Получение и изучение рекомбинантных fab'–фрагментов антител к афлатоксинам
На правах рукописи
Калиниченко Артем Андреевич ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ FAB'–ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ К АФЛАТОКСИНАМ СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.01.04 – «Биохимия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2010 г.
Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории инженерии белка Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор Д.А. Долгих
Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор С.А. Еремин Кандидат биологических наук, С.В. Беневоленский
Ведущая организация: ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России
Защита состоится 25 марта 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, стр.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33 стр.
Автореферат разослан: 24 февраля 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.
Афлатоксины - группа токсичных веществ небелковой природы вторичных метаболитов грибов. Обнаруживаются при поражении грибами Aspergillus flavus и A. parasiticus семян злаковых и масличных культур, орехов, сухофруктов. Афлатоксины – гепатоканцерогены, и являются серьезной проблемой пищевой промышленности и сельского хозяйства во многих странах.
Токсичность различных типов афлатоксинов сильно различается. Афлатоксин В наиболее токсичный и часто встречающийся в пищевых продуктах и кормах отнесен к первой группе канцерогенов Международным Агентством по изучению Рака.
В настоящее время основным, наиболее простым и эффективным методом детекции афлатоксинов в пищевых продуктах и кормах является иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител. Высокая токсичность, небольшой размер молекул и незначительные структурные отличия между молекулами разных типов афлатоксинов затрудняют получение специфичных моноклональных антител к ним. В литературе имеется много работ, описывающих получение моноклональных антител к различным типам афлатоксинов с достаточно высокими значениями аффинности. Но большинство этих антител обладают и высокой кросс-реактивностью. Один из наиболее перспективных подходов изменения функциональных параметров антител состоит в использовании методов белковой инженерии. Существует несколько простых (замена моноклональных антител, направленная замена CDR-областей аминокислот с использованием мутагенеза) и более сложных (фаговый, рибосомный или клеточный дисплей) методов, применяемых в белковой инженерии антител. Однако, применение таких методов нецелесообразно без знаний о структуре генов антител и взаимодействия антител с афлатоксинами.
Таким образом, изучение структуры генов антител против различных афлатоксинов может открыть новые перспективы для модификации этих антител и создания новых, более совершенных и специфичных способов определения этих токсинов.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Целью данной работы было изучение панели моноклональных антител к афлатоксинам, и их экспрессия в виде Fab'-фрагментов.
В рамках поставленной цели были решены следующие задачи:
1. Тестирование моноклональных антител.
2. Выделение мРНК из отобранных клеток гибридом.
3. Обратная транскрипция и получение кДНК библиотек.
4. Амплификация вариабельных и константных участков легких и тяжелых цепей антител, определение их нуклеотидной последовательности. Анализ полученных данных.
5. Получение экспрессионных векторов, выделение и анализ рекомбинантных Fab-фрагментов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.
С помощью реакции обратной транскрипции получены, секвенированы и проанализированы гены вариабельных областей 10 моноклональных антител к трем различным афлатоксинам.
Получены экспрессионные вектора для генов антител. Показана возможность получения функционально активных рекомбинантных антител против афлатоксинов в виде Fab-фрагментов.
Впервые были секвенированы гены вариабельных областей моноклональных антител к афлатоксинам. Анализ генов показал высокую гомологию последовательностей легких цепей антител и позволил предположить, что аффинность к антигену преимущественно определяется структурой тяжелых цепей антител.
Полученные с помощью обратной транскрипции гены антител против афлатоксинов могут быть использованы для получения рекомбинантных антител с измененными параметрами аффинности и кросс-реактивности методами белковой инженерии и создания на их основе эффективных систем детекции.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Работа была представлена на международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008);
33-ем Конгрессе FEBS «Biochemistry of Cell Regulation» (Афины, Греция, 2008);
11-ом семинаре SAC ISTC “New Trends in Chemical (Москва, Россия, 2008);
21-ой школе молодых ученых Toxicology” «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2009);
34-м международном конгрессе FEBS «Life's molecular interactions» (Прага, Чехия, 2009).
ПУБЛИКАЦИИ.
По основным результатам диссертации опубликовано 7 работ, из них статьи в рецензируемых российских журналах и 5 тезисов в сборниках материалов российских и международных конференций.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.
Диссертационная работа изложена на 92 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и таблицами. Список литературы содержит 166 источников.
СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ АфлаТ – афлатоксины;
МА – моноклональные антитела;
БСА – бычий сывороточный альбумин;
CDR - complementary determining regions, – области, образующие антигенсвязывающий центр;
Fab-фрагмент – антиген, связывающий фрагмент антитела;
ИФА – иммуноферментный анализ;
ПЦР – полимеразная цепная реакция;
ФНО- фактор некроза опухолей- ;
ПААГ – – полиакриламидный гель.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение моноклональных антител против афлатоксинов В1, В2, G Иммунизация животных АфлаТ затруднена из-за их высокой токсичности и низкомолекулярной природы (Рис 1).
Рис. 1. Строение молекул различных АфлаТ и некоторых их метаболитов.
Конъюгирование с белковым носителем в значительной степени позволяет решить обе проблемы. Для иммунизации использовали конъюгаты трех токсинов (АфлаТ В1, АфлаТ В2, АфлаТ G2) с бычьим сывороточным альбумином.
Сыворотки мышей, иммунизированных АфлаТ, тестировали с помощью вариантов непрямого и конкурентного ИФА на наличие антител к АфлаТ. Связывание антигена с антителами сыворотки крови иммунизированных животных значительно превышало контрольные значения для неиммунизированных животных. При этом антитела сыворотки иммунизированных мышей связывают конъюгат АфлаТ-БСА более чем в 3 раза эффективнее, чем БСА. Титр сывороток иммунизированных животных составил около 1:10000 для соответствующих коньюгатов трех афлатоксинов АфлаТ B2, АфлаТ В1 и АфлаТ G2.
Конкурентный ИФА антител сывороток иммунизированных мышей подтвердил наличие антител, специфичных к АфлаТ В1, В2 и G2. Клетки подколенных лимфоузлов выделяли из мышей с наибольшим титром специфических антител в сыворотках и гибридизовали с клетками линии миеломы Sp2/0 по стандартной методике. После первичного скрининга не менее ста линий гибридом, полученных в результате иммунизации мышей каждым из конъюгатов, отбирали по 10-20 положительных клонов, секретирующих специфичные к АфлаТ антитела. Отобранные клетки дополнительно клонировали 3-4 раза методом лимитирующих разведений, контролируя продукцию ими антител. Отобранные клоны выращивали и вводили в брюшную полость мышей для получения асцитов.
Критерием отбора клонов было взаимодействие продуцируемых ими МА со свободными АфлаТ, коньюгатами АфлаТ-БСА и отсутствие связывания с БСА. В результате были получены и отобраны 10 гибридом, продуцирующих специфичные MA против АфлаТ В1 (К15.458, К15.200, К15.22, К15.727, К15.226), АфлаТ В2 (К33.1Е7, K33.3D2), АфлаТ G2 (К95.Е11, К95.D2, К95.В12). Все перечисленные МА были выделены из асцитных жидкостей мышей методом одностадийной аффинной хроматографии на белок G-сефарозе. По данным электрофоретического анализа в денатурирующем ПААГ было показано наличие высокоочищенных антител с молекулярной массой около 25 и 45 кДа, для легкой и тяжелой цепей соответственно (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма (12% SDS-ПААГ) аффинно-очищенных МА К33.3D2 против АфлаТ B2 (2);
1 – белковые маркеры молекулярной массы.
Изотипирование антител Анализ субизотипов MA против АфлаТ проводили методом прямого твердофазного ИФА с использованием диагностических антител против различных субизотипов мышиных антител. Из 10 отобранных антител половина содержит 1-изотип тяжелой цепи, четыре - 2a-изотип, и одно антитело - 2b.
Однозначные результаты по изотипированию легких цепей были получены только для 5 -легких цепей. Поэтому было решено подтвердить соответствие аминокислотной последовательности легких цепей МА и нуклеотидной последовательности их генов, полученных обратной транскрипцией на мРНК матрице, с помощью методов масс-спектрометрии, а также ПЦР-амплификации с использованием набора специфических праймеров. Для анализа легких цепей МА масс-спектрометрией они были разделены в 15% ПААГ в присутствии меркаптоэтанола. Полосы, соответствующие легким цепям всех антител, были вырезаны и подвергнуты гидролитическому расщеплению трипсином. Анализ смеси пептидов проводили на тандемном MALDI-MS/MS масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером. Анализ масс-спектров полученных фрагментов с помощью программы Mascot и идентификация белка методом сравнения с пептидными базами данных показали наличие пептидов, соответствующих последовательностям константных участков МА. Для пяти легких цепей МА K15.226, K15.727, K33.1E7, K33.3D2, K95.B12 была подтверждена принадлежность к - подклассу. В их спектрах были идентифицированы пептиды, соответствующие последовательности варибельного и константного доменов - легких цепей антител мышей (рис. 3).
