Гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты в горячих источниках камчатки
На правах рукописи
СЛЕПОВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА ГИДРОГЕНОГЕННЫЕ КАРБОКСИДОТРОФНЫЕ ПРОКАРИОТЫ В ГОРЯЧИХ ИСТОЧНИКАХ КАМЧАТКИ Специальность 03.00.07. – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2008
Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН
Научный консультант: кандидат биологических наук От (Р Т.Г. Соколова От (Р
Официальные оппоненты: доктор биологических наук От (Р А.Н. Ножевникова От (Р доктор биологических наук От (Р Ю.А. Троценко От (Р
Ведущая организация: факультет Почвоведения От (Р Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова
Защита состоится «12» мая 2008 г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им.
С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат диссертации разослан «11» апреля 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк От (Р
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты представляют физиологическую группу микроорганизмов, способных расти за счет энергии окисления СО в реакции с водой с образованием Н2 и СО2. Впервые термофильные микроорганизмы с данным типом литотрофного метаболизма были обнаружены В.А. Светличным в микробных сообществах горячих источников Курильских островов (Светличный и др., 1990;
Svetlichny et al., 1991a).
Впоследствии в различных типах гидротерм, а также в антропогенных горячих местах обитания было показано широкое распространение гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, относящихся к обоим доменам – бактериям и археям (Svetlichny et al., 1991b;
Sokolova et al., 2001;
2002;
2004a, b;
2005;
2007;
Parshina et al., 2005;
Zavarzina et al., 2007;
Kozina et al., 2008). Биохимия этого процесса была подробно исследована на первом выделенном организме этой группы – Carboxydothemus hydrogenoformans (Dobbek et al., 2001;
Svetlichnyi et al., 2001;
2004;
Soboh et al., 2002;
Jeoung, Dobbek, 2007). Полностью прочитан геном C. hydrogenoformans (Wu et al., 2006), и в стадии аннотирования находятся геномы еще трех представителей данной группы.
Интерес к термофильным гидрогеногенным карбоксидотрофам связанпрежде всего с тем, что данная группа прокариот является компонентом микробных сообществ гидротермальных мест обитаний, рассматриваемых учеными как аналоги древнейших биоценозов (Заварзин, 1984;
Stetter, 2006).
Также представляет интерес, в том числе и прикладной, исследование термостабильных ферментов организмов, относящихся к данной группе термофилов. Запатентована РНК-зависимая ДНК-полимераза Carboxydothermus hydrogenoformans (Европейский патент No. 97.121151.1), обладающая рядом полезных свойств. Ведутся исследования по использованию гидрогеногенных карбоксидотрофных термофилов в очистке синтез-газа, состоящего в основном из Н2, СО и СО2, и увеличении эффективности получения Н2 из него (Sipma et al., 2007). Однако об экологии данной группы в природных местообитаниях термофильных прокариот – горячих источниках ничего не известно.
В гидротермах основными энергетическими субстратами литотрофных прокариот считаются Н2 и восстановленные соединения серы (Бонч-Осмоловская и др., 1999;
Spear et al., 2005). СО также поступает в гидротермы с вулканическими газами (Symonds et al., 1994), образуется за счет термального и фотохимического разложения органического вещества (Hellebrand et al., 2008) и как продукт метаболизма некоторых термофильных прокариот (Conrad, Thauer, 1983;
Diekert et al., 1984). Таким образом, и СО может также являться источником энергии для литотрофных прокариот.
Известно, что СО могут использовать для роста следующие группы термофильных прокариот: метаногены (Daniels et al., 1977), ацетогены (Diekert, Thauer, 1978;
Savage et al., 1987;
Balk et al., 2008), железоредуцирующие (Slobodkin et al., 2006) и сульфатредуцирующие (Parshina et al., 2005a, b;
Henstra et al., 2007) прокариоты, а также большая группа гидрогеногенных карбоксидотрофов, которым посвящено данное исследование. Несмотря на большое разнообразие анаэробных термофилов, способных расти на СО, не известно, идет ли в горячих источниках микробное потребление СО. Не известно также, микроорганизмы каких физиологических групп участвуют в трансформации СО в анаэробной зоне гидротерм, и какова роль гидрогеногенных карбоксидотрофов в ней. Одним из направлений данной работы было определение с помощью радиоизотопных и хроматографических методов скорости микробной трансформации СО, идущей в горячих источниках. В задачи исследования входило также определение основных продуктов микробной трансформации СО для оценки участия различных физиологических групп прокариот в исследуемом процессе.
К началу наших исследований группа анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов состояла из бактерий, относящихся к классу Clostridia (Svetlichny et al., 1991;
Sokolova et al., 2001;
2002, 2004б, 2005), и одной археи рода Thermococcus (Sokolova et al., 2004а). Впоследствии было выделено еще несколько представителей Clostridia, способных расти на СО с образованием Н2 (Parshina et al., 2005;
Zavarzina et al., 2007;
Kozina et al., 2008), а также описан представитель нового бактериального класса Thermolithobacteria (Sokolova et al., 2007). Таким образом, стало ясно, что физиологическая группа гидрогеногенных карбоксидотрофов не является филогенетически однородной. Поэтому данная работа включала поиск новых термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных бактерий и архей.
Цели и задачи исследования Целью работы было исследование микробной трансформации СО на примере микробных сообществ горячих источников Камчатки и характеристика разнообразия участвующих в ней термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
(1) определение активности и основных продуктов трансформации СО чистыми культурами и микробными сообществами карбоксидотрофных термофильных прокариот;
(2) определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников;
(3) выявление возможных агентов трансформации СО в микробных сообществах горячих источников при помощи методов молекулярной экологии;
(4) выделение и характеристика новых анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов.
Научная новизна и практическая значимость работы Впервые с помощью радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной СО трансформации в термальных местообитаниях. Определены основные продукты микробной трансформации СО.
Для количественного разделения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами разработан радиоизотопный метод.
Выделены, частично или полностью охарактеризованы новые термофильные анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты.
Выделен новый вид гипертермофильных архей ‘Thermofilum carboxydotrophus’ sp.
nov.;
новые виды термофильных бактерий ‘Dyctioglomus carboxydivorans’ sp. nov., ‘Carboxydothermus siderophilus’ sp. nov., Carboxydocella sporoproducens sp. nov., а также четыре новых штамма рода Carboxydocella. Показано широкое распространение представителей р. Carboxydocella в горячих источниках Камчатки.Полученные результаты расширяют филогенетические и фенотипические границы группы термофильных анаэробных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.
