Роль связывания с липидной мембраной в фотодинамическом воздействии металлофталоцианинов на ионные каналы грамицидина а
На правах рукописи
Пашковская Алина Андреевна РОЛЬ СВЯЗЫВАНИЯ С ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНОЙ В ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ МЕТАЛЛОФТАЛОЦИАНИНОВ НА ИОННЫЕ КАНАЛЫ ГРАМИЦИДИНА А Специальность 03.00.02 – «Биофизика»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2009
Работа выполнена на Факультете Биоинженерии и Биоинформатики и в Научно исследовательском Институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова.
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Антоненко Юрий Николаевич кандидат биологических наук Котова Елена Аврамовна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Соловьева Анна Борисовна доктор биологических наук, профессор Иванов Илья Ильич
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита состоится 29 октября 2009 года в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет, Кафедра биофизики, Новая аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.
М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан 28 сентября 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д.501.001.96, доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Фталоцианины – гетероциклические соединения, содержащие сопряженное кольцо тетраазатетрабензопорфина, структурно родственные порфиринам. Они широко используются как красители, молекулярные полупроводники в различных устройствах микроэлектроники, материалы для жидко-кристаллических дисплеев, катализаторы и т.д. Одной из важных областей применения этих соединений в последние десятилетия стала фотодинамическая терапия, где фталоцианины выполняют роль фотосенсибилизаторов. Для медицинского использования существенным свойством фталоцианинов является водорастворимость ряда их производных, которая достигается присоединением анионных или катионных заместителей. Среди анионных фталоцианинов популярными агентами в фотодинамической терапии стали сульфированные фталоцианины алюминия и цинка. Положительно заряженные производные фталоцианинов оказались эффективными агентами для фотодинамической инактивации бактерий, отрицательно заряженная оболочка которых препятствует проникновению анионных фотосенсибилизаторов.
Диссертационная работа посвящена изучению роли связывания фотосенсибилизаторов с мембраной в процессе фотодинамического повреждения мембранных белков на примере фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов в искусственной бислойной липидной мембране (БЛМ) в присутствии замещенных металлофталоцианинов. Актуальность темы определяется значением мембраны как одной из важнейших мишеней фотодинамического воздействия и необходимостью связывания фотосенсибилизатора с мишенью из-за малого радиуса действия активных форм кислорода, вызывающих фотодинамическое повреждение.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выяснение механизма взаимодействия катионных и анионных металлофталоцианинов с липидной мембраной, ведущего к фотодинамическому повреждению встроенных в нее пептидов.
В работе планировалось решить следующие задачи:
1. Изучить в модельной системе на примере фотосенсибилизированной инактивации ионных каналов, образованных пентадекапептидом грамицидином А в плоских БЛМ различного липидного состава, фотодинамическую активность металлокомплексов фталоцианинов, несущих различные анионные и катионные заместители.
2. С помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии и измерения электрофоретической подвижности липосом исследовать связывание с мембранами ряда анионных и катионных металлофталоцианинов в зависимости от липидного состава мембран.
3. Сопоставить данные по фотодинамической активности и связыванию фталоцианинов в различных условиях и выяснить природу взаимодействий, определяющих связывание металлофталоцианинов с фосфолипидной мембраной.
Научная новизна и практическа значимость работы. В настоящей диссертационной работе впервые представлены обоснованные доказательства того, что связывание фотосенсибилизаторов с мембраной является необходимиым звеном в процессе фотодинамического воздействия на компоненты мембраны. В работе выявлены два основных типа взаимодействий, определяющих фотодинамическую активность и связывание замещенных металлофталоцианинов с мембраной: координационное взаимодействие центрального атома металла с фосфатной группой фосфолипида и электростатическое взаимодействие анионных и катионных заместителей с заряженными головками липидов. Наряду с методом фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов, разработанным в лаборатории Ю.Н. Антоненко, для изучения взаимодействия сенсибилизаторов с мембраной в работе использован метод измерения электрофоретической подвижности липосом, а также метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Этот экспериментальный подход применен для изучения связывания фотосенсибилизаторов впервые. Полученные в работе данные вносят вклад в решение фундаментальной проблемы выяснения механизма взаимодействия фотосенсибилизаторов с биологическими мембранами. Результаты работы продемонстрировали плодотворность использования комбинации биофизических методов для изучения взаимодействия фотодинамических агентов с мембранами и могут стать основой для проведения подобных исследований в других лабораториях.
