Изучение вариаций в организации и экспрессии оперонов рибосомных белков эубактерий
На правах рукописи
Хайруллина Гузель Анваровна Изучение вариаций в организации и экспрессии оперонов рибосомных белков эубактерий 03.01.03 – молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова”
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович
Официальные оппоненты:
Сергиев Петр Владимирович, доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова”, химический факультет, кафедра химии природных соединений, доцент.
Бениаминов Артемий Давидович, кандидат физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.
Энгельгардта Российской академии наук, научный сотрудник.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук.
Защита состоится «26» апреля 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд. 389.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).
Автореферат разослан марта 2013 года.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы На экспоненциальной стадии рост клеток E. coli прямо зависит от количества рибосом на клетку (Saito et. al., 1994) и масса рибосом составляет примерно 30 - 40% от массы клетки.
Для биогенеза рибосом клетка тратит существенную часть ресурсов. Рибосома - сложно организованный супрамолекулярный комплекс, состоящий из трех молекул рРНК и молекул белка;
21 белок и одна 16S рРНК входят в состав малой 30S субчастицы.
При биогенезе прокариотических 70S рибосом происходит раздельная сборка двух субчастиц. Определяющую роль в самосборке 30S субчастицы играют белки, которые первыми связываются с 16S рРНК (S4, S7, S8, S15), что приводит к формированию т. н.
«структурного остова» малой субчастицы.
Синтез многих рибосомных (р-) белков сбалансирован с рРНК. Саито и коллегами (Saito et. al, 1994) был предложен механизм регуляции по типу обратной связи, когда избыток р белка ингибирует трансляцию собственной мРНК. Это справедливо, в том числе и для стрептомицинового (str-) оперона, регулируемого белком S7 (рис. 2).
Основные работы по изучению механизмов регуляции экспрессии str-оперона были проведены для E. coli, данные для других бактерий немногочисленны. Аллен (Allen et al, 2004) сравнил регуляцию для двух оперонов Vibrio cholerae. Оказалось, что механизмы не универсальны не только для типа, но даже для класса гамма протеобактерий;
например, отличаются для Pseudomonas aeruginosa. Сравнение структуры генов L5 для P. aeruginosa и E. coli показало, что потенциальные участки взаимодействия с S8 спектиномицинового (spc-) оперона P. aeruginosa и E. coli не могут иметь однотипную вторичную структуру (Allen et al, 2004).
В связи с этим, исследование универсальности механизмов регуляции экспрессии оперонов р-белков эубактерий, особенно для ключевых белков сборки рибосом, является крайне актуальной задачей современной молекулярной биологии. Наиболее интересны опероны, кодирующие белки, которые первыми связываются с 16S рРНК, а именно S4 и S из альфа- и str-оперонов E. coli, соответственно.
В задачу данной работы входило сравнительное изучение организации и экспрессии оперонов р-белков эубактерий, в частности E. coli и ряда патогенов.
Для этого выбраны два представителя из одного типа – Proteobacteria, поскольку к нему относится вид E. coli: один представитель того же порядка Enterobacteriales - Salmonella enterica серотип typhi (S. Typhi), и второй, но относящийся к другому порядку – V. cholera.
Два других представителя: типа Firmicutes - Staphylococcus aureus и типа Actinobacteria – Mycobacterium tuberculosis также относятся к патогенам.
Цель и задачи исследования Цель работы - изучение геномной и оперонной организации генов, а также цистронов в оперонах р-белков патогенных бактерий из различных классов.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:
1) Охарактеризовать расположение генов р-белков в геномах различных эубактерий;
2) Сравнить организацию генов/цистронов р-белков в оперонах различных эубактерий;
3) Охарактеризовать и исследовать экспрессию стабильных бактериальных коротких РНК (бкРНК, (sRNA)), имеющих отношение к оперонам р-белков;
4) Разработать метод для изучения кинематики рибосом на полицистронной мРНК in vivo на примере str-оперона E. coli, используя ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ);
5) Сравнить дифференциальную экспрессию отдельных цистронов str- и альфа-оперонов р белков, ключевых для биогенеза малой субчастицы.
Научная новизна и практическая значимость работы Проанализировано положение генов р-белков на хромосомной карте E. coli, а также структура их оперонов для S. Typhi, M. tuberculosis, V. cholerae, S. aureus. В зависимости от эволюционных различий меняется взаимное расположение групп оперонов. Выделены опероны, которые чаще других расположены кластерами в геномах бактерий. Найдены различия в построении и составе самих оперонов. Наиболее яркий пример - альфа-оперон V.
cholerae, в котором отсутствует ключевой ген регуляторного р-белка S4.
Проанализирована структура str-оперона для всех пяти эубактерий. Для двух близких эубактерий: E. coli и S. Typhi (рис. 1), относящихся к одному порядку, не выявлено различий в структуре str-оперона. Но для V. cholerae (другой порядок) показано наличие дополнительной копии гена фактора элонгации EF-G, находящейся вне str-оперона в совершенно другом участке генома. S. aureus отличается только по копийности генов EF-Tu (одна копия, а не как в E. coli - две). M. tuberculosis отличается по копийности генов обоих факторов элонгации EF-G и EF-Tu.
В данной работе для S. Typhi, V. cholerae, S. aureus и M. tuberculosis выявлена 41 бкРНК, картированные в 15 р-оперонах. Их экспрессия показана Нозерн-блот гибридизацией: бкРНК экспрессируются в зависимости от фазы роста бактерий: экспрессия некоторых значительна на стационарной фазе роста, для других она минимальна;
некоторые бкРНК экспрессируются на всех стадиях роста. Для V. cholerae найдены три бкРНК (VcR_4520;
VcR_4751;
VcR_4371), экспрессия которых зависит от белка Hfq (РНК-связывающий бактериальный регулятор экспрессии генов).
Изучены профили представленности различных участков цистронов str-оперона на разных стадиях роста E. coli. Показана активность одного из двух предполагаемых внутренних промоторов при росте на богатой среде.
Для различных физиологических условий впервые построен паттерн представленности str-оперона. Деградосома (полинуклеотидфосфорилаза) также участвует в модуляции представленности цистронов р-белков.
Проведен анализ профилей представленности различных участков цистронов альфа оперона на разных фазах роста E. coli.
Публикации и апробации работы.