Создана коллекция новых термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, которая может быть использована в водородной энергетике, очистке сточных вод, а также как потенциальный источник термостабильных ферментов.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на международных конференциях “Extremophiles 2004”, “Thermophiles 2005”, “Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles 2005”, “The 11th International Symposium on Microbial Ecology – 2006”, “Extremophiles 2006”, “Thermophiles 2007”, “The 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry - 2007” и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005».
Публикации Материалы диссертации содержатся в 11 печатных работах: экспериментальных статьях и 8 тезисах конференций.
Место проведения работы Основная работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ РАН).
Радиоизотопные исследования проводились в лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов ИНМИ РАН. Секвенирование последовательностей 16S рДНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре Биоинженерии РАН. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автор приносит искреннюю благодарность всем, кто помогал и участвовал в данной работе: д.б.н. Пименову Н.В., д.г.-м.н. Карпову Г.А., Камзолкиной О.В., к.б.н. Русанову И.И., к.б.н. Дулову Л.Е., к.б.н. Слободкиной Г.Б., к.б.н. Черных Н.А., к.б.н. Лысенко А.М., к.б.н. Переваловой А.А., к.б.н. Туровой Т.П., к.б.н.
Колгановой Т.В., к.б.н. Кострикиной Н.А., к.б.н. Гаврилову С.Н.;
а также всем сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Соколовой Т.Г., д.б.н. Бонч Осмоловской Е.А. и к.б.н. Лебединскому А.В. за практическую помощь, постоянное внимание и ценные советы на всех этапах выполнения работы.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и включает 22 рисунка и 9 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, который содержит наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Объекты и методы исследования Отбор проб. Пробы воды, ила и бактериальных обрастаний отбирали из горячих источников Камчатки, расположенных в кальдере Узон, Долине гейзеров, в районах вулканов Мутновский и Карымский. Температура воды в источниках была от 30 до 94С, рН воды от 4.0 до 8.4.
Для детальных исследований трансформации СО с помощью радиоизотопных, хроматографических и молекулярно-биологических методов было выбрано 4 источника кальдеры Узон. Характеристики этих источников приведены в таблице 1.
Объектами исследования служили микробные сообщества горячих источников, накопительные культуры, осуществляющие анаэробное окисление СО, а также выделенные из них гидрогеногенные карбоксидотрофные микроорганизмы.
Определение концентрации растворенного в источнике СО проводили с использованием “head-space” метода отбора проб воды, по методике равновесной дегазации (Большаков, Егоров, 1987). Концентрацию СО в воздушной фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматэк», Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором.
Влияние концентрации СО на скорость его анаэробной трансформации микробными сообществами горячих источников.
В 60-мл флаконы помещали 2 мл пробы. СО вводили в воздушную фазу, заполненную N2, в концентрации 0.2-155 мкмоль/л газовой фазы. Пробы инкубировали при температурах, близких к in situ, на водяной бане-шейкере ThermoHaake SWB25 (Германия) со скоростью 80 об/мин. Заранее была подобрана такая скорость перемешивания, при увеличении которой скорость потребления СО уже не повышалась. Остаточное содержание СО в газовой фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматэк», Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором. Расчет концентрации СО в осадках проводили с использованием табличного значения коэффициента его растворимости при данной температуре и минерализации среды.
Таблица 1. Характеристика горячих источников кальдеры Узон, в которых проводились комплексные исследования СО трансформации Источник Т,С рН Eh, мВ Описание источника Тип пробы воронка, 2.5х7 м, сверху покрытая гранулами нативной циано Заварзина 60 6.2 -296 серы белого цвета;
по краям бактериальный воронки активно развиваются мат циано-бактериальные маты воронка, 1 м в диаметре, с «Оранжевый светло-серый 70 6.0 -310 мутной водой нейтральный» осадок глубокая трещина, 1 м в серые обрастания длину, стенки покрыты «Трещинный» 80 6.5 - со стенок серыми обрастаниями воронка, 15 м в диаметре, с серые обрастания постоянным интенсивным «Бурлящий» 90 6.5 - со дна выходом газа в центре Оценка потенциальной активности и определение основных продуктов анаэробной термофильной трансформации СО.
Перед началом исследования трансформации СО термофильными прокариотами была проверена эффективность действия при высоких температурах трех традиционных в радиоизотопных исследованиях способов фиксации: добавления NaOH, глютарового альдегида и автоклавирования.
Оптимальным фиксатором для данных исследований оказался глютаровый альдегид (в конечной концентрации 2.5% от общего объема).
Скорости трансформации СО чистой культурой термофильной гидрогеногенной бактерии и микробными сообществами горячих источников были измерены с использованием 14СО. Интенсивность трансформации СО чистой культурой определяли модифицированным радиоизотопным методом (Беляев и др., 1975). Вносили 0.1 мл 14СО общей активностью 0.2 мКи, в конечной концентрации 450 мкмоль/л культуры. Культуру инкубировали с меченным субстратом в течение 3 часов при 65С, после чего фиксировали глютаровым альдегидом.
Опыты с природными пробами проводили в 18мл пробирках Хангейта. 2 мл осадка заливали до края водой из источников, герметично закрывали. За счет вытеснения воды вводили 1 мл газовой смеси, содержащей N2 и 14СО (общая активность 0.0046 мКи, конечная концентрация 116 мкмоль 14СО/л осадка).
Пробы инкубировали in situ 3, 6, 9, 12 и 24 часа, после чего образцы фиксировали глютаровым альдегидом. Также оценивали потенциальную активность аэробной микробной СО трансформации в источниках, для чего увеличивали газовую фазу в пробирках до 10 мл и наполняли воздухом.
Интенсивность микробной трансформации 14СО в природных пробах оценивали по образованию 14СН4, 14СО2, включению углерода 14СО в растворенное органическое вещество (РОВ), биомассу клеток и летучие жирные кислоты (ЛЖК). Для отделения газообразных продуктов трансформации 14СО (14СН4, 14СО2, 14С-ЛЖК) от оставшегося субстрата была разработана и успешно апробирована специальная установка. Разделение продуктов состояло из следующих этапов: в реакционной колбе 14СО2 связывалась добавлением 2 Н NaOH;
затем проба нагревалась и 14С-ЛЖК конденсировались при помощи обратного холодильника, подсоединенного к колбе;
оставшаяся смесь 14СН4 и СО пропускалась через нагретую до 300С колонку с CuO, где происходило окисление 14СО до 14СО2, которая на выходе улавливалась -фенилэтиламином в сцинтилляционной смеси;
14СН4 поступал в нагретую до 700-800С кварцевую трубку, наполненную силикагелем, пропитанным солями кобальта, где сжигался до 14СО2. Остальные продукты 14СО трансформации разделяли и количественно определяли, используя описанные ранее методики (Беляев и др., 1975;
Гальченко, 1994). Радиоактивность образовавшихся продуктов определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack-Beta (LKB, Швеция).