Публикация и апробация работы. По результатам исследований опубликовано работ, из них: одна в реферируемом научном российском журнале («Биохимия»), две в реферируемом научном зарубежном журнале («Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes») и 5 в тезисах конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение, Выводы и Список цитируемой литературы из ссылок. В работе содержится 52 рисунка и 5 таблиц.
Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.
В Литературном обзоре проанализированы имеющиеся в литературе данные о структуре и свойствах металлофталоцианинов, влиянии этих свойств на взаимодействие металлофталоцианинов с искусственными и природными мембранами, их фотодинамическую активность.
В Экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.
Таблица 1. Структура фталоцианинов, использованных в работе R Тетрасульфированные R R1 N R металлофталоцианины (AlPcS4, ZnPcS4, N N M NiPcS4) N N N N R1,R3,R5,R7= SO3H M = Al, Zn, Ni N R R R2,R4,R6,R8= H R R Тетракис(трибутиламмониометил)гидрокси + R1,R3,R5,R7= CH2N(CH2CH2CH2CH3)3 Cl фталоцианин алюминия (AlPcN4) R2,R4,R6,R8= H M-тетракис(пиридиниометил)фталоцианин + Cl N (AlPcPym4, ZnPcPym4) R1,R3,R5,R7= M = Al, Zn R2,R4,R6,R8= H + M-гексакис(пиридиниометил)фталоцианин Cl N R1,R3,R4,R5,R7,R8= (AlPcPym6) M = Al R2,R6= H + M-октакис(пиридиниометил)фталоцианин Cl N R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8= (AlPcPym8, ZnPcPym8) M = Al, Zn Октакис[N-(2-гидроксиэтил)-N,N + CH R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8= CH2 N CH2CH2OH Cl диметиламмониометил]фталоцианин цинка CH (ZnPcChol8) В работе использованы тетрасульфированные металлофталоцианины, полученные от фирмы «Porphyrin Products» (США), катионный фталоцианин алюминия, синтезированный на кафедре технологии тонкого органического синтеза Ивановского государственного химико-технологического университета, и серия катионных металлофталоцианинов, синтезированных в Научно-исследовательском институте органических полупродуктов и красителей (ГНЦ «НИОПИК»). Все использованные в работе липиды получены от фирмы «Avanti Polar Lipids» (США).
Фотодинамическую активность фталоцианинов измеряли с помощью метода фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов (Антоненко и др., 2005). Измерения проводили на плоской бислойной липидной мембране, которую формировали по методике Мюллера-Рудина. Для измерения проводимости БЛМ применяли метод фиксации напряжения, в котором на мембрану подавали постоянную разность потенциалов. С одной стороны добавляли фотосенсибилизатор. Освещение производили видимым светом. Измеряли ток, индуцированный грамицидином А.
Для изучения связывания фотосенсибилизаторов был использован метод измерения электрофоретической подвижности липосом, а также метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Суть метода измерения электрофоретической подвижности липосом состоит в том, что сорбция молекул фотосенсибилизатора на поверхности липосом приводит к изменению их заряда и выражается в изменении электрокинетического () потенциала. Метод FCS состоит в измерении флуоресценции от очень малого объема в условиях нахождения в нем небольшого числа флуоресцирующих частиц. Свободные молекулы фотосенсибилизатора в растворе дают лишь короткие всплески флуоресценции малой амплитуды. Добавление липосом приводит к появлению длительных всплесков высокой амплитуды. Для количественной оценки временных характеристик флуоресцентного сигнала вычисляется автокорреляционная функция.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1.1 Наличие фосфатной группы в молекуле липида – необходимое условие для фотодинамической активности металлофталоцианинов в липидных мембранах.
