Высокотехнологичные методы определения метилирования днк
На правах рукописи
ПЕХОВ ВАСИЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК 03.01.03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2011
Работа выполнена в лаборатории геномики и эпигеномики позвоночных Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН.
Научный консультант:
кандидат биологических наук Прохорчук Егор Борисович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Брага Элеонора Александровна ФГУП «ГосНИИгенетика» доктор биологических наук, Лагарькова Мария Андреевна Институт общей генетики РАН
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН
Защита диссертации состоится «» февраля 2011 г. в _ на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».
Автореферат разослан «» декабря 2010 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Воюшина Татьяна Львовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Метилирование ДНК – эпигенетический механизм, обнаруженный в геномах как прокариот, так и эукариот. Нарушения метилирования ДНК могут приводить к геномной нестабильности и нарушенной экспрессии генов. Подобные изменения в половых клетках или на ранних этапах онтогенеза способны вызвать фатальные нарушения развития. За последние четверть века многократно показано, что в раковых клетках нарушено метилирование ДНК. При этом наблюдается гипометилирование повторяющихся элементов, что приводит к нестабильности генома. Другие участки, например, CpG-островки промоторов генов-супрессоров опухолевого роста, напротив, гиперметилируются, способствуя быстрому росту раковых клеток. Кроме того, недавно установлена роль ДНК-метилирования в развитии неврологических и ряда других заболеваний, её зависимость от факторов внешней среды. В этой связи в научной и клинической практике применяется большое число методик, направленных на определение метилирования как отдельных последовательностей ДНК или конкретных CpG-динуклеотидов, так и всего генома с нуклеотидным разрешением (метилома).
В основе многих методов определения метилирования лежит обработка ДНК бисульфитом натрия, в результате которой неметилированный цитозин превращается в урацил, а 5-метилцитозин остается неизменным. Бисульфитная обработка предоставляет возможность определить степень метилирования отдельных CpG-динуклеотидов, однако, эти методы остаются трудоемкими и дорогими. После бисульфитной конвертации последовательности ДНК, по-сути, состоят из трех типов оснований, что усложняет обработку результатов. Методы другой группы, основанные на применении метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции, также имеют серьезное ограничение, т.к. зависят от наличия специфических сайтов рестрикции в анализируемой ДНК. Поэтому разработка новых информативных и достоверных методов определения метилирования ДНК остается актуальной задачей.
Сегодня все более широкое применение находят методы обогащения ДНК метилированными фракциями, что достигается путем взаимодействия с ДНК специфических белков, обладающих сродством к метилированным последовательностям. При некоторых недостатках, такой подход, тем не менее, позволяет значительно сократить объем и стоимость исследования, облегчить обработку результатов. Для связывания метилированной ДНК обычно используют антитела к 5-метилцитозину или MBD домен (methyl-CpG-binding domain) метил-ДНК связывающего белка MBD2, принадлежащего к семейству MBD - белков. Однако, известно еще одно семейство метил-ДНК-связывающих белков, включающее Каизо и Каизо-подобные белки. Поскольку эффективность связывания метилированных последовательностей белками MBD2 и Каизо различна - MBD2 обладает сродством к одиночным метилированным CpG, а Каизо – преимущественно к CpGpCpG-тетрануклеотидам - представляет интерес сравнить их с точки зрения использования для определения уровня и участков метилирования ДНК.
Белок Каизо принадлежит к семейству Каизо, которое выделяется по трем характеристикам: 1) способности связывать метилированную ДНК;
2) наличию BTB/POZ домена и 3) наличию нескольких доменов «цинковые пальцы». Три домена «цинковые пальцы» Каизо определяют его уникальные ДНК связывающие свойства: во-первых, Каизо является метил-ДНК-связывающим белком, а, во-вторых, при определенных условиях в системе in vitro может связывать неметилированную специфическую последовательность CTGCNA.
Однако, вопрос о том, какая из этих двух активностей преобладает in vivo, остается спорным. При этом внесение ясности в эту проблему интересно как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения, т.к. определит возможность применения Каизо для определения метилирования ДНК.
Цель и задачи исследования:
Цель данной работы состоит в получении и характеристике аффинного сорбента на основе домена «цинковые пальцы» белка Каизо и применении его для определения метилирования ДНК.