Получение и филогенетический анализ первичных накопительных культур анаэробных карбоксидотрофных прокариот.
Под током чистого N2 в пробирки Хангейта вносили 2 мл осадков и 8 мл воды из источника. Пробирки закрывали крышками и подсоединяли при помощи резиновых шлангов и инъекционных игл к 100-мл сосуду, полностью заполненному СО. По градиенту концентрации СО диффундировал в опытные пробирки. Наибольшее содержание СО в газовых фазах опытных пробирок могло составить 5-6%. Пробирки инкубировали in situ в течение трех суток (контрольные пробирки – без соединения с сосудом с СО).
Филогенетический анализ полученных накопительных культур проводили при помощи ПЦР-ДГГЭ метода (см. геносистематические методы). Состав микробной популяции накопительной культуры, полученной в присутствии СО, сравнивали с составом популяции, инкубированной без СО.
Культивирование накопительных и чистых культур анаэробных СО трофных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот проводили на среде следующего состава (г/л): NH4Cl – 0.66, MgCl2*6H2O – 0.16, CaCl2*2H2O – 0.1, KCl – 0.33, KH2PO4 – 0.33, NaHCO3 – 0.5. В среду добавляли мл/л раствора витаминов (Wolin et al., 1963), микроэлементов (Кевбрин, Заварзин, 1992), иногда в виде ростового фактора вносили дрожжевой экстракт (0.2 г/л). По 2 г/л вносили органические субстраты роста и акцепторы электронов. S0, Fe(III) в виде аморфного оксида или цитрата и 9,10-антрахинондисульфонат Na (АХДС) вносили в концентрациях 10 г/л, 90 мМ, 20 мМ и 20 мМ, соответственно. Среду готовили анаэробно, с кипячением и последующим охлаждением под током чистого N2, с добавлением резазурина (0.002 г/л) и, в качестве восстановителя, Na2S*9H2O (0.5 г/л). Среду с аморфным оксидом железа готовили согласно методике (Sokolova et al., 2004b). Среды, содержащие Fe(III) или АХДС, готовили без добавления восстановителя и резазурина. До нужного значения рН доводили с помощью 6Н HCl или 6Н NaOH, после чего под током газа разливали среду по пробиркам и флаконам с герметично закрывающимися крышками. После этого газовую фазу во флаконах полностью или частично замещали СО (100, 45, 15 или 5% СО в газовой фазе). Автоклавирование среды проводили при 1 или 0.5 (при наличие в среде S0) АТИ.
Численность карбоксидотрофных анаэробов в осадках определяли методом предельных разведений, инкубируя пробы на минеральной среде со 100% СО в газовой фазе. Численность органотрофных анаэробов определяли на той же минеральной среде, содержащей по 0.1% глюкозы, пептона и дрожжевого экстракта в атмосфере N2. Общую численность прокариот определяли прямым счетом, окрашивая препараты раствором ДАФИ (4, 6-диамидино-2 фенилининдол) в течение 5-7 мин (Huber et al., 1985), с использованием флуоресцентного микроскопа (Axio Imager D1, Германия).
Чистые культуры гидрогеногенных карбоксидотрофов получали методом предельных разведений, зачастую с последующим высевом на твердые среды для получения отдельных колоний. Использовали твердые (1-3% агара) и полутвердые среды (0.5% агара) двух типов: «агаровые столбики» с органическими субстратами или «roll-tubes» со 100% СО в газовой фазе.
Микроскопия. Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 с фазово-контрастным устройством КФ-4 (ЛОМО, Россия). При присутствии в среде Fe его нерастворимые в воде формы растворяли в оксалатном буфере (Гаврилов и др., 2003), разведение учитывали при подсчете. Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Япония).
Определение продуктов метаболизма и субстратов. Определение газообразных продуктов метаболизма (СО2, СН4, Н2) и СО определяли на газово жидкостном хроматографе GLC-Chrom 5 (Laboratorni Pristrozhe, Чехия) со стеклянной колонкой, заполненной активированным углем АГ-3, газ-носитель – Ar, детектор – катарометр. Определение концентрации Fe(II) проводили с дипиридилом, согласно методике (Балашова, Заварзин, 1980).
Проверка устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Антибиотики добавляли в среду для культивирования в концентрации 100-500 мкг/мл.
Геносистематические методы. Выделение ДНК проводили методами Мармура или Бирнбойма-Доли в модификациях (Marmur, 1961;
Булыгина и др., 2002), с применением технологии фирмы Promega (США). Определение содержания Г+Ц пар оснований в ДНК проводили по кривым плавления (Marmur, Doty, 1962). ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации (De Lay et al., 1970). Амплификацию генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирование полученных ампликонов проводили согласно описанным ранее методикам (Субботина и др., 2003). При этом использовали следующие бактериальные, архейные и универсальные праймеры: Bact8-27F, Arch338F, Bact907R, Arch1381R, Arch915R, Univ515F, Univ1492R. Денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ) проводили согласно описанной ранее методике (Kublanov et al., submitted).
Филогенетическое положение изолятов и разделенных ДГГЭ фрагментов природной ДНК определяли путем сравнения последовательностей генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных GenBank, с использованием программ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) и CLUSTAL W v.1.75 (Thompson et al., 1994). Филогенетические деревья были построены с помощью программ TREECON W (Van de Peer, De Wachter, 1994) и PHYLIP (Felsenstein, 1989).
2. Результаты исследования и их обсуждение Исследование условий трансформации СО культуральными методами.
Пробы воды и осадков из 53 различных источников инкубировали в лабораторных условиях на минеральной среде в атмосфере 100% СО (10% засев).
Анаэробная трансформация СО активна шла в пробах из источников с температурами 50-94С и рН 5.0-8.5. При этом в горячих источниках с температурой воды ниже 80С карбоксидотрофные анаэробы были представлены в основном клетками палочковидной формы, а в источниках с температурой выше 80С окись углерода метаболизировали клетки нитевидной и кокковидной формы.
Влияние концентрации СО на скорость его анаэробной трансформации микробными сообществами горячих источников. Опыт проводили на осадках из источника «Трещинный» (80С) (табл. 1). Была показана двухступенчатая зависимость трансформации СО от его концентрации. Этот эффект можно объяснить тем, что в осадках горячего источника функционирует СО-трофное сообщество, гетерогенное по признаку сродства к субстрату (рис. 1).
m V 4, скорость, ммоль/л осадка/сут 3, 2, 1, 0, KS1 KS 0 20 40 60 80 100 120 140 СО, мкмоль/л Рис. 1. Зависимость скорости потребления СО от его концентрации в газовой фазе пробами из ист. «Трещинный» (кальдера Узон, Камчатка).