Работа апробирована на российских и международных конференциях “Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы” (Белгород, 2008), “Ломоносов-2009” (Москва, 2009), “Ломоносов-2011” (Москва, 2011), “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2010), “Международный конгресс по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID” (Москва, 2012), 3d EMBO Meeting (Vienna, Austria, 2011);
4th EMBO Meeting (Nice, France, 2012), 37th FEBS Congress (Seville, Spain, 2012). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи.
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен оперонам р-белков), обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 52 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 134 цитированных работ. Работа выполнена при поддержке РФФИ и ДААД.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Филогения исследуемых эубактерий Гены р-белков эубактерий очень консервативны, но сохраняется ли такой консерватизм в геномной, оперонной и внутриоперонной структуре?
Для сравнения выбраны представители одного типа – Proteobacteria. Два вида, принадлежащих одному порядку Enterobacteriales – S. enterica серотип typhi (S. Typhi) и E.
сoli;
один - из того же типа, но другого порядка – V. cholerae, а также по одному представителя совершенно других типов: Firmicutes – S. aureus и Actinobacteria – M.
tuberculosis. Филогения выбранных видов представлена на рис. 1.
Рис. 1. Неукорененное филогенетическое древо прокариот, основанное на 16S рРНК (с изменениями (Nelson et. al., 2000).
Мы попытались ответить на вопрос: насколько универсальна организация р оперонов E. coli для других эубактерий, в том числе патогенных?
Хромосомное расположение генов р-белков E. coli.
Большинство генов р-белков было картировано около 20 лет назад. Более половины генов расположены в классическом str-spc-локусе, где они организованы в четыре оперона, содержащих от 4 до 12 генов. Остальные собраны в кластеры от одного до четырех генов и находятся в разных частях хромосомы (рис. 2). В кластерах генов str-участка направление репликации и транскрипции совпадает – против часовой стрелки. Аналогичная ситуация наблюдается и для rif-участка, где все гены транскрибируются в направлении по часовой стрелке. Т.е. гены р-белков могут активно транскрибироваться одновременно с репликацией.
Ранее замечено, что гены р-белков и рРНК расположены на хромосоме не случайным образом: большая часть генов располагаются не дальше одной шестой от ориджина репликации, и всего лишь три находятся в отдалении. Такая организация позволяет синтезировать большое количество р-белков и рРНК в процессе активного роста и деления при наличии множественных репликативных вилок, обеспечивающих многокопийность этих генов.
Рис. 2. Расположение оперонов р-белков на хромосомах E. coli, V.
cholerae, S.aureus. Ori – ориджин репликации;
rr_N (серый цвет) – гены рРНК;
черный цвет – гены р-белков.
Гены р-белков собраны в кластеры - опероны. Опероны в свою очередь условно можно сгруппировать в блоки. Для E. coli характерно сосредоточение оперонов примерно в левой трети от ориджина. В этом участке располагаются следующие опероны: S21, S15, L13, S10, spc, альфа, str, L28, L34, L11, L10, S6, S20 и S2. Некоторые опероны расположены в геноме одиночно: S16, L20, L25, S1 и L32. В скоплении оперонов можно различить два блока. Первый, располагающейся на основной цепи и содержащий 4 оперона (S6, L10, L11, L34), и второй, располагающийся на комплементарной цепи, состоящий из 7 оперонов (S15, L13, S10, spc, альфа, str, L28).
V. cholerae. Геном состоит из двух кольцевых и неравных по размерам хромосом:
большая - приблизительно 2 961 тыс. п.н., меньшая - примерно 1 072 тыс. п.н. Практически все р-опероны, а также опероны рРНК располагаются на большой хромосоме. Также как и у E. coli, существует участок, содержащий большинство оперонов. В отличие от E. coli, где все опероны условно располагались с одной стороны от ориджина, у V. cholerae ориджин находится между группами оперонов. Но, как и для E. coli, все опероны располагаются недалеко от ориджина.
Если сравнить линейные размеры обоих участков наибольшей плотности оперонов р белков, то они примерно равны и составляют 1 300 – 1 500 тыс. п.н. Гены р-белков, располагающиеся на большой хромосоме, условно можно разделить на три блока: 1) альфа, spc, S10 - на комплементарной цепи;
2) L28, L11, L10, str, S6 - на основной цепи и 3) S16, L13, S15 – на основной цепи (рис. 2). При сравнении с аналогичными участками генома E.
coli можно заметить, что первый блок имеет тот же состав, но обратный порядок;
второй блок сильно видоизменился при сохранении сцепления оперонов L10, L11;
из третьего блока только два оперона сцеплены - L13, S15. Интересно, что порядок следования оперонов для этих видов бактерий противоположный.
У V. cholerae, как и у E.coli (кроме оперона S16), опероны L32, S1, L25 и L располагаются поодиночке. Оперон L20 - единственный из р-оперонов находится на малой хромосоме V. cholerae II. В геноме E. coli этот одиночный оперон располагается на большом расстоянии от основных двух блоков.
V. cholerae - один из эволюционно близких к E. coli видов. Оба относятся к одному типу – Proteobacteria. Тем не менее, взаимное расположение оперонов в геноме значительно изменяется в ходе эволюции.
S. aureus. Содержит одну кольцевую хромосому длиной примерно 2 879 тыс. п.н. S.
aureus эволюционно гораздо более далекий представитель, чем E. coli и V. cholerae между собой, и относится к типу Firmicutes. Данный тип таксона эубактерий известен низким процентом GC-пар.
В отличии от V. cholerae и E. сoli, р-опероны в хромосоме S. aureus не сгруппированы, а располагаются 4 блоками, которые распределены по хромосоме относительно равномерно.
Первый блок – L13, альфа, spc, S10 - совпадает с аналогичным E. coli и V. cholerae, и точно также находится на комплементарной цепи. Второй блок – S6, L25, L11, L10, str - (основная цепь) также совпадает с блоком ранее описанных видов, но последовательность расположения оперонов изменена. Третий блок, состоящий из L28, S16, S2, S15 оперонов, не совпадает с блоками, описанными у E. coli и V. cholerae. Последний блок – S1, S21, S20, L - располагается примерно в одном месте на хромосоме, но при этом часть оперонов находится на основной цепи – S21, L20, а другая часть – S20, S1 - на комплементарной.