K33 3D VTMSCKSSQSLLNSR NYLAWYQQKPGQSPKLLIYW LLIYW NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYW ASTR ASTRESGVPDR ASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSWTFGGGTK ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK QNGVLNS QNGVLNS LEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNS WTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK WTDQDSK DEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK WTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC Рис. 3. Последовательность аминокислот вариабельной и константной областей - легкой цепи МА (выделена черным цветом) и пептиды (выделены красным цветом), обнаруженные при MALDI-TOF масс-спектрометрическом анализе МА K33.3D2, производимыми клетками гибридом.
Для других пяти легких цепей антител K15.458, K15.200, K15.22, K95.D2, K95.E было установлено, что они относятся к - подклассу, поскольку в их спектрах обнаружены пептиды, соответствующие константному домену - легких цепей антител мышей.
Изотипическую принадлежность легких и тяжелых цепей исследуемой панели МА также определяли на основании результатов амплификации фрагментов генов. Получение генов вариабельных и константных областей МА проводилось с использованием пар праймеров, специфичных к разным изотипам легких и тяжелых цепей. Наличие продукта ПЦР лишь в одном из вариантов реакций с различными парами праймеров позволяет судить о изотипе МА. Кроме того, полученные таким образом гены вариабельных и константных областей МА были секвенированы. Окончательные результаты изотипирования представлены в таблице 1.
Таблица 1. Изотипы моноклональных антител, полученных против трех АфлаТ.* Иммуноген МА Тяжелые Легкие (тип AflaT) гибридомы цепи цепи 2a B1 K15. 1 K15. 1 K15. 2b K15. 1 K15. 1 B2 K33.1E 1 K33.3D 2a G2 K95.B 2a K95.D 2a K95.E *По результатам ИФА, масс-спектрометрии, ПЦР и анализа нуклеотидной последовательности для каждого МА.
Такая большая доля - легких цепей значительно отличается от типового распределения - и - подклассов мышиных антител (95% и 5%, соответственно).
Получение и анализ свойств Fab-фрагментов из природных МА путем гидролитического расщепления Одной из задач работы было получение рекомбинантных Fab-фрагментов и изучение их свойств. Исследование Fab-фрагментов целесообразно проводить на основании сравнительного анализа антигенсвязывающих свойств рекомбинантных моновалентных Fab-фрагментов, получаемых в бактериях, и их аналогов, образующихся в результате ферментативного гидролиза полноразмерных моноклональных антител.
Природные Fab-фрагменты всех MA исследуемой панели с чистотой не менее 80% (по данным электрофореза в денатурирующем ПААГ, рис. 4) были получены путем ограниченного протеолиза трипсином и последующим восстановлением дисульфидных связей 2-меркаптоэтиламином. Разработан метод тестирования их функциональной активности.
Рис. 4. Электрофореграмма (10 % SDS-ПААГ) Fab-фрагментов МА K33.3D против АфлаТ B2, полученных в результате протеолиза в невосстанавливающих условиях: 1 - маркеры молекулярной массы, 2 - K33.3D2 Fab, 3 - K33.3D2 F(ab)2, 4 - МА K33.3D2.
Для МА трех различных подклассов 1, 2а и 2b условия протеолиза (pH буфера, соотношение пепсин/MA и время реакции) оптимизировали индивидуально. Аффинность полученных Fab- и F(ab)2 –фрагментов изучали с помощью непрямого ИФА. МА и полученные из них F(ab)2- и Fab-фрагменты при их различной концентрации тестировали на связывание с соответствующим коньюгатом, к которому они получены. По результатам такого титрования было обнаружено, что аффинность МА и полученных из них F(ab)2- и Fab-фрагментов практически не отличается от аффинности исходных полноразмерных антител (рис. 5). Такая же закономерность обнаружена для всех исследуемых антител.
Рис. 5. Непрямой ИФА. Тестирование исходных МА K33.3D2 (1) и полученных из них F(ab)2- (2) и Fab-фрагментов (3) на связывание с коньюгатом АфлаТ В2-БСА.
Это свидетельствует о сохранении функциональных свойств, полученных F(ab)2- и Fab-фрагментов, что позволяет использовать их в качестве контроля для сравнения аффинности рекомбинантных Fab-фрагментов.