Ранее Рокицкой и соавт. (1993, 1996, 2000) было показано, что облучение БЛМ видимым светом в присутствии сульфированного фталоцианина алюминия приводит к падению тока через мембрану, индуцированного грамицидином А, сформированную из дифитаноилфосфатидилхолина (DPhPC). Это явление, опосредованное действием активных форм кислорода, генерируемых при возбуждении молекул фотосенсибилизатора, получило название фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов (Антоненко и др., 2005). Нами проведено сравнительное изучение кинетики фотоинактивации грамицидина в БЛМ, сформированных из DPhPC, фосфолипида, несущего два остатка фитановой кислоты, и БЛМ из глицеролмоноолеата – липида, не содержащего фосфатной группы и несущего один остаток олеиновой кислоты.
На Рис.1 представлены кинетики подавления тока Вспышка через мембрану, cформированную из глицеролмоноолеата (кривые I/I0, % 1 и 2) или DPhPC (кривая 3).
С транс-стороны мембраны добавляли 20 фотосенсибилизатор AlPcS (кривые 1 и 3) или -2 0 2 4 бенгальский розовый (кривая время, c 2). После этого в начальный Рис.1. Кинетика фотоинактивации грамицидиновых момент регистрации тока каналов в БЛМ из DPhPC или глицеролмоноолеата производилась вспышка после освещения мембраны фотовспышкой: кривая 1 – в присутствии 1 мкМ AlPcS4, кривая 2 – в присутствии света. Как можно видеть, в 1 мкМ бенгальского розового, кривые 1 и 2 – на случае, когда мембрану мембране из глицеролмоноолеата, кривая 3 – в присутствии 6 мкМ AlPcS4 на мембране из DPhPC. формировали из DPhPC, вспышка света в присутствии AlPcS4 приводила к подавлению тока на 15% (Рис.1, кривая 3). В случае добавления AlPcS4 к мембране из глицеролмоноолеата подавления тока после вспышки света не наблюдалось (Рис.1, кривая 1). В присутствии бенгальского розового, напротив, наблюдалось существенное уменьшение тока (на 50%) после вспышки света.
На Рис. 2 освещение мембраны осуществлялось в течение 20 с помощью источника постоянного света. Добавление 1 мкМ AlPcS4 к БЛМ из DPhPC приводило к повреждению грамицидиновых каналов на А=50 % (Рис.2, кривая 2). Величина A, называемая амплитудой фотоинактивации, отражает долю поврежденных каналов A=((I0-I)I0)·100 %.
В отсутствие фотосенсибилизатора освещение не приводило к фотоинактивации грамицидиновых каналов (Рис.2, кривая 1).
Отсутствие фотодинамической активности AlPcS4 в мембране из Действие глицеролмоноолеата, в видимого света совокупности с данными Рокицкой и соавт. (2000) о необходимости связывания I/I0, % A, % фотосенсибилизаторов с липидной мембраной для эффективного фотодинамического воздействия 0 20 40 60 80 100 на встроенные в мембрану время, c молекулы грамицидина, позволяет нам предположить, что Рис.2. Кинетика фотоинактивации грамицидиновых каналов в БЛМ из DPhPC при освещении связывание алюмофталоцианина источником постоянного света. Кривая 1 – в с фосфолипидной мембраной отсутствие фотосенсибилизатора, кривая 2 – в присутствии 1 мкМ AlPcS4, кривая 3 – в опосредовано фосфатной группой присутствии 1 мкМ AlPcS4 и 1 мМ KF. Буферный фосфолипида.
раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7. Это предположение было проверено в опытах по влиянию добавления фосфата калия в среду на фотодинамическую активность AlPcS4. Замена мМ KCl в буферном растворе на A, % 60 1 100 мМ KH2PO4 приводила к существенному ослаблению фотоинактивации грамицидиновых каналов в мембране из DPhPC в 100x10-12 1x10-9 10x10-9 100x10-9 1x10-6 10x10-6 100x10- присутствии AlPcS4 (Рис.3, С, М кривые 1 и 2). Зависимость Рис.3. Зависимость амплитуды фотоинактивации амплитуды фотоинактивации от грамицидина А в мембране из DPhPC от концентрации AlPcS4. Кривая 1 – буферный раствор концентрации AlPcS4 в содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, фосфатном буфере сместилась pH=7. Кривая 2 – буферный раствор содержал на 2 порядка в сторону больших мМ KH2PO4, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7.
концентраций по отношению к таковой в буфере, содержащем KCl. Таким образом, полученные данные подтвердили нашу гипотезу о важной роли, которую в процессе связывания красителей с фосфолипидной мембраной играет взаимодействие центрального атома металла фталоцианинов с фосфатными группами фосфолипидов.
