Популяционная вариабельность микроорганизмов

На правах рукописи

ХАБИБУЛЛИН САМАТ СИРИНОВИЧ ПОПУЛЯЦИОННАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007 1

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева и в Институте микробиологии РАН им.

С.Н.Виноградского

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Воробьева Лена Ивановна кандидат биологических наук Пичугина Галина Ивановна

Ведущая организация: НТЦ «Лекбиотех»

Защита состоится «_» 2007г. в _ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им.

Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., 9. в ауд.443.

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан «»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ДМ 212.204.13 И.В. Шакир Актуальность проблемы. Изучение фенотипической изменчивости как генетического феномена, лежащего в основе таких явлений и процессов как изменение скорости микробных синтезов и трансформаций, вирулентность и персистенция патогенных и условно-патогенных бактерий, результативность симбиозов и замещение продуктивных вариантов промышленных штаммов, является одной из наиболее актуальных проблем современной микробиологии.

Понимание механизмов внутрипопуляционной изменчивости микроорганизмов и возможность их контроля позволят значительно повысить эффективность существующих микробиологических производств. Известно, что популяция микроорганизмов гетерогенна и характеризуется наличием внутри популяции (одного штамма) клеток, различающихся по ряду колониально-морфологических и физиолого-биохимических свойств и способных к диссоциативным переходам с высокой частотой (10-2–10-4 на одно клеточное деление) [Милько, Егоров, 1991;

Головлев, Согласно современным представлениям популяционная 1998].

вариабельность бактерий обусловлена процессами внутригеномной рекомбинации генетического материала клетки, которые можно отнести к специфическому типу мутаций В появившихся в последние десятилетия [Прозоров, 2001].

экспериментальных работах отмечается повышение фенотипической гетерогенности популяции в стационарной фазе роста, в стареющих и длительно хранящихся микробных культурах [Милько, Егоров, 1991, Kelly et.al., 2001]. Согласно ряду гипотез это связано с состоянием пролиферативного покоя клеток, с включением общего регулона стационарной фазы и действием сигнальных молекул, контролирующих экспрессию генов этой фазы и переход клеток к состоянию покоя [Yildiz&Schoolnik;, 1998;

Suh et.al., 1999;

Andersson et.al., 1999]. Среди внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы: аутоиндукторы анабиоза – факторы d (производные алкилоксибензолов – АОБ), выделенные и описанные для широкого круга микроорганизмов [Эль-Регистан, 1988;

Батраков с соавт., 1993;

Мулюкин с соавт., 1996;

Бухарин с соавт., 2005]. Возможность использования этих ауторегуляторов для направленной регуляции популяционной вариабельности и стабилизации диссоциантов бактерий представляет интерес для микробиологии, медицины и биотехнологии.

изучить закономерности саморегуляции популяционной Цель работы:

вариабельности спорообразующих и неспорообразующих бактерий, разработать приемы направленного контроля диссоциативных переходов.

Задачи исследования:

1. Изучить популяционную вариабельность бактерий Вacillus licheniformis, B.subtilis, Pseudomonas aeruginosa, P.aurantiaca, реализующуюся при прорастании покоящихся форм различных морфотипов.

2. Охарактеризовать выделенные диссоцианты бактерий по их колониально морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

3. Разработать приемы регуляции популяционной вариабельности бактерий с помощью химических аналогов факторов d1 – алкилоксибензолов (С7-АОБ и С12 АОБ).

4. Изучить возможный механизм действия АОБ в процессах диссоциативных переходов бактерий в тесте возврата к прототрофности клеток ауксотрофного штамма B.subtilis B1733.

Научная новизна.

1. Впервые изучена фенотипическая диссоциация В.licheniformis шт.103, B.subtilis шт.B1733, P.aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558, выделены и описаны колониально-морфологические варианты этих бактерий. 2. Показана зависимость между типом покоящихся форм (ПФ) бактерий и степенью вариабельности микробной популяции при их прорастании: у всех изученных бактерий наибольшей нестабильностью генотипа обладали цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК). 3.

Впервые разработаны приемы регуляции популяционной изменчивости промышленного штамма В.licheniformis 103 при воздействии ауторегуляторных факторов на эндоспоры. Приемы предусматривают как индукцию выщепления минорных вариантов, так и селективное развитие определенного варианта при обработке эндоспор как инокулируемого материала определенными концентрациями АОБ. 4. Изучены возможные механизмы воздействия АОБ в процессах популяционной вариабельности бактерий. В тесте возврата к прототрофности клеток ауксотрофного штамма B.subtilis B1733 показано, что С12 АОБ обладает слабой мутагенной активностью. Обнаружена корреляция между мутагенной активностью С12-АОБ и интенсивностью диссоциативных переходов, которые индуцируются определенными концентрациями АОБов.

Разработаны приемы расширения Практическая ценность работы.

диссоциативного спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий для отбора биотехнологически перспективных вариантов. Приемы включают образование ЦПК, имеющих нестабильный генотип, их рассев на плотные среды и выделение выросших диссоциантов в отдельные клоны, различающиеся свойствами.

На примере конкретного исследования показано, что отдельные диссоцианты псевдомонад, отличающиеся стрессоустойчивостью, могут быть использованы в биотехнологических целях, в частности, при конструировании биосенсоров.