В связи с указанной целью были поставлены следующие задачи:
1. Создать сорбент на основе доменов «цинковые пальцы» белка Каизо и описать его свойства в сравнении с метил-ДНК связывающим сорбентом на основе белка MBD2.
2. Применить сорбенты Каизо и MBD2 для сравнительного поиска метилированных участков эукариотического генома (на примере клеточной линии HEK 293).
3. Определить, какая из двух активностей Каизо – метил-ДНК связывающая или CTGCNA-связывающая – является доминирующей.
4. Применить сорбент Каизо для поиска метилированных участков прокариотического генома (на примере бактерии Helicobacter pylori).
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые создан аффинный сорбент на основе доменов цинковые пальцы метил-ДНК связывающего белка Каизо. Сорбент Каизо обладает аффинностью к метилированной ДНК;
это свойство может быть использовано для анализа метилирования ДНК. Для сорбента Каизо характерна высокая специфичность в отношении метилированных CG-богатых последовательностей генома – метилированных CpG-островков и промоторов генов. Это свойство отличает сорбент Каизо от сорбента MBD2, который обладает более широкой специфичностью, связывая последовательности с разным CG-составом и уровнем метилирования.
В работе показано, что in vitro Каизо обладает более высокой аффинностью к метилированной ДНК, чем к неметилированной последовательности CTGCNA.
Этот вывод, помимо фундаментального, имеет важное практическое значение, которое заключается в том, что сорбент Каизо позволяет получать фракции ДНК, обогащенные именно метилированными последовательностями.
Сорбент Каизо может быть использован как для анализа метилирования отдельных последовательностей ДНК, так и целых геномов, в т.ч. при раковой трансформации. При этом, благодаря повышенной аффинности к CG-богатым последовательностям, сорбент Каизо представляется более предпочтительным, чем сорбент MBD2, для анализа метилирования раковых клеток, т.к. позволяет с высокой специфичностью обнаруживать гиперметилированные CpG-островки.
Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» от 1 декабря 2010 г. Результаты настоящей работы доложены автором диссертации на 13 Международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2009 г.), 14 Международной школе конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2010 г.), Международной конференции «Epigenetics Europe» (Дублин, 2010 г.), III Всероссийской школе-семинаре молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на отечественных и международных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка публикаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и содержат _таблиц и _ рисунков. Список литературы включает_ источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Создание аффинных сорбентов.
Первая часть данной работы посвящена получению и характеристике сорбента на основе метил-ДНК-связывающих доменов «цинковые пальцы» белка Каизо. Для сравнения и контроля был использован сорбент на основе домена MBD, обладающий аффинностью к метилированным последовательностям (Rauch et al, 2005;
Serre et al, 2010;
Li et al, 2010), а также сорбент на основе домена CXXC белка CGBP, способный связываться с неметилированными CpG динуклеотидами (Lee et al, 2001). Для получения сорбентов были использованы экспрессионные конструкции, содержащие:
1. Фрагмент гена Каизо мыши, включающий последовательность доменов «цинковые пальцы» (аминокислотные остатки 344 – 638) в векторе pGEX4T-1.
2. Фрагмент гена MBD2 человека, включающий последовательность домена MBD (аминокислотные остатки 150 – 411) в векторе pGEX4T-1.
3. Фрагмент гена CGBP мыши, включающий последовательность домена CXXC (аминокислотные остатки 113 – 254) в векторе рЕТ23а.
Для очистки экспрессированных химерных белков, содержащих GST (у Каизо и MBD2) или 6 гистидиновых остатков (у CGBP) была проведена аффинная хроматография с использованием глутатион-сефарозы (GE Healthcare, UK) или Ni-агарозы (Qiagen), соответственно. В результате были получены три вида сорбентов: сефароза – GST – Каизо (сорбент Каизо), сефароза – GST – MBD (сорбент MBD2) и агароза – 6His – CGBP (сорбент CGBP) (рис. 1).
Рисунок 1. ДДСН-ПААГ-электрофорез экспрессированных белков: А.GST-Каизо;
Б. GST MBD2;
В. CGBP-6His. 10% (А.Б) или 12% (В) ПААГ. Окрашивание – Coomassie R250. М – маркер, 1 – культура до индукции, 2 – осадок клеток до очистки, 3 – очищенный химерный белок, аффинно-связанный с сорбентом (обозначен стрелкой).