1.2 Зависимость эффективности фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов в присутствии металлофталоцианинов от природы центрального атома металла.
В настоящей работе были изучены тетрасульфированные фталоцианины, содержащие в качестве центрального атома металла атомы алюминия, цинка и никеля.
Кроме того, был исследован также положительно-заряженный фталоцианин алюминия, а именно тетра(трибутиламмонийметил)гидрокси-фталоцианин алюминия (AlPcN4). На Рис.4 представлены зависимости амплитуды фотоинактивации грамицидиновых каналов от концентрации AlPcN4, AlPcS4, ZnPcS4 и NiPcS4.
На Рис.4 видно, что из исследованных фотосенсибилизаторов катионный фталоцианин алюминия, AlPcN4, проявлял наибольшую фотодинамическую A, % активность в данной системе, т.е. вызывал подавление активности грамицидиновых 4 каналов при наиболее низких концентрациях (Рис.4, кривая 1).
100x10-12 1x10-9 10x10-9 100x10-9 1x10-6 10x10-6 100x10 NiPcS4 фотоинактивацию C, М грамицидина не вызывал (Рис.4, Рис.4. Зависимость амплитуды фотоинактивации кривая 4). Если сравнивать грамицидина А в мембране из DPhPC от фотодинамическое действие концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая 1 – AlPcN4, кривая 2 – ZnPcS4, кривая 3 – AlPcS4, кривая ZnPcS4 и AlPcS4, то 4 – NiPcS4. Буферный раствор содержал 100 мМ KCl, цинкфталоцианин является 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7.
более эффективным фотосенсибилизатором в данной системе, чем алюмофталоцианин (Рис.4, кривые 2 и 3).
Различия в фотодинамической активности ряда фталоцианинов могут быть обусловлены различиями в 1) квантовом выходе генерации синглетного кислорода (Ф) и 2) связывании с мембраной. Согласно результатам наших измерений (по кинетике светозависимого падения флуоресценции 9,10-диметилантрацена), Ф для тетракатионного фталоцианина алюминия, растворенного в DMSO, несколько меньше Ф для ZnPcS4 в тех же условиях (Таблица 2). Эти данные не соответствуют различиям в фотодинамической активности AlPcN4 и ZnPcS4 (Рис.4).
Таблица 2. Квантовый выход генерации синглетного кислорода (Ф) различными металлофталоцианинами Ф ZnPcS4 0, AlPcN4 0, AlPcS4 0, NiPcS4 AlPcN4+KF 0, 1.3 Связывание с липидной мембраной ряда металлофталоцианинов в сравнении с фотодинамическим воздействием этих сенсибилизаторов на грамицидиновые каналы.
На Рис.5 представлена зависимость -потенциала липосом из яичного фосфатидилхолина от, мВ концентрации фотосенсибилизаторов. Видно, - 3 что добавление AlPcN4 (кривая 1) - приводит к более значительному росту абсолютной величины - 0 10 20 30 40 50 электрокинетического C, мкМ потенциала, чем добавление Рис.5. Зависимость -потенциала липосом из тетрасульфированных яичного фосфатидилхолина от концентрации фталоцианинов. Кривая 1 – AlPcN4, кривая 2 – фталоцианинов цинка и ZnPcS4, кривая 3 – AlPcS4, кривая 4 – NiPcS4.
алюминия (кривые 2 и 3). Это Буферный раствор содержал 10 мМ KCl, 5 мМ MES, 5 мМ Tris, pH 7. показывает, что AlPcN эффективнее связывается с липосомами из фосфатидилхолина, чем AlPcS4 и ZnPcS4. В случае добавления NiPcS4 электрофоретическая подвижность липосом не изменялась (кривая 4), т.е. этот краситель не сорбировался на поверхности липосом.
Таким образом, данные по электрофоретической подвижности липосом в присутствии заряженных фталоцианинов коррелируют с измерениями их фотодинамической активности, позволяя сделать вывод о том, что именно различия в связывании с липидом являются причиной различий в фотодинамическом действии.