Разработаны приемы направленной регуляции популяционной изменчивости спорообразующих бактерий путем воздействия на вегетативный или споровый инокулят алкилоксибензолами химическими аналогами микробных – ауторегуляторных факторов d1. Установлены концентрационные диапазоны АОБ, предусматривающие как расширение диссоциативного спектра и индукцию выщепления минорных вариантов, так и сужение спектра и селективное развитие определенных из них. Полученные в работе результаты могут быть использованы для: 1) быстрого получения широкого спектра внутрипопуляционных диссоциантов грамположительных и грамотрицательных бактерий;

2) направленного контроля развития необходимого варианта;

3) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на II Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003). По материалам диссертации опубликовано 5 работ: из них 3 статьи и 2 тезиса.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 148 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 253 публикации отечественных и зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 24 таблицами и 30 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили бактерии Bacillus licheniformis шт.103, B.subtilis trpА5 шт.B1733, которые поддерживали на косяках с картофельным агаром, а также Pseudomonas aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558 – поддерживаемые на МПА.

Среды и культивирование. Для роста и получения покоящихся форм бацилл различных морфотипов использовали следующие среды. Среда №1 (для эндоспорообразования): основной солевой состав (г/л): (NH4)2HPO4 – 1,0;

KCI – 0,2;

MgSO47H2O – 0,2;

CaCl2 – 0,2;

FeCl36H2O – 0,001;

MnSO4H2O – 0,0017;

МПБ – 20%;

глюкоза – 0,2%. Среда №2 (для получения цистоподобных рефрактерных клеток – ЦПК): основной солевой состав, бактопептон – 0,3 г/л, глюкоза 4 – 6%.

Среда №3 (агаризованная – БСА, для выявления колониально-морфологических вариантов при высеве на плотную среду бактериальных суспензий из ряда разведений): МПБ и сусло в соотношении 1:1, глюкоза – 2%. Среда №4 (среда Спицайзена для роста B.subtilis) (г/л): (NH4)2SO4 – 2,0;

KH2PO4 – 6,0;

K2HPO4 – 14,0;

цитрат Na – 1,0;

MgSO4*7H2O – 0,2;

глюкоза – 5,0;

агар – 20. Среда №5 (для выявления мутагенной активности АОБ при культивировании ауксотрофного по триптофану шт. B 1733 B. subtilis trpA5): среда №4 и триптофан – 50 мг/л. Значение pH после стерилизации 7,2.

Клетки псевдомонад выращивали на 50%-ном МПБ и на среде М 9 (г/л): глюкоза 2;

КН2РО4-0,1;

(NH4)2SO4-0,5;

К2НРО4-1;

CaCl2-0,2;

MgSO47Н2О-0,1;

дрожжевой экстракт -0,05;

микроэлементы (мг/л): FeSO4-20;

MnCl24Н2О-20;

ZnSO4-0,4;

B(OH)3 0,5;

CuSO45Н2О-0,5;

Na2MoO 42H2О-0,2 (среда №6);

среде №7 – среде того же состава, но с лимитом по источнику азота – (NH4)2SO4–0,1г/л (для получения цистоподобных покоящихся клеток – ЦПК). Значения pH после стерилизации 7,0. В качестве инокулята использовали: для бацилл – суспензию 3-7 суточных эндоспор, для псевдомонад – клетки фазы линейного роста, начальная ОП 0,2 («Specord», = 600нм, l = 10мм). Культивирование проводили в колбах на 250мл (объем среды 50мл) при температуре 280С и перемешивании на качалке с 140 об/мин. ЦПК под действием факторов d1 получали внесением в суспензию клеток бактерий фазы замедленного роста химического аналога ауторегулятора С12-АОБ в концентрациях 1х10-5 – 5х10-3М.

Микробиологические методы. Оптическую плотность клеточных суспензий (ОП) определяли на спектрофотометре “Specord” (=600 нм, =10мм). Массу сухих клеток (МСК) определяли их высушиванием до постоянного веса в течение 24 часов при температуре 105 С. Численность клеток (жизнеспособных) определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве на агаризованные среды бактериальных суспензий из ряда разведений. Для выделения колониально морфологических вариантов исследуемых штаммов и изучения их признаков использовали метод многократных пассажей [Кузнецов, 1974] и метод рассева цистоподобных покоящихся клеток. Индекс диссоциации популяций определяли как долю колоний определенного фенотипа к общему числу колоний.

(%) Термоустойчивость клеток определяли при прогреве клеточных суспензий в ультратермостате “UV-10” при температуре 850С в течение 15 минут с последующим определением числа КОЕ. Микроскопические наблюдения проводили на микроскопе “Amplival” (Германия) с фазово-контрастным устройством.

В качестве Биохимические и физико-химические методы анализа.

химических аналогов факторов d1 использовали С12-АОБ и С7-АОБ – амфифильные соединения (со степенью очистки 99,9%). Выделение ауторегуляторных факторов d1 Pseudomonas aeruginosa проводили, как описано ранее [Светличный с соавт., 1986]. Активность внеклеточных протеаз определяли модифицированным методом Ансона [Грачева, 2003]. Эндогенное дыхание клеток определяли по методу Шольца - Островского на полярографе LP7E в кислородной ячейке объемом 1 мл [Шольц, Островский, 1975].

Ростингибирующую активность (токсичность) Генетические методы.