2. Характеристика аффинных сорбентов.
2-1. Связывание сорбентами коротких фрагментов ДНК.
Для проверки ДНК-связывающих свойств полученных сорбентов были проведены опыты по связыванию ими коротких метилированных и неметилированных фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК были получены из плазмиды pUC18, содержащей CG-богатую вставку (CG11) (Meehan et al, 1989) путем вырезания соответсвующими эндонуклеазами рестрикции (рис.2).
Связывание ДНК сорбентами проводили в буфере для связывания, содержащим 0,1М KCl, после чего элюировали ДНК буферами с возрастающей концентрацией соли. Чем эффективнее взаимодействие между ДНК и белком, тем более высокая концентрация соли требуется для разрушения взаимодействия. Это свойство было использовано для оценки эффективности связывания метилированной и неметилированной ДНК с сорбентами. Элюированные с сорбентов фрагменты ДНК разделяли в ДНК-электрофорезе и анализировали с помощью Саузерн-блот гибридизации.
Рисунок 2. Схема получения фрагментов ДНК.
Неметилированный фрагмент (M-, 416 н.п.) получен обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции PvuII. Метилированный фрагмент (М+, 238 н.п.) получен обработкой in vitro метилированной плазмиды эндонуклеазами EcoRI и PvuII. Числами обозначены позиции сайтов рестрикции в векторе pUC со вставкой CG11.
При работе с сорбентом Каизо фракция ДНК, не связавшейся с сорбентом (0,1М KCl), была обогащена неметилированным фрагментом (рис.3).
Неметилированный фрагмент элюировался с сорбента при низкой соли (0,2-0,5М) без выраженного пика. Для метилированного фрагмента был показан пик элюции, приходящийся на фракцию 0,7М KCl, а низкосолевые фракции были обеднены метилированным фрагментом (рис.3). Для сорбента MBD2 было показано, что метилированный фрагмент начинает элюироваться при более высокой соли (0,9М KCl), чем неметилированный (0,3-0,5М KCl) (рис.4). Данные, полученные для сорбента MBD2, полностью соответствовали опубликованным ранее (Rauch et al, 2005). Сорбент CGBP, полученный на основе домена СххС белка CGBP, обладающего сродством к неметилированным CpG-динуклеотидам, связывается с неметилироваными фрагментами, которые элюируются при 0,5-0,6М KCl.
Таким образом, сорбент Каизо, подобно сорбенту на основе домена MBD, обладает большей аффинностью к метилированным фрагментам CG11, чем к неметилированным. Сорбент CGBP, напротив, обладает сродством к неметилированным фрагментам.
Рисунок 3. Связывание сорбентом Каизо фрагментов ДНК. А.Саузерн-блот (зонд - 32Р меченные М+ и М- фрагменты). Б. График элюции фрагментов ДНК (значения получены оцифровкой Саузерн-блота и нормализацией на фракцию ДНК до связывания (1/5 исходного количества ДНК, использованной для связывания)). М- неметилированный фрагмент, 416 н.п.
М+ метилированный фрагмент, 238 н.п.
2-1. Связывание сорбентами геномной ДНК.
Далее было необходимо проверить эффективность связывания полученными сорбентами геномной ДНК. Для этого была использована геномная ДНК из клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека colo (АТСС № CCL-220.1™). Для определения способности связывать метилированную ДНК сорбентами Каизо и MBD2 были выбраны два участка Рисунок 4. Связывание сорбентом MBD2 метилированных фрагментов ДНК. Представлен график элюции фрагментов ДНК (получен так же, как и для сорбента Каизо). М неметилированные фрагменты, М+ метилированные фрагменты.