В силу важности полученной корреляции были проведены опыты по измерению связывания фталоцианинов с мембраной другим методом, а именно методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Экспериментальная установка представляет собой микрофлуориметр, регистрирующий флуоресценцию F лишь от малого объема, по порядку величины составляющего 10-15 литра. Для возбуждения флуоресценции применяли He-Ne лазер с длиной волны 633 нм. Для количественной обработки флуктуирующего сигнала F(t) производится вычисление автокорреляционной функции:
F (t ) F (t + ) G ( ) = (1) F (t ) F (t ) – средняя интенсивность флуоресценции, а F (t ) - F (t ) где – отклонение от среднего значения. Для случая трехмерной диффузии частиц функция G() имеет вид:
1 1 G ( ) = (2), N w2 1+ 1+ d z 0 d где N – среднее число флуоресцирующих частиц в конфокальном объеме, w0, z0 – геометрические характеристики конфокального объема, d - среднее время нахождения в конфокальном объеме, которое определяется размером частиц.
На Рис.6 представлены данные по связыванию AlPcS4 (правая панель) и AlPcN (левая панель) с мембранами липосом, приготовленных из яичного фосфатидилхолина.
Приведены типичные сигналы флуоресценции фотосенсибилизаторов, которые в данной шкале имеют вид прямой линии (панели A и В, кривые 1). Ниже приведены автокорреляционные функции двух красителей, характерное время корреляции которых составляет около 100 мкс (панели Б и Г). Средний ряд графиков соответствует добавлению липосом (панели A и В, кривые 2 и 3). Видно, что в случае AlPcN4 в записи флуоресценции появляются длительные пики высокой амплитуды (Рис.6, панель А, кривая 2) и происходит сдвиг автокорреляционной функции в область более продолжительных времен (Рис.6, панель Б, кривая 2). Оба наблюдения свидетельствуют о связывании красителя с мембранами липосом.
В A 800 600 1 400 Интенсивность флуоресценции, kГц Интенсивность флуоресценции, kГц 200 0 800 600 2 400 200 0 t, с t, с 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Г Б 1, 1, G() G() 1,04 1, 1, 1,02 1, 1, 101 102 103 104 105 101 102 103 104 105, мкс, мкс Рис.6. Связывание AlPcN4 (левая часть, панели A, Б) и AlPcS4 (правая часть, панели В, Г) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Записи сигнала флуоресценции (панели A, В) и автокорреляционные функции (панели Б, Г). Кривые 1 – контроли, измеренные в отсутствие липосом, в присутствии 300 нM AlPcN4 (левая часть) и 300 нM AlPcS4 (правая часть);
кривые 2 – в присутствии 0,0067 мг/мл липосом;
кривые – в присутствии 0,67 мг/мл липосом. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами: панель Б, кривая 1 – 0,103 мс;
кривая 2 – 0,20 мс (14 %) и 11 мс (86 %);
кривая 3 – 0,126 мс (18 %) и 9,2 мс (82 %);
панель Г, кривая 1 – 0,066 мс;
кривая 2 – 0,072 мс;
кривая 3 – 0,076 мс ( %) и 9,6 мс (28 %).
1.3 Сравнение действия фторид-иона на фотоинактивацию грамицидиновых каналов, сенсибилизированную положительно и отрицательно заряженными металлофталоцианинами.
Ранее было показано, что добавление фторид-ионов приводит к подавлению фотоинактивации грамицидиновых каналов в присутствии сульфированных фталоцианинов алюминия и десорбции этих фотосенсибилизаторов с поверхности нейтральных липидных мембран (Rokitskaya et al., 2000). Этот результат трактовался как следствие возрастания отрицательного заряда красителя при присоединении аниона фторида к центральному атому алюминия в молекуле алюмофталоцианина. Такая трактовка предполагала, что добавление фторид-ионов должно вызывать возрастание сорбции AlPcN4 на поверхности липосом вследствие уменьшения общего положительного заряда молекулы при связывании аниона фторида, приводящего к повышению липофильности молекулы. Однако поставленные нами опыты не подтвердили данного предположения.
