Аэробные аноксигенные фототрофные бактерии щелочных местообитаний
На правах рукописи
БОЛДАРЕВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА АЭРОБНЫЕ АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ЩЕЛОЧНЫХ МЕСТООБИТАНИЙ Специальность 03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва, 2008 2
Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН доктор биологических наук
Научный консультант:
В.М. Горленко доктор биологических наук
Официальные оппоненты:
Л.М. Герасименко доктор биологических наук Р.Н. Ивановский Институт биохимии и физиологии
Ведущая организация:
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина
Защита диссертации состоится «» июня 2008 г. в ч.
На заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат диссертации разослан «» мая 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы: Аноксигенные фототрофные бактерии (АФБ) представляют собой филогенетически разнородную группу микроорганизмов, содержащих несколько типов хлорофиллов, которые принято называть бактериохлорофиллами. К настоящему времени известны бактериохлорофиллы а, b, c d, e, g, отличающиеся от хлорофилла а незначительными заменами в боковых радикалах магний-порфиринового кольца. Фотосинтез АФБ отличается от фотосинтеза цианобактерий, водорослей и высших растений тем, что вода не может служить донором электронов и кислород не образуется в процессе фотосинтеза. Фотоассимиляция СО2 происходит при участии только одной фотосистемы и зависит от использования внешних доноров электронов, таких как восстановленные соединения серы, молекулярный водород или органические соединения. АФБ подразделяют на следующие филогенетические группы: зеленые серобактерии;
зеленые нитчатые (несерные) бактерии;
гелиобактерии;
серные пурпурные бактерии;
несерные пурпурные бактерии;
аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии (АБС). Представители этих групп различны по морфологии, цитологии, пигментному составу и физиологии.
Для первых пяти групп АФБ, которые являются анаэробами, фотосинтез основной тип метаболизма. Аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии (АБС) принципиально отличаются от типичных АФБ тем, что для них респираторный метаболизм является главным энергетическим процессом, а фотосинтез дает не более 10-50 % дополнительной энергии. Важно отметить, что доказательства протекания аноксигенного фотосинтеза представлены лишь для немногих из описанных видов АБС (Harashima et al, 1982;
Wakao et al., 1996). В настоящее время известно свыше 30 родов АБС, большинство из которых принадлежат альфа-подгруппе Протеобактерий. Лишь один вид принадлежит к бета-Протеобактериям и один к гамма-Протеобактериям.
Существует мнение, что АБС являются промежуточным звеном между пурпурными бактериями и аэробными хемотрофными бактериями. Таким образом, способность к альтернативному аэробному метаболизму у несерных пурпурных бактерий (НПБ) можно рассматривать как эволюционный этап на пути образования облигатно аэробных бактерий.
За последнее время было установлено, что АБС широко распространены в воде аэробной зоны морей и мирового океана, составляя от 11 до 16 % от общего числа бактерий. Таким образом, можно предположить, что АБС играют заметную роль в круговороте углерода в планетарном масштабе.
Ранее было показано, что содовые озера содержат различные группы АФБ, представленные новыми видами и родами пурпурных серобактерий и гелиобактерий. Все они приспособлены к жизни при высоких значениях рН, а многие являются натронофилами или галоалкалофилами (Брянцева, 2000).
Экология и разнообразие АБС в эпиконтинентальных содовых озерах была практически не изучена. К моменту начала наших работ был описан лишь один род и вид алкалофильных АБС Roseinatronobacter thiooxidans (Сорокин и др., 2000). Этот вид оказался филогенетически близок к единственной известной алкалофильной несерной пурпурной бактерии Rhodobaca bogoriensis (Milford et al., 2000). Очевидно, что изучение разнообразия АБС в щелочных местообитаниях, а также исследование свойств новых алкалофильных представителей АБС и факультативно аэробных НПБ даст возможность прояснить пути эволюции прокариотных микроорганизмов и таких важнейших энергетических процессов, как фотосинтез и дыхание.
Целью настоящей работы являлось сравнительное изучение распространения, филогенетического положения, способности к фотосинтезу и других особенностей физиологии у аноксигенных фототрофов АБС и факультативно аэробных НПБ, обитающих в содовых озерах и щелочных термальных источниках.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить распространение аноксигенных АБС и НПБ, способных к аэробному росту, и их приспособленность к жизни в различных щелочных местообитаниях: содовых озерах и гидротермах.
2. Выделить чистые культуры новых штаммов АБС и факультативно аэробных НПБ, исследовать их физиолого-биохимические признаки, таксономическое и филогенетическое положение.
3. Определить способность к фотосинтетическому переносу электронов у алкалофильных АБС. Изучить основные компоненты электронно транспортной цепи, участвующие в фотосинтезе и дыхании у типового вида алкалофильной АБС Roseinatronobacter thiooxidans.
4. Провести сравнительное исследование морфо-физиологических свойств у филогенетически близких алкалофильных видов АБС и факультативно аэробных НПБ с целью подтверждения их эволюционного родства.
5. Выявить способность к восстановлению солей теллура и селена аэробными бактериохлорофилл а-содержащими бактериями и несерными пурпурными бактериями.
Научная новизна. Результаты проведенных исследований расширяют представления о видовом и функциональном разнообразии АБС и НПБ бактерий в щелочных местообитаниях. Выделены и идентифицированы новые алкалофильные виды АБС – “Roseinatronobacter monicus” sp. nov., “Roseinatronobacter doroninskoensis” sp. nov, “Roseococcus suduntuyensis” sp.
nov., “Roseococcus volcanoes” sp. nov. и НПБ – “Rhodobaca barguzinensis” sp.
nov., “Rubribacter polymorphus” gen. nov., sp. nov. Обнаружены новые экотипы АБС Porphyrobacter donghaensis из слабоминерализованного содового озера и термального щелочного источника. Этот вид ранее считался морским.
Получены новые доказательства филогенетического родства АБС и факультативно аэробных НПБ. Впервые установлена фотосинтетическая активность и изучены компоненты фотосинтетической и дыхательной электронно-транспортной цепи у алкалофильных аэробных бактериохлорофилл а-содержащих бактерий.
Практическая значимость. Показано широкое распространение АФБ в содовых озерах, что позволяет говорить об их существенной роли в круговороте углерода в этих водоемах. Установлена способность к восстановлению солей теллура и селена исследованными аэробными бактериохлорофилл а-содержащими бактериями и несерными пурпурными бактериями, что делает их привлекательным объектом для использования в биоремедиации щелочных минерализованных промышленных сточных вод и в биометаллургии.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих научных конференциях: Международная конференция «Водные экосистемы, организмы, инновации» (Москва, 2005);
Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005);
III-я Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006);
II Международная молодежная школа конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006);
The young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology” (Odessa, Ukraine, 2007);
2-й Байкальский микробиологический симпозиум с международным участием (Иркутск, 2007);
III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано экспериментальные статьи и 7 тезисов, 2 статьи приняты к печати.