алкилоксибензолов (С7-, С12-АОБ) оценивали по их влиянию на развитие тестерного штамма В1733 Bacillus subtilis trрА5 на жидкой среде с фактором d1 (АОБ) в сравнении с ростом на контрольной среде без добавления АОБ. Генотоксическое действие алкилоксибензолов выявляли в стандартном тесте без метаболической активации [Maron & Ames, 1983] у ауксотрофного по триптофану штамма В Bacillus subtilis trрА5. Тестирование проводили методом высева на МПА культуры, выросшей в жидкой среде, при внесении соответствующих количеств алкилоксибензолов. Выделение ДНК. Препараты ДНК из клеток B.cereus и B.subtilis выделяли, как описано ранее [Булыгина с соавт., 2002]. ПЦР-фингерпринтинг.

Амплификацию геномной ДНК проводили на приборе Cetus 480 (Perkin Elmers, Швеция) с использованием подобранных праймеров, в том числе, к элементам IS [Sasakawa, 1982]. Выбор праймеров и оптимизация проведения DIR-ПЦР. С помощью ранее разработанного алгоритма [Chaley et al., 1999] был проведен анализ 87 полных геномов микроорганизмов, представленных на тот момент в базе данных Genebank. Это позволило создать набор универсальных олигонуклеотидных праймеров, способных выявлять незначительные изменения в геномах близкородственных бактерий. Для работы были отобраны 24 праймера. Проверку этих праймеров, а также подбор оптимальных условий для DIR-ПЦР проводили на диссоциантах B. cereus и B. subtilis. Амплификацию, выделение и секвенирование 5 концевой области гена 16S рРНК проводили с использованием универсальных праймеров на приборе Cetus 480 (Perkin Elmers, Швеция) с применением термостабильной полимеразы ЛТД”, Москва) согласно BioTaq (“Диалат рекомендациям фирмы-производителя и электрофоретическим разделением продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Секвенированием очищенных фрагментов генов 16S рРНК с помощью набора “Silver Sequencing” (производство Promega, США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями.

проводили с использованием стандартных Статистический анализ математических методов (t-теста Стьюдента) в программе Microsoft Excel-2000.

Критерий вероятности Р0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Внутрипопуляционная вариабельность фенотипов у бактерий Bacillus licheniformis шт. 1.1 Взаимосвязь фенотипической изменчивости Bacillus licheniformis с типом покоящихся форм Известно, что в стационарной фазе роста, в стареющих и длительно хранящихся культурах, представленных, в основном, покоящимися клетками, существенно увеличивается фенотипическая гетерогенность популяции, выщепляются минорные варианты. Для микроорганизмов свойственен полиморфизм покоящихся форм (ПФ), образующихся адаптивно к условиям роста культур. В наших исследованиях были проанализированы популяционные спектры суспензий вегетативных клеток В.licheniformis различного физиологического состояния и ПФ разных морфотипов – эндоспор и ЦПК.

Таблица 1. Соотношение вариантов в первом пассаже рассева (БСА) вегетативных клеток и покоящихся форм разных типов B.licheniformis шт.103.

индекс диссоциации,% формы клеток RM RS M S клетки экспоненциальной фазы 96,3 0,3 0,5 2, клетки стационарной фазы 95,8 1,9 0 2, ЦПК при действии фактора d1 (2,5мМ) 69,2 12,8 1,43 16, эндоспоры 91,8 0 6,1 2, ЦПК получали в естественном цикле развития бактерий в средах, репрессирующих спорообразование и лимитированных по источнику N, что направлено на усиливание биосинтеза факторов d1, индуцирующих образование ЦПК [Мулюкин с соавт., 1996]. Другим способом получения ЦПК было искусственное повышение уровня факторов d1 внесением химического аналога этих ауторегуляторов – С12 – АОБ, в концентрациях 1 – 2,5мМ. Анализ популяционных спектров вегетативных культур и суспензий ПФ показал, что доля минорных вариантов при рассеве покоящихся форм разных морфотипов была всегда выше, чем при рассеве вегетативных клеток. При этом среди покоящихся форм наибольшей нестабильностью генома обладали цистоподобные покоящиеся клетки, при высеве которых на плотные питательные среды уже в первом пассаже наблюдалось резкое увеличение индекса диссоциации (до 25% минорных вариантов) (табл. 1).

Клетки клонов, полученных из однотипных колоний пересевали на плотную среду. Вариантом (диссоциантом) считали клон, сохраняющий колониально морфологические признаки в течение 3-5 пассажей.

Таким образом, на стабильность фенотипа или смену диссоцианта бактерий существенно влияет морфотип покоящихся форм, из которых развивается культура.

1.2 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики диссоциантов B.licheniformis Выделенные после рассева на плотной питательной среде ЦПК, полученных под действием С12 -АОБ или в цикле развития (лимит по N), RM–, RS–, M–, и S-варианты были тождественны вариантам, которые получали традиционным методом многократных пассажей: и те, и другие обладали сходными колониально морфологическими признаками. Следует отметить, что для В.licheniformis характерна высокая стабильность доминантного что обусловливало RM, постоянную реверсию минорных вариантов к доминантному RM –типу.

Выделенные варианты различались длительностью лаг-фазы, удельной скоростью роста и уровнем накопления биомассы при культивировании в стандартных условиях (рис. 1-3).