Были найдены следующие кинетические параметры: KS1 = 54 нМ (нмоль СО/л осадка, соответствующая равновесная концентрация в воздухе составляет 3.75 мкмоль СО/л или 84 ppm), V1m = 0.45 ммоль СО/л осадка/сут;
KS2 = 1 мкМ ( мкмоль СО/л равновесной газовой фазы или 1568 ppm), V2m = 4.5 ммоль СО/л осадка/сут. Зная концентрацию СО в источнике (в данном случае 20 нМ) и пользуясь полученной зависимостью, можно оценить реальную скорость трансформации СО микробным сообществом источника «Трещинный» как 0. ммоль/л осадка/сут.
Полученные результаты говорят о том, что в микробном окислении СО в горячем источнике участвует сообщество СО-трофных прокариот с высоким и низким сродством к субстрату. При этом внутри сообщества могут существовать как разные по сродству к СО различные группы карбоксидотрофов, так и организмы, у которых функционируют ферментативные системы с разным сродством к СО. Возможно, это позволяет организмам лучше адаптироваться в условиях циклических перепадов доступности СО.
Исследование трансформации СО термофильными прокариотами с помощью радиоизотопных методов. Для радиоизотопных исследований трансформации 14СО был взят автотрофно растущий на СО штамм Carboxydocella sp. 1503. Общая интенсивность потребления 14СО штаммом составила 38 – ммоль/л/сут. За время инкубации в продукты трансформировалось до 4% от внесенного меченого СО. При этом более 99.4% от потребленного 14СО окислялось до 14СО2;
оставшийся углерод 14СО шел на образование клеточных структур.
Трансформацию СО термофильными микробными сообществами исследовали на примере четырех источников кальдеры Узон (табл. 1). В отобранных пробах воды всех источников растворенный оксид углерода был обнаружен в концентрациях 20-30 нМ. 14СО был добавлен к пробам в больших концентрациях (116 мкМ) для того, чтобы проследить трансформацию метки во все возможные продукты. Поэтому полученные данные характеризуют потенциальную активность процесса. Проведенные опыты показали быструю трансформацию СО микробными сообществами. Более 90% от внесенной метки трансформировалось за 9 часов инкубации в источнике Заварзина (60С), за 3 часа в ист. «Трещинный» (80С). В источнике «Бурлящий» (90С) 80% от внесенной СО трансформировалось в различные продукты за 12 часов инкубации (рис. 2).
Потенциальная активность анаэробной микробной трансформации СО в источниках с температурами 60, 70, 80 и 90С составила 0.09, 0.10, 0.48 и 0. ммоль/л осадка/сут, соответственно.
Рис. 2. Динамика радиоактивность (имп*106/мин) трансформации 14СО в СО СО2 и 14С-органическое вещество (14С-ОВ) микробными сообществами ист.
СО «Бурлящий» (90С), где 2 С-ОВ С-ОВ – это сумма 14С ЛЖК, 14С-РОВ и 14С 0 3 6 9 12 15 18 21 клеточной массы.
время инкубации (ч) Основным продуктом микробной трансформации СО являлся СО2 (90-100% от использованного 14СО). Не более 5% от использованного СО трансформировалось в ЛЖК;
доля метки, обнаруживаемой в ЛЖК, снижалась с повышением температуры в источнике. Оставшийся 14С включался в РОВ и биомассу (рис. 3). Перехода метки в 14СН4 обнаружено не было.
Отсутствие метаногенной активности в исследованных горячих источниках согласуется с полученными ранее результатами, показавшими незначительные скорости литотрофного метаногенеза из СО2 в источниках кальдеры Узон с температурами 55-75С и полное его отсутствие в источниках с температурами выше 80С (Бонч-Осмоловская и др., 1987;
1999;
Pimenov et al., 2007).
Присутствие воздуха в газовой фазе экспериментальных пробирок при инкубации с 14СО полностью ингибировало процесс в пробе циано бактериального мата из ист. Заварзина (рис. 4). Это говорит о том, что СО трофные прокариоты, видимо, населяют анаэробную зону мата и очень чувствительны к О2. В ист. «Трещинный» кислород, наоборот, стимулировал процесс почти вдвое, что может означать участие в трансформации СО в этом источнике как анаэробных, так и аэробных прокариот. В ист. «Бурлящий» присутствие О2 практически не повлияло на СО трансформацию (рис. 4).
ист. Заварзина (60С) ист. «Оранжевый нейтральный» (70С) СО CO 95.0% 100% 14 С-ЛЖК С-клеточная 4.8% масса 0.1% ист. «Трещинный» (80С) ист. «Бурлящий» (90С) 14 СО2 СО 99.2% 90.4% 14 С-ЛЖК С-ЛЖК С-РОВ С-клеточная 0.8% масса 0.8% 8.3% 0.5% Рис. 3. Распределение метки в продуктах трансформации 14СО микробными сообществами горячих источников кальдеры Узон (Камчатка). Время инкубации часов.
Наши результаты указывают на то, что в горячих источниках Камчатки активно функционируют как анаэробные, так и аэробные прокариоты, использующие СО как источник энергии. Надо отметить, что пока не выделен ни один гипертермофильный аэроб, способный расти на СО. Таким образом, полученные результаты могут помочь в поиске новых СО-трофных прокариот.
Заварзин-60С Оранжевый Н-70С Трещинный-80С Бурлящий-90С 0 0,2 0,4 0,6 0,8 скорость, ммоль/л/сут инкубация в условиях in situ инкубация с воздухом Рис. 4. Потенциальная скорость трансформации СО микробными сообществами осадков горячих источников в условиях in situ (анаэробные условия) и в присутствии воздуха.
Определение численности анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот.
Результаты определения численности анаэробных СО-трофов в источниках кальдеры Узон и Долины гейзеров приведены в таблице 2.
Таблица 2. Численность анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников Доминирующие Численность, клетки/мл Название формы прокариот в ТС или последнем разведении, инкубации* Анаэробные Анаэробные № источника где наблюдали СО-трофные органотрофные Общая потребление СО прокариоты прокариоты 105 108 2.3* ист.Заварзина 60 короткие палочки длинные тонкие нити, 108 0.7* «Трещинный» 82 кокки 106 108 1.4* «Бурлящий» 90 кокки 1525 70 н.о. н.о. короткие палочки 106 1534 90 н.о. кокки 1507 82 н.о. н.о. овальчики, кокки 1260 52 10 н.о. н.о. н.о.
105 1312 70 н.о. палочки 104 1315 70 н.о. палочки * - инкубировали при рН среды 6.8-7.0;
н.о. – не определяли.
Как видно из таблицы 2, численность карбоксидотрофных анаэробных термофилов может достигать 106 кл/мл осадка.