Место проведения работы. Работа выполнялась в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им.
С.Н. Виноградского РАН. Анализ состава каротиноидов и пигментбелковых комплексов, фотоингибирования дыхания и состав компонентов электронно транспортной цепи проводили совместно с д.б.н. А.А. Москаленко, д.б.н.
В.А.Бойченко, М.Ф. Янюшиным, д.б.н. И.Н. Стадничуком и д.б.н. Е.П.
Лукашевым (Институт фундаментальных проблем биологии РАН и Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Биологический факультет МГУ им. М.В.
Ломоносова, Москва). Молекулярно-биологическая часть работы проводилась в сотрудничестве с Туровой Т.П., Лысенко А.М., Детковой Е.Н. (ИНМИ РАН), Колгановой Т.В., Булыгиной Е.С. (Центр «Биоинженерия»).
Работа была выполнена при поддержке грантов: Программа Президиума РАН «Поддержка молодых ученых», «Молекулярная и клеточная биология», а также грантов РФФИ.
Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым выше участникам работы, сотрудникам и аспирантам лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН, а также Намсараеву Б.Б. и сотрудникам лаборатории микробиологии ИОЭБ БНЦ СО РАН за помощь в проведении экспедиции и обработке результатов. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н.
профессору Горленко В.М.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают _ рисунков и _ таблиц.
Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Выводы», «Список литературы», включающий в себя наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Объектами полевых исследований служили степных содовых озер и 2 щелочных термальных источника, расположенные в Бурятии и Читинской области, а также озеро Моно Лейк (Калифорния, США) (таблица 1). В лабораторных экспериментах использовали 14 штаммов новых бактериохлорофилл а-содержащих бактерий и 4 штамма НПБ, способных к аэробному росту. Для сравнения были взяты типовые штаммы Roseinatronobacter thiooxidans (AF249749), Rhodobaca bogoriensis (AF248638 ), Porphyrobacter donghaensis (AY559428), а также Rhodobacter blasticus штамм Rb5.
Выделение и культивирование. Для культивирования АБС и НПБ, способных к аэробному росту, использовали агаризованую среду (2 %) следующего состава (г/л): NH4Cl – 0.4;
KH2PO4 – 0.5;
MgCl2 – 0.2;
Na2SO4 – 0.5;
дрожжевой экстракт – 1;
ацетат Na – 1;
пируват Na – 1;
пептон – 1;
соетон – 1;
Na2S2O3.5H2O – 1;
KCl – 0.5;
витамин В12 –10 мкг/л;
раствор микроэлементов по Пфеннигу (Pfennig, 1978) – 1мл/л;
содержание NaCl в среде соответствовало минерализации воды природного местообитания. Растворы NaHCO3 (10 %), Na2CO3 (10 %) готовили и стерилизовали отдельно, а затем вносили необходимое количество в основную среду непосредственно перед посевом.
Щелочность среды устанавливали близкой к рН природного источника.
Культивирование АБС проводили аэробно в темноте в конических колбах объемом 500 мл, содержащих 200 мл питательной среды. Культивирование НПБ проводили анаэробно на свету в закрытых резиновыми пробками пенициллиновых флаконах, полностью заполненных средой, а также выращивали аэробно в темноте как АБС бактерии. Анаэробные посевы экспонировали при освещенности 2000 люкс и температуре 25 - 30 °С.
Очистку культур проводили аэробно на чашках Петри на плотной среде указанного состава, а так же в пробирках с агаром (0.7 %) для НПБ, путем ряда последовательных пересевов отдельно выросших пигментированных колоний.
Чистоту культур контролировали микроскопированием и по отсутствию колоний посторонних микроорганизмов.
Изучение морфологии и ультратонкого строения клеток. Морфологию бактерий изучали в световом микроскопе Olympus с фазовым контрастом, а также с использованием электронного микроскопа. Тотальные препараты контрастировали 0.2 % водным раствором уранилацетата. Для получения ультратонких срезов клетки обрабатывали по методу Келленберга. Для контрастирования использовали реактив Рейнольдса (Reynolds, 1963).
Тотальные препараты и ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Jeol JEM – 100C (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Методы изучения пигментного состава клеток. Пигментный состав бактерий исследовали в суспензиях, обработанных ультразвуком, а также в ацетон-метанольных (7:2) экстрактах. Спектры поглощения пигментов записывали на спектрофотометре СФ 56а «ЛОМО» (Россия) или Cary50, детектор с диодной матрицей SPD M-20A «Shimadzu» (Япония). Разделение каротиноидов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Москаленко и др., 2004).
Изучение физиологических свойств. Об отношении исследуемых штаммов к кислороду судили по расстоянию зоны роста от поверхности столбика с агаризованной средой.
Влияние рН и солености на АБС и НПБ изучали в жидкой среде.
Относительный прирост биомассы определяли измерением оптической плотности культуры при 650 нм на фотометре КФК-3 (Россия). Оптимальное значение рН устанавливали, используя разные соотношения карбоната и бикарбоната натрия, сохраняя одинаковую суммарную молярную концентрацию карбонатов. Температурный оптимум и пределы развития микроорганизмов определяли с использованием градиентного термостата.
Для определения спектра потребляемых субстратов в аэробных условиях для АБС, а также в аэробных и анаэробных условиях для НПБ использовали минеральную среду, не содержащую органических веществ, с дрожжевым экстрактом в качестве витаминной добавки (0.01 г/л). Испытуемые вещества вносили в концентрации 1 г/л.
Изменения концентрации сульфида регистрировали колориметрически (Trper & Schlegel, 1964). Содержание сульфата определяли нефелометрически, тиосульфат - йодометрическим титрованием (Резников и др., 1970).
Способность окислять тиосульфат и другие восстановленные соединения серы штаммами Roseinatronobacter изучали, измеряя дыхание отмытых клеток при добавлении субстрата. С этой целью использовался полярограф («Yellow Spring Co», Ohio, USA) с использованием электрода Кларка (Сорокин и др., 2000).
Чувствительность к антибиотикам выявляли при аэробном росте бактерий на чашках Петри по размеру зоны отсутствия роста возле дисков, содержащих исследуемый антибиотик (Нетрусов и др., 2005).
