 16S рРНК – HQ702468, HQ702469, HQ702470, HQ702471, HQ702472;
alk-гены – HQ702473, HQ702474, HQ702475, HQ702477.
Метагеномный анализ микробного сообщества битумных построек. Для одного из образцов постройки №8 была выделена суммарная ДНК, как описано выше. Анализ проведён под руководством д.б.н. Н.В. Равина в «Центре Биоинже нерия» РАН. ПЦР гена 16S рРНК проводили с праймерами U341F 5' CCTACGGGRSGCAGCAG-3', U515R 5'- TTACCGCGGCKGCTGVCAC-3', по про грамме (30 циклов): активация полимеразы – 96 °С, 3 мин;
денатурация – 96 °С, сек;
отжиг – 55 °С, 30 сек;
амплификация – 72 °С, 40 сек;
элонгация – 72 °С, мин. Секвенировали на GS FLX (Roche) на основе технологии пиросеквенирования «454 Life Science».
Влияние температуры на культивирование штаммов изучали в 50 мл про бирках с 10 мл среды Раймонда и 10 мкл стерильной нефти при 4, 22, 37 и 46 °С в течение 168 ч.
Исследование деструкции n-алканов выделенными штаммами проводили в трёх повторностях в стеклянных флаконах (200 мл) со средой Раймонда (100 мл), куда помещали культуру и 100 мкл нефти в качестве единственного источника уг лерода. Флаконы инкубировали в течение 92 ч при 22 °С на орбитальном шейкере BIOSAN OS-10 с постоянным перемешиванием (120 об./мин). Через каждые 24 ч отбирали один флакон (3 повторности, 4 дня – 12 флаконов) для исследования.
Весь объём среды экстрагировали хлористым метиленом (3 х 50 мл). Экстракт ана лизировали хроматографически, как описано ранее (Uchida et al., 1989b).
Выявление гликолипидов проводили у штамма №4, который засевали в мл среды СПА (сухой питательный агар) в колбу (100 мл) с ватно-марлевой проб кой для предварительного накопления биомассы. Посевной материал получали при комнатной температуре и постоянном перемешивании (100 об./мин) в течение часов. Далее 5 мл полученной биомассы переносили в колбу (5 л) с ватно-марлевой пробкой с ферментативной средой состава (Куюкина, 2007) (г/л): KNO3 – 0,1;
KH2PO4 – 2,0;
K2HPO4 – 2,0;
(NH4)2SO4 – 2,0;
NaCl – 1,0;
MgSO4·7H2O – 0,2;
CaCl·2H2O – 0,02;
FeCl3·7H2O – 0,01;
раствор микроэлементов (Drews, 1974) – 1, мл, содержащей в качестве единственного источника углерода 3 объёмных % n гексадекана. Для повышения выхода биосурфактантов в минеральную среду вно сили дрожжевой экстракт (0,1 г/л), а концентрация KNO3 была снижена в 10 раз (до 0,1 г/л). Культивирование проводили при комнатной температуре и постоянном пе ремешивании (80 об./мин) в течение 456 ч. По истечении времени в культуральной среде выделилось три слоя, каждый из которых отбирали в отдельную пробирку.