Как видно на Рис.2 (кривая 3), добавление 1 мМ KF приводит к 1, почти полному снятию действия 1, нормированная амплитуда света на грамицидиновые каналы в 0, присутствии AlPcS4, в соответствии с 0, данными, полученными Рокицкой и Col 1 vs Col 0, соавт. (2000). На Рис.7 представлена зависимость нормированной 0, амплитуды фотоинактивации 0, 0 5 10 15 20 25 грамицидиновых каналов от KF, мМ концентрации фторид-анионов для Рис.7. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из DPhPC от ряда фотосенсибилизаторов: ZnPcS4, концентрации фторида калия. Кривая 1 – ZnPcS4, AlPcS4 и AlPcN4.
кривая 2 – AlPcN4, кривая 3 – AlPcS4. Буферный раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, 10 Согласно полученным мМ Tris, pH 7.
данным, фторид калия подавляет фотоинактивацию грамицидиновых каналов в нейтральных мембранах в присутствии AlPcN4 (Рис.7, кривая 2), так же как и в присутствии AlPcS4 (Рис.7, кривая 3) и не действует на фотодинамическую активность ZnPcS4 (Рис.7, кривая 1).
1.4 Сравнение влияния фторид-иона на связывание с мембраной положительно и отрицательно заряженных металлофталоцианинов.
A Б 1, 1, 0, 0, 2 0, 0, G() G() 0, 0,4 0, 0,2 1 0, 0, 101 102 103 104 10 10 10 10 10 1 2 3 4 5, мкс, мкс Рис.8 Действие KF на связывание AlPcN4 (A) и AlPcS4 (Б) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Кривые 1 – автокорреляционные функции без липосом, в присутствии 300 нM AlPcN4 (A) и AlPcS4 (Б);
кривые 2 – в присутствии 0, мг/мл липосом;
кривые 3 – после добавления 1 мM KF;
кривая 4 – после добавления мM KF. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами: панель A, кривая 1 – 0,1 мс;
кривая 2 – 0,1 мс (22 %) и 7, мс (78 %);
кривая 3 – 0,14 мс (77 %) и 10,6 мс (23 %);
кривая 4 – 0,15 мс. панель Б, кривая 1 – 0,09 мс;
кривая 2 – 0,07 мс (69 %) и 6,3 мс (31 %);
кривая 3 – 0,08 мс.
На Рис.8 показано влияние фторид-аниона на связывание AlPcN4 и AlPcS4 с мембранами липосом из яичного фосфатидилхолина, измеренное методом FCS. В случае AlPcN4 добавление липосом приводит к появлению плеча на автокорреляционной функции (Рис.8, панель А, кривая 2). Добавление KF вызывает исчезновение этого плеча (Рис.8, панель А, кривая 4). В случае AlPcS4 добавление липосом приводит к появлению плеча на автокорреляционной функции, но это не так ярко выражено, как в случае катионного алюмофталоцианина (Рис.8, панель Б, кривая 2). Добавление фторида калия к липосомам с тетрасульфированным алюмофталоцианином вызывает исчезновение этого плеча (Рис.8, панель Б, кривая 3). При сравнении кривой 2 (панель А) в отсутствие KF и кривой 4 (панель А) в присутствии 10 мМ KF видно, что как и в случае AlPcS4 (Рис.8, панель Б, кривые 2 и 3), фторид-ион вызывает десорбцию AlPcN4 с поверхности мембран липосом.
Таким образом, данные по фотоинактивации грамицидиновых каналов коррелируют с данными, полученными методом FCS, о том, что фторид-анион вызывает десорбцию AlPcN4 с поверхности мембраны.
1.5 Действие анионов фторида и фосфата на спектры флуоресценции металлофталоцианинов.
При измерении спектров флуоресценции выявлен коротковолновый сдвиг положения максимума в спектре флуоресценции AlPcN4 в этаноле под действием фторид ионов (Рис. 9), аналогичный сдвигу для AlPcS4, что свидетельствует об образовании комплекса фторида-иона с фталоцианином алюминия. Подобный сдвиг наблюдался в наших экспериментах и под действием фосфат-иона.
б а 1, 1, Флуоресценция, у.е.
Флуоресценция, у.е.
1, 1,0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 660 680 700 720 740 0, 660 680 700 720, нм, нм Рис. 9. Спектры флуоресценции AlPcN4 (а) и AlPcS4 (б) в этаноле в отсутствие (сплошные линии) и в присутствии 1 мМ KF (штриховые линии).