Способность исследуемых штаммов к анаэробному росту за счет восстановления нитратов определяли по увеличению биомассы и образованию N2 и NO2– как продуктов восстановления. N2 регистрировали по объему газообразования во флаконах, NO2 – - количественно колориметрически (Carret & Nason, 1969), а также качественно по окрашиванию среды в красный цвет после добавления реактива Грисса (Carret, Nason, 1969).
О каталазной активности судили по образованию пузырьков кислорода при воздействии на клетки 3 % раствором перекиси водорода (Нетрусов и др., 2005).
Методы генетических исследований. ДНК изолировали методом Мармура (Marmur, 1961). ГЦ в составе ДНК определяли методом термической денатурации, используя спектрофотометр «Pye Unicum SP 1800». ДНК-ДНК гибридизацию регистрировали методом оптической реассоциации (De Ley et al., 1970). Амплификацию и секвенирование нуклеотидов гена 16S pРНК проводили с использованием универсальных праймеров (Edwards et al, 1989).
Определение состава жирных кислот. Пробу сухой биомассы клеток ( мг) обрабатывали в 0.4 мл 1 N хлористого водорода в метаноле при 80оС в течение 1 часа (кислый метанолиз). Образовавшиеся при метанолизе эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном и вводили в газовый хроматограф системы Шерлок (Microbial Identificaition System, «MIDI Inc.», USA) (Цаплина и др., 1994).
Методы определения способности к фотосинтезу.
Фотосинтетическую активность клеток бактерий определяли методом обратимого фотоингибирования дыхания (ФИД), вызываемого активацией ЭТЦ фотосинтеза, конкурентной дыхательной цепи. С этой целью полярографически регистрировали уменьшение скорости потребления О2 в образцах под вспышками монохроматического света в спектральном диапазоне 400-930 нм (0.2 мкм квантов/м2с, спектральная полуширина щели 3 нм, длительность 1 с и темновые интервалы 20-60 с) ( Бойченко В.А., 2004).
Анализ мембранных цитохромов. Клеточные мембраны в буфере А ( мг/мл) солюбилизировали, добавляя додецилмальтозид из 10 % раствора до весового соотношения с белком 1/1. Смесь инкубировали на льду в течение 1 ч при периодическом перемешивании, наслаивали на градиент концентрации сахарозы (10 % - 30 %, в буфере А, содержащем 0.1 % додецилмальтозид) и центрифугировали на бакет-роторе Ti-60 при 40000 об/мин 12 ч. Полученные сахарозные фракции, а также исходную смесь анализировали, как и водорастворимые цитохромы, спектрофотометрически и с помощью электрофореза в ПААГ.
Изучение водорастворимых цитохромов. Клетки осаждали при 1000 g, промывая дважды буферным раствором (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0 – буфер А).
Осажденные клетки обрабатывали 0.1 % раствором лизоцима в течение 30 мин при комнатной температуре (буфер А, содержащий 2 мМ ЭДТА) и добавляли ДНКазу до 0.01 % и MgSO4 до 5 мM. Смесь инкубировали 10 мин на льду и центрифугировали 30 мин при 140000 g. Осадок вновь суспендировали в буфере А, и клетки разрушали ультразвуком дважды по 15 сек. Грубые фрагменты мембран и остатки неразрушенных клеток удаляли центрифугированием при 15000 g в течение 20 мин. Мембраны из полученного супернатанта осаждали 90 мин при 140000 g. Оба супернатанта соединяли и использовали для изучения водорастворимых цитохромов спектрофотометрически.
Спектры поглощения мембран и выделенных фракций регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония).
Электрофорез белков в ПААГ. SDS-электрофорез (15 % акриламида) проводили в системе Лэммли (Laemmli, 1970) или с добавлением 6 М мочевины в системе Шэгера - фон Ягова (Schagger, von Jagow, 1987). Белковые зоны прокрашивали в коллоидном растворе кумасси G-250. Цитохромы с в ПААГ выявляли, используя окрашивание 3,3’5,5’-тетраметилбензидином (ТМБЗ), ковалентно связанным с белком гема С (Thomas et al., 1976).
Изучение способности бактерий восстанавливать теллурит и селенит.
Штаммы АБС и НПБ культивировали на стандартной среде с добавлением 1 г/л Na2TeO3 или Na2SeO3. О способности к восстановлению судили по почернению колоний в случае образования Те° или покраснению при образовании Se°.
Элементный состав включений и минералов определяли с помощью рентгеновского микроанализатора LINK 860 с детектором E5423 («Link System», Англия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Распространение АБС и факультативно аэробных НПБ в содовых озерах и щелочных термальных источниках В процессе выполнения работы были отобраны пробы воды, илов и микробных матов из содовых озер с минерализацией от 3 г/л до насыщения и рН выше 9.0 (Таблица 1).
Нам не удалось получить роста колоний ни несерных пурпурных бактерий, ни аэробных бактериохлорофилл а-содержащих бактерий из проб с минерализацией более 120 г/л. Можно предположить, что нишу аэробных фотогетеротрофов в гиперсоленых озерах занимают галофильные археи с бактериородопсином, которые также способны к светозависимому фотосинтезу в аэробных условиях. Наиболее высокий процент АБС, до 60 % колониеобразующих организмов, был в пробах воды гиперсоленого меромиктического содового озера Моно Лейк (Калифорния). В воде другого меромиктического содового озера Доронинского (Восточная Сибирь) АБС также присутствовали, но их было значительно меньше по сравнению с другими типами микроорганизмов. В перечисленных озерах обнаружены различные виды алкалофильных АБС рода Roseinatronobacter. Можно заключить, что присутствие представителей этого рода характерно для содовых озер с умеренной минерализацией (18 - 90 г/л).
В значительном количестве АБС обнаружены в прибрежном иле оз.
Шулуутай-Эхе-Тором и песчанистом мате в зоне проявления грязевого вулканчика оз. Доронинского. При высоких значениях рН (9.5 - 9.8) минерализация илового раствора в этих местообитаниях была относительно низкой, около 3 - 10 г/л. Из этих экозон содовых водоемов были выделены два штамма, отнесенные к двум новым видам рода Roseococcus.
Факультативно аэробные НПБ также были распространены в степных озерах с относительно невысокой минерализацией. Из озер Баргузинской долины выделены две новые факультативно аэробные алкалофильные НПБ:
“Rhodobaca barguzinensis” sp. nov. (содовое озеро № 1 с минерализацией 60 г/л) и “Rubribacter polymorphus” gen. nov., sp. nov. (содовое озеро № 2 с минерализацией 22 г/л).