Клетки отделяли центрифугированием (3600g, 20 мин), отбрасывали слой гексадекана и собирали клетки, находящиеся в интерфазе и осаждённые. Проводи ли двукратную экстракцию реактивом Фолча (хлороформ : метанол = 2 : 1, 50 % к объему экстрагируемой смеси) в течение 3 ч при комнатной температуре и посто янном перемешивании (160 об./мин). Объединенный нижний слой, содержащий гликолипиды, упаривали на роторном испарителе до постоянного объема при тем пературе 40 °С. Для удаления остаточного гексадекана пробу наносили на концен трирующий патрон для твердофазной экстракции Discovery® DSC-Si SPE Tube (500 мг, объем 6 мл, Supelco) и гексадекан элюировали 100 мл гексана, контроли руя его наличие в элюате методом ГХ-МС. Фракцию гликолипидов элюировали мл смеси хлороформ : метанол = 5 : 1,5, упаривали досуха на роторном испарителе при 40 °С и перерастворяли в 200 мкл хлороформа (Uchida et al., 1989b). Раство рившуюся часть (экстракт) наносили на хроматографическую пластинку и прово дили двумерную хроматографию. В первом направлении проводили в системе хло роформ : метанол : вода = 6,5 : 1,5 : 0,2 мл. При хроматографировании во втором направлении вместо воды был взят 0,1% раствор тетрабората натрия. Пластинку высушивали и опрыскивали водой. О наличии гликолипидов судили по проявляв шимся пятнам, расположенным ниже горизонтальной линии.
Полногеномное секвенирование alk-генов. У штамма №4 полностью рас шифрованы alk-гены (Illumina GAIIx, Индия). Число чтений – 10 млн п.о. Сборкой фрагментов отдельных нуклеотидных последовательностей с использованием про граммы Velvet_1.1.02 получено 3897 контигов среднего размера 1,8 тыс. п.о. и суммарной длинной 6,9 мегабаз. Далее их транслировали в аминокислотные после довательности в программе Expasy Translate tool (http://web.expasy.org/translate/).
Поиск последовательностей алкангидроксилаз проводили с использованием мик роорганизма R. erythropolis PR4 из международной базы данных NCBI. По амино кислотным последовательностям найдены ближайшие гомологи при помощи про граммы BLASTX. Структуры проанализировали в программе ClustalW v.1.4. Фило генетический анализ осуществляли с помощью пакета программ МЕGA v.4.0 и ал горитма группирования «neighbor-joining».
Глава 4. Химическое и микробиологическое исследование битума неактивной постройки В момент отбора образцов постройка не была активна. Элементный состав постройки следующий: C – 77,06 %;
H – 12,12 %;
N – 6,38 %;
S – 0,75 %;
Cl – 0, %;
зольность – 2,86 %. По данным хроматографического анализа в неактивной по стройке содержится 148 мг/г C22-C34 n-алканов, с максимум при C25;
0,03 % состав ляют полиароматические углеводороды (ПАУ), 1 % – изопреноиды, каротиноиды и гопаны;
остальные 48 % приходятся на «нафтено-ароматический горб» – смесь высших углеводородов, неразделяемых газовой хроматографией. Примерно 33 % органического материала не вышло из колонки. Полученные данные были сопос тавлены с данными по составу другой, активной, битумной постройки №3 и нефти с водной поверхности, отобранных в том же районе нефтепроявлений у м. Горевой Утёс (Горшков, 2010;
Конторович, 2007) (рис. 1). Нефть, собранная с водной по верхности, содержит 900 мг/г (90 %) n-алканов, а в битуме постройки №3 – мг/г. Содержание n-алканов в исследуемой постройке №8 оказалось в 5 раз меньше (148 мг/г), а гомологи легче C22 отсутствуют. В составе неактивной постройки не обнаружены n-алканы короче C22. Более того, общее содержание этих углеводоро дов гораздо меньше, чем в активной постройке. Разность концентраций n-алканов в нефти активной битумной постройки №3 и неактивной №8 связана с процессом де парафинизации (Горшков и др., 2010). На своём пути из глубинных слоёв осадка к поверхности дна нефть претерпевает первичное фракционирование с накоплением высших парафинов. При достижении границы «дно-вода» происходит окончатель ное разделение нефти – «тяжёлые» углеводороды кристаллизуются с образованием битумных построек, а «лёгкие» всплывают к поверхности (Горшков и др., 2010).
Метагеномный анализ ампликонов гена 16S рРНК суммарной ДНК, выде ленной из битумных построек №3 и №8, выявил наличие широкого спектра микро организмов, принадлежащих к разным таксонам (рис. 2). Представители класса Actinobacteria (куда входит род Rhodococcus) присутствуют в обеих постройках (4,3 % и 3,6 %, соответственно).