ДНК, CG-богатые, но с разным уровнем метилирования. Известно, что CpG островок промотора гена р16 CDKN2А гиперметилирован в клеточной линии colo320 (Пехов, 2009);
участок CpG-островка этого гена был использован в качестве метилированной последовательности. Промотор повсеместно экспрессирующегося гена домашнего хозяйства -актина был выбран в качестве неметилированной CG-богатой последовательности. Кроме этого, была определена эффективность связывания сорбентом Каизо последовательности CTGCNA (Каизо Связывающий Сайт;
КСС);
для этого был выбран промотор гена матрилизина (MMP-7), содержащий КСС. После связывания ДНК сорбентами проводили элюцию буферами с возрастающей концентрацией соли. Для определения копийности последовательностей в элюированной ДНК была использована количественная ПЦР в реальном времени. Для каждого гена (р16, актин, матрилизин) была построена калибровочная кривая. Рассчитанная на ее основе копийность была нормализована на содержание ДНК в каждой фракции.
Таким образом, было установлено относительное обогащение каждой фракции по той или иной последовательности.
При элюции с сорбента Каизо наблюдается обогащение по промотору р для широкого диапазона фракций (от 0,3 до 0,6М), с максимальным обогащением при ~ 0,6М соли (рис.5а). С увеличением количества ДНК, взятой на связывание, существенных различий в степени обогащения фракций не наблюдается (рис. 5а).
Рисунок 5. А,Б. Обогащение фракций ДНК, элюированных после связывания с сорбентом Каизо, метилированным промотором гена р16 (А) и содержащим CTGCNA промотором матрилизина (Б). Разные графики соответствуют разному исходному количеству ДНК: - мкг;
- 30 мкг;
- 60 мкг. В. Обогащение фракций ДНК, элюированных после связывания с сорбентом Каизо, неметилированным промотором -актина ( ). Для сравнения приведены данные об элюции р16 ( ) и матрилизина ( ) из А и Б. Использована геномная ДНК клеточной линии colo 320.
Для этих же фракций обогащения по -актину не наблюдалось, зато обогащенной оказывалась фракция не связавшейся с сорбентом ДНК (0,1М KCl) (Рис.5в). Пик обогащения промотором матрилизина наблюдался при 0.3М KCl (рис.5б). Стоит отметить, что концентрация соли, соотвествующая пику обогащения по матрилизину, оказалась ниже, чем для промотора р16. Это свидетельствует о меньшей эффективности связывания сорбентом последовательности CTGCNA в сравнении с метилированной ДНК (рис.5б,в).
Таким образом, сорбент Каизо связывает, хотя и с разной аффинностью, метилированные участки и КСС, однако, не связывает неметилированные последовательности вне контекста КСС.
Рисунок 6. Обогащение фракций ДНК, элюированных после связывания с сорбентом MBD (А) и CGBP (Б), метилированным промотором гена р16 ( ) и неметилированным промотором -актина ( ). Использована геномная ДНК клеточной линии colo 320.
Для фракций ДНК, элюированных с сорбента MBD2, обогащение промотором p16 было около 0,9-1,1М, а промотором -актина – при 0,1-0,3М KCl (рис.6а). Таким образом, MBD2-сорбент, подобно сорбенту Каизо, обладает метил-ДНК-связывающими свойствами.
Для фракций, элюированных с сорбента CGBP характерны высокая степень обогащения промотором -актина при 0,3 – 0,5М соли и отсутствие обогащения промотором р16 (рис.6б). Это свидетельствует о том, что сорбент CGBP эффективно связывает неметилированные и не связывает метилированные последовательности ДНК. Таким образом, сорбенты, с одной стороны Каизо и MBD2, и, с другой стороны, CGBP, обладают противоположной аффинностью в отношении метилированной ДНК.
3. Поиск метилированных районов генома клеточной линии HEK293.
Следующая задача заключалась в сравнительном поиске участков связывания в геноме клеточной линии HEK 293 (human embryonic kidney) (АТСС № CRL-1573.3™) сорбентами MBD2 и Каизо. После связывания сорбентов с геномной ДНК, сорбенты промывали буферами (содержат 0,3 и 0,7 М KCl при работе с Каизо и MBD2, соответственно) и элюировали ДНК буферами (1 и 2 М KCl). Элюированную ДНК использовали для приготовления геномных библиотек и последующего геномного секвенирования на приборе Genome Analyzer II (Illumina). Всего для сорбентов Каизо и MBD2 было получено 19,7 и 24,2 млн.