Из низкоминерализованного (1.5 г/л) содового озера Ножий был изолирован штамм АБС, филогенетически близкий к морскому виду Porphyrobacter donghaensis. Другой штамм этого же вида был выделен из термального источника Сея. Оба штамма предпочитают расти в слабо щелочной среде и не являются алкалофилами. Из источника Кучигер была получена хорошо растущая аэробно НПБ, имеющая 98 % сходства по данным сиквенса 16S рРНК с типовым штаммом Rhodobacter blasticus. Этот штамм также оказался нейтрофилом. Таким образом, можно заключить, что среда низкоминерализованных содовых озер и щелочных источников не благоприятна для существования алкалофильных микроорганизмов.
Табл. 1. Физико-химическая характеристика исследованных содовых озер и щелочных термальных источников Содовые озера Термальные источники Тип Баргузин. долина Баргузин. долина перемешиваемое перемешиваемое перемешиваемое водое меромиктич. оз.
меромиктич. оз.
оз. Шулутайн ма Озеро Ножий Доронинское оз. Горбунка Эхэ- Тором Моно Лейк озеро № озеро № Кучигер Сея 9.5 9.8 До 10 9.62 9.5 9.24 9.56 9.08 9.67 рН 9. 18 - 90 90 16- 32.3 60 22 3 1.5 0.40 0.40 Мине 0. рализ ация, г/л Н.д. Н.д. Н.д. 31 25 23 24 32-55 21- T °C ил, вода вода, альго вода прибре прибре циано вода Источ микро песчан бакте жный жный бакте ник бный ый мат риаль ил нагон риаль выдел мат ный ный ения мат мат polymorphus” sp. nov.
Rca. barguzinensis sp.
Rhodobacter blasticus “Rsc. suduntuyensis” “Rna. doroninskoen “Rna. monicus” sp.
vulkanoes” sp. nov.
микроорганизмы sis” sp. nov., “Rsc.
Изолированные Por. donghaensis Por. donghaensis Rna. thiooxidans “Rubribacter sp. nov.
nov.
nov За период исследований выделено 4 новых вида АБС и 2 новых вида НПБ.
Большинство алкалофильных штаммов АБС и НПС получены из содовых экосистем с минерализацией выше 3 г/л. Наши исследования существенно расширили знания о распространении и видовом разнообразии АБС и факультативно аэробных НПБ в содовых озерах разного типа с рН выше 9.0 и минерализацией от нескольких грамм до полного насыщения. Можно также предположить, что АБС играют значительную роль в балансе углерода не только в пресных и морских водоемах, но и в содовых эпиконтинентальных озерах.
2. Характеристика новых микроорганизмов 2.1. АБС слабоминерализованных щелочных водных экосистем Porphyrobacter donghaensis. Штамм Noj-1 близок по данным сиквенса нуклеотидов гена 16S рРНК (99.7 %) к морскому виду АБС Porphyrobacter donghaensis (штамм AY559428). Он был выделен из тонкого пурпурного мата, развивающегося на поверхности прибрежного ила степного слабоминерализованного (1.5 г/л) содового озера Ножий (Читинская облать).
Палочковидные клетки штамма Noj-1 способны к ветвлению (Рис. 1), грамотрицательны, внутрицитоплазматические мембраны отсутствуют.
Выделенные бактерии облигатные аэробы, гетеротрофы, содержат бактериохлорофилл а и каротиноидные пигменты. Несмотря на то, что организм обнаружен в водоеме с рН выше 9, оптимальный рост был при рН 7.5.
В отличие от типового морского штамма, штамм Noj-1 не нуждался в обязательном присутствии NaCl, однако рост отсутствовал уже при концентрации NaCl 10 г/л.
бг 0. а 79 Noj- Se- 87 Porphyrobacter donghaensis AY Porphyrobacter donghaensis AY Porphyrobacter sanguineus AB в Porphyrobacter neustonensis AF Porphyrobacter tepidarius D Porphyrobacter cryptus AF Porphyrobacter dokdonensis DQ Erythrobacter longus M Рис. 1. Ультратонкое строение (а), морфология клеток (б, в) (масштаб – 0. мкм) и филогенетическое положение сходства по данным сиквенса 16S рРНК (г) новых штаммов Porphyrobacter donghaensis.
Подобными свойствами обладает второй штамм Se-4, выделенный с поверхности циано-бактериального мата щелочного термального источника Сея (Бурятия). Особенностью этого штамма является высокий температурный оптимум, 39 оС, тогда как у штамма из содового озера tопт = 23°С, а у типового штамма tопт = 30 °С. Несмотря на заметные фенотипические различия, по данным 16S рРНК (99.6 - 99.7 %) оба выделенных штамма идентифицированы как экотипы известного вида Porphyrobacter donghaensis (Рис. 1г). Таким образом, установлено, что местообитанием для Porphyrobacter donghaensis является не только море, но также слабоминерализованные содовые озера и щелочные термальные источники.
Новые виды рода Roseococcus. Из ила содового озера Шулуутай-Ехэ Тором и оз. Доронинское (Читинская область) выделено два штамма АБС (SHET и Da). Суспензия клеток окрашена в розово-красный цвет. Оба штамма подвижны, имеют форму кокков или коротких палочек (рис. 2 а).
У штамма SHET пигменты представлены бактериохлорофиллом а (главный максимум in vivo 865 нм) и каротиноидами: спириллоксантин гликозидом и его дериватами (максимумы in vivo 410, 480, 509, 540 нм).
Микроорганизмы обладали редким для АБС свойством – содержали редкие пристенные мембранные везикулы, сходные с фотосинтезирующими структурами НПБ (рис. 2 б, в). Основной тип метаболизма для штамма дыхание. В качестве источников углерода бактерии используют органические кислоты, сахара, дрожжевой экстракт и гидролизаты белка. В отличие от типового штамма Rsc. thiosulfatophylus тиосульфат в присутствии органических субстратов не используется как в темноте, так и на свету. Бактерии проявляют способность образовывать нитрит из нитрата, но прибавки урожая при этом не происходит. Бактерии штамма SHET факультативные алкалофилы и галотолеранты. Они медленно растут в нейтральных условиях, однако наилучший рост происходит при рН 8.5 - 9.2 и концентрации NaCl 2 - 5 г/л.
Штамм SHET отнесен к роду Roseococcus и описан как новый вид “Roseococcus suduntuyensis” sp. nov. (ВKM В-2453, DSM 19979) б в а Рис. 2. Морфология (a) (масштаб –5 мкм) и ультратонкое строение (б, в) клеток “Roseococcus suduntuyensis ” (масштаб – 0.5 мкм). Стрелкой указаны редкие пристенные мембранные везикулы.