Рис. 1. Содержание n-алканов в нефти, собран- Рис. 2. Состав бактериального сообщества в ной с водной поверхности и в активной и неак- битумных постройках №3 (активная) и №8 (не тивной битумных постройках. активная) по данным метагеномного анализа (ген 16S рРНК).
При посеве битума на среду, где единственным источникам углерода была стерильная нефть, из множества визуально одинаковых выпуклых, круглых, бле стящих слизистых колоний бледно-розового цвета с ровным краем диаметром 1- мм (рис. 3А) было выделено 5 штаммов. В суточной культуре клетки были непод вижны, грам-положительны, имели палочковидную форму: длина 1,5 мкм, диаметр 0,52 мкм (рис. 3Б). На шестые сутки в культуре преобладали кокки (диаметром 0, мкм), в меньших количествах встречались короткие палочки длиной 0.8 мкм и диаметром 0,6 мкм (рис. 3В). Выделенные штаммы обладали морфологическими свойствами типичных представителей рода Rhodococcus (Alvarez, 2010). Клетки имели сложную клеточную стенку и внутриклеточную перегородку, характерную для представителей семейства Nocardiaceae (Scott and Finnery, 1976) (рис. 3Г).
Рис. 3. Микроскопический анализ штаммов. А – колонии на чашке Петри, высеянные из битума постройки №8;
Б – гомогенная культура под световым микроскопом;
В – шестидневная культура под СЭМ;
Г – ультратонкий срез клетки бактерии под ТЭМ. На фотографии ультратонкого среза стрелками обозначено: 1 – перегородка;
2 – плазмалемма;
3 – слой, состоящий из пептидогликана;
4 – слой, состоящий из арабиногалактана. Масштаб: А – 1 см;
Б – 10 мкм;
В – 1 мкм;
Г – 250 нм.
Все выделенные штаммы являются аэробами и растут в диапазоне от +4 до +37 °С, при оптимуме 22 °С. Штаммы не давали роста при +46 °С. При добавлении в среду NaCl в концентрации 3 и 5 % отмечен рост бактерий, который прекращался при 8 %. Отмечена чувствительность к лизоциму (5 мкг/мл). Все штаммы образо вывали продукты, сдвигающие pH среды в щелочную область, утилизировали цит раты, рамнозу, рафинозу, мальтозу, арабинозу, аммонийный и нитратный азот, не дезаминировали фенилаланин, тирозин, дульцит, инозит, сорбит, маннит, адонит. У всех штаммов обнаружено наличие орнитиндекарбоксилазы, лизиндекарбоксилазы, аргининдегидролазы и уреазы. Отрицательный результат дали тесты на образова ние индола и сероводорода, газообразование, наличие -галактозидазы. Штаммы №1, 2 и 4 не утилизировали глюкозу, лактозу, фруктозу, ксилозу, сахарозу, галак тозу. Для штамма №5 через 48 ч отмечено слабое окисление фруктозы, сахарозы, лактозы, глюкозы, а штамм №3 деградировал эти субстраты существенно. Это род нило их с типовым штаммом R. erythropolis DSM 43066. В отличие от последнего (Alvarez, 2010), ни один штамм не деградировал сорбит.
По структуре гена 16S рРНК выделенные штаммы с гомологией 99-100 % отнесены к роду Rhodococcus. Штаммы №1-4 гомологичны штамму R. erythropolus TT07R-57 (AB546303), №5 – R. erythropolis DLC-terla (EU043316). Среди гомологов штаммов №1-4 представлены углеводородокисляющие бактерии рода Rhodococcus, выделенные из почв, загрязнённых нефтью. Одним из гомологов, помимо выше упомянутого, штамма №5 является микроорганизм R. globerulus AZ1-15, выделен ный из сильвинитных шахт. Физиологический анализ 5 штаммов из постройки № с 12 штаммами из постройки №3, 18 из водной толщи и 5 из осадка у м. Горевой Утес показывает их филогенетическое родство (отмечено пунктиром) (рис. 4).