Похоже, что подобная группировка оперонов является случайной и их можно отнести к классу одиночных. У S. aureus имеются другие одиночные опероны: L34, L20, L32. Опероны L20 и L32 являются одиночными и в типе Proteobacteria.
Помимо перегруппировки некоторых оперонов для S. aureus показаны внутри-оперонные изменения. Наиболее яркий пример - в альфа-опероне отсутствует ген S4, являющийся классическим примером регуляторного белка E. coli. Альфа-оперон располагается на комплементарной цепи на расстоянии примерно 500 тыс. п.н. от гена S4, находящегося на главной цепи. Аналогичный пример можно привести для оперона S6, откуда переместился ген L9. Обнаружены не только перемещения генов из оперонов, но и дупликация генов.
Например, в опероне S15 S. aureus найдена дополнительная копия гена L33 на расстоянии прим. 200 тыс. п.н. от оперона. Найдена дупликация гена/оперона L28.
Организация генов р-белков в оперонах разных бактерий Регуляция экспрессии такого большого и разнообразного числа оперонов отличается для каждого оперона, но насколько отличаются механизмы регуляции для одного и того же оперона в разных видах бактерий неизвестно.
Один из простейших способов координации синтеза различных р-белков – объединение их генов в одну или несколько транскрипционных единиц. Подобное решение обеспечивает, с одной стороны, возможность эквимольного синтеза р-белков, а с другой – позволяет упростить регуляцию такого большого числа генов. Что и наблюдается в E. coli: существуют несколько транскрипционных единиц — оперонов р-белков, которые имеют разное количество цистронов. Помимо генов р-белков некоторые опероны содержат гены белков, участвующих в транскрипции и трансляции. Например, оперон S21 содержит ген ДНК праймазы и ген сигма-субъединицы РНК-полимеразы.
Сложность транскрипционной организации оперонов может возрасти за счет предполагаемых внутренних промоторов разной силы. Для оперона L10 E. coli сначала было показано существование промотора перед первым геном оперона – rplJ (Post, 1979), который определяет транскрипцию четырех цистронов: rplJ-rplL-rpoB-rpoC. Через несколько лет (Fukuda, 1983;
Bass, 1982) был найден внутренний промотор перед геном бета-субъединицы РНК-полимеразы, определяющий более короткий транскрипт: rpoB-rpoC. Возможно, такой механизм понадобился для дополнительной регуляции РНК-полимеразы.
Регуляция экспрессии р-оперонов происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Разные опероны регулируются по-разному. Оперон может иметь оба уровня регуляции, например р-оперон S10. Белок L4, цистрон которого стоит третьим в опероне S10, регулирует как транскрипцию, так и трансляцию всех одиннадцати генов/цистронов этого оперона.
На трансляционном уровне наиболее характерным является регуляция по типу обратной связи: регуляторный белок связывается либо с рРНК с образованием рибосомы, либо его избыток - с собственной мРНК, тем самым ингибируя как свой синтез, так и синтез нескольких цистронов этого оперона.
По данным Саито и коллег (Saito K. et. al, 1994) регуляция трансляции фактора элонгации EF-Tu происходит вне зависимости от предыдущих трех цистронов и его количество отличается от р-белков. Причин может быть несколько: активность внутренних промоторов, наличие в геноме E. coli двух генов Tu - одна копия tufA в str-опероне (рис. 8), вторая - tufB транскрибируется отдельно. Нуклеотидные последовательности генов содержат лишь несколько нуклеотидных замен. Разница в экспрессии р-белков и Tu может быть десятикратной, при этом синтез с tufA идет в 2-3 раза более активно, чем с tufB (Pedersen, 1976).
Для двух эубактерий одного порядка: E. coli и S. Typhi (табл. 1, рис. 1) количество цистронов в str-опероне одинаково. Но для обоих видов характерно наличие двух генов EF Tu (один в составе str-оперона, второй - в другой области генома).
Вид/ген S12 S7 EF-G EF-Tu S.aureus 1 1 1 E.coli 1 1 1 S.Typhi 1 1 1 V.cholerae 1 1 2 M.tuberculosis* 1 1 2 Таблица 1. Количество цистронов в str-оперонах E. coli, S. Typhi, V. cholerae, M. tuberculosis и S. aureus (*по первичной структуре два гена EF-G аналогичны, но не гомологичны).
У M. tuberculosis также наблюдается дополнительный ген, но не EF-Tu, как у E. coli, а EF G. Для V. cholerae существует дополнительные копии обоих генов: EF-G и EF-Тu.
Можно заметить, что единообразие в составе наблюдается только для эубактрий одного порядка.
бкРНК, картированные в оперонах р-белков Благодаря интенсивному изучению различных бкРНК найдены примеры эволюции путем дупликации, горизонтального переноса, трансформации известных РНК или случайной транскрипции.
Можно выделить три основных типа стабильных бкРНК:
1) функциональные РНК - например, тРНК 2) фрагменты РНК, устойчивые к деградации благодаря собственной структуре - например, псевдоузлы.
3) РНК, защищаемые от деградации белками или рибосомами.
Активно ведется поиск новых методов для обнаружения бкРНК;
например, предложен метод выявления участков трансляционных пауз рибосом в бактериях, основанный на секвенировании фрагментов мРНК, которые защищены рибосомами от деградации (Li et. all, 2012). Оценка профилей плотности рибосом на транскриптах показала, что редкие кодоны не приводят к паузированию, в отличии от последовательностей, аналогичных Шайн Дальгарно.
Данная работа сфокусирована на РНК из второй и третьей группы, поскольку они могут иметь регуляторную функцию.
Для создания библиотеки кДНК брали одинаковое количество суммарной РНК, выделенной из клеток патогенных бактерий на разных стадиях роста (любезно предоставленной Р. Рейнхардом и Т. Таном) и длиной от 50 до 200 н. 3’-конец РНК полиаденилировали, а 5`-конец лигировали с адаптором. Продукт, получившийся после обратной транскрипции и одноцепочечной ПЦР, клонировали в вектор pSPORT1 и трансформировали E. coli. Положительные клоны отбирали случайным образом, плазмидные вставки секвенировали и собирали в контиги с помощью пакета программ http://www.dnastar.com, последовательности картировали с использованием BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;
координаты представлены на рис. 3.
Рис. 3. Список координат бкРНК, найденных в геноме бактерий и относящихся к оперонам р-белков.