Численность органотрофных анаэробов в этих же источниках составила 106 108 кл/мл осадка. Прямой подсчет микроорганизмов в источниках Заварзина, «Трещинный» и «Бурлящий» показал присутствие 2.3*108, 0.7*108 и 1.4*108 кл/мл осадка, соответственно. Таким образом, доля анаэробных СО-окисляющих прокариот составляет около 1% от общей численности микроорганизмов(табл. 2).
Филогенетический анализ микробных популяций первичных карбоксидотрофных накопительных культур из проб воды и ила, отобранных из источника «Бурлящий» (90С/рН 7.0), проводили ПЦР-ДГГЭ методом. Было показано присутствие в источнике представителей термофильных архей и бактерий, родственных Thermococcus sp. AM4 (100% сходства фрагментов 16S рДНК) и Meiothermus silvanus (97% сходства), соответственно.
Thermococcus sp. AM4 – единственный представитель этого рода, способный расти на СО с образованием Н2 и СО2 (Sokolova et al., 2004а).
Возможное присутствие его аналога в источнике «Бурлящий» подтверждается еще и тем, что в описанных экспериментах по подсчету численности СО окисляющих анаэробов в источнике «Бурлящий» в последних разведениях, где шло потребление СО, доминирующими формами были кокки (табл. 2). Таким образом, можно предположить, что представители рода Thermococcus, обладающие способностью к гидрогеногенному окислениюь СО,, являются основными СО-окисляющими агентами в 90-градусном источнике.
Для представителей бактериального рода Meiothermus, как и для всего порядка Thermales, ранее не была отмечена способность использовать окись углерода в своем метаболизме (Tenreiro et al., 1995;
Rainy, da Costa, 2001;
Miroshnichenko et al., 2003a;
2003б). Бактериальную ДНК из накопительной культуры, инкубированной без СО в газовой фазе, не удалось выделить.
Возможно, это говорит о том, что Meiothermus присутствует в источнике в минорных количествах и его численность возросла в присутствии СО. В свою очередь, этот результат также подтверждает предположение, что в трансформации СО в высокотемпературных источниках могут участвовать факультативно-анаэробные прокариоты.
Выделение анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот. Из СО-трофных накопительных культур с устойчивым ростом, полученных из различных горячих источников Камчатки, было выделено 7 штаммов бактерий и 1 штамм археи.
Carboxydocella sporoproducens sp. nov.
(BacteriaFirmicutesClostridiaClostridialesSyntrophomonadaceae Carboxydocella) Выделена из горячего источника вулканического озера Карымское, в районе вулкана Карымский. Температура и рН в источнике – 60С/6.6, соответственно.
Клетки представляют собой спорообразующие прямые палочки без жгутиков, 1-6 мкм длиной и 0.5 мкм шириной (рис. 5). Клеточная стенка грамположительного типа. Образование спор – терминальное (рис. 6b,c).
Облигатный анаэроб. Термофил, растущий при 50-72С, с оптимумом при 60С.
Нейтрофил, растущий в пределах 6.2-8.0, с оптимумом при 6.8. Растет хемолитоавтотрофно в атмосфере 100% СО на минеральной среде с образованием равных количеств Н2 и СО2 (рис. 6). Время удвоения в атмосфере СО в оптимальных условиях (о.у.) – 1 час.
2,8 клетки 2,4 СО СО, Н2, ммоль/мл клетки, 10 /мл 1, 1, H2 0, 0, 0 0 10 20 30 время, ч Рис. 6. Рост, потребление СО и Рис. 5. Электронные микрофотографии образование водорода C.
Carboxydocella sporoproducens KarT ( a, b – sporoproducens KarT (о.у.).
негативное контрастирование, c – жидкой культуры.
ультратонкий срез). Шкала, 0.5 мкм.
Растет органотрофно в атмосфере N2 на дрожжевом экстракте, сахарозе или пирувате. Не растет на пептоне, крахмале, глюкозе, арабинозе, фруктозе, ксилозе, галактозе, лактозе, мальтозе, глицерине, цитрате, сукцинате, ацетате, формиате, этаноле, метаноле или на смеси Н2:СО2 (4:1). Не восстанавливает SO42-, S2O32-, SO32-, S0, NO3- или Fe3+ в присутствии различных органических и неорганических доноров электронов. SO32-, S0 и NO3- ингибируют рост.
Содержание Г+Ц пар в ДНК составляет 49.5±1 мол%.
Ближайшим родственником является Carboxydocella thermoautotrophica 41T (Sokolova et al., 2002)со сходством последовательностей генов 16S рРНК 99.5% (рис. 7). ДНК-ДНК гибридизация с C. thermoautotrophica 41T составила 45%.
Типовой штамм KarT депонирован в российской и немецкой коллекциях микроорганизмов (=DSMZ 16521T =ВКМ В-2358Т).
Carboxydocella spp., штаммы 1244, 930, 961 и Штаммы 1244, 930 и 961 выделены из горячих источников кальдеры Узон.
Температура воды в источниках была 57С, 60С, 58С, соответственно, значения рН близки к нейтральным. Штамм 1503 выделен из источника в районе в.
Мутновский (75С/6.5).
Carboxydocella sp. 1244 (EU260048) Carboxydocella sp. 930 (EU260049) Carboxydocella sp. 961 (EU260050) Carboxydocella_thermoautotrophica Carboxydocella_sporoproducens (AY673988) Carboxydocella sp. 1503 (EU260047) ‘Carboxydocella ferrireduca’ Termoanaerobacter_ethanolicus Termoanaerobacter_mathranii Caldanaerobacter_subterraneus_pacificus Caldanaerobacter subterraneus subterraneus Caldanaerobacter sub tencongensis Moorella_thermoacetica Desulfotomaculum_nigrificans Desulfotomaculum_carboxydivorans Sporotomaculum_hydroxybenzoicum Thermincola_carboxydophila Thermincola_ferriacetica Desulfitobacterium_hafniense Desulfitobacterium_dehalogenans Anaerobranca_horikoshii Thermosyntropha_lipolytica Syntrophospora_bryantii Syntrophomonas_wolfei Desulfotomaculum_thermobenzoicum Thermolithobacter_carboxydivorans Thermolithobacter_ferrireducens Thermaerobacter_marianensis Thermosinus_carboxydivorans Dendrosporobacter_quercicolus Ammonifex_degensii Carboxydothermus_ferrireducens ‘Carboxydothermus siderophilus’ (EF542810) Carboxydothermus_hydrogenoformans Dictyoglomus sp. Dictyoglomus_thermophilum Desulfovibrio_vulgaris_vul_H Escherichia_coli Rubrivivax_gelatinosus Rhodospirillum_rubrum Rhodopseudomonas palustris Рис. 7. Филогенетическое положение новых анаэробных термофильных гидрогенных СО-трофных бактерий (внешний репер - Methanobacterium formicicum).