Амплификация кДНК вариабельных и константных доменов моноклональных антител Для получения вариабельных и константных доменов МА из клеток соответствующих линий гибридом была выделена суммарная мРНК, проведена обратная транскрипция и получены кДНК-библиотеки. Используя кДНК библиотеку гибридомы в качестве матрицы, с помощью ПЦР в несколько стадий были амплифицированы кДНК вариабельных и константных доменов МА. При амплификации кДНК тяжелых и легких цепей антитела использовали набор ген специфичных праймеров, комплементарных областям константных доменов различных подклассов МА. При этом ПЦР-фрагменты необходимой длины (550 600 п.о. для фрагментов легких, и 600-650 п.о. для фрагментов тяжелых цепей антитела) (рис. 6) обнаруживались только в реакционной смеси, содержащей праймеры, соответствующие изотипу МА, установленному с помощью ИФА (табл.
1).
Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификаций вариабельных областей легких и тяжелых цепей антитела К33. 3D2 (1% агарозный гель). 1, 4 – маркеры молекулярной массы. Амплификация с праймерами для генов легких цепей - (2) и - (3), для генов подклассов тяжелых цепей 2a (5), 1 (6) и 2b (7).
Амплификация вариабельных и константных участков генов МА и дальнейший анализ их нуклеотидной последовательности подтвердили достоверность результатов проведенного ранее изотипирования. В случае амплификации кДНК легких цепей некоторых МА наблюдали появление транскрипта, так называемой аберрантной -легкой цепи антитела. Наличие такого аберрантного транскрипта легкой цепи с коротким константным доменом объясняется присутствием соответствующего гена в клетках миеломной линии Sp 2/0. Применение конкурентной ПЦР помогло избежать ко-амплификации этой последовательности из кДНК-библиотек, быстро и эффективно получить необходимые гены, кодирующие вариабельные домены МА. Анализ нуклеотидной последовательности вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей МА подтвердил результаты проведенного с помощью ИФА изотипирования.
Аминокислотные последовательности, соответствующие нуклеотидным, были картированы для определения гипервариабельных участков (CDR) варибельных областей. Выяснилось, что 4 из 5 - легких цепей и 3 из 5 - легких цепей полностью совпадают по аминокислотной последовательности (рис. 7).
Рисунок 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных участков генов легких цепей антител. Необходимые для построения разрывы отмечены «-».
Легкая цепь антитела В12 имеет наибольшие различие в аминокислотном составе CDR– участков по отношению к другим - легким цепям. В то же время, легкие цепи антител Е11 и D2 имеют лишь по одной аминокислотной замене в каждом CDR– участке, по сравнению с другими - легкими цепями. Были обнаружены также аминокислотные остатки, консервативные для - и - легких цепей. Так, в первом CDR– участке обоих подклассов легких цепей во 2-ом, 3-м и 10-ом положении находится серин. В CDR–2 в 5-ом положении - аргинин, а в CDR–3 в 5 ом положении - серин.
Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей фрагментов вариабельных участков генов тяжелых цепей антител показал, что некоторые из них имеют определенный уровень гомологии, однако все три CDR – участка тяжелых цепей отличаются аминокислотным составом (рис. 8).
Рисунок 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных участков генов тяжелых цепей антител. Необходимые для построения разрывы отмечены «-».
Таким образом, несколько антител, имеющих различные параметры аффинности и кросс-реактивности, содержат одну легкую цепь. Это может говорить о том, что эти параметры определяются разными тяжелыми цепями в их составе, а точнее различием в антигенсвязывающем центре, образуемым ими с легкой цепью. Можно также предположить, что легкие цепи в составе антител выполняют каркасную функцию, стабилизируя трехмерную структуру антигенсвязывающего центра.
Получение плазмидных конструкций для экспрессии рекомбинантных антител Для получения экспрессионных конструкций нуклеотидные последовательности фрагментов вариабельных и константных участков МА были амплифицированы и объединены методом ПЦР с перекрывающимися областями (SOE-PCR). При этом сохранена изотипическая принадлежность генов иммуноглобулинов – для каждого антитела получали ген константной области из библиотек кДНК. Гены Fab фрагментов МА были клонированы в экспрессионный вектор pTrc в виде бицистронной конструкции. Для упрощения процесса выделения Fab-фрагментов перед легкой и тяжелой цепью (на 5’-конце) в этих конструкциях вставлены последовательности, кодирующие лидерный пептид stII термостабильного энтеротоксина II E.coli, для секреторной экспрессии целевого белка в культуральную среду. Для последующей очистки белков с использованием метал аффинной хроматографии на 3’-конец генов тяжелых цепей помещена синтетическая последовательность, кодирующая додекагистидиновый таг. По данной схеме в экспрессионный вектор были клонированы гены пяти МА:
К15.458, К15.200, К15.226, К33.1Е7, K33.3D2 (рис. 9).