Второй новый вид рода Roseococcus “Roseococcus vulkanoes” sp.nov., штамм Da, выделен из песчаного альгобактериального мата вблизи грязевого вулканчика, возникшего в прибрежной зоне сибирского содового озера Доронинское. По спектру поглощения целых клеток и основным физиологическим свойствам этот штамм сходен с бактериями штамма SHET.
Он содержит бактериохлорофилл а и каротиноиды и является облигатным аэробом. На рис. 3 показано филогенетическое положение “Roseococcus vulkanus” по данным сиквенса нуклеотидов гена 16S рРНК. Он почти одинаково удален как от типового вида Rsc. thiosulfatophylus, так и от “Rsc.
suduntuensis”(94 % и 95 %). Следует отметить, что большой кластер, включающий выделенные нами алкалофильные Roseococcus, содержит в основном экстремофильных (ацидофильных и слабо термофильных) представителей АБС, а также ацидофильную НПБ Rhodopila globiformis.
Последняя способна к факультативному микроаэробному росту в темноте.
Rhodovastum atsumiense б а Rhodovarius lipociclius Rubritepida flocculans “Roseococcus vulkanoes” R Rsc. suduntuensis Rsc.thiosulfatophylus Рис. 3. Морфология “Roseococcus vulkanoes” (масштаб – 5 мкм) (а) и фрагмент филогенетического древа по данным сиквенса гена 16S рРНК (б).
2.2. АФБ среднеминерализованных содовых озер. Новые виды рода Roseinatronobacter Из двух меромиктических содовых озер, расположенных в разных климатических зонах, были выделены два новых вида АБС, отнесенных к роду Roseinatronobacter.
Из озера Моно Лейк (Калифорния, США) были выделены в чистую культуру 6 близких по фенотипическим свойствам штаммов АБC. Штамм ROS 10, из пробы воды аэробной зоны, и штамм ROS 35, из придонной воды, содержащей сульфид, были исследованы подробно и описаны как новый вид “Roseinatronobacter monicus” sp. nov.
Колонии штаммов имели розовую окраску. Пигменты фотосинтеза представлены бактериохлорофиллом а и каротиноидами, по спектральным характеристикам сходные с сфероиденоном. Форма клеток у всех штаммов палочковидная, внутрицитоплазматические мембранные структуры отсутствовали (рис.4). Бактерии росли гетеротрофно, только при доступе кислорода. Редукция нитратов до нитритов не давала прибавки биомассы. В качестве источника углерода и энергии новые микроорганизмы используют органические кислоты, сахароспирты, ацетат, гидролизат казеина, глицерин, дрожжевой экстракт, лактат, малат, пропионат, пируват, рамнозу, мальтозу, сахарозу. Особенностью этого вида является способность к окислению восстановленных серных соединений, видимо, по литогетеротрофному пути.
Об этом свидетельствовала значительная прибавка биомассы при добавлении в среду тиосульфата. Окисление тиосульфата происходило с образованием сульфата.
Все штаммы - облигатные алкалофилы. Рост типового штамма ROS был возможен в диапазоне рН 8.5 – 10.0 с оптимумом при рН 9.0 - 9.5. Пределы роста от 0 до 100 г/л NaCl с оптимумом 40 - 60 г/л. По данным анализа сиквенса гена 16S рРНК бактерии имели 98.1 % сходства с единственной известной алкалофильной АБС Roseinatronobacter thiooxidans (Сорокин и др., 2000).
Данные ДНК-ДНК гибридизации (25 - 27% сходства с типовым штаммом Rsn.
thiooxidans) подтвердили правомочность выделения исследованных штаммов в новый вид (DSM 18423, ВKM В-2404, UNIQEM U-251).
Рис. 4. Морфология (a) и ультратонкое строение (б) клеток “Roseinatronobacter monicus” (масштаб – 0.5 мкм).
Второй новый вид рода Roseinatronobacter “Rna. doroninskoensis” sp. nov.
выделен из воды аэробной зоны сибирского содового меромиктического озера Доронинское. Форма клеток нового изолята палочковидная (рис. 5). Как и “Rna.
monicus”, бактерии являются облигатными аэробами, алкалофилами. Пигменты фотосинтеза представлены бактериохлорофиллом а и каротиноидами.
Фенотипические свойства этого изолята исследованы частично.
Филогенетическое родство с видами алкалофильного рода Roseinatronobacter составляет 95 % (рис. 5). Обращает внимание близость алкалофильных АБХ бактерий с хемотрофными бактериями Natronohydrobacter thiooxidans и алкалофильными несерными пурпурными бактериями рода Rhodobaca (95%).
“Rna. doroninskoensis” б а Rca.bogoriensis “Rca. barguzinensis” “Rna. monicus” “Natronohydrobacter thiooxidans” Рис. 5. Морфология клеток “Rna. doroninskoensis”, масштаб - 5 мкм (а) и фрагмент филогенетического дерева по данным сиквенса гена 16S рРНК (б).
3. Определение фотосинтетической активности у аэробных бактериохлорофилл а-содержащих бактерий Rna. thiooxidans Из известных облигатных аэробов, имеющих Бхл а, способность к фотосинтезу продемонстрирована только для некоторых видов (Roseobacter denitrificans, Erythrobacter longus, Acidiphilium rubrum). Для большинства описанных АБС, а их более 40 видов, установлено лишь присутствие бактериохлорофилла а и каротиноидов. Поэтому прямое доказательство фотосинтетической активности у различающихся филогенетически и физиологически представителей АБС бактерий является актуальной проблемой эволюции фотосинтеза. Исследования в этом направлении были выполнены в данной диссертационной работе.
Одним из методов индикации фотосинтеза является фотоингибирование дыхания (ФИД) за счет перехвата потока электронов из дыхательной цепи на фотосинтез. Это явление было зарегистрировано нами у АБС Rna. thiooxidans, “Rna. monicus”, НПБ “Rhodobaca barguzinensis” в сравнении с факультативно аэробной НПБ Rhodospirillum rubrum. В результате экспериментов была показана сходная реакция клеток на освещение, выраженная во временном угнетении дыхания (рис. 6). Совпадение спектра фотоингибирования дыхания AБС и факультативно аэробных НПБ с спектром поглощения пигментов доказывает, что в клетках исследованных микроорганизмов осуществляется процесс фотосинтеза.
1, Фотоингибирование дыхания, от. ед.