Все выделенные штаммы представлены палочками, размерами 0.5х2-3 мкм.
Штаммы 1244 и 961 способны образовывать споры. Растут при оптимальной температуре 60-65С и нейтральном значении рН.
Все штаммы растут хемолитоавтотрофно на 100% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и СО2, или хемоорганогетеротрофно на дрожжевом экстракте и глюкозе. Не растут на смеси Н2:СО2 (4:1, об.%), на пептоне, казеине, сукцинате, оксалате, цитрате, малате, лактате, пирувате, ацетате и фумарате.
Ближайшим родственником по анализу последовательности генов 16S рРНК является C. thermautotrophica 41T (Sokolova et al., 2002) (99.5% сходства с генами штаммов 1244, 930 и 961 и 97.5% сходства с геном штамма 1503) (рис. 7).
Таким образом, было показано широкое распространение представителей рода Carboxydocella в различных гидротермальных системах Камчатки. Все представители рода Carboxydocella, включая выделенную ранее из горячего источника Долины гейзеров C. thermautotrophica (Sokolova et al., 2002), являются строгими анаэробами, умеренными термофилами и нейтрофилами. Способны расти хемолитоавтотрофно на 100% оксида углерода в газовой фазе, образуя равные количества водорода и углекислого газа, согласно реакции СО + Н2О СО2 + Н2. Представлены короткими прямыми подвижными палочками с грамположительным типом клеточной стенки, некоторые способны образовывать споры. Эта способность показана для представителей гидрогеногенных карбоксидотрофов впервые.
‘Carboxydothermus siderophilus’ sp. nov.
(BacteriaFirmicutesClostridiaClostridialesPeptococcaceae Carboxydothermus) Выделен из горячего источника Долины гейзеров (72С/рН 8.4).
Клетки представляют палочки 0.4 мкм шириной и 1-2 мкм длиной (рис. 8).
Жгутики отсутствуют. Термофил. Растет в диапазоне температур от 52 до 70С, с оптимумом при 65С. Нейтрофил, также может расти в умеренно щелочных условиях.
Растет только в присутствии Fe(III) или АХДС, восстанавливая их до Fe(II) или АХДСН2, соответственно. Хемоорганотрофно растет на глюкозе, ксилозе, лактате или дрожжевом экстракте в атмосфере N2, или хемолитотрофно на 100% СО. Нуждается в дрожжевом экстракте (0.2 г/л). Во время роста на СО в присутствии Fe(III) или АХДС образует Н2, СО2 и Fe(II) или АХДСН2, соответственно.
Рис. 8. Электронная микрофотография ‘Carboxydothermus siderophilus’ 1315T (негативное контрастирование). Шкала, 1 мкм.
Не растет на смеси Н2:СО2 (4:1), пептоне, сахарозе, галактозе, фруктозе, мальтозе, формиате, ацетате, пирувате, сукцинате, оксалате, цитрате, малате, фумарате, глицерине, этаноле или метаноле, как в присутствии, так и в отсутствии Fe(III) или АХДС. Восстанавливает до 30 мМ Fe(III), образуя магнетит. Не восстанавливает SO42-, S2O32-, SO32-, S0, NO3- или фумарат.
Содержание Г+Ц пар в ДНК 41.5±0.5 мол%.
Ближайшим родственником по анализу последовательности гена 16S рРНК является Carboxydothermus hydrogenoformans (97.5%) (Svetlichny et al., 1991) (рис.
7). По филогенетическим и фенотипическим отличиям был отнесен к новому виду ‘Carboxydothermus siderophilus’.
Типовой штамм 1315Т (=DSMZ 21278T, ВКМ В-2474Т, ВКПМ В-9905Т).
Род Carboxydothermus к началу исследования состоял из двух видов: C.
hydrogenoformans (Svetlichny et al., 1991) и C. ferrireducens (Slobodkin et al., 1997;
2006). Основные отличия нового изолята от остальных видов приведены в таблице 3. ‘C. siderophilus’ способен расти на СО с образованием Н2 и СО2, восстанавливая Fe(III) до Fe(II). C. hydrogenoformans не способен к железоредукции при росте на СО (Svetlichny et al., 1991;
Henstra, Stams, 2004), однако восстанавливает Fe(III) при росте на Н2 (табл. 3). C. ferrireducens, напротив, растет на СО, восстанавливая Fe(III), однако без образования Н (Slobodkin et al., 2006). Новый вид C. siderophilus также не способен восстанавливать иные чем Fe(III) неорганические акцепторы электронов, в отличие от двух других видов (Henstra, Stams, 2004) (табл. 3).
Таблица 3. Способность представителей рода Carboxydothermus восстанавливать различные акцепторы электронов при росте на неорганических и органических субстратах ‘C.
Условия C. hydrogenoformans C. ferrireducens siderophilus’ Донор электронов - СО Акцептор Fe(III) - +* +** электронов АХДС +** +* +** Донор электронов - Н Акцептор Fe(III) + + электронов АХДС + + Донор электронов - лактат сульфат - - сульфит + + Акцептор тиосульфат + + электронов сера + + нитрат + + фумарат + - Henstra, Stams, 2004;
Henstra, Stams, 2004;
данная Ссылки Slobodkin et al., 2006. Slobodkin et al., 2006. работа * - рост без образования Н2;
** - рост с образованием Н2.
‘Dictyoglomus carboxydivorans’ sp. nov. (штамм 1512) (BacteriaDictyoglomiDictyoglomiDictyoglomalesDictyoglomaceae Dictyoglomus) Выделен из источника Трещинный (78С/6.5) (Восточное термальное поле, кальдера Узон).
Представляет собой тонкие длинные нити толщиной 0.3 мкм, длиной до 15 мкм (рис. 9).
Экстремальный термофил. Растет при температурах от 65 до 85С, с оптимумом при 75С. Нейтрофил.
Анаэроб. Клеточная стенка грамотрицательного типа.
Рис. 9. Электронная микрофотография ‘Dictyoglomus carboxydivorans’ 1512 (негативное контрастирование). Шкала, 1 мкм.
Хемолитотрофно растет при 5% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и СО2. Выдерживает также 15% СО в газовой фазе, при 45% уже не растет. Не растет на смеси Н2:СО2 (4:1). Органотрофно растет на пирувате.
Нуждается в дрожжевом экстракте (0.2 г/л). Время генерации при росте на 5% СО в оптимальных условиях – 60 часов.
Инкубация природных проб в атмосфере с низким содержанием СО позволила выделить гидрогеногенный карбоксидотрофный микроорганизм, относящийся к новому для СО-трофов филогенетическому типу Dictyoglomi. По анализу последовательности гена 16S рРНК отнесен к роду Dictyoglomus (рис. 7), с ближайшим родственником D. thermophilum H-6-12Т (98.6% сходства) (Saiki et al., 1985). На основании филогенетических и фенотипических отличий отнесен к новому виду ‘D. carboxydivorans’ 1512T.