На основании полученных данных нами - A выдвинута гипотеза о важной роли Me - - координационного взаимодействия центрального _ O атома металла фталоцианина с фосфатной группой OPO O липида в связывании металлофталоцианинов с фосфатидилхолиновой мембраной. Кроме того, мы + + Б предполагаем, что на эффективность Me + + координационного взаимодействия центрального _ атома металла фталоцианинов с фосфатной группой O OPO липида значительное влияние оказывает O электрическое поле, которое создают заряды, Рис.10. Схема взаимодействия AlPcS4 (А) и AlPcN4 (Б) с расположенные на периферии молекулы фосфатными группами липидов.
фталоцианина. Четыре отрицательных заряда в случае AlPcS4 существенно препятствуют взаимодействию красителя с фосфатной группой липида, в то время как четыре положительных заряда в случае AlPcN4 такое взаимодействие облегчают (Рис.10).
Эффект фторид-ионов хорошо объясняется в рамках предположения о том, что связывание AlPcN4 с фосфолипидной мембраной, так же как и в случае сульфированных металлофталоцианинов, определяется координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида, которая может быть вытеснена из координационной сферы алюминия вследствие конкурентного замещения фторид-ионом (Рис.11).
O_ OPO O + N KF SO SO N _ + N N SO 3 _ Al N N SO + N N O_ Al OPO O N + _ N SO SO SO _ O_ SO OPO O _ + N SO 3 _ SO + - FAl _ SO _ O_ SO OPO O + N Рис.11. Схема комплексообразования KF с AlPcS4, которое приводит к десорбции AlPcS4 с поверхности мембраны.
2.1 Влияние заряда мембраны на связывание катионных и анионных фталоцианинов.
Для изучения влияния заряда мембраны на эффективность связывания были поставлены опыты с отрицательно заряженными липосомами (из фосфатидилсерина мозга быка) и положительно заряженными липосомами (с добавлением цетилтриметиламмония, CTAB).
A Б 1, 1, 1, G() G() 1, 1, 1, 1, 1,01 1, 1, 1, 101 102 103 104 105 101 102 103 104 105, мкс, мкс Рис.12. Влияние CTAB на связывание AlPcN4 (панель A) и AlPcS4 (панель Б) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Кривая 1 – автокорреляционная функция в отсутствие липосом, в присутствии 300 нМ AlPcN4;
кривая 2 – в присутствии 0,67 мг/мл липосом;
кривая 3 – после добавления 200 мкM CTAB. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами D: панель A (AlPcN4) кривая 1 – 114 мкс;
кривая 2 – 116 мкс (19 %), 6900 мкс (81 %);
кривая 3 – 100 мкс (87 %), 6200 мкс (13 %);
панель Б (AlPcS4) кривая 1 – 66 мкс;
кривая 2 – 74 мкс (85 %), 7700 мкс (15 %);
кривая 3 – 6600 мкс.
На Рис.12 представлены данные, полученные методом FCS, по влиянию положительно заряженного амфифильного вещества CTAB на связывание AlPcN4 (панель А) и AlPcS4 (панель Б) с липосомами, приготовленными из яичного фосфатидилхолина. В случае AlPcN4 добавление липосом вызывает сдвиг автокорреляционной функции в сторону больших времен (Рис.12, панель А, кривая 2). Добавление CTAB приводит к практически полному возвращению автокорреляционной функции к контролю (Рис.12, панель А, кривая 3). В случае AlPcS4, в согласии с ранее описанными данными, добавление липосом не вызывает значительных изменений автокорреляционной функции (Рис.12, панель Б, кривая 2), тогда как добавление СТАВ к липосомам из фосфатидилхолина в присутствии AlPcS4 приводит к значительным изменениям (Рис.12, панель Б, кривая 3). Автокорреляционная функция при этом сдвигается вправо, т.е.
введение положительного заряда на поверхность нейтральных липосом увеличивает связывание анионного алюмофталоцианина.
Мы также изучили влияние заряда мембраны на связывание катионных и анионных фталоцианинов другим способом, а именно: методом измерения -потенциала липосом.