Номера соответствуют базам данных DDBJ/EMBL/GenBank Найдено 25 бкРНК, экспрессия которых показана Нозерн-блот гибридизацией. Кроме того, были получены бмРНК из штаммов Hfq KO.
Hfq – это РНК-связывающий белок, который у многих бактерий взаимодействует с дуплексами бмРНК-мРНК, модулируя экспрессию многих мРНК как положительно, так и отрицательно (Vogel, 2011;
Hajnsdorf E, 2012).
Spc-оперон. Содержит гены одиннадцати р-белков: L14, L24, L5, S14, S8, L6, L18, S5, L и L15, а также ген secY. Последний кодирует белок, участвующий в секреции белков.
Маттеакис и Номура (Mattheakis L.C., Nomura M., 1988) показали, что S8, пятый в опероне, регулирует синтез восьми р-белков этого оперона, контролируя участок с цистрона L5 и до L15. Предполагается, что и трансляция L14 и L24 также может регулироваться S8.
S8 связывается с межцистроном L24 - L5, что приводит к репрессии сопряженной трансляции цистронов L5 - L15.
Для M. tuberculosis и V. cholerae картированы бкРНК примерно в одном районе – перед первым цистроном этого оперона (рис. 4).
Рис. 4. Структура spc-оперона V. cholera и M. tuberculosis.Названия генов подписаны снизу, сверху - названия белков. Регуляторный белок подчеркнут;
регулируемые цистроны выделены черным, не регулируемые – белым, частично регулируемые - серым. Р – возможные промоторы;
стрелками обозначены бкРНК.
MtbR5725 имеет длину 60 н, а его аналог из V. cholerae – VcR4751, возможно, является продуктом процессинга, поскольку обнаружена экспрессия бкРНК длиной 200, 150 и 70 н.
В отличии от M. tuberculosis в V. cholerae, количество бкРНК зависит от фазы роста, а также от активности Hfq.
Найденные фрагменты мРНК могут участвовать в регуляции двух первых цистронов spc оперона.
L11 оперон В последнее время по данным секвенирования обнаружено, что бактериальная антисмысловая транскрипция намного более частое явление, чем считалось ранее. В связи с этим предполагается, что бактериальная транскриптомика включается в себя весь геном – т. е. транскрипцию с обоих тяжей. Арнвиг и коллеги (Arnvig 2011) привели примеры профилей обратной регуляции экспрессии между соответствующими парами:
мРНК и антисмысовыми транскриптами в M. tuberculosis, иллюстрируя общий, и может быть даже общегеномный механизм транскрипционной ко-регуляции.
Для малых кДНК, полученных из РНК для различных р-оперонов, характерна транскрипция участков, комплементарных мРНК (кмРНК). Обнаружены кмРНК, принадлежащие различным оперонам четырех изучаемых видов эубактерий. Экспрессия некоторых была независимо подтверждена Нозерн-блот гибридизацией.
Картированы три кмРНК к оперону L11 M. tuberculosis. Для одного из них - MtbR 7477, была показана экспрессия Нозерн-блот гибридизацией - фрагмент длиной 60 н.
экспрессируется на всех стадиях роста (рис. 5). Номурой (Kearney KR, Nomura M., 1987) был обнаружен район связывания регуляторного белка L1 с мРНК – примерно первые 100 н цистрона. MtbR 7477 картируется примерно в этой же области. Данная бкРНК может принимать участие в регуляции путем нарушения сложной вторичной структуры, образуемой мРНК, которая необходима для связывания с регуляторным белком.
Рис. 5 Структура оперона L11 M. Tuberculosis. Названия генов даны снизу, сверху - названия белков. Регуляторный белок подчеркнут;
регулируемые им цистроны выделены черным;
не регулируемые - белым. Р – возможные промоторы;
стрелками обозначены бкРНК.
L10(L12) оперон Кодирует два р-белка: L10 и L12. В отличие от других р-белков L10 и L12 образуют пентамерный комплекс в стехиометрии 1 к 4: L10-(L12)4. Помимо основной функции этого комплекса - формировать рибосомы, известно, что он специфически взаимодействует с 5’-лидерным участком мРНК оперона, выполняя регуляторную функцию.
В рРНК и мРНК обнаружен мотив, узнаваемый L10-(L12)4: т. н. «kink-turn» и петля UUAA (рис. 6C). В транскриптоме S. Typhi обнаружен StyR 55, который картирован за 133 н. от AUG мРНК L10-L12 (рис. 3, 6A). Анализ вторичной структуры StyR 55 показал на участок связывания L10-(L12)4. Т.о. StyR 55 может связывать комплекс L10-(L12)4, влияя на регуляцию оперона L10 (рис. 6 A, C) Рис. 6. Структура и анализ оперона L пяти эубактерий: E.
coli, S. Typhi, V.
cholera, S. aureus, M.
tuberculosis. А) Схема структуры оперона L10(L12). Cтрелкой указано расположение семейства ncR 55;
названия генов даны снизу, сверху названия белков.
Регуляторный белок подчеркнут;
регулируемые им цистроны выделены черным;
не регулируемые - белым.
Р – промотор, показанный для E. coli.
В) Участок 23S рРНК E. coli и предполагаемая вторичная структура, образованная участками семейства ncR (предполагаемый мотив «kink-turn» обведен рамкой);
C) Нозерн-блот анализ экспрессии семейства бкРНК ncR 55.
Идентифицирован потенциальный ортолог StyR 55 - VcR 4925 (далее переименованный в VcR 55) в библиотеке V. cholerae. На основе структурного анализа VcR 55 предположили, что данная бкРНК содержит мотив «kink-turn» и петлю UUAA (рис. 6C). Основываясь на последовательности StyR 55 и VcR 55, а также консервативности структуры псевдоузла, была предложена последовательность потенциальных гомологов в E. coli (EcoR 55) и S.
aureus (Sau 55). Найти подобную структуру для M. tuberculosis не удалось.