Первый представитель рода Dictyoglomus, D. thermophilum H-6-12Т, был описан более 20 лет назад (Saiki et al., 1985). Однако за прошедший период времени в литературе появилось описание только одного нового вида, ‘D.
turgidus’ (Светличный, Светличная, 1988), который был выделен из горячего источника кальдеры Узон. Совсем недавно из этого же термального региона Камчатки были выделены в чистые культуры еще два новых штамма рода Dictyoglomus (Kublanov et al., submitted). При этом все перечисленные организмы росли только за счет энергии окисления органических субстратов. Новый вид ‘D.
таким образом, является первым представителем carboxydivorans’, филогенетического типа Dictyoglomi, способным к литотрофному росту.
‘Thermofilum carboxydotrophus’ sp. nov. (штамм 1505) (ArchaeaCrenarchaeotaThermoproteiThermoprotealesThermofilaceae Thermofilum) Выделен из горячего источника в районе вулкана Мутновский (84С/6.5).
Клетки представляют собой очень тонкие длинные нити толщиной 0.2 мкм и длиной до 15-20 мкм (рис. 10). Гипертермофил. Температурный оптимум роста 90С, минимум 80С. Нейтрофил.
Рис. 10. Электронная микрофотография ‘Thermofilum carboxydotrophus’ (негативное контрастирование).
Шкала, 1 мкм.
Хемолитотрофно растет на 45% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и СО2. Облигатно зависит от присутствия дрожжевого экстракта и цистеина (0.2 г/л). Время генерации в данных условиях при температуре инкубации 92С - 30 часов. Не растет при 15% СО в газовой фазе, при 100% СО рост значительно замедляется. Органотрофно растет на дрожжевом экстракте. Не растет на смеси Н2:СО2 (4:1), лактате или пептоне.
Ближайший родственник по анализу последовательности гена 16S рРНК – Thermofilum pendens Hrk-5T (97.8%) (рис. 11) (Zillig et al., 1983). По филогенетическим и фенотипическим отличиям новый изолят отнесен к новому виду ‘T. carboxydotrophus’ 1505Т.
На момент начала работы среди архей был известен только один представитель, способный окислять СО в реакции с водой с образованием Н2 и СО2. Это представитель типа Euryarchaeota, Thermococcus sp. AM4, выделенный из глубоководной гидротермы и растущий при 100% СО в газовой фазе (Sokolova et al., 2004a). В работе, инкубируя накопительную культуру при пониженном содержании СО в газовой фазе, удалось выделить еще одну гидрогеногенную карбоксидотрофную архею, обладающую наиболее высоким температурным оптимумом роста среди СО-трофных прокариот – 92С. Более того, новый изолят оказался представителем другого филогенетического типа – Crenarchaeota, и лишь третьим видом рода Thermofilum (Zillig et al., 1983;
Burggraf et al., 1997).
Thermococcus_gammatolerans Thermococcus_sp._AM Thermococcus_celer Methanobacterium_formicicum Methanopyrus_kandleri Euryarchaeota Thermoplasma_acidophilum Archaeoglobus_fulgidus Methanosarcina_barkeri Halobacterium_salinarum Methanomicrobium_mobile Methanococcus_vannielii Sulfolobus_acidocaldarius Desulfurococcus_mobilis Crenarchaeota Thermoproteus_tenax Thermofilum_pendens ‘Thermofilum carboxydotrophus’ Escherichia_coli Рисунок 11. Филогенетическое положение новой гипертермофильной археи ‘Thermofilum carboxydotrophus’ 1505.
Также оказалось, что последовательность гена 16S рРНК выделенного изолята полностью совпала с последовательностями ДНК-клонов, полученных из различных проб горячих источников Йеллоустонского Национального Парка (США) (Barns et al., 1994;
Reysenbach et al., 2000;
Korf et al., неопубликованные данные). Это говорит, во-первых, о широком распространении этого вида в гидротермальных местах обитания, отнесенных друг от друга на тысячи километров и разделенных океаном;
во-вторых, можно предположить, что микроорганизмы, обитающие в горячих источниках Йеллоустонского Национального Парка, также способны расти на СО с образованием Н2 и СО2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Используя разнообразие горячих источников Камчатки, мы предприняли комплексное исследование микробной СО трансформации. Для детального анализа были выбраны три нейтральных источника с температурами, соответствующими оптимумам роста умерено термофильных (60С), экстремально (70-80С) и гипертермофильных (90С) прокариот. Выбранные значения рН (6.0-7.0) соответствовали оптимумам развития большинства выделенных на данный момент карбоксидотрофных термофилов. Были исследованы источники, в которых присутствовали циано-бактериальные маты (ист. Заварзина), и источники, где не было обрастаний, осуществляющих фотосинтетическую продукцию органического вещества (источники «Оранжевый нейтральный», «Трещинный» и «Бурлящий»). Проведенные исследования показали присутствие во всех источниках окиси углерода.
Хроматографические и радиоизотопные исследования показали, что в горячих источниках происходит активная трансформация СО микробными сообществами. Основным продуктом микробной СО трансформации является СО2. Незначительное образование других продуктов трансформации является прямым или косвенным указанием на то, что за трансформацию СО в горячих источниках кальдеры Узон ответственны отличные от метаногенов и ацетогенов микроорганизмы. Как было показано, в источниках присутствуют, наряду с анаэробными, и аэробные прокариоты, окисляющие СО.
При помощи культуральных методов были показаны границы СО трансформации в горячих источниках Камчатки. Прокариоты, способные активно метаболизировать СО, обнаруживаются в местах обитания с диапазоном температур и рН от 50 до 94С и от 5.0 до 8.5, соответственно. Было показано, что численность анаэробных карбоксидотрофных прокариот в источниках может достигать значительных величин – до 106 клеток/мл, что составляет около 1% от всей численности микроорганизмов в сообществах этих источников. В источнике «Трещинный» (80С), где была показана самая высокая микробная активность СО трансформации, не было отмечено значительного присутствия анаэробных СО-трофов, способных расти на минеральной среде со 100% СО в газовой фазе. Однако из этого источника удалось впоследствии выделить чистую культуру СО-трофного микроорганизма. Новый вид ‘Dictyoglomus carboxydivorans’ был способен хемолитотрофно расти на СО с образованием равных количеств Н2 и СО2, но при концентрациях СО в газовой фазе, не превышающих 15%. Таким образом, истинная численность микроорганизмов, окисляющие СО, может оказаться выше за счет видов, чувствительных к его высоким концентрациям.