Глава 5. Идентификация генов у выделенных штаммов Rhodococcus erythropo lis, участвующих в деструкции n-алканов По данным ПЦР-анализа у штамма №2 обнаружены alkB1-1 и alkB3-гены, у остальных – только alkB3-гены. Структура нуклеотидных последовательностей фрагментов alkB-генов всех штаммов имеет сходство со структурой аналогичных генов представителей рода Rhodococcus. Последовательности alk-генов выделен ных 5 штаммов сравнили с аналогичными последовательностями штаммов из би тумной постройки №3, из осадка и водной толщи исследуемого района (рис. 5).
AlkB-гены штаммов №4 и №5 располагаются на отдельных ветвях и класте ризуются с последовательностями, полученными из активной постройки и из вод ной толщи, что может свидетельствовать о специфичности данных alk-генов. По следовательности 1, 2 и 3 имеют структуры, схожие с фрагментами генов одного из видов рода Rhodococcus (рис. 5).
Проведен первый раунд секвенирования полного генома штамма №4. Из по лученных чтений удалось собрать контиги, из которых затем были собраны полные последовательности пяти alk-генов этого штамма. Они были сопоставлены с соот ветствующими генами из полного генома R. erythropolis PR4 (Seike et al., 2006) морского происхождения и с последовательностями фрагментов alkB-генов, опи санных в предыдущем разделе. Оказалось, что четыре alk-гена штамма №4 значи тельно отличаются друг от друга по последовательностям нуклеотидов, но каждый Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последователь ностей фрагментов гена 16S рРНК чистых культур аэробных микроорганизмов, изолированных из водной толщи и битумных построек и осадка района естественного нефтепроявления м. Горевой Утес на озере Байкал. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов.
Рис. 5. Филогенетическое положение 5 штаммов из битумной постройки №8 относительно гомо логов и штаммов из битумной постройки №3 и осадка, отобранного в районе естественного неф тепроявления у м. Горевой Утёс, определённое исходя из анализа нуклеотидных последовательно стей alkB-генов Масштаб: 10 нуклеотидных замен на каждые 100 нуклеотидов.
из них имеет весьма близкого аналога среди 4 расшифрованных alk-генов R. eryt hropolis PR4. Это позволяет предположить, что alk-гены, присутствующие в геноме штамма №4, выполняют несколько различающихся функций, например, кодируют ферменты, обладающие способностью окислять алканы различной длины.
Глава 6. Исследование выделенных штаммов Rhodococcus erythropolis в лабо раторных условиях В эксперименте установлено, что все штаммы утилизировали с разной ин тенсивностью n-алканы с длиной цепи C23-C29, концентрация других гомологов уменьшалась равномерно (рис. 6). В состав постройки №8 входят n-алканы с дли ной цепи C22-C34 (рис. 1), а выделенные нами штаммы микроорганизмов утилизи руют n-алканы C12-C29. Таким образом, отсутствие n-алканов C12-C21 в постройке частично может быть обусловлено их потреблением бактериями, в том числе и представителями рода Rhodococcus.
У штамма R. erythropolis № была исследована способность про дуцировать биосурфактанты. Для этого при 22 °С проводили культи вирование в течение 456 ч в при сутствии n-гексадекана в качестве единственного источника углерода.
Через 240 ч в культуральной жид кости под слоем гексадекана обра зовались флоккулы, которые в по кое слипались друг с другом, уве личиваясь в размере. При возоб новлении перемешивания, они раз рушались и оставались лишь мел кие. Флоккулы проэкстрагировали реактивом Фолча, а экстракт про анализировали методом двумерной тонкослойной хроматографии. При Рис. 6. Деградация n-алканов выделенными штам опрыскивании водой наряду с пят- мами R. erythropolis в среде Раймонда в присутст нами, расположившимися на диаго- вии нефти. Серые столбцы - начальные концентра ции n-алканов, белые – конечные, через 92 ч при нали, были обнаружены пятна, сме- °С.