RM 0, 2,5 RM 0, M M 0, OD 1,5 RS S - RS 0,,ч 0, 0,5 S 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 -0,1 время, ч время, ч Рис.1 Кривые роста вариантов Рис.2 Удельная скорость роста B.licheniformis шт.103 вариантов B. licheniformis 1, 2, 1, 1, 1, Е/мл OD 1,5 0, 1 0, 0, 0, 0, Rm Rs M S Rm Rs S M Рис.3 Накопление биомассы Рис.4 Протеолитическая способность вариантами B. licheniformis вариантов B. licheniformis Помимо показателей роста, варианты существенно различались характеристиками развития культур: спорообразование у диссоциантов при погруженном культивировании имело количественные различия и наблюдалось в разное время. Через 24 часа RS–вариант содержал 100% спорулирующих клеток, доминантный RM – 63%, S – 50%;

выход зрелых спор наблюдался у RS– и RM– вариантов на 2 сутки, у S – на 3 сутки. Варианты различались физиолого биохимическими характеристиками: устойчивостью к антибиотикам (SRM) и активностью внеклеточных гидролаз (рис. 4). Самый медленно растущий вариант (S) обладал максимальной протеолитической способностью, что представляет интерес для биотехнологических целей (табл. 2).

Таблица 2. Основные физиолого-биохимические характеристики диссоциантов B.licheniformis шт. Диссоцианты Rm Rs S M Параметры Продолжительность лаг-фазы,ч 2 1 ч- µ max, 0,35 0,3 0, 0, Урожай (OD) 1,6 1,5 1, 2, 14 10 13 Время выхода на стационар, ч 0,42 0,37 0, 1, Протеолитическая способность (ПС) удельная Таким образом, свойство ЦПК бактерий прорастать на плотных средах гетерогенной по диссоциативному спектру популяцией колоний может быть использовано для быстрого скрининга диссоциантов, представляющих биотехнологический интерес. Частые замещения продуктивных промышленных штаммов непродуктивными требуют постоянной селекции. Предлагаемые приемы получения и рассева ЦПК обеспечивают как селекцию, так и хранение штамма;

они надежны, быстры и экономичны, что определяет их преимущества перед традиционными.

1.3 Регуляция популяционной вариабельности B. licheniformis Изучение возможности направленного контроля развития необходимого варианта является актуальным для биотехнологических производств. Так как промышленные бациллярные культуры хранят в виде эндоспор, следующей задачей было исследование возможности сужения диссоциативного спектра культур промышленного штамма B.licheniformis 103 при использовании в качестве инокулята эндоспоры доминантного RM-варианта. Так как стадийность развития бактериальных культур (переход в стационарную фазу и образование ПФ) связана с накоплением в культурах ауторегуляторных фd1, фd2, и изменением их баланса [Эль-Регистан, 1988;

2006], было исследовано влияние химического аналога фd (С12-АОБ) на диссоциативную активность культур, засеваемых эндоспорами B.licheniformis. Задачей исследований было изменение диссоциативного спектра и его регуляция, направленная на развитие продуктивного (по протеазам) S-варианта.

Прединкубация эндоспор различной степени зрелости (1-7 сут) с С12-АОБ в разных концентрациях в течение разного времени (1-3 час) влияла на процент прорастания спор и индекс диссоциации. Был подобран режим с использованием 7 ми суточной споровой суспензии и их прединкубацией с С12-АОБ в концентрациях 0,005 – 0,05% в течение 1 часа, обеспечивающий развитие популяции, в которой до 43% клеток было представлено S-типом (табл. 3). Выявленный эффект относится к феномену индукции диссоциативных переходов. В других вариантах опытов при рассеве суспензии эндоспор на агаризованной среде с внесенным в нее фактором d также было обнаружено изменение индекса диссоциации развивающейся популяции (табл.4).

Таблица 3. Основные направления диссоциации доминантного R-варианта B.licheniformis шт. 103 при действии на эндоспоры C12-АОБ.

Концентрации C12-АОБ, Основные направления диссоциации индуцирующие диссоциацию, % 1-суточные споры 0 R - M (1,6%) 0,005 R - S (1,75%) 0,05 R - R (100%) 0,1 R - R (100%) 0,2 R - R (100%) 3-суточные споры 0 R - S (6.8%) 0,005 R - S+M (8.76%) 0,05 R - S+M (4,11%) 0,1 R - S (1.98%) 0,2 R - S (8.3%) 7-суточные споры 0 R - R (100%) R - S (36.6%) 0, R - S (31.18%) 0, R - S (43.2%) 0, 0,2 R - S (30.43%) Таблица 4. Диссоциация доминантного варианта (Rm) B.licheniformis шт.103 под действием С12-АОБ (внесение в твердую питательную среду), посев 7-суточными спорами Индекс диссоциации на различные КОЕх107, Концентрация колониально-морфологические варианты, % С12-АОБ, % клеток/мл Rm Rs M S контроль 8,4±1.59 81.2 2.4 2.3 4. 0.0005 5,8±1.08 59 1.3 0 39. 0.001 3,4±0.61 72.6 5.1 1.3 Таблица 5. Диссоциация доминантного варианта B.licheniformis шт.103 при прорастании эндоспор, полученных при развитии культур с дополнительно внесенным С12-АОБ Индекс диссоциации на различные В культурах инокулята колониально-морфологические варианты, % КОЕх107, Концентрация Rm Rs M S С12-АОБ, % клеток/мл 0 (контроль) 60±10.9 81.5 2.1 13.1 3. 0.00002 40±8.1 67.7 0 11,8 20. 0.0001 43±8.3 40.5 6.3 0 53. 0.002 5±0.88 72.2 3.2 0 24. В этом случае индуцируется диссоциативный переход RмS, а также происходит селекция развития S-варианта условиями культивирования, так как среды различаются концентрацией С12-АОБ. Третий способ состоял в том, что С12-АОБ в подобранных концентрациях вносили в среду роста, в которой выращивали культуры до стадии созревания спор. Полученные таким образом споры использовали в качестве инокулята для опытных культур. В этом варианте в развивающейся популяции было до 53% клеток, дающих колонии S-типа (табл. 5). В этом случае условия прорастания эндоспор и роста клеток были стандартные, но посевной материал различался диссоциативной способностью. Выявленное изменение диссоциативного спектра популяций, вырастающих при рассеве эндоспор, которые были получены в культурах с дополнительно внесенным С12 АОБ представляет как практический, так и теоретический интерес, так как в этом случае выщепление и развитие альтернативных вариантов (S-тип 53%) демонстрирует адаптивный потенциал культуры (табл. 5).