Рис. 6. Спектры действия фотоингибирования дыхания 0, АБС Roseinatronobacter thiooxidans (штамм ALG1) (), 0, НПБ “Rhodobaca barguzinensis” (), и НПБ 0, Rhodospirillum rubrum ().
0, 400 500 600 700 800 Длина волны, нм (в) Длина волны, нм (г) Молекулярная масса, кДа Поглощение Длина волны, нм Номера фракций Рис. 7. Состав мембранных цитохромов Rna. thiooxidans.
(а) распределение РЦ-LH1 пигмент-белкового комплекса (1), цитохрома b (2), цитохрома c (3) и цитохромоксидазной активности (4) по фракциям солюбилизированных мембран в градиенте плотности сахарозы;
(б) электрофорез полученных фракций;
слева по вертикали - молекулярные массы маркеров и выявленных цитохромов с. Первая дорожка – суммарный состав мембранных цитохромов;
(в) спектры поглощения в инфракрасной области клеточных мембран (1) и РЦ-LHI пигмент-белкового светособирающего комплекса (2);
(г) cпектр действия потребления О2 в суспензии клеток Rna. thiooxidans, ингибированных моноокисью углерода.
Пигменты клеток Rna. thiooxidans представлены Бхл а, (871, 806 нм) и каротиноидами (480, 520 и 545 нм) (рис. 6). Максимум 871 нм отвечает присутствию в клетках LHI, или В870 светособирающего Бхл а-содержащего пигмент-белкового комплекса фотосинтеза. Отсутствие в спектре поглощения интенсивных максимумов 805 и 835-850 нм означает, что мембраны Rna.
thiooxidans не имеют LHII светособирающего комплекса фотосинтеза, дополняющего комплекс LHI у ряда пурпурных бактерий (рис. 7в).
Фракционированием солюбилизированных мембран Rna. thiooxidans в градиенте плотности сахарозы (рис. 7 а, б) были разделены цитохромы, которые, согласно молекулярным массам и прокрашиванию ковалентно связанных с полипептидами гемов С, были идентифицированы как субъединица цитохрома с1 в составе bc1-комплекса (22 кДа) и субъединицы cbb цитохромоксидазы (24, 30 кДа).
Было также показано, что Rna. thiooxidans наряду с cbb3 содержит вторую цитохромоксидазу а3-типа. Под импульсным монохроматическим светом молекулы ингибированной цитохромоксидазы освобождались от СО, восстанавливая дыхательную активность ЭТЦ. Характерный максимум спектра при 590 нм свидетельствует о присутствии в клетках терминальной цитохромоксидазы а3-типа (рис. 7г). Использование альтернативной оксидазы, очевидно, зависит от условий культивирования.
С учетом результатов, полученных в данной работе, можно предположить общую схему путей переноса электронов у Rna. thiоoxidans (рис. 8).
Полученные данные указывают на принципиальное сходство состава электронно-транспортной цепи у АБС и НПБ.
РЦ альтернативная фотосинтеза оксидаза а3 -типа фотосинтез дыхание Пул bc NAD(Н)P сbb3 оксидаза пластохинонов Цитохром с комплекс Рис. 8. Вероятная схема путей переноса электронов у Rna. thiooxidans.
4. Новые алкалофильные факультативно аэробные НПБ “Rhodobaca barguzinensis” sp. nov. (ВKM В-2406, DSM 19920). До начала наших исследований был известен единственный алкалофильный вид НПБ Rhodobaca bogoriensis, полученный из содового озера Африки. Из проб прибрежного ила содового озера Баргузинской долины (Восточная Сибирь) нами выделен штамм alga-05, идентифицированный как новый вид этого рода.
Новые НПБ - анаэробы, гетеротрофы, факультативные аэробы, хорошо растущие на поверхности агаризованной среды. Нами впервые показана способность к активному аэротаксису клеток Rhodobaca как предварительно выросших аэробно в темноте, так и анаэробно на свету. Клетки быстро собирались на границе раздела жидкой и воздушной фаз.
Пигменты фотосинтеза представлены бактериохлорофиллом а и каротиноидами сфероиденового ряда. Фотосинтезируюшие структуры выделенного штамма представлены везикулами по периферии клеток (рис. 9 в).
В аэробных условиях внутрицитоплазматические мембранные структуры не образуются. В качестве источника углерода клетки используют ацетат и другие органические кислоты, сахара, дрожжевой экстракт и пептон. В небольших количествах используют сульфид в присутствии органических субстратов, окисляя его до серы или полисульфида. NH4Cl потребляется как источник азота. Бактерии восстанавливают нитраты до нитритов. Отсутствовал рост на среде без азота, также не был обнаружен nifH ген, что свидетельствует о неспособности к азотфиксации. В клетках также не обнаружен ген РуБисКо, что является редким явлением среди НПБ. Новый вид - облигатный алкалофил с диапазоном роста от рН 7.5 до 9.5. Он также является умеренным галофилом с оптимальным ростом при концентрации NaCl 20 - 30 г/л. Филогенетически бактерии близки к типовому виду Rhodobaca bogoriensis (99.1 %) и “Roseinatronobacter monicus” (98.6 %) (рис. 10).
б в а Рис. 9. Морфология (а,б) и ультратонкое строение (в) клеток “Rca.
barguzinensis”, штамм alga-05: а – световой микроскоп (масштаб – 10 мкм), б – электронный микроcкоп, тотальный препарат (масштаб – 1 мкм), в – срезы клеток, выращенных анаэробно на свету (масштаб – 0.5 мкм). 1 внутрицитоплазматические мембраны везикулярного типа.
0. 75 Rhodobaca bogoriensis LBB2, AF 100 Rhodobaca bogoriensis CL1, AF 57 Rhodobaca bogoriensis LBB1T, AF 69 “Rhodobaca barguzinensis”, alga- 88 “Roseinatronobacter monicus” ROS “Natronohydrobacter thiooxidans” AJ Roseinatronobacter thiooxidans ALG1T, AF Rhodobacter veldkampii ATCC 35703T, D Rhodovulum strictum MB-G2T, D Rhodovulum euryhalinum DSM 4868T, D Albidovulum inexpectatum FRR-10T, AF Рис. 10. Филогенетическое положение видов родов Rhodobaca и Roseinatronobacter по данным сиквенса гена 16S рРНК.