В другом подробно исследованном источнике Заварзина (60С) удалось показать активный процесс микробной трансформации СО, высокую численность анаэробных СО-трофных прокариот (106 клеток/мл осадка), а также выделить термофильную бактерию, осуществляющую этот процесс. Ей оказался представитель рода (штамм 1244), растущий Carboxydocella хемолитоавтотрофно в присутствии 100% СО в газовой фазе, с образованием равных количеств Н2 и СО2. На момент начала работы этот род состоял из одного представителя, C. thermautotrophica (Sokolova et al., 2002), выделенного из горячего источника Долины гейзеров. В ходе работы было показано широкое распространение фенотипически сходных представителей рода Carboxydocella во всех исследованных гидротермальных системах Камчатки.
Из горячего источника Долины гейзеров выделен новый вид гидрогеногенной карбоксидотрофной бактерии р. Carboxydothermus, ‘C.
siderophilus’, способный к литотрофной железоредукции.
В самом горячем источнике «Бурлящий» (90С), где также была показана активная микробная трансформации СО и высокая численность анаэробных СО трофов, с помощью молекулярных методов удалось выявить возможных агентов трансформации СО – архей рода Thermococcus и бактерий рода Meiothermus.
Представители рода Thermococcus широко распространены в морских гидротермах, однако известны два вида, обитающие в наземных пресных источниках Новой Зеландии (Klages, Morgan, 1994;
Gonzlez et al., 1999).
Другим организмом, способным проводить процесс трансформации СО при температуре выше 90С, оказался новый архейный вид ‘Thermofilum carboxydotrophus’, также образующий только Н2 и СО2 при росте на СО. Данный изолят обладает наиболее высоким температурным оптимумом роста для карбоксидотрофных прокариот (92С) и является первым представителем типа Crenarchaeota, способным расти за счет окисления СО.
Таким образом, несмотря на низкие концентрации растворенной в горячих источниках СО, результаты свидетельствуют о наличии активной популяции СО-трофных прокариот и активной трансформации СО в гидротермах Камчатки.
В ходе работы было показано широкое распространение в гидротермах Камчатки, а также фенотипическое и филогенетическое разнообразие группы гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, которая может играть важную, если не основную роль в трансформации СО.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что в горячих источниках кальдеры Узон при температуре 60-90С и нейтральных значениях рН идет активное окисление СО до СО2.
2. Анаэробные карбоксидотрофы присутствуют в источниках Камчатки с температурами 50-94С и рН 5.0-8.5, где их численность составляет до 1% от общей численности микроорганизмов.
3. Снижение концентрации СО в газовой фазе при культивировании увеличивает разнообразие выделяемых термофильных прокариот, способных к его гидрогеногенному окислению.
4. Обнаружено высокое филогенетическое разнообразие гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в наземных горячих источниках Камчатки:
среди архей – представители филогенетических типов Crenarchaeota и Euryarchaeota, среди бактерий – представители типов Firmicutes, Dictyoglomi и Thermus-Deinococcus.
5. Выделены новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты:
Carboxydocella sporoproducens sp. nov. – первый спорообразующий представитель этой группы;
‘Carboxydothermus siderophilus’ sp. nov. – облигатно зависящий от Fe(III);
‘Dictyoglomus carboxydivorans’ sp. nov. – первый литотрофный и карбоксидотрофный представитель типа Dictyoglomi;
‘Thermofilum carboxydotrophus’ sp. nov. – первый карбоксидотрофный представитель типа Crenarchaeota.
6. Показано широкое распространение представителей гидрогеногенного карбоксидотрофного рода Carboxydocella в источниках Камчатки с температурами 50-70С и значениях рН, близких к нейтральному.
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи 1. Слепова Т.В., Русанов И.И., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. и Пименов Н.В.
(2007) Радиоиозотопное измерение интенсивности трансформации СО анаэробными термофильными прокариотами. Микробиология. 76(5), 594-601.
2. Slepova T.V., Sokolova T.G., Lysenko A.M., Tourova T.P., Kolganova T.V., Kamzolkina O.V., Karpov G.A. and Bonch-Osmolovskaya E.A. (2006) Carboxydocella sporoproducens sp. nov., a novel anaerobic CO-utilizing/H2-producing thermophilic bacterium from a Kamchatka hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 797-800.
3. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V., Tourova T.P. and Bonch-Osmolovskaya E.A.
Carboxydothermus siderophilus sp. nov., a novel thermophilic hydrogenogenic carboxydotrophic dissimilatory Fe(III)-reducing bacterium from Kamchatka hot spring. Int. J.
Syst. Evol. Microbiol., in press.
Тезисы конференций 1. Слепова Т.В., Колганова Т.В. и Соколова Т.Г. Распространение анаэробных термофильных СО-окисляющих/Н2-образующих микроорганизмов в наземных горячих источниках Долины Гейзеров и Кальдеры Узон, Камчатка, Россия. Молодежная школа конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии", Ноябрь 2005, Москва, Россия.
2. Slepova T.V., Subbotina I.V., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Sokolova T.G.
Carboxydocella sporoforma sp. nov., a novel anaerobic, thermophilic, CO-utilizing hydrogenogenic bacterium from a Kamchatka hot spring. International conference “Extremophiles”, September 2004, Baltimore, USA.
Abstract
187.
3. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser Valley and Uzon Caldera, Kamchatka, Russia. International workshop “Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles”, August 2005, Petropavlovsk Kamchatky, Russia.
4. Slepova T., Sokolova T. and Kolganova T. Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser valley and Uzon caldera, Kamchatka, Russia. International conference “Thermophiles”, September 2005, Cold Coast, Australia. Abstract P45.
5. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V., Pimenov N.V., Rusanov I.I. and Bonch Osmolovskaya E.A. Hydrogenogenic CO-oxidizing prokaryotes in microbial communities of Kamchatka hot environments. 11th International Symposium on Microbial Ecology, August 2006, Vienna, Austria. Abstract 374.
6. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Bonch Osmolovskaya E.A. A novel thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizing Fe(III)-reducing bacterium. International conference “Extremophiles”, September 2006, Brest, France.
Abstract P032.
7. Slepova T., Sokolova T., Rusanov I., Pimenov N., Lebedinsky A., Kolganova T., Kostrikina N., Bonch-Osmolovskaya E. CO transformation by anaerobic microbial communities of Kamchatka hot springs. International conference “Thermophiles”, September 2007, Bergen, Norway. Abstract L9.
8. Pimenov N.V., T. V. Slepova, T. G. Sokolova, I. I. Rusanov, and E. A. Bonch Osmolovskaya. Microbial activity in Uzon Caldera (Kamchatka) hot springs. 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry, November 2007, Taupo, New Zealand. Abstract G-9.