чтений длиной 36 нуклеотидов, соответственно. Анализ уникально картированных на геном человека чтений проводили с использованием программы QuEST (Valouev et al, 2009), выявляя в геноме обогащенные чтениями участки связывания. В участке связывания можно выделить пик (или несколько пиков), что позволяет оценить геномную локализацию сайтов связывания функциональными доменами сорбентов (рис.7). Всего для сорбентов Каизо и MBD2 было идентифицировано 2424 и 16165 участков связывания, при средней длине 1199 и 308 н.п., соответственно. При этом, участок связывания MBD содержит обычно один пик, в то время как для участка связывания Каизо характерно наличие более одного пика (рис. 7). Таким образом, при относительно небольшом числе участков связывания, в их пределах Каизо ассоциирован с ДНК более «плотно», по сравнению с MBD2 в своих участках. Локализованные участки связывания генома сорбентом Каизо расположены преимущественно в CpG-островках (рис.8), в то время как участки связывания MBD2 – как внутри, так и вне CpG-островков.
Рисунок 7. Примеры типичных участков связывания генома сорбентами Каизо (А) и MBD2 (Б), представленные в интерфейсе программы Genome Browser.
Далее был проведен анализ локализации участков связывания в разных районах генома – промоторах (от -1000 н.п. до точки старта транскрипции), экзонах и интронах генов (от точки старта до точки терминации транскрипции), в 3-концах генов (от точки терминации до +1000 н.п.), а также в межгенных областях (районы, не являющиеся генами, промоторами и 3-концами генов) (рис.
9).
Оказалось, что значительная доля участков (около 49% и 65% для Каизо и MBD2, соответственно) расположена внутри генов. Однако, основным отличием сорбента Каизо от MBD2 является значительное обогащение промоторными областями участков связывания для сорбента Каизо (рис.9).
Рисунок 8. Распределение идентифицированных участков связывания в зависимости от наличия CpG-островков.
Рисунок 9. Локализация участков связывания Каизо и MBD2 в различных районах генома клеточной линии HEK293.
Поиск участков связывания, общих для двух сорбентов, показал, что такие участки локализованы преимущественно в CpG-островках (рис.10). Вне контекста CpG-островков перекрывающихся участков связывания оказалось мало, что вполне согласуется с тем фактом, что участки связывания Каизо встречаются, в основном, в CpG-островках (рис.8, 10).
Рисунок 10. Перекрывание участков связывания Каизо и MBD2. В областях пересечения первая цифра обозначает число участков Каизо, вторая – число участков MBD2. Различия в числе перекрывающихся участков связаны с тем, что участок связывания одного сорбента может перекрываться с несколькими участками другого сорбента.
Был проведен анализ последовательностей в участках связывания сорбентов Каизо и MBD2. Было проанализировано распределение CG, CGCG и КСС в областях ±50 нуклеотидов вокруг пика – эту область можно оценивать как район, содержащий сайт связывания сорбента (Valouev et al, 2009).
Было показано, что CG-динуклеотиды присутствуют в большинстве участков связывания Каизо (98,6%) и MBD2 (92,6%) (рис.11). Во-вторых, CGCG тетрануклеотиды присутствуют в 77,4% участков связывания Каизо и лишь в 37,6% участков MBD2. Следует отметить, что в промоторных областях эти значения выше, чем в целом по геному - 84,2% и 58% для Каизо и MBD2, соответственно. Таким образом, сорбент Каизо в геноме связывает преимущественно CG -богатые районы – CpG -островки, промоторы генов, в то время как сорбент MBD2 – районы с меньшим содержанием цитозина и гуанина.
Это заключение подтверждается и CG-составом участков связывания – содержание CG, в-среднем, составляет 73% и 63% для участков связывания Каизо и MBD2, соответственно.
Для КСС не было обнаружено обогащения в случае использования сорбента Каизо относительно MBD2, который не обладает аффинностью к данному сайту.
Так, последовательность CTGCNA присутствует лишь в 17,3% участков связывания Каизо (±50 нуклеотидов вокруг пика);
сходная величина обнаружена и в участках связывания MBD2 (21,3%). В промоторах число участков Рисунок 11. Представленность последовательностей CG, CGCG, CTGCNA в участках связывания (100 пар вокруг пика) генома сорбентами Каизо и MBD2.