Обнаружена экспрессия бкРНК 55 в S. Typhi, V. cholerae, E. coli и S. aureus Нозерн-блот гибридизацией. Сигналы найдены в интервале длин РНК от 70 до 100 н, экспрессия зависит от стадии роста и возрастает к стационарной фазе у S. Typhi и E. coli (рис. 6);
для S. aureus обнаружена другая зависимость. Нозерн-блот гибридизация не дала положительного сигнала для обычного фенотипа S. aureus, однако экспрессия StyR 55 была обнаружена на логарифмической и стационарной фазах с фенотипом мелких колоний (small colony forming variant - SCV) (рис. 6C): транскрипты 70 и 100 н. соответствуют аналогичным бкРНК, найденным в S. Typhi, V. cholerae и E. coli. Фенотип SCV способен выживать во внутриклеточном пространстве, устойчив, рецидивнен и трудно излечим. Sau представляет большой интерес в качестве биомаркера для мониторинга SCV-инфекций в клетках человека.
Альфа-оперон Кодирует четыре р-белка и альфа-субъединицу РНК-полимеразы.
Эффективность трансляции этой полицистронной мРНК регулируется р-белком S4, который взаимодействует с псевдоузлом лидерной последовательности цистрона S13: между -75 и +35 н. Для него возможны два типа структуры: один разрешает трансляцию, второй — нет.
Обе конформации могут взаимодействовать с 30S субчастицей рибосомы и равновероятно представлены в клетке. S4 взаимодействует только с неактивной конформацией и ингибирует инициацию трансляции. При взаимодействии рибосомы с комплексом S4-мРНК она оказывается в «ловушке» и равновесие смещается в сторону неактивной структуры.
Если 30S субчастица связывается с неактивной конформацией мРНК в отсутствии S4, то может произойти реактивация.
Идентифицирована бкРНК StyR 337 в S. Typhi длинной 175 н (рис. 7), которая картирована в 5’-лидерной области мРНК S13. StyR 337 целиком содержит регуляторный район S4, формирующий псевдоузел (рис. 7). Можно предположить, что либо наличие StyR 337 указывает на связывание с S4, либо существование дополнительных StyR 337 могут служить «ловушкой» для белка, выводя его из регуляции.
Рис. 7. Структура альфа-оперона S. Typhi и M. tuberculosis. Названия генов подписаны снизу, сверху - названия белков. Регуляторный белок подчеркнут;
регулируемые им цистроны выделены черным;
не регулируемые цистроны показаны белым. Р – возможные промоторы;
стрелками обозначены бкРНК.
Нозерн-блот указывает на различную экспрессию StyR 337 бкРНК в зависимости от фазы клеточного роста: сигнал увеличивается от экспоненциальной фазы к стационарной (рис. 7).
Анализ библиотек кДНК выявил бкРНК MtbR 6032 в M. tuberculosis, картирование которой совпадает со StyR 337 (рис. 7). Описанный для E. coli механизм регуляции, возможно, сохраняется и для S. Typhi, поскольку виды достаточно близкие, а последовательности бкРНК очень консервативны, в отличие от M. tuberculosis. Поскольку MtbR 6032 располагается в той же области, что и StyR337, можно предполагать ее участие в регуляции экспрессии альфа-оперона. Экспрессия бкРНК показана с помощью Нозерн-блот гибридизации (рис. 7).
Str-оперон Чтобы найти бкРНК, относящиеся к str-оперону, были проанализированы и картированы библиотеки кДНК малой длины, полученные из S. Typhi, E. coli, V. cholerae, M.
tuberculosis и S. aureus. Выделены два класса транскриптов: 1) межгенная бкРНК VcR 4520, которая комплементарна межцистрону S7 - EF-G (рис. 8), 2) бкРНК MtbR 5775, транскрибируемая с комплементарного тяжа начала цистрона EF-G (рис. 8).
Рис. 8. Структура spc-оперона V. cholera.
Названия генов подписаны снизу, сверху названия белков. Регуляторный белок подчеркнут;
регулируемые им цистроны выделены черным;
не регулируемые показаны белым;
частично регулируемые - серым.
Цифрами показана длина межцистронов в н. Р - обозначены промоторы (P с вертикальной стрелочкой в гене S7 обозначает предполагаемый промотор), t - терминатор.
У V. cholerae бкРНК VcR 4520 картирована в участке между S7 и EF-G. Анализ вторичной структуры выявил структуру, подобную rho-независимому терминатору. А Нозерн-блот дает сигналы, соответствующие длинам 100 и 150 н. Экспрессия VcR значительно снижается на стационарной фазе роста. Многие бкРНК могут комплементарно связываться с мРНК, меняя их трансляционную эффективность или стабильность. Наличие большинства из обнаруженных бкРНК зависит от присутствия белка Hfq.
Hfq - бактериальный белок, вовлеченный в ряд процессов: репликация бактериофагов, ответ на стресс (путем регуляции трансляции двух стрессовых транскрипционных факторов S (RpoS) и E (RpoE)), подвижность некоторых видов Synechocystis, а также за вирулентность и патогенность P. aeruginosa, B. rucella abortus, V. cholerae, Listeria monocytogenes, Legionella pneumophila и E. coli, этот белок необходим в S. Typhi для инвазии и роста паразитов в эпителиальных клетках и макрофагах. Известно, что это РНК связывающий белок, который участвует в регуляции экспрессии путем связывания с бкРНК, стимулируя их взаимодействие с мРНК.
Экспрессия VcR 4520 показана в V. Cholerae, нокаутном по Hfq - Hfq KO (рис. 8). В отличие от штамма дикого типа, в Hfq KO экспрессия VcR 4520 зависит от стадии роста и минимальна для лаг-фазы. Зависимость стабильности VcR 4520 от белка Hfq позволяет предполагать участие этого белка в данном типе регуляции.
Различия str-оперонов у эубактерий Для каждой из изучаемых эубактерий показано, что в их геноме имеется одна копия str оперона с одинаковым составом, кроме наличия (или отсутствия) дополнительных копий генов факторов элонгации (рис. 9).
Для одного порядка (E. coli и S. Typhi) нет различий в организации str-оперонов, не считая разницу в 1-2 н. в межцистронах. Различия начинаются уже в V. choleraе, относящемуся к порядку Vibrionales (рис. 9). Межцистрон S12-S7 стал больше, слегка увеличился второй межцистрон, а длина третьего стала больше почти в три раза, что скорее всего должно отразиться на уровне синтеза EF-Tu.
Рис. 9. Структура str-оперона для пяти эубактерий: E. coli, S. Typhi, V.
cholera, S. aureus, M. tuberculosis.