Другая новая алкалофильная НПБ “Rubribacter polymorphus” gen. nov. sp.
nov. была выделена нами из небольшого содового озера Баргузинской долины с общей минерализацией 22 г/л, рН 9.5. Клетки изолята полиморфны (рис. 11 а), подвижны с помощью жгутиков. Фотосинтезирующие мембраны везикулярного типа заполняют всю полость клетки (рис. 11 б), что характерно для многих НПБ. Пигменты фотосинтеза представлены бактериохлорофиллом а и каротиноидами (рис. 11 в). Наряду со сфероиденовыми они содержат значительное количество спириллоксантиновых каротиноидов. Одновременное присутствие этих двух типов каротиноидов ранее не было обнаружено у НПБ, относящихся к Альфапротеобактерям. Бактерии фотогетеротрофы, факультативно аэробные хемогетеротрофы. Хорошо растут в аэробных условиях. Восстанавливают нитраты до нитритов, не прибавляя в биомассе. Не способны к азотфиксации, о чем свидетельствует отсутствие nifH гена.
Наиболее близкой к исследуемому штамму оказалась АБС бактерия Rubrimonas cliftoensis (рис. 12), хотя уровень сходства между ними составил всего 93.3 % (табл. 2). Степень филогенетической близости других НПБ членов семейства Rhodobacteraceae была заметно ниже и не превышала 90 %. Это позволило определить новые алкалофильные НПБ как новый род и новый вид.
Микроорганизму предложено название “Rubribacter polymorphus” gen. nov., sp.
nov. (ВKM В-2481).
в а б Длинна волны, нм.
Рис. 11. Морфология (a) (масштаб – 5 мкм) и ультратонкое строение (б) клеток “Rhubribacter polymorphys” (масштаб – 0.5 мкм);
1 - фотосинтетические структуры, в - спектр поглощения пигментов in vivo.
Rhodobaca bogoriensis LBB1T (AF248638) 0.05 Roseinatronobacter thiooxidans ALG 1T (AF249749) Albidovulum inexpectatum FRR-10T (AF465833) Rhodobacter sphaeroides 2.4.1T (X53853) Thioclava pacifica TL 2T (AY656719) Rhodovulum sulfidophilum DSM1374T (D16423) Paracoccus denitrificans ATCC17741T (Y16927) Methylarcula terricola h1T (AF030436) Rubellimicrobium thermophilum C-lvk-R2A-2T (AJ844281) Thalassobius mediterraneus CECT5383T (AJ878874) Oceanibulbus indolifex Hel 45T (AJ550939) 71 Roseobacter litoralis ATCC49566T (X78312) Amaricoccus kaplicensis Ben101T (U88041) Rubrimonas cliftonensis OCh317T (D85834) “Rubribacter polymorphus” GREEN Ahrensia kielensis IAM12618T (D88524) Pseudovibrio denitrificans DN34T (AY486423) Roseibium denhamense OCh 254T (D85832) Stappia aggregata IAM12614T (D88520) Pannonibacter phragmitetus C6-19T (AJ400704) Rhodothalassium salexigens ATCC35888T (D14431) Рис. 12. Филогенетическое положение алкалофильных родов Roseinatronobacter, “Rubribacter ” и Rhodobaca.
6. Способность алкалофильных АБС и НПБ восстанавливать теллурит и селенит Впервые было показано, что алкалофильные виды родов Roseonatronobacter, Rubribacter и Rhodobaca обладают устойчивостью к токсичным окисленным формам Te и Se, а также способны восстанавливать их до элементного состояния (рис. 13). Такой же способностью обладали штаммы Porphyrobacter sp. Noj-1, Se-4, Roseococcus suduntuyensis штамм SHET. Следует подчеркнуть высокую толерантность к металлоидам алкалофильных АБС. Это делает их привлекательным объектом для использования в биоремедиации щелочных минерализованных промышленных сточных вод.
Те Рис. 13. Клетки Rna. monicus, а б Те выращенные на среде с теллуритом (а, б) и R.
barguzinensis, выращенные на среде с селенитом (в, г): а – внеклеточное отложение Тe0, Sе в г тотальный препарат;
б элементный состав частиц, электронный микроскоп с рентгеновским анализатором;
в - внеклеточное отложение Se0, г – внутри- и внеклеточное отложение Se.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Суммируя полученные данные, отметим, что наши исследования существенно расширили знания о распространении и видовом разнообразии АБС и факультативно аэробных НПБ в содовых озерах разного типа с рН выше 9.0 и минерализацией от нескольких грамм до полного насыщения. На момент начала нашей работы был известен лишь один алкалофильный вид аэробных бактериохлорофилл а-содержащих бактерий и один алкалофильный вид несерных пурпурных бактерий. Нам удалось выделить в чистую культуру и дать таксономическое описание четырем новым видам облигатно аэробных алкалофильных бактериохлорофилл а-содержащих бактерий, а также описать новый род и два новых вида факультативно аэробных алкалофильных НПБ (табл. 3). Нами доказано протекание фотосинтеза у двух из исследованных АБС и показано принципиальное сходство состава дыхательной цепи у АБС и НПБ.
Установлено, что оба вида НПБ рода Rhodobaca не имеют гена ключевого фермента цикла Кальвина (РуБисКо) и не фиксируют молекулярный азот, что наряду с хорошим ростом в аэробных условиях сближает их с видами АБС рода Roseinatronobacter. Проведенный филогенетический анализ демонстрирует тесное родство (до 98 %) между алкалофильными видами НПБ и алкалофильными видами АБС (табл. 2), а также хемотрофными беспигментными бактериями. Новый род алкалофильных НПБ “Rubribacter polymorphys” gen. nov., sp. nov. также имеет в качестве ближайшего родственника АБС рода Rubrimonas. Все вместе взятое подтверждает гипотезу происхождения аэробных хемотрофных бактерий от факультативно аэробных НПБ, через промежуточное звено АБС.
Табл. 2. Степень филогенетического родства алкалофильных АБС и факультативно аэробных алкалофильных НПБ по данным сиквенса гена 16S рРНК (жирным шрифтом отмечены описанные нами виды).
АБС Факультативно аэробные НПБ Сходство по данным сиквенса гена 16S рРНК 1. Roseinatronobacter 1. Rhodobaca bogoriensis 2. “Rca. barguzinensis” sp. nov. 95 - 98.6 % thiooxidans 2. “Rna. monicus” sp. nov.
3. “Rna. doroninskoensis” sp. nov.
1. Roseococcus 96 % Rhodopila globiformis thiosulfatophilus 2. “Rsc. suduntuyensis” sp.
nov.
3. “Rsc. vulkanoes” sp. nov.
“Rubribacter polymorphus” 93.3 % Rubrimonas cliftoensis gen. nov., sp. nov.
Табл. 3. Сравнительная характеристика исследованных алкалофильных АБС и алкалофильных факультативно аэробных НПБ Свойства “Rsc. “Rna. “Rca. “Rubribacter suduntuyensis” monicus” barguzinensis” polymorphus” sp. nov. sp. nov. sp. nov. gen. nov., sp.
nov.