связывания Каизо, содержащих КСС составляет 15,6%;
вариации между различными районами генома незначительны (рис.11).
Если геном человека разделить случайным образом на отрезки длиной н.п., то 46,4% таких отрезков будут содержать последовательность CG, 1,77% CGCG и 16,1% - CTGCNA. Таким образом, участки связывания генома сорбентом Каизо обогащены метилированными CG и CGCG последовательностями, но не неметилированной последовательностью CTGCNA. Это позволяет заключить, что in vitro Каизо обладает преимущественно метил-ДНК связывающей активностью.
Необходимо было определить степень метилирования цитозинов в участках связывания Каизо и MBD2-сорбентов. Для этого были проанализированы литературные данные о степени метилирования 190 промоторов генов хромосомы клеточной линии HEK293 (Zhang et al, 2009). Из 190 районов, оказались перекрывающимися с участками связывания Каизо и все они имели высокую степень метилирования (80-100%). 96 районов перекрывались с участками связывания MBD2, из них 40 были высокометилированы, метилированы в средней степени и 44 слабометилированы. Из районов, которые оказались вне участков связывания сорбентами, свыше 70% неметилированы или слабометилированы, около 12% метилированы в средней степени и около 18% гиперметилированы. Таким образом, свойства домена MBD позволяют связывать как CG-богатые, так и CG-бедные районы генома, что приводит к обнаружению большого числа участков связывания с различным содержанием CG. При этом при проведении анализа возможна ситуация, когда, происходит преципитация одиночного метилированного CpG, в непосредственной близости от которого фрагмент содержит несколько неметилированных. Очевидно, что при дальнейшем анализе этот фрагмент будет детектирован как метилированный.
Свойства домена «цинковые пальцы», напротив, позволяют проводить обнаружение CG-богатых районов генома с высокой специфичностью. Эти свойства обусловливают различную специфичность сорбентов – Каизо специфичен к высокометилированным CG-богатым последовательностям, а MBD2 имеет более широкую специфичность, что объясняется высокой чувствительностью. Тем не менее, несмотря на высокую специфичность Каизо к метилированным последовательностям, некоторые метилированные участки не были связаны сорбентом Каизо. Возможно, это связано с тем, что последовательность сайта связывания Каизо имеет более сложную структуру, чем mCG или mCGmCG.
При полногеномном анализе сайтов связывания экзогенных Каизо мыши и Danio rerio в геноме клеточной линии HEK293 с помощью ChIP-Seq ранее было установлено, что Каизо как мыши, так и Danio rerio связывают преимущественно CG-богатые последовательности, но не содержащие CTGCNA мотивы (Ruzov et al, 2009). Настоящая работа, основанная на применении сорбента Каизо, полностью согласуется с этими данными. Тем не менее, нельзя однозначно утверждать, что КСС-связывающая активность Каизо не важна для развития млекопитающих и организмов других таксономических групп. Полученные данные свидетельствуют о том, что метил-ДНК связывающая активность Каизо универсальна и распространяется на весь геном. При этом CTGCNA-связывающая активность Каизо, очевидно, связана с ограниченным числом районов генома;
обогащение участков связывания этим мотивом статистически недостоверно.
Преимущественная метил-ДНК-связывающая активность сорбента Каизо также имеет и важное практическое значение. Оно заключается в том, что сорбент Каизо позволяет получать фракции ДНК, обогащенные именно метилированными последовательностями. Иными словами, аффинный сорбент Каизо может применяться для анализа метилирования ДНК генома. При этом, сорбент Каизо позволяет выявить CG-богатые высокометилированные участки генома, преимущественно CpG-островки и промоторы генов. В таком виде метод имеет некоторое сходство с такими методами анализа CG-богатых районов генома как метод ограниченного бисульфитного секвенирования (RRBS) (Meissner, 2008), рестрикционное сканирование генома (RLGS) (Smiraglia, 2007), и метод обогащения CpG-островков с помощью ПЦР (HELP) (Khulan, 2006). Однако, в сравнении с перечисленными методами, предложенный здесь подход, основанный на применении сорбента Каизо и геномного секвенирования, имеет следующие преимущества:
1. Не требуется бисульфитная обработка ДНК.
2. Возможность локализовать метилированные участки генома.