(а) XhoI pTrc-stIILH 12His [NcoI] NdeI NdeI HindIII BamHI Trc term 12xHis SD stII L stII H (б) Рисунок 9. Схемы бицистронной конструкции для экспрессии генов Fab фрагментов антител (а) и вектора pTrcLH12His, содержащего VC-фрагменты генов легкой (VCL) и тяжелой цепей (VCH) пяти МА: К15.458, К15.200, К15.226, К33.1Е7, K33.3D2 (б).
Биосинтез и выделение рекомбинантных Fab – фрагментов МА В результате проведенных ранее исследований было показано, что наибольший уровень продукции Fab-фрагментов различных МА при их секреции в культуральную жидкость наблюдается в клетках E. coli BL-21 (DE3), поэтому данный штамм был выбран для проверки экспрессии полученных конструкций.
Проведены индукция и культивирование при трех различных температурах (23°С, 37°С) в небольших объемах. Результаты дот-блот-гибридизации 30°С, свидетельствуют о том, что наибольшее количество рекомбинантного Fab фрагмента обнаруживается в культуральной жидкости при температуре инкубации 30°С (рис. 10 а). Больший выход рекомбинантных Fab – фрагментов при температуре 30°С может быть связан с замедлением биосинтеза белка клетками E.
coli, что важно для сворачивания белка и образования необходимой трехмерной структуры Fab – фрагментов. Это и приводит к повышению выхода полноценных, функционально активных Fab – фрагментов антител.
Рис. 10. Результаты дот-блот анализа накопления Fab-фрагмента МА К33.3D2 в культуральной жидкости клеток E. coli BL-21 (DE3). (а) – нетрансформированные клетки (1);
клетки, трансформированные плазмидой, содержащей легкую цепь Fab-фрагмента (2);
клетки, трансформированные плазмидой pTrcLH12His при 23°С (3, 4), 30°С (5, 6), 37°С (7, 8) (по данным двух независимых экспериментов). Контроль наличия Fab-фрагмента МА К33.3D2 при его очистке и выделении из культуральной жидкости клеток E. coli BL-21 (DE3).
(б) - Культуральная жидкость клеток, трансформированных плазмидой pTrcLH12His, до центрифугирования (1);
супернатант культуральной жидкости после центрифугирования (2);
культуральная жидкость нетрансформированных клеток (3), культуральная жидкость клеток, трансформированных плазмидой с легкой цепью Fab-фрагмента (4);
культуры клеток, продуцирующих Fab фрагменты антител против ФНО (5, 10);
сконцентрированная культуральная жидкость (6);
жидкость, удаленная при концентрировании (7);
диализованный концентрат культуральной жидкости (8);
буфер после диализа (9). (в) Электрофореграмма (12 % SDS-ПААГ) аффинно-очищенного Fab-фрагмента антитела K33 3D2 (2 – в буфере с меркаптоэтанолом, 3 – без меркаптоэтанола);
1 маркеры молекулярной массы.
Экспрессию рекомбинантных Fab-фрагментов проводили при температуре 30°С, после чего культуры центрифугировали, а супернатанты концентрировали в 50 раз. Причем при очистке Fab-фрагментов, содержащих - легкие цепи, на стадии концентрирования добавляли детергент Tween-20 до концентрации 0.05%.
Процесс выделения контролировали дот-блот-гибридизацией аликвот раствора белка, отобранных после каждой стадии очистки (рис. 10 б). Для очистки рекомбинантных Fab-фрагментов использовали аффинную хроматографию на Со2+ИДА-сефарозе. В случае с Fab-фрагментами, содержащими - легкие цепи, данный этап очистки так же проводился в присутствии 0.05% Tween-20. По данным электрофоретического анализа в денатурирующем ПААГ получены высокоочищенные Fab-фрагменты с молекулярными массами легких и тяжелых цепей около 25 кДа (рис. 10 в). Таким образом, продемонстрировано, что разработанный метод наработки, выделения и очистки позволяет получать рекомбинантные Fab-фрагменты для анализа их функциональной активности (аффинность и кросс-реактивность) (рис. 11).
Рис.11. Очистка рекомбинантных Fab-фрагментов с помощью аффинной хроматографии: МА К15.3D2 с – легкой цепью (а), МА К15.458 с – легкой цепью (б). 1 – маркеры молекулярной массы, 2 – образцы, нанесенные в буфере, содержащем - меркаптоэтанол, 3 - образцы, нанесенные в буфере без меркаптоэтанола.