Названия генов подписаны снизу, сверху - названия кодируемых ими белков. Регуляторный белок подчеркнут, регулируемые им цистроны выделены черным, не регулируемые цистроны показаны белым, частично регулируемые цистроны показаны серым. Цифрами дана длина межцистронов в н. Буквами Р обозначены промоторы (P с вертикальной стрелочкой в гене S7 обозначает предполагаемый промотор), t-терминатор.
Для более далеких от E. coli эубактерий выявлены круциальные изменения в str-оперонах.
Например, длина первого межцистрона для S. aureus уменьшилась до 66 н. Для E. coli Номурой с коллегами было показано, что на уровне трансляции S7 выступает в роли репрессора, регулируя синтез S7, EF-G и возможно, EF-Tu (Saito K., et. all, 1994). Для сопряжения трансляции цистронов S12 и S7 необходимо, чтобы межцистрон образовал шпильку, сблизив терминирующий и инициирующий кодоны, но в S. aureus межцистрон короче на треть и идентичную шпильку образовать не может, что оставляет открытым вопрос о механизме регуляции.
Тот же самый межцистрон в M. tuberculosis вообще отсутствует, терминирующий и инициирующие кодоны перекрываются, что вновь провоцирует вопрос – как же регулируется трансляция этого оперона у микобактерий? Участок между цистронами S7 и EF-G также более протяженный, чем в E. coli, но одинаковой длины для эубактерий из разных типов – 122 нуклеотида. Поэтому вопрос о том, как регулируется трансляция EF-G также остается открытым. Последний межцистрон str-оперона у S. aureus составляет 216 н. и это больше, чем у V. cholerae и у E. coli;
в то время как у M. tuberculosis его длина приближается к 400 н. Возможно, увеличение данного межцистрона свидетельствует о независимой регуляции экспрессии EF-Tu, а также о возможном отчуждении этого гена в эволюции.
Регуляция трансляции str-оперона Саито и коллеги (Saito K., et.all, 1994) исследовали регуляцию трансляции str-оперона in vivo. При увеличении экспрессии S7 более чем в 2 раза (с плазмидной копии), синтез белков str-оперона уменьшается: S12 на 40 – 50 % (со временем степень ингибирования снижается), EF-G - на 50 – 60 %, EF-Tu - на 20 %. Кроме того, несмотря на то, что трансляция S7, в основном, осуществляется за счет сопряженной трансляции с S12, в 10 - 20 % случаев S синтезируется благодаря независимой инициации трансляции.
Экспрессия белков str-оперона происходит не в стехиометрических количествах. Зенгель и Линдал (Zengel JM, Lindahl L., 1984;
Zengel JM, Lindahl L., 1990 ) идентифицировали внутренний промотор в опероне. Мутационным анализом показали, что промотор картирируется недалеко от 3’-конца гена EF-G. Это объясняет повышенную представленность мРНК EF-Tu по сравнению с другими цистронами str-оперона.
Для понимания возможных причин происхождения бкРНК, а именно – вследствие защиты от деградации участков мРНК транслирующими рибосомами, возникла необходимость в разработке метода исследования кинематики рибосом на полицистронной мРНК in vivo, т.е. определение представленности отдельных участков цистронов, например в районах сигнальных последовательностей трансляции. Метод разрабатывался на несинхронной культуре клеток, поэтому наличие сигнала должно указывать на доминантные события.
ПЦР РВ отражает представленность того или иного участка РНК. Чаще всего нормировка экспериментальных данных проводится по т. н. «генам домашнего хозяйства»: их экспрессия относительно постоянна в жизненном цикле клеток, они высоко консервативны.
Для этих целей обычно используют гены р-белков, которые в данной работе являются собственно предметом исследования и т.о. не могут быть выбраны для нормировки;
поэтому в качестве контрольных выбраны гены рРНК. Во-первых, гены рРНК очень консервативны. Во-вторых, представленность рРНК совпадает с количеством рибосом в клетке, которое, в свою очередь, зависит от скорости роста культуры клеток. Т. о.
представленность цистронов р-белков была нормирована на количество рибосом в клетке на разных стадиях роста культуры.
При синтезе и амплификации ПЦР РВ для детекции флуоресцентным красителем оптимальной длинной участка считается 80 -100 н, в то время как для определения плотности распределения рибосом на мРНК наибольший интерес представляет амплификация участка размером 30 - 40 н, который соответствует размеру, физически «закрываемому» рибосомой. Однако использовать продукт менее 80 - 90 н длиной для ПЦР РВ не удалось. Праймеры подбирались длиной 16 - 20 н с помощью программы PRIMER (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi). Современные методы дизайна праймеров учитывают многие параметры, такие как длина, нуклеотидный состав, вторичная структура праймеров и продуктов, состав реакционной смеси, концентрация реагентов и тип красителей. Однако теоретический выбор не всегда приводит к адекватным результатам, что диктует необходимость экспериментальной проверки эффективности праймеров.
Использование набора праймеров, комплементарных различным участкам мРНК, которые должны давать эквивалентный сигнал, еще больше усложняет задачу. В данной работе были подобраны праймеры, комплементарные началу и концу каждого цистрона str мРНК, которые давали эквивалентные сигналы.
Оказалось, что представленность 3'-конца EF-G гораздо выше, чем всех остальных участков str-оперона. Видимо, предсказанный Зенгел с коллегами внутренний промотор действительно определяет синтез дополнительного транскрипта для EF-Tu на всех стадиях роста эубактерий (рис. 10А).
Рис. 10 Гистограмма представленности различных участков str-(А-В) и альфа (Г-Е) оперонов на трех разных фазах роста E.coli. Белый– ранняя логарифмическая;
серый – средняя логарифмическая;
черный- стационарная фаза роста. А,Г - рост на нормальной среде (LB), Б,Д - рост на нормальной среде (LB) штамма pnp-, В,Е - рост на минимальной среде (M9).
Ранние работы изучали экспрессию генов для клеток, в основном для какой-либо одной фазы роста (или двух), например для экспоненциальной или/и стационарной. В последнем случае состояние клеток можно рассматривать как стрессовое. Современные работы позволили дискриминировать патерны экспрессии отдельных генов даже на ранней логарифмической и логарифмической фазе роста. Например, для Salmonella enterica две эти стадии отличаются по спектру бкРНК (Chinni SV et. al., 2010). В данной работе отбирали клетки на всех трех фазах роста.