3. Относительно невысокая стоимость, т.к. сорбент Каизо обеспечивает обогащение ДНК метилированными фракциями и нет необходимости секвенировать большой объем данных.
4. Высокая специфичность в отношении CG-богатых метилированных последовательностей.
Правда, подобно другим методам, использующим обогащение, основное ограничение этого подхода связано с тем, что происходит идентификация сайтов связывания функционального домена белка (в данном случае – «цинковых пальцев» Каизо), хотя эти сайты и обогащены метилированными CG- и CGCG последовательностями. Кроме того, метод не позволяет проводить анализ уровня метилирования отдельных CpG, ограничиваясь геномными участками.
Метод на основе сорбента Каизо может быть использован при сравнительном анализе метилирования как отдельных последовательностей ДНК, так и целых геномов. При этом специфичность сорбента Каизо к CG-богатым метилированным последовательностям делает его применение более рациональным, чем сорбента MBD2, для анализа геномов с нарушенным метилированием CpG-островков (что часто происходит при раке).
4. Применение сорбента Каизо для поиска CpG-метилированых участков генома Helicobacter pylori.
Следующая задача заключалась в применении сорбента Каизо для поиска метилированных последовательностей генома бактерии Helicobacter pylori. Для этой цели ДНК, выделенную из штаммов бактерии, использовали для связывания с сорбентом Каизо. Анализ был проведен методом гибридизации на микроматрицах элюированной с сорбента Каизо фракции ДНК. Микроматрица содержит 1590 открытых рамок считывания (ОРС) генома H. pylori. У использованного в работе штамма J99 H. pylori активны две метилазы, осуществляющие перенос метильной группы на пятый углеродный атом цитозина: Hpy99III (ОРС 1050;
сайт метилирования GCGC) и Hpy99XI (ОРС 435, сайт метилирования ACGT) (Kong et al, 2000). Таким образом, 5-метилцитозин присутствует в геноме H. pylori в составе CpG-динуклеотидов, что обусловливает возможность их обнаружения сорбентом Каизо.
Донором метильных групп в реакции метилирования ДНК выступает S аденозилметионин (SAM), а его предшественником в клетке является аминокислота метионин. Отдавая метильную группу, SAM превращается в S аденозилгомоцистеин (SAH), который, в свою очередь, может превратиться в гомоцистеин, являющийся предшественником метионина. Поскольку ДНК метилтрансферазная реакция зависит от поступления SAM и удаления SAH, соотношение SAM/SAH принято считать «индексом метилирования», который обозначает вероятность гипер- или гипометилирования ДНК. Поэтому было сделано предположение о возможном влиянии повышенных концентраций метионина в ростовой среде на процессы метилирования генома H.pylori. Для проверки предположения выполнены две серии экспериментов. В первом эксперименте штаммы инкубировали в течение 48 часов на стандартной питательной среде (контроль) и на средах, дополнительно содержащих 1 и 100 мМ метионина (экспериментальные штаммы J99-1мМ-48 и J99-100мМ-48). Во втором эксперименте клетки H. pylori пассировали в среде, содержащей 1 и 10 мМ метионина в течение 2 недель (экспериментальные штаммы J99-1мМ-2нед. и J99 10мM-2нед.). После этого определяли статус метилирования генов во всех штаммах. Предложенная система с повышенной концентрацией метионина позволяет смоделировать сравнительный анализ метилирования ДНК.
Было установлено, что с увеличением концентрации метионина увеличивается степень его воздействия: растет число как гиперметилированных генов, так и гипометилированных (Табл.1). Причем при инкубации в течение 48 ч с увеличением концентрации метионина в большей степени увеличивается число гиперметилированных генов, в то время как при 2-недельной инкубации - число гипометилированных генов. В ходе работы не обнаружено общих гиперметилированных генов при разной (48 часов и 2 недели) времени инкубации бактерий с метионином. Вероятно, это отражает различные процессы адаптации микроорганизма к метионину в разных условиях.
Полученные результаты согласуются с литературными данными о влиянии метионина на метилирование генома позвоночных. Так, увеличенное поступление метионина с пищей приводило к изменению соотношения SAM/SAH в печени крыс (Rowling et al, 2002;
Regina et al, 1993), гиперметилированию некоторых генов у мышей (Tremolizzo et al, 2002), но не влияло на общегеномное метилирование ДНК (Devlin et al, 2004).