Таким образом, показана возможность регуляции популяционной изменчивости бациллярных культур воздействием химического аналога (С12-АОБ) фd1 на эндоспоровый инокулят. Направленным изменением концентрации фd1 можно индуцировать выщепление вариантов с желаемыми свойствами, или стабилизировать развитие определенных вариантов с необходимыми признаками, что может быть использовано в биотехнологических целях или для хранения коллекционных штаммов этих микроорганизмов.

1.4 DIR-ПЦР Применение метода для идентификации внутрипопуляционных диссоциантов B.cereus и B.subtilis Следующая часть работы была посвящена выяснению возможности генотипирования внутрипопуляционных вариантов бацилл, различающихся устойчивыми фенотипическими признаками, в данном случае, колониально морфологическими свойствами. Для этого были получены ПЦР-фингерпринты ДНК B.cereus и B.subtilis с использованием как одиночных, так и пар праймеров.

Практически все фингерпринты отличались между собой по числу, размерам и интенсивности полос. Причем если у диссоциантов B.subtilis происходило исчезновение одного-двух фрагментов при сохранении общей картины фингерпринта, то для диссоциантов B.cereus выявились отличия, наиболее значительные у белого варианта. Чтобы убедиться, что такие различия не являются результатом гетерогенности культур диссоциантов B.cereus, для них были определены нуклеотидные последовательности 5’-вариабельной области гена 16S рРНК. Процентный анализ не выявил по этой характеристике отличий у изучаемых диссоциантов, что подтверждает их культуральную чистоту. Кроме того, стабильность получаемых фингерпринтов проверялась постановкой ПЦР на препаратах ДНК, выделенных из разных пассажей всех типов диссоциантов.

Характер полученных паттернов был стабилен, что исключает фактор случайности.

Таким образом, эксперименты показали, что проявление и развитие различных типов диссоциантов обусловлено устойчивыми геномными перестройками. В целом, продемонстрированная стабильность получаемых фингерпринтов позволяет использовать метод DIR-ПЦР для идентификации отдельных штаммов бактерий, Работа проводилась совместно с сотрудниками центра «Биоинженерия» РАН Б.Б.Кузнецовым, к.б.н. Е.С.Булыгиной и к.б.н. С.И.Цыганковой, за что автор выражает им большую благодарность принадлежащих к вышеуказанным группам, что может быть применено при создании молекулярного паспорта конкретного штамма.

Глава 2. Популяционная вариабельность Pseudomonas aurantiaca и P.aeruginosa Зависимость популяционной вариабельности от морфотипа клеток, из которых развиваются микробные популяции, была подтверждена при работе с неспорообразующими псевдомонадами P.aurantiaca шт.В1558 и P.aeruginosa шт.К2.

Исследовалась диссоциация культур, развивающихся из вегетативных клеток, а также из цистоподобных покоящихся форм псевдомонад, которые образовывались в естественном цикле развития бактерий или при искусственном внесении химического аналога фактора d1 – С12-АОБ.

2.1 Образование покоящихся клеток Р.aurantiaca и P.aeruginosa Покоящиеся формы Р.aurantiaca и P.aeruginosa были получены в цикле развития культур при модификации условий культивирования – создании дисбаланса по источнику азота (лимит N в 5 раз), что было направлено на усиление биосинтеза фактора d1.

В других экспериментах ПФ псевдомонад получали внесением С12-АОБ в культуры начала стационарной фазы роста до конечных концентраций 1х10-4М– 5х10-4М. Образующиеся в цикле развития и полученные искусственно ПФ обладали всеми характеристиками цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) бактерий:

отсутствием эндогенного дыхания клеток;

длительным (1,5 года) сохранением жизнеспособности особенностями их ультраструктурной (КОЕ=10–45%), организации.

2.2 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические свойства фенотипических диссоциантов P.aurantiaca шт. В При рассеве ЦПК P.aurantiaca, полученных в цикле развития бактерий или при воздействии С12-АОБ, наблюдалась диссоциация с выщеплением: более пигментированного Р-варианта и варианта R-типа, отличавшихся по колониально морфологическим признакам от доминантного S-варианта. Частота появления диссоциантов P- и R-типа зависела от концентрации С12-АОБ, используемого для образования ЦПК, и возраста (времени хранения) цистоподобных клеток (табл.6). В частности переход SR с частотой 45-67%, обеспечивался воздействием С12-АОБ в - концентрации 1x10 M на 3- и 20-суточные ЦПК. Вариант R-типа был менее стабилен, судя по уменьшению частоты его встречаемости по мере хранения ЦПК.