Для первых цистронов S12 и S7 str-оперона наблюдается небольшое превалирование участков для цистрона S7, особенно на ранней логарифмической стадии (рис. 10A), что можно объяснить небольшой дополнительной независимой инициацией трансляции S7. В этом случае наблюдается большая плотность рибосом на данном участке мРНК, а значит и большая физическая экранированность мРНК от действия деградосом, и, как следствие, большая стабильность данного участка мРНК (что может определять появление бкРНК).
Регуляция экспрессии str-оперона в клетках E. coli, мутантных по полинуклеотидфосфорилазе str мРНК имеет определенное время полу-жизни в зависимости от физиологического статуса клетки: для E. coli оно составляет от 30 сек до 20 мин, что во многом определяется активностью нуклеаз. Нуклеазы представлены различными эндо- и экзо-рибонуклеазами, РНКазой III, РНКазой Е и проч. В клетках E. coli нуклеазы собраны в мультиферментный комплекс - деградосому, который содержит еще целый ряд белков – в том числе, полинуклеотидфосфорилазу (3’ - 5’ –экзорибонуклеазу, ПНФ), RhlB (РНК-хеликазу), енолазу и проч (Carpousis et.al., 2002). Расщепление мРНК в E. coli происходит за счет как эндо-, так и 3’ - 5’ экзонуклеазной активности (Kaberdin et.all, 2006).
Очевидно, что представленность цистронов str-оперона должна зависеть от активности деградосом. Чтобы оценить вклад ПНФ в стабильность отдельных участков мРНК использовали штамм E.coli, дефектный по ПНФ. На ранней логарифмической стадии роста наблюдается такой же патерн представленности цистронов, как и для клеток дикого типа, однако разница в представленности первого и второго цистронов выражена не так сильно (рис. 10Б).
На экспоненциальной фазе роста для клеток дикого типа повышенной представленности цистрона S7 не наблюдалось, и в целом профиль в обоих экспериментах выглядит одинаково. На стационарной фазе, когда количество мРНК в клетке становится меньше, в клетках мутанта pnp- профиль представленности различных участков оперона практически выравнивается, т.е. гидролиз мРНК происходит стохастически.
Активность внутреннего промотора EF-G осталась неизменной также и в клетках штамма pnp- (рис. 10Б).
Регуляция экспрессии str-оперона E. coli в стрессовых условиях (минимальная среда) Из общих соображений следует, что при росте клеток на богатой среде регуляция экспрессии может быть не такой жесткой, как при росте на бедной среде, когда требуется контроль за ресурсами. Как отмечалось во введении, биосинтез белка требует значительного количества ресурсов клетки и поэтому требует строгого контроля за процессом биогенеза самих рибосом.
На ранней логарифмической стадии роста, когда клетки еще не успели адаптироваться на бедной среде, общее количество транскриптов снижено по сравнению с остальными фазами роста. Соотношения представленности различных цистронов str-оперона остается примерно таким же, как и у клеток, выращенных на богатой среде, но заметно увеличение представленности первого цистрона (рис. 10А, В).
На экспоненциальной стадии роста клетки адаптировались к условиям дефицита и уровень транскрипции вырос. Интересно заметить, что при этом резко уменьшилась представленность концевого района EF-G. По-видимому, это связано с тем, что внутренний промотор оперона отключается в стрессовых условиях.
Более заметно увеличение представленности цистрона S12, которая продолжает увеличиваться на стационарной фазе роста. Возможно, это является отражением регуляции трансляции str-оперона. р-белок S7 взаимодействует с межцистроном S12-S7, тем самым ингибируя трансляцию этого и последующего участков. Участки мРНК, не взаимодействующие с рибосомой, деградируют. Трансляция продолжает идти с 5’-конца str оперона.
Регуляция трансляции альфа-оперона Альфа-оперон E. coli содержит гены четырех р-белков и -субчастицы РНК-полимеразы.
Экспериментально показано, что трансляция р-белков этого оперона репрессируется р белком S4, цистрон которого располагается третьим в альфа-опероне. Длина межцистронных участков в ряду изучаемых эубактрий варьирует (рис.11).
Рис. 11. Структура альфа-оперона для пяти эубактрий: E. coli, S. Typhi, V. cholera, S.
aureus, M. tuberculosis.
Названия генов подписаны снизу, сверху даны названия кодируемых ими белков. Регуляторный белок подчеркнут;
регулируемые им цистроны выделены черным и серым, не регулируемые цистроны показаны белым. Цифрами показана длина межцистронов в н. Р – промотор, показанный для E. coli.
Предполагается, что альфа-оперон имеет единственный участок узнавания р-белка S4, и что трансляция цистрона L17 сопряжена с трансляцией трех р-белков, цистроны которых расположены раньше.
Участок связывания S4 включает в себя лидерную последовательность и проксимальные 40 н первого цистрона S13. Участок связывания S4 с альфа- образует сложную вторичную структуру. Как и в случае участка связывания S4 с 16S рРНК - это достаточно протяженная область на 5’-конце рРНК. Структура участков связывания с 16S рРНК и альфа мРНК не похожа ни по первичной структуре, ни по гипотетической вторичной структуре (Zengel J., Lindahl L., 1994).
Предполагается, что связывание S4 с мРНК вызывает аллостерический конформационный переход в РНК, который, в свою очередь, ингибирует нормальную инициацию трансляции.
Ранее показано существование двух конформаций мРНК, переход между которыми происходит достаточно медленно. Механизм репрессии трансляции представляется следующим: после связывания S4 с мРНК происходит смещение равновесия в пользу той конформации, при которой инициация трансляции невозможна.
В данной работе проведен анализ представленности различных участков цистронов альфа-оперона;
она оказалась не одинаковой и различалась на разных стадиях роста. На рисунке 10Г приведены результаты представленности.
Представленность разных участков оперона для всех трех стадий роста примерно одинаковая за исключением ранней логарифмической стадии, где заметно сильное (примерно в полтора - два раза) превалирование начального участка цистрона S13.
Регуляторный белок S4 узнает и связывается с данным участком мРНК;
она не может транслироваться и подвергается гидролизу. В то же время S4 экранирует участок связывания и ближайшие нуклеотиды от гидролиза нуклеазами. Время жизни данного участка мРНК возрастает, что и отражается на уровне сигнала. Подобный феномен характерен только для ранней логарифмической стадии роста.