Масс-спектрометрический анализ соответствующих полос на электрофореграмме подтвердил наличие в них аминокислотных последовательностей легких и тяжелых цепей рекомбинантных Fab-фрагментов.
Кроме того, было выявлено, что Fab-фрагменты, содержащие – легкие цепи, совыделяются с бактериальным шапероном GroEL. Выход белка для Fab фрагментов с – и - легкими цепями различается и составляет 0.1-1 мг и 1.5 мг с одного литра культуры, соответственно. Такой сильный разброс можно, по видимому, объяснить существенными различиями в сворачивании - и – легких цепей. Для последних, вероятно, необходимо присутствие шаперонов для осуществления правильного фолдинга и образования функционально активного комплекса с тяжелой цепью. Процесс сборки Fab-фрагментов, состоящих из – легкой и тяжелой цепей, в этом случае затруднен, что является причиной уменьшения выхода белка при экспрессии в культуральную жидкость.
Определение аффинности и кросс-реактивности МА и Fab фрагментов Данные непрямого ИФА показали, что кривые титрования МА (зависимости степени связывания с антигеном от концентрации МА) имеют традиционную сигмоидную форму. Антитела имеют высокую аффинность к коньюгатам АфлаТ-БСА, значения констант диссоциации находятся в диапазоне от 10-9-10-7 М. Методом конкурентного ИФА показана способность МА связывать свободные АфлаТ. Для каждого из МА исследовали связывание с четырьмя типами АфлаТ (B1, B2, G1, G2) как в свободном виде, так и в составе конъюгатов с БСА (табл. 2).
Таблица 2. Сравнительная характеристика аффинности и кросс-реактивности полученных МА против трех различных АфлаТ.* Афлатоксины Иммуноген МА B1 B2 G1 G Афлатоксин нд K15.200 ++ + нд B1 K15.22 +++ ++ нд K15.458 +++ ++ нд K15.727 - + нд K15.226 ++ + K33.1E7 - ++ +++ Афлатоксин B K33.3D2 ++++ ++++ +++ +++ K95.B12 - + + Афлатоксин K95.D2 + + ++ G K95.E11 ++ +++ +++ *нд- нет данных, прочерк – отсутствие связывания, количество знаков (+) отражает аффинность МА по отношению к соответствующему антигену, по данным непрямого, твердофазного и конкурентного ИФА Два МА (К33.3D2 и К33.1Е7), полученные против АфлаТ B2, обладают наибольшей аффинностью. Они способны связывать как свободные АфлаТ, так и конъюгаты АфлаТ-БСА с высоким сродством, однако их специфичность по отношению к АфлаТ значительно различается. МА К33.3D2 взаимодействует с АфлаТ всех четырех типов примерно с одинаковой силой связывания, тогда как МА К33.1Е7 характеризуется большей селективностью, т.к. взаимодействует только с АфлаТ B1 и B2, проявляя при этом высокое сродство к ним. Аффинность МА серии К15 значительно различается. Все они связываются с АфлаТ B1, против которого были получены, проявляя меньшее сродство к АфлаТ G1. МА серии К (иммуноген – АфлаТ G2-БСА) связываются в различной степени с АфлаТ G1, G2 и B1. При этом ни одно из них не связывается с АфлаТ B2, а наименее аффинное по отношению к АфлаТ G2 (К95.В12) не связывается и с АфлаТ G1. Наименьшими показателями аффинности обладают МА К15.727 и К95.В12. При этом К15. связывается только с АфлаТ В1, а К95.В12 - с B1 и G2. Из приведенных данных следует, что полученные МА обладают широким спектром показателей аффинности и кросс-реактивности, что очень важно для их дальнейшего использования. Так, МА К33.3D2, связывающее четыре типа АфлатТ с высоким сродством, может быть использовано для тест систем и эффективного суммарного определения АфлаТ, а МА К33.1Е7, обладающее высоким сродством к АфлаТ В2, для специфичного определения данного токсина.
Для восьми полученных путем протеолиза трипсином Fab-фрагментов на основе результатов конкурентного ИФА были рассчитаны константы связывания с четырьмя типами АфлаТ. Для измерения аффинности использовали метод иммуноферментного анализа. В качестве антигенов использовали свободные афлатоксины B1, B2, G1, G2. Для этого строили калибровочные кривые зависимости оптической плотности от концентрации Fab/- фрагментов. На рис. а приведена калибровочная кривая для Fab/- фрагмента МА К15.458. Для ее построения использовали диапазон концентраций от 1000 нг/мл до 50 нг/мл. При этом удалось выбрать диапазон концентраций, при котором зависимость оптической плотности OD 450 нм от разведения К15.458 Fab/ - фрагмента имеет практически линейный вид, что позволяет использовать упрощенный метод для расчета Кд.