Р-вариант выщеплялся со стабильной частотой при рассеве ЦПК, полученных при воздействии С12-АОБ в концентрации 1x10-4M, а при воздействии 2,5Х10-4М частота появления Р-варианта возрастала с увеличением возраста ЦПК и он замещал доминантный S-вариант.

Таблица 6. Зависимость частоты появления вариантов Р.aurantiaca R- и Р-типа от концентрации вносимого С12-АОБ и времени инкубации ЦПК (в контрольных культурах популяция была представлена клетками S-диссоцианта) Доля диссоциантов, % от общего числа колоний Концентрация, С12-АОБ, М 3 суток 20 суток 40 суток S 8 36 - 1x10 P 25 19 R 67 S 75 57 2,5Х10-4 P 10 38 R 15 5 Следует отметить, что при высеве контрольных клеточных суспензий без внесения С12-АОБ диссоцианты R- и Р-типа не выявлялись.

Диссоцианты S-, P- и R-типа различались скоростью роста, устойчивостью к антибиотикам, активностью внеклеточных протеаз (табл. 7).

Таблица 7. Колониально – морфологические и физиолого – биохимические признаки вариантов Р.аurantiaca Ростовые Устойчивость к антибиотику, Активность внеклеточных характеристики * мкг/мл протеаз, Ед/л Вар - µmax ч стрептомицин тетрациклин Y IC50=170 IC50= R 0,7г/МСК 0,035 5, IC70=310 IC70= IC50=190 IC50= S 0,65г/МСК 0,024 14, IC70=375 IC70= IC50=235 IC50= P 0,046 1г/МСК IC70=405 IC70= *Среда с лимитом по азоту 2.3 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические свойства фенотипических диссоциантов P.aeruginosa шт. К Следующим объектом исследования был другой вид псевдомонад P.aeruginosa, включающий биотехнологически важные, а также патогенные штаммы. При рассеве ЦПК, полученных под воздействием С12-АОБ, были селекционированы S-, R-, M варианты. Выделенные варианты были идентичны по своим свойствам вариантам, которые получали традиционным методом многократных пассажей. Варианты различались колониально-морфологическими признаками, скоростью роста, устойчивостью к антибиотикам, активностью внеклеточных протеаз. Наиболее интересно, что диссоцианты различались также продуктивностью синтезируемых АОБ (табл.8).

Таблица 8. Колониально–морфологические и физиолого–биохимические признаки вариантов Р. аeruginosa Устойчивость к Активность АОБ, Вари Описание колоний тетрацикли-ну, внеклеточных мкг/мл анты протеаз, мЕ/мл IC,мкг/мл КЖ клет.

Гладкие, выпуклые, S блестящие, с резко IC70=90 98,6 253.7 41. очерченными краями.

Шероховатые, со складчатой матовой R IC70=75 85,3 303 87. поверхностью, с неровными краями.

Крупные, слизистые, растекающиеся, M IC70=60 104 58. 319. блестящие, более светлые, чем S Полученные данные о различии синтеза АОБ отдельными диссоциантами адекватно объясняли динамику популяционного состава поликультуры (R+M) при засеве клетками R- и M-типов (%, 40:60) (рис.5).

ОП, едх100 pH 2 доля,% М-диссоцианта 50 M 0 5 10 24 30 50 70 76 93 126 140 155 163 190 210 234 0 5 10 24 30 50 70 76 93 126 140 155 163 190 210 234 время, час Рисунок 5. Динамика роста и состав популяции бинарной культуры R- и М диссоциантов P.aeruginosa. 1 – оптическая плотность культуры (ОПх100);

2 – рН среды;

3 – удельная доля М-диссоцианта, % КОЕ.

В цикле развития R+M культуры доля М-клеток в популяции увеличивалась дважды – в лаг-фазе и фазе отмирания культуры. Эти изменения вряд ли были связаны с трофическими факторами, так как в первом случае среда была полноценной, а во втором – истощённой. Возможное объяснение – это селекция М диссоцианта более стрессоустойчивого и имеющего низкую скорость роста.

Повышение уровня АОБ в условиях стресса в лаг-фазе роста (стресс новой среды) и в стареющей культуре (стресс голодания), типичное для динамики развития микробных культур [Светличный с соавт., 1986;

Эль-Регистан с соавт., 2006], может быть причиной индукции диссоциативного перехода и повышения доли (%) М-варианта. Этому объяснению не противоречат данные по устойчивости диссоциантов Р. аeruginosa к иммобилизации в полиакриламидный гель.

2.4 Устойчивость диссоциантов P.aeruginosa шт.К2, иммобилизованных в ПААГ Целью экспериментов было определение влияния условий выращивания культур диссоциантов псевдомонад и уровня экзогенного С12-АОБ на жизнеспособность клеток при их иммобилизации в микрообъемах ПААГ (на клеточном микрочипе).

Работа проводилась совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии РАН Д.О.Фесенко и Т.В.Наседкиной, за что автор выражает им большую благодарность Варианты P.aeruginosa шт.К2 выращивали на средах, предусматривающих образование ЦПК (при дисбалансе источников питания и lim N и P). Аликвоты культур, содержащих полученные таким образом клетки, были иммобилизованы в ПААГ и применены при конструировании биочипов. После хранения полученных чипов (20 сут) определяли способность иммобилизованных клеток возобновлять рост и делиться. Маркером был витальный краситель SYTO 9. Флюоресценцию микрочипа регистрировали при возбуждения/регистрации нм.