По данным, полученным в настоящей работе, добавление метионина приводит к гиперметилированию небольшого числа генов H. pylori, 1.9 – 6.9%, в зависимости от условий. Одновременно метионин вызывает гипометилирование Таблица 1. Влияние метионина на уровень метилирования генома H.pylori. Показано число генов, метилирование которых изменяется в сравнении с контролем. В скобках указан процент от общего числа ОРС на ДНК-микроматрице (1590).
ряда (до 16.2%) генов. Такое избирательное воздействие согласуется с гипотезой о влиянии метионина, выдвинутой для многоклеточных животных.
Согласно этой гипотезе, влияние метионина на метилирование ДНК гено- и тканеспецифично и проявляется на отдельных этапах развития (Waterland et al, 2006).
Таким образом, используя сорбент Каизо и гибридизацию на микроматрицах, в модельной системе установлено, что метионин оказывает разнонаправленное действие на метилирование генома H. pylori. Часть генов гиперметилируется, что потенциально ведет к повышению скорости их мутирования;
часть же генов гипометилируется. Эти данные согласуются с эволюционно-генетическими особенностями H. pylori – высокой генетической гетерогенностью и способностью к быстрой адаптации. Однако, влияние уровня метилирования генома на процессы адаптации H. pylori требует дополнительного изучения.
ВЫВОДЫ.
1. Создан сорбент Каизо на основе доменов цинковые пальцы белка Каизо, обладающий свойством in vitro связывать метилированные последовательности ДНК.
2. Показана возможность применения сорбента Каизо для поиска метилированных участков эукариотического генома (на примере клеточной линии HEK293).
3. Сорбенты Каизо и MBD2 обладают разной специфичностью: Каизо избирательно связывает CG-богатые участки генома, преимущественно CpG островки;
MBD2 обладает более широкой специфичностью, связывая, районы с разным содержанием CG.
4. Белок Каизо in vitro обладает большей аффинностью к метилированной ДНК, чем к последовательности CTGCNA. Использование сорбента Каизо не приводит к обогащению ДНК последовательностями, содержащими мотив CTGCNA, при анализе клеточной линии HEK 293.
5. Показана возможность применения сорбента Каизо для поиска метилированных участков генома бактерии (на примере Helicobacter pylori).
Установлено, что повышенная концентрация метионина оказывает воздействие на метилирование генома H. pylori.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. В.М. Пехов, А.М. Мазур, Е.Б. Прохорчук. Создание технологии на основе аффинных смол для оценки уровня метилирования ДНК позвоночных// Биотехнология – 2009 - №4 – С.40-50.
2. В. М. Пехов, Н. Ю. Краснова, А. М. Мазур, О. В. Селезнева, Е. Б. Прохорчук, К. Т. Момыналиев Метилирование CpG-динуклеотидов генома Helicobacter pylori при повышении концентрации метионина//Молекулярная биология – 2010 – Т.44 №1 – С.170-173.
3. Пехов В.М., Чеканов Н.Н., Мазур А.М., Прохорчук Е.Б. Среда проживания, но не принадлежность этносу влияет на метилирование ДНК генома. – Материалы Международной Пущинской Школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века».- Пущино - 2009. С.35- 4. Пехов В.М., Чеканов Н.Н., Мазур А.М., Прохорчук Е.Б. Поиск дифференциально-метилированных ЦфГ-динуклеотидов у жителей города и сельской местности. Материалы 14 Международной Пущинской Школы конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века» – Том 2 - Пущино 2010. С.170-171.
5. Pekhov V.M., Zhenilo S.V., Prokhortchouk E.B. Application of Methyl-CpG Binding Proteins Kaiso and MBD2 to Whole-Genome DNA Methylation Analysis – International Conference Epigenetics Europe – 14-15 September 2010 – Dublin, Ireland.
6. Пехов В.М. Использование метил-ДНК связывающих белков Каизо и MBD для поиска метилированных участков генома. – Материалы конференции III Всероссийской школы-семинара молодых ученых «Нанобиотехнологии:
проблемы и перспективы» 6-9 октября 2010 года – Белгород – 2010. С. 113-115.