Рис. 12. Калибровочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации Fab/- фрагментов МА К15.458, непрямой ИФА (а). Кривые Клотца для связывания Fab/-фрагментов МА К15.458 с АфлаТ B1 (б), B2 (в), G1 (г), G2 (д).
Константу диссоциации (Кд) рассчитывали по уравнению Клотца: Ао/Ао А1+1/а Кд, где Ао – оптическая плотность, измеренная для Fab/ в отсутствии антигена, А оптическая плотность, измеренная для свободных Fab/ в смеси антиген-антитело, а- концентрация антигена. Концентрацию Fab/ для измерения Кд выбирали на линейном участке калибровочной кривой. Кривые Клотца для связывания Fab/-фрагментов МА К15.458 с АфлаТ B1, B2, G1, G2 приведены на рис.
12 б, в, г и д. Константы диссоциации для других семи Fab/-фрагментов были рассчитаны аналогичным образом и приведены в таблице 3 а.
Таблица 3. Аффинность полученных гидролитическим расщеплением трипсином Fab-фрагментов МА.* А. Константы диссоциации Kд, М АфлаТ B1 АфлаТ B2 АфлаТ G1 АфлаТ G / Fab К15.200 8,3 х10 2,4 х10 2,4 х10 6,5 х10- -9 -8 - К15.22 3 х10-9 6,6 х10-8 1,2 х10-8 4,4 х10- К15.458 4,7 х10-9 1,8 х10-7 2,8 х10-8 8,3 х10- К15.727 1,6 х10-7 2,1 х10-7 3 х10-7 1,1 х10- К33.1E7 1,7 х10-7 4,5 х10-8 1,8 х10-6 6 х10- К33.3D2 6 х10-9 2,3 х10-8 2,9 х10- 1 x 10- К95.D2 6,3 х10-8 6,3 х10-8 9 х10-9 4,5 х10- К95.E11 2,5 х10-5 5,8 х10-6 7,5 х10-8 7 х10- К95.В12 9,0 х10-6 7,8 х10-6 5,5 х10-6 3,5 х10- *Приведены значения констант диссоциации (М).
Б. Относительное значение аффинности (минимальная Кд принята за 1, остальные рассчитаны относительно нее) Kд, М АфлаТ B1 АфлаТ B2 АфлаТ G1 АфлаТ G / Fab К15.200 2771 958 958 К15.22 7667 348 1917 К15.458 4894 128 821 К15.727 144 110 77 К33.1E7 135 511 13 К33.3D2 2300 3833 1000 К95. D2 365 365 2556 К95. E11 1 4 307 К95. В12 3 3 4 В. Связывание с четырьмя типами АфлаТ Кросс-реактивность, % АфлаТ B1 АфлаТ B2 АфлаТ G1 АфлаТ G / Fab К15.200 100 35 35 К15.22 100 5 25 К15.458 100 3 17 К15.727 100 46 53 К33.1E7 26 100 3 К33.3D2 60 100 26 К95. D2 7 7 50 К95. E11 0 1 100 К95. В12 43 43 57 Критерием аффинности для Fab-фрагментов являлись значения констант диссоциации, а кросс-реактивность по отношению к четырем АфлаТ рассчитывалась по значениям Кд в % от максимальной.
Как видно из таблицы, Кд Fab-фрагментов МА варьируют в достаточно широком диапазоне от 2.5 х 10-5 М до 3.0 х 10-9 М. При этом сохраняется специфичность полученных Fab-фрагментов, поскольку их аффинность к АфлаТ, который входил в состав конъюгата при иммунизации, выше, чем к другим типам.
Так, Fab-фрагменты серии К15, полученные против коньюгата БСА-АфлаТ В1, имеют большую аффинность к свободному АфлаТ В1, чем к АфлаТ B2, G1, G2.
Аналогичным образом МА серий К33 и К95 проявляют наибольшую аффинность к свободным АфлаТ B2 и G1, соответственно. Таким же способом рассчитаны константы диссоциации для полученных в бактериальной системе экспрессии рекомбинантных Fab-фрагментов. Их константы диссоциации совпадают с таковыми для Fab-фрагментов МА. Кд к четырем АфлаТ для рекомбинантных Fab-фрагментов 3D2 и 458 представлены в таблице 4.