стившиеся от диагонали вниз. Из вестно, что в число биосурфактантов продуцируемых родококками входят глико липиды, в частности, трегалозодимиколат. Остатки глюкозы в последнем образуют отрицательно заряженный боратный комплекс. Очевидно, что упомянутые выше пятна могут принадлежать такому гликолипиду.
ВЫВОДЫ 1. В битумных постройках, обнаруженных в районе естественного выхода нефти в Байкале на глубине 900 м, обитают микроорганизмы, относящиеся к доменам Archaea и Bacteriae. С помощью метагеномного анализа гена 16S рРНК в актив ной постройке выявлено 4520 и 5197 различных последовательностей архей и бактерий, соответственно, в которые входят представители семейства Methano sarcinales (46%), классов бета- (25%) и гаммапротеобактерий (12%). В неактив ной постройке выявлено 1401 и 2200 последовательностей архей и бактерий, соответственно, включающих представителей семейства Methanomicrobiales (38%), классов альфа- (15%) и бетапротеобактерий (16%). Их соотношение за висело от экологических условий.
2. Из всего разнообразия микроорганизмов, из неактивной постройки культивиро ванием на среде, где в качестве единственного источника углерода была нефть, удалось выделить в чистые культуры 5 активных штаммов микроорганизмов деструкторов нефти рода Rhodococcus. На основании анализа нуклеотидных по следовательностей гена 16S рРНК, морфологических и физиолого биохимических свойств они отнесены к виду R. erythropolis. Выделенные штаммы обладают способностью расти в широком диапазоне температур (от + до +37 °С) и при различной концентрации NaCl (3 и 5 %).
3. С помощью ПЦР-анализа у всех 5 штаммов удалось выявить alk-гены, у одного штамма эти гены полностью расшифрованы.
4. В лабораторных экспериментах показано, что все выделенные штаммы R. eryt hropolis за 92 ч на 60-100 % утилизируют C12-C29 n-алканы, входящие в состав битума построек и разгружающейся нефти. Отсутствие в постройке n-алканов C12-C21 обусловлено их биодеградацией микроорганизмами. Из культуры штам ма №4 выделены гликолипиды.
5. Сумма полученных данных вносит существенный вклад в понимание процессов биодеградации углеводородов в оз. Байкал и описывает новые возможности для практических применений родококков – деструкторов нефти.
Содержание диссертации опубликовано в следующих работах Статьи в рецензируемых журналах:
1. Лихошвай А.В. Донные битумные постройки и населяющая их биота по данным обследования озера Байкал с глубоководных обитаемых аппаратов «Мир» / О.М. Хлыстов, Т.И. Земская, Т.Я. Ситникова, И.В. Механикова, И.А. Кайгоро дова, А.Г. Горшков, О.А. Тимошкин, О.В. Шубенкова, С.М. Черницына, А.В.
Ломакина, А.В. Лихошвай, А.М. Сагалевич, В.И. Москвин, В.И. Пересыпкин, Н.А. Беляев, М.В. Слипенчук, А.К. Тулохонов, М.А. Грачев. // Доклады Акаде мии Наук. 2009. Т. 428. №5. С. 1-4.
2. Лихошвай А.В. Микробные сообщества в районах естественных выходов нефти на озере Байкал. / О.Н. Павлова, А.В. Ломакина, А.В. Лихошвай, Г.А. Фёдорова, Т.А. Шишляннкова, Е.С. Корнева, С.В. Букин, Т.И. Земская. // Успехи наук о жизни. 2010. №2. С. 169-172.
3. Likhoshvay A. The chemical composition and oil-degrading rhodococci of a deep water bitumen mound on the bottom of Lake Baikal / A. Likhoshvay, T. Khanaeva, A.