Все данные по представленности цистронов р-белков нормированы на количество рРНК.
На ранней логарифмической стадии роста, в отличии от поздней и стационарной, соотношение количества мРНК к рРНК выше. На этой фазе роста идет активный синтез рибосом для обеспечения эффективного биосинтеза белка. Поскольку количество р-белков не может превышать уровень рРНК в клетке, включается процесс регуляции трансляции р белков.
Регуляция экспрессии альфа-оперона в клетках E. coli, мутантных по полинуклеотидфосфорилазе При регуляции трансляции оперонов показан существенный вклад, который вносит гидролиз, а именно – функционирование деградосом. Это супрамолекулярный комплекс белков, основной задачей которого является деградация свободной РНК. Для выяснение вклада нуклеаз в регуляцию трансляции альфа-оперона были проведены эксперименты на штамме E. coli с мутацией в гене полинуклеотидфозфорилазы.
Представленность различных участков альфа-оперона для мутантных клеток похожа на распределение, полученное для исходных клеток (рис. 10 Г, Д). Также как и в исходном штамме наблюдается превалирование начального участка цистрона S13 над всеми остальными на ранней логарифмической стадии роста, что говорит о том, что при дефиците деградации механизм регуляции сохраняется.
На ранней логарифмической стадии роста заметно, что представленность последующих трех участков становится одинаковой;
по-видимому отсутствие экзонуклеазной активности выравнивает паттерн представленности.
Регуляция экспрессии альфа-оперона E. coli в стрессовых условиях (минимальная среда) При росте E. coli на минимальной среде на ранней логарифмической стадии представленность начального участка цистрона S13 не такая большая, как для клеток, растущих на богатой среде, что может говорить о других механизмах регуляции (рис. 10Е).
При сравнении паттерна представленности цистронов альфа-оперона на нормальной и на минимальной средах заметно уменьшение представленности начальных участков цистронов S11 и S4 по сравнению с их концевыми участками (рис. 10Е). Возможно, что это отражает наличие рибосом, которые паузируют при терминации.
ВЫВОДЫ 1) Найдены существенные различия в организации генов рибосомных (р-) белков в геномах, а также в организации цистронов в оперонах р-белков ряда эубактерий: E. coli, V.
cholerae, S. Typhi, M. tuberculosis, S. aureus.
2) Идентифицированы 25 стабильных бактериальных коротких РНК (бкРНК), картированных на обоих тяжах оперонов р-белков (смысловых и антисмысловых), что расширяет возможности регуляции экспрессии.
3) Для лидерной области альфа- и L10-оперонов р-белков E. coli, найдены смысловые бкРНК, соответствующие районам псевдоузла и мотива «kink-turn», соответственно, которые участвуют в регуляции трансляции.
4) Методом ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) найдена повышенная представленность концевого участка цистрона EF-G, что указывает на наличие активного внутреннего промотора str-оперона E. coli.
5) Повышенная представленность межцистрона S12-S7 str-оперона E. coli определяется его предполагаемым участием в регуляции трансляции по типу обратной связи белком S7.
6) Изменение паттерна представленности цистронов альфа- и str-оперонов мутантного pnp штамма E. coli указывает на участие деградосом в определении уровня представленности различных участков str мРНК.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Khayrullina G.A., Raabe C.A., Hoe C.H., Becker K., Reinhardt R., Tang T.H., Rozhdestvensky T.S., Kopylov A.M. Transcription analysis and small non-protein coding RNAs associated with bacterial ribosomal protein operons. // Current Medicinal Chemistry. 2012. V. (30). Р. 5187-5198.
2. Головин А. В., Хайруллина Г. А., Крааль Б., Копылов А. М. Идентификация нового РНК-белкового контакта в комплексе р- белка S7 с 3'- концевым фрагментом 16S рРНК E.
coli. // Acta Naturae. 2012. Т. 4. № 4 (15). С. 18-25.
3. Kopylov A., Khairulina G., Rozhdestvensky T., Golovin A. Interface inhibitors of macromolecular interactions – ribosomal paradigm for creation of novel antibiotics. // Current Medicinal Chemistry. 2012. V.19. Р. 97.
4. Kopylov A., Khayrullina G., Raabe C., Tang T.H., Rozhdestvensky T., Golovin A.
Regulation of expression of bacterial str-operon through RNA structure and RNA-protein interactions. // FEBS Journal. From single molecule to system biology. Spain. Seville. 2012. V. (Suppl. 1). Р. 508.
5. Хайруллина Г.А., Копылов А.М. Разработка подходов к мультиплексному анализу стрептомициновых оперонов бактерий методом ПЦР в реальном времени. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Россия. Москва. 2012. Т. 14. №2 (Прил. 1).
С. 53-54.
6. Kopylov A., Khairullina G., Golovin.A., Tang T., Rozhdestvensky T. Regulation of expression of bacterial str-operon during ribosomal biogenesis. // The EMBO Meeting. France.
Nice. 2012. Р.4.
7. Kopylov A., Khairullina G., Yuminova A., Reshetnikov R., Zavyalova E., Golovin.A.
Nucleic acids – protein E.coli recognition: what we have learned from aptamers. // The EMBO Meeting. Austria. Vienna. 2011. Р.54.
8. Хайруллина Г.А. Метод анализа движения рибосом по матрице. // Материалы докладов XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ. Россия. Москва. 2011. С.1.
9. Хайруллина Г.А. Инверсия стабильности цистронов S7 и S12 в полицистронной мРНК стрептомицинового оперона. // Сборник тезисов 14 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Россия. Пущино. 2010.
Т. 2. С. 193-194.
10. Хайруллина Г.А. Инверсия стабильности цистронов S7 и S12 в полицистронной мРНК стрептомицинового оперона. // Материалы докладов XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ. Россия. Москва.
2010. С.1.
11. Хайруллина Г.А. Количественные параметры регуляции экспрессии стрептомицинового оперона. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ. Россия. Москва. 2009. С.1.
Хайруллина Г.А., Головин А.В., Спиридонова В.А. RT-PCR в исследованиях 12.
регуляции дифференцированной экспрессии генов стрептомицинового оперона. // Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы». Россия. Белгород. 2008. С. 163-164.