485/ Наибольшей устойчивостью обладали клетки М-варианта, выращенные в условиях lim N (рис. 6), что коррелирует с высоким уровнем внеклеточных АОБ, синтезируемых этим диссоциантом (табл.8).

Рис. 6. Сравнительный анализ сохранения жизнеспособности покоящихся клеток разных вариантов P.aeruginosa шт.К2 при иммобилизации в микрообъемах ПААГ (на клеточном микрочипе).

Таким образом, разработаны приемы расширения диссоциативного спектра грамотрицательных бактерий для отбора биотехнологически перспективных вариантов. Приемы включают образование ЦПК, имеющих нестабильный генотип, их рассев на плотные среды и выделение выросших диссоциантов в отдельные клоны, различающиеся свойствами, в том числе стрессоусойчивостью. На примере конкретного исследования показано, что отдельные диссоцианты псевдомонад могут быть использованы в биотехнологических целях, в частности при конструировании биосенсоров.

Глава 3. Участие ауторегуляторных факторов d1 (АОБ) в регуляции популяционной вариабельности бактерий Последняя часть работы посвящена анализу возможных механизмов участия АОБ в процессах вариабельности бактериальных культур. Ранее, при изучении механизмов действия фd1 бактерий – алкилоксибензолов был сделан вывод об их полимодальности. АОБ способны непосредственно взаимодействовать с биополимерами (белками и НК). При комплексообразовании с ферментными белками АОБ вызывали изменение их конформации, следствием чего является стабилизация и модуляция функциональной активности [Беспалов с соавт., 1998;

Колпаков с соавт., 2000;

Мартиросова с соавт., 2004]. Можно предположить аналогичное действие на белковые макромолекулы, вовлеченные в регуляцию диссоциативных переходов на уровне образования транскриптов. Другой вариант участия АОБ в индукции фенотипической диссоциации может быть обусловлен их непосредственным взаимодействием с ДНК [Kozubek et.al., 1999;

Давыдова с соавт., 2005;

2006] и, таким образом, влиянием на модификацию генетического материала клетки. Изменения структурной организации ДНК обуславливают возможность индукции обратимых мутаций, понимая под мутациями направленные внутригеномные перестройки [Прозоров, 2001]. Гипотезу, согласно которой контролирующим механизмом диссоциации бактерий на популяционном уровне являются взаимодействия АОБ с ДНК, проверили в тесте реверсии к прототрофности клеток штамма B. subtilis trpA5 B1733, ауксотрофного по триптофану.

3.1 Влияние (токсичность) факторов d1 на рост бактерий Для корректной оценки возможного влияния химических аналогов фd1 (С7-, С12 АОБ) на геном клетки, необходимо было определить интервал концентраций исследуемых веществ, в которых их ростингибирующая активность не перекрывала бы прогнозируемый мутагенный эффект.

Влияние АОБ на рост B. subtilis trpA5, культивируемого в жидкой среде, зависело от гидрофобности АОБ и имело дозозависимый характер. С7-АОБ в исследуемом диапазоне (0,005–0,5мМ) концентраций не вызывал ингибирования роста, хотя в высоких концентрациях обуславливал увеличение времени лаг-фазы и использовался в указанных концентрациях.

Более гидрофобный С12-АОБ, напротив, оказывал ростингибирующее действие, что коррелирует с данными о возрастании влияния на функциональную активность мембран АОБ с более гидрофобными свойствами [Эль-Регистан с соавт., 2006]. Ростингибирующее действие С12-АОБ выражалось в увеличении времени лаг-фазы (0,05 – 0,005мМ), снижении удельной скорости роста (0,05 и 0,005мМ), снижении выхода биомассы и полном отсутствии роста (при концентрации 0,5мМ).

На основании этих результатов в дальнейших исследованиях использовали С12 АОБ в концентрациях ниже 0,5 мМ.

3.2 Мутагенный эффект АОБ В опытах был использован штамм B. subtilis trpA5 B1733. О наличии мутагенного действия АОБ судили по их влиянию на возврат ауксотрофных клеток к прототрофности. Значимым считали двукратное превышение числа ревертантов над спонтанным уровнем реверсий в контроле (без внесения АОБ). Были использованы два гомолога АОБ, различающиеся гидрофобностью.

Суспензии делящихся и стационарных (пролиферативно покоящихся) клеток обрабатывали растворами С7-, С12-АОБ в концентрациях, не вызывающих ингибирования роста культуры. В вариантах с использованием С12-АОБ частота реверсий в суспензиях активно растущих клеток увеличивалась на порядок в области концентраций свыше 0,025мМ (табл.9). В этих же условиях С7-АОБ проявлял слабый мутагенный эффект, частота реверсий не превышала спонтанный фон более чем в 2-5 раз (табл.10).

У стационарных клеток С12-АОБ в концентрациях 0,25 – 0,5мМ вызывал повышение частоты возникновения ревертантов в 4 и 125 раз. Отметим, что при концентрации 0,25мМ ростингибирующего эффекта АОБ не было, в отличие от обработки пролиферирующих клеток. В то же время, при обработке суспензий стационарных клеток С7-АОБ не только не проявил мутагенной активности, но, напротив, продемонстрировал антимутагенный эффект (частота реверсий снизилась в 2 раза).