Gorshkov, T. Zemskaya, M. Grachev. // Geomicrobiology Journal. 2011 (принята в печать).
4. Лихошвай А.В. Микробные сообщества и их способность окислять N-АЛКАНЫ в районе разгрузки газо-нефтесодержащих флюидов в Среднем Байкале (м. Го ревой Утес). / О. Н. Павлова, А. В. Ломакина, А. Г. Горшков, М. Ю. Суслова, А.
В. Лихошвай, Т. И. Земская. // Известия РАН. 2011 (на рецензии в журнале).
Тезисы и материалы конференций:
1. Лихошвай А.В. Микробные сообщества, участвующие в деградации углеродо ров в озере Байкал. / Т.И. Земская, О.В. Шубенкова, С.М. Черницына, А.В. Ло макина, А.В. Лихошвай, О.Н. Павлова. // Материалы «IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов». – Новосибирск, 2008, С. 136.
2. Лихошвай А.В. Микробные сообщества и фауна холодных сипов и грязевых вулканов в осадках озера Байкал. / Т.И. Земская, Т.Я. Ситникова, О.В. Шубен кова, С.М. Черницына, А.В. Ломакина, О.Н. Павлова, И.В. Механикова, А.В.
Лихошвай, О.М. Хлыстов. // X Съезд Гидробиологического общества при РАН.
– Владивосток, 2009. С. 155.
3. Лихошвай А.В. Биологическое сообщество битумных построек из района неф тепроявления у м. Горевой Утёс, Средний Байкал. / С.М. Черницына, А.В. Ли хошвай, А.В. Ломакина, О.Н. Павлова Т.И., Земская, Т.Я. Ситникова. // Пятая Верещагинская Байкальская конференция, Международная научная школа для молодежи «Экология крупных водоемов и их бассейнов», 16 объединенный се минар по проблемам изучения региональных осаждений из атмосферы: тезисы докладов и стендовых сообщений. – Иркутск, 2010. С. 126-127.
4. Лихошвай А.В. Бактерии из битумных построек на дне озера Байкал, дегради рующие нефть. / А.В. Лихошвай, Т.А. Ханаева, А.В. Ломакина, А.Г. Горшков, О.Н. Павлова, Т.И. Земская, М.А. Грачёв, М.В. Слепенчук. // Там же. С. 139-141.
5. Лихошвай А.В. Первые результаты поиска углеводородокисляющих бактерий, изолированных из оз. Байкал - продуцентов поверхностно-активных веществ. / О.Н. Павлова, Г.А. Федорова, Т.А. Шишлянникова, Е.С. Корнева, А.В. Лихош вай, С.В. Букин, А.В. Ломакина, Т.И. Земская. // Там же. С. 149-150.
6. Likhoshway A.V. Comparative description of communities from bottom sediments at two sites of natural oil seeps in Lake Baikal: analysis of nucleotide sequences of 16S r RNA gene. / A.V. Lomakina, O.N. Pavlova, A.V. Likhoshway, A.G. Gorshkov, V.I.
Moskvin, I.V. Morozov, V. Nisheta, T.I. Zemskaya. // 10th International Conference on Gas in Marine Sediments. – Listvyanka (Lake Baikal), 2010. P. 122.
7. Likhoshvay Al.V. The Chemical composition and oil-degrading bacteria of a deep water bitumen mound in Lake Baikal. / Al.V. Likhoshvay, T.A. Khanaeva, T.I. Zem skaya // 32nd Annual Lorne Genome Conference, 2011. P. 385.
8. Лихошвай А.В. Сравнительная характеристика микроорганизмов р. Rhodococcus и р. Pseudomonas, образующих биосурфактанты. / О.Н. Павлова, А.В. Лихош вай, Г.А. Федорова, Т.А. Шишлянникова, С.В. Букин, А.В. Ломакина, Т.И. Зем ская. // Материалы 3-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с ме ждународным участием. – Иркутск, 2011. С. 94.