Таблица 4. Сравнение констант диссоциации рекомбинантных Fab'-фрагментов К33.3D2 и К15.458 с полученными гидролитическим расщеплением.
Kд, М АфлаТ B1 АфлаТ B2 АфлаТ G1 АфлаТ G / Fab К33.3D2 1,15 х10 2,1 х10 4 х10 4,5 х10- -8 -8 - Рекомбинантный 3D2 1,6 х10-8 3 х10-8 4,5 х10- 1,1 x 10- К15.458 4,4 х 10-9 2 х 10-7 3 х 10-8 8,5 х 10- Рекомбинантный 458 5 х 10-9 5,2 х 10-7 3,5 х 10-8 8,3 х 10- Как видно из таблицы, Кд практически совпадают (идентичны) для четырех афлатоксинов, что указывает на идентичность аминокислотных последовательностей, характера фолдинга и функциональных свойств рекомбинантных белков и Fab'-фрагментов, полученных из МА. Кд по отношению к АфлаТ В2 в 2-3 раза ниже, чем рассчитанная ранее, что, скорее всего, связано с деградацией АфлаТ В2 при хранении. Таким образом, были получены функционально активные рекомбинантные сохраняющие Fab-фрагменты, аффинность и специфичность по отношению к свободным АфлаТ.
ВЫВОДЫ Впервые получены гены панели из 10 моноклональных антител к 1.
афлатоксинам B1, B2, G2, определена их нуклеотидная последовательность, картированы гипервариабельные участки вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антител.
Обнаружено необычное для мышей соотношение подклассов легких 2.
цепей - половина антител содержат легкие цепи лямбда подкласса.
Показано ограниченное разнообразие легких цепей антител, как каппа, 3.
так и лямбда подклассов. Это позволяет предположить, что основную роль в формирование аффинности по отношению к гаптену вносят тяжелые цепи полученных антител.
Разработан метод экспрессии и очистки функционально активных 4.
рекомбинантных антител к афлатоксинам в виде Fab-фрагментов.
Показано, что полученные рекомбинантные Fab-фрагменты обладают 5.
аффинностью и кросс-реактивностью, не уступающими по значениям исходным моноклональным антителам.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах Калиниченко А.А., Топорова В.А., Панина А.А., Алиев Т.К., Крюкова 1.
Е.А., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Позднякова Л.П., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. (2010) Получение антител против афлатоксинов различных типов и их свойства. Биоорганическая Химия (Москва). 36(1) с. 122- Калиниченко А.А., Топорова В.А., Панина А.А., Алиев Т.К., Крюкова 2.
Е.А., Позднякова Л.П., Свешников П.Г., Долгих Д.А. (2010) Особенности экспрессии рекомбинантных Fab'-фрагментов антител к афлатоксинам.
Естественные и технические науки (Москва). 45(1) с. 138- Тезисы конференций Калиниченко А.А., Топорова В.А., Панина А.А., Алиев Т.К., Крюкова 1.
Е.А., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Изучение структуры антител против афлатоксинов. Тезисы докладов Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», с. 232-233 (Гурзуф, 31 мая - 9 июня 2008 г.) 2. Kalinichenko A.A., Panina A.A., Aliev T.K., Shemchukova O.B., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Structure of the antibodies against aflatoxins. FEBS Journal V. 275 (1), p. 406 (Abstracts of 33d FEBS Congress, Athens, 28 June – 4 July 2008) 3. Dolgikh D.A., Aliev T.K., Panina A.A., Kalinichenko A.A., Toporova V.A., Kryukova E.A., Shemchukova O.B., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Quemeneur E., Raoul H., Kirpichnikov M.P. Immunological detection of aflatoxins: functional and genetic analysis of monoclonal antibodies. 11th SAC Seminar “New Trends in Chemical Toxicology”, p. 59 (Moscow, 22-25 September 2008) Калиниченко А.А., Топорова В.А., Панина А.А., Алиев Т.К., Крюкова 4.
Е.А., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Структурные особенности антител к афлатоксинам. Тезисы докладов 21-й школы молодых ученых «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», с. 9 (Москва, 9 – 11 февраля 2009 г.) 5. Kalinichenko A.A., Dolgikh D.A., Aliev T.K., Panina A.A., Toporova V.A., Kryukova E.A., Shemchukova O.B., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Quemeneur E., Raoul H., Kirpichnikov M.P. The influence of chain shuffling on the properties of anti aflatoxin antibodies. FEBS Journal 276 (1), p. 371 (Abstracts of 34th FEBS Congress Prague, 2-9 July 2009)