Особого внимания заслуживает тот факт, что при внесении как С12-АОБ, так и С7 АОБ в суспензии делящихся или стационарных клеток параллельно с повышением частоты возникновения ревертантов над спонтанным фоном наблюдали и увеличение индекса диссоциации популяций. В варианте добавления в суспензию пролиферирующих клеток С12-АОБ (0,025мМ) частота реверсий возросла в раза при одновременном увеличении доли минорного S варианта до 87,5%. При обработке клеток стационарной фазы С12-АОБ в концентрациях 0,05 и 0,25мМ индекс диссоциации (доля S варианта) 50 и 84% соответствовал частоте реверсий, превышающей спонтанный фон в 4 и 125 раз соответственно.

Таблица 9. Частота реверсий к прототрофности и диссоциация доминантного варианта (R) B. subtilis trpA5 шт.В1733 под действием С12-АОБ Индекс диссоциации, % Частота KOE/мл, реверсий, x10- С12-АОБ, мМ x10 R S Экспоненциальная фаза роста 0 6,6 100 0 0,025 113 12,5 87,5 85,6 (43) 0,05 13 100 0 18,7 (9,5) 0,25* 31,25 68,8 3300 (1650) Стационарная фаза роста 0 20 100 0 0,025 10 100 0 12, 0,05 20 50 50 40 (4) 0,25 125 16 84 1250 (125) * не корректно, приведено для сравнения Таблица 10. Частота реверсий к прототрофности и диссоциация доминантного варианта (R) B. subtilis trpA5 шт.В1733 под действием С7-АОБ Индекс диссоциации, % Частота KOE/мл реверсий, х10- С7-АОБ, мМ x10 R S Экспоненциальная фаза роста 0 2 75 25 2, 0,025 2,5 100 0 0,05 3,5 71,4 28,6 3,9 (2) 2 60 40 5 (2,5) 0, 0,5 2,5 9 (4,5) 20 Стационарная фаза роста 0 10,5 85,7 14,3 0,025 9,5 100 0 3, 0,05 6 83,4 16,6 1, 0,25 10 95 5 3, 0,5 5 100 0 1, Важно подчеркнуть, что выявленные эффекты АОБ подтверждают показанные ранее их действие как эндогенных мутагенов [Маргулис с соавт., 2003], в низких концентрациях, вызывающих внутригеномные перестройки, которые являются причиной диссоциативных переходов, невидоспецифично. Это открывает практические возможности использования фd1 для (алкилоксибензолов) направленной регуляции популяционной вариабельности и стабилизации диссоциантов бактерий различных таксонов.

ВЫВОДЫ:

Впервые изучена фенотипическая диссоциация грамположительных 1.

спорообразующих бактерий В.licheniformis шт.103, шт.B1733 и B.subtilis грамотрицательных неспорообразующих бактерий P.aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558, выделены колониально-морфологические варианты этих бактерий и охарактеризованы по их физиолого-биохимическим свойствам: ростовым характеристикам, стрессоустойчивости, продуктивности внеклеточных гидролаз.

2. Установлена зависимость между типом покоящихся форм и степенью диссоциации бактериальных популяций при их прорастании. Показано, что наибольшей нестабильностью генотипа обладают цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК) спорообразующих и неспорообразующих бактерий. Метод получения ЦПК с их последующим рассевом на плотные среды может быть использован для быстрого скрининга вариантов с необходимыми признаками.

На примере и продемонстрирована возможность 3. B.cereus B.subtilis генотипирования популяционных диссоциантов методами с DIR-ПЦР использованием случайных праймеров.

4. Установлено, что изменение уровня АОБ в инокулируемом материале изменяет диссоциативный спектр развивающейся из него популяции. Для спорообразующих бактерий В.licheniformis выявлены концентрации, способствующие расширению диссоциативного спектра, или, напротив, стабилизирующие развитие определенных вариантов.

Возможным механизмом действия АОБ в процессах популяционной 5.

вариабельности бактерий, по-видимому, является их функционирование как эндогенных мутагенов. В тесте с ауксотрофным штаммом B.subtilis B обнаружена корреляция между частотой реверсий и интенсивностью диссоциативных переходов, которые индуцируются определенными концентрациями С12-АОБ.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Цыганкова С.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Хабибуллин С.С., Дорошенко Е.В., Коротков Е.В., Эль-Регистан Г.И. Получение внутрипопуляционных диссоциантов некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации // Микробиология. – 2004. – Т.73, №3. –С.398-405.

2. Милько Е.С., Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А, Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И.

Динамика роста и состава популяций смешанных культур R-, S- и M-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa // Микробиология. – 2005. – Т.74, №3. – С.

3. Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Голод Н.А., Милько Е.С., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция фенотипической диссоциации у Bacillus licheniformis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммуннологии. – 2006. – Т.75, №6. – С.9-13.

4. Хабибуллин С.С., Фесенко Д.О., Наседкина Т.В., Голод Н.А., Зайцева А.А.

Применение стабилизированных клеток бактерий для создания биочипов // II-ого Материалы Международного конгресса состояние и «Биотехнология:

перспективы развития». 10-14 ноября 2003. Москва. – Т.2. – С.223-224.

5. Цыганкова С.В., Хабибуллин С.С., Лойко Н.Г., Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Коротков Е.В., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Регуляция фенотипической диссоциации бактерий // Материалы II-ого Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 10-14 ноября 2003.

Москва. – Т.1. – С.16-17.