АБС АБС НПБ НПБ Группа кокки, палочки палочки овальные палочки, Морфология палочки полиморфные 0.8–1.11.2–1.7 0.5-0.71.2- 1.01.5 0.71.0-3. Размер, мкм 1. + - + + Подвижность - - + + Анаэробный рост редкие везикулы отсутст- везикулы по везикулы Фотосинте по периферии вуют периферии по всей тические клетки клетки цитоплазме структуры 410, 480, 509, 480, 525, 492, 525, 593, 477, 507, Поглощение 540, 802, 865 550, 804, 803, 870 795, 837, пигментов in vivo, нм спириллоксантин сфероиде- сфероидено- сфероидено Каротиноиды – гликозид и его новой вой серии вой и производные серии спирилло ксантиновой серии LH1 LH1 LH1 LH1, LH Светособира ющий комплекс 8.5-9.2 9.0-9.5 8.5-9.2 9. Опт. рН 2 40-60 20-30 Опт. NaCl, г/л 25 25-30 25-35 20- Опт.
температура, °С + + + + Каталазная активность 69.1 59.0-59.4 59.8 69. ГЦ, мол.% DSM 18423, ВKM В-2453, ВKM В-2406, ВKM В- Место ВKM В DSM 19979 DSM депонирова 2404, ния UNIQEM U Выводы:
1. Алкалофильные АБС широко распространены в содовых озерах с минерализацией от 3 до 90 г/л. В гиперсоленых озерах с более высокой минерализацией АБС не выявлены. Обнаруженные в микробных матах щелочных гидротерм Бурятии АБС и НПБ не являются алкалофилами.
2. Выделены и идентифицированы новые виды алкалофильных АБС “Roseinatronobacter monicus” sp. nov., “Roseinatronobacter doroninskoensis” sp.
nov, “Roseococcus suduntuyensis” sp. nov. “Roseococcus vulkanoes” sp. nov. и новые алкалофильные НПБ “Rhodobaca barguzinensis” sp. nov., “Rubribacter polymorphys” gen. nov., sp. nov.
3. Из щелочного термального источника и слабоминерализованного содового озера выделено два новых штамма АБС Porphyrobacter donghaensis, ранее считавшихся морским видом.
4. Установлено принципиальное сходство состава электронно транспортной цепи у АБС и НПБ. Впервые показана способность к фотосинтезу у видов АБС Roseinatronobacter и изучены компоненты электронно транспортной цепи.
5. Тесное филогенетическое родство между алкалофильными видами НПБ рода Rhodobaca и алкалофильными видами АБС Roseinatronobacter, а также хемотрофными бактериями “Natronohydrobacter thiooxidans”, указывает на эволюционную взаимосвязь микроорганизмов разных физиологических групп.
6. Впервые показана способность к восстановлению солей теллура и селена алкалофильными АБС и НПБ и их высокая толерантность к этим токсичным соединениям.
Список публикаций ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ 1. Болдарева Е.Н., Брянцева И.А., Цапин А., Нельсон К., Сорокин Д.Ю., Турова Т.П., Бойченко В.А., Стадничук И.Н., Горленко В.М. Новая алкалофильная бактериохлорофилл а-содержащая бактерия Roseinatronobacter monicus sp. nov., из гиперсоленого содового озера Моно Лейк (Калифорния, США). // Микробиология.
2007. Т. 76. № 1. С. 95-106.
2. Болдарева Е.Н., Акимов В.Н., Бойченко В.А., Стадничук И.Н., Москаленко А.А., Махнева З.К., Горленко В.М. Новая алкалофильная несерная пурпурная бактерия Rhodobaca bargusiensis sp. nov. из содового озера Баргузинской долины (Восточная Сибирь, Бурятия) // Микробиология. 2008. Т. 77. № 2. С. 241- 3. Болдарева Е.Н., Турова Т.П., Колганова Т.В., Москаленко А.А., Махнева З.К., Горленко В.М. Новая аэробная бактериохлорофилл а-содержащая бактерия Roseococcus suduntuyensis sp. nov., выделенная из слабоминерализованного содового озера Восточной Сибири // Микробиология. Принята к печати.
4. Стадничук И.Н., Янюшин М.Ф., Бойченко В.А., Болдарева Е.Н., Лукашев Е.П., Соловьев А.А., Горленко В.М. Фотосинтетическая активность и компоненты цепи электронного транспорта у аэробной бактериохлорофилл а-содержащей бактерии Roseinatronobacter thiooxidans. // Микробиология. Принята к печати.
ТЕЗИСЫ:
1. Болдарева Е.Н., Брянцева И.А., Горленко В.М. Новые алкалофильные аэробные бактериохлорофилл а- содержащие бактерии из гиперсоленого озера Моно Лейк (США, Калифорния). Конференция «Водные экосистемы, организмы, инновации», 15 октября 2005, Москва, МГУ.
2. Болдарева Е.Н., Брянцева И.А., Горленко В.М. Способность к восстановлению теллурита и селенита у новых видов алкалофильных аэробных бактериохлорофилл а содержащих бактерий. Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» Саратов, 14 – 16 сентября 2005г.
Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Материалы конференции/ Международная конференция. Саратов, 14-16 сентября 2005 г. Саратов:
Изд-во Научная книга, 2005.- с.9.
3. Болдарева Е.Н., Горленко В.М. Новая пресноводная аэробная бактериохлорофилл а содержащая бактерия, выделенная из термального источника Сибири. III-я Межрегиональная конференция молодых ученых Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. 10-13 октября 2006г., Саратов.
4. Болдарева Е.Н. Новая алкалофильная несерная пурпурная бактерия Rhodobaca bargusiensis sp. nov. из содового озера Баргузинской долины (Восточная Сибирь, Бурятия). II Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 1-3 ноября 2006 г.
5. E. N. Boldareva, V. M. Gorlenko. Tellurite and selenite reduction by anoxygenic phototrophic bacteria able to aerobic growth. The young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology”. Odessa, Ukraine. 28-31 May 2007. P. 33.
6. Болдарева Е.Н., Горленко В.М. Аноксигенные фототрофные бактерии содовых озер, способные к аэробному росту. 2-й Байкальский микробиологический симпозиум с международным участием, Иркутск, 10-15 сентября 2007.Стр. 29.
7. Болдарева Е.Н., Горленко В.М. Новые аэробные бактериохлорофилл а-содержащие бактерии Бурятии. III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», стр. 12-13, Москва, 22-23 ноября 2007 г.