На Рис.13 представлена зависимость -потенциала отрицательно заряженных липосом, приготовленных из липида E.coli, от концентрации фотосенсибилизаторов. Добавление катионного фотосенсибилизатора AlPcN4 к таким липосомам приводило к резкому изменению электрофоретической подвижности (Рис.13, кривая 1), что выражалось в изменении знака -потенциала. В случае анионных фотосенсибилизаторов электрофоретическая подвижность липосом изменялась слабо. Можно заключить, что анионные фталоцианины не сорбировались на поверхности отрицательно заряженных липосом (Рис. 13, кривые 2, 3, 4).
Из данных по измерению -потенциала следует, что AlPcN4 наиболее эффективно из изученного ряда 0 10 20 30 40 50 фотосенсибилизаторов, мВ C, мкМ - связывается как с отрицательно - заряженными липосомами из - липида E. сoli (Рис.13), так и с нейтральными липосомами из - Рис.13. Зависимость -потенциала липосом, фосфатидилхолина (Рис.5).
приготовленных из липида E.coli, от концентрации фталоцианинов. Кривая 1 – AlPcN4, кривая 2 – ZnPcS4, кривая 3 – AlPcS4, кривая 4 – NiPcS4.
Буферный раствор содержал 10 мМ KCl, 5 мМ MES, 5 мМ Tris, рН 7.
.
2.2 Значение электростатического взаимодействия с липидной мембраной для фотодинамической активности металлофталоцианинов.
На Рис.14 представлены зависимости амплитуды фотоинактивации грамицидиновых каналов в присутствии AlPcN4, AlPcS4 и ZnPcS4 для мембран, содержащих кислые липиды. Ранее (Рис.4) аналогичные данные были показаны для мембраны из нейтрального липида (DPhPC). Сравнение этих двух рисунков показывает существенно большую разницу в активности изученных фотосенсибилизаторов на отрицательно заряженных мембранах, приготовленных из смеси DPhPC и анионного липида дифитаноилфосфатидилглицерола (DPhPG), чем на нейтральных мембранах.
Данные по фотоинактивации грамицидиновых каналов хорошо коррелируют с результатами измерений A, % потенциала. Учитывая данные по квантовому выходу генерации синглетного кислорода для ZnPcS4, AlPcS4 и AlPcN 100x10-12 1x10-9 10x10-9 100x10-9 1x10-6 10x10-6 100x10- (Таблица 2), можно C, М заключить, что Рис.14. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из смеси DPhPC/DPhPG существенные различия в (70/30%) от концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая фотодинамической 1 – AlPcN4, кривая 2 – ZnPcS4, кривая 3 – AlPcS4.
Буферный раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, 10 активности положительно и мМ Tris, pH 7.
отрицательно заряженных фталоцианинов на липидных мембранах, и в особенности на тех, которые содержат анионные липиды, объясняются различиями в связывании фталоцианинов. Эти результаты свидетельствуют о значительном вкладе электростатического взаимодействия в процесс связывания заряженных фталоцианинов с мембраной.
Мы провели систематическое исследование фотодинамической активности (по фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов) и связывания с фосфолипидной мембраной (по изменению электрофоретической подвижности липосом) целого ряда тетра-, гекса- и октакатионных металлофталоцианинов, полученных из НИОПИК, в сравнении с тетрасульфированными металлофталоцианинами.
Оказалось, что на нейтральной мембране из DPhPC эффективнее действуют тетрасульфированные фталоцианины цинка и алюминия (Рис. 15, кривые 1 и 2), чем октакатионные металлофталоцианины (Рис. 15, кривые 3, 4 и 5).
На отрицательно заряженной мембране 2 наблюдаются более 100 значительные различия в фотодинамической активности катионных и A, % анионных фотосенсибилизаторов, причем катионные фталоцианины действуют при 100x10-9 1x10-6 10x10-6 100x10-6 1x10-3 10x10-3 100x10- гораздо меньших C, мМ концентрациях (Рис.16, Рис.15. Зависимость амплитуды фотоинактивации кривые 1, 2 и 3), чем грамицидина А в мембране из DPhPC от концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая 1 – ZnPcS4, кривая 2 – анионные фталоцианины AlPcS4, кривая 3 – ZnPcPym8, кривая 4 – AlPcPym8, (Рис.16, кривые 4 и 5).
кривая 5 – ZnPcChol8. Буферный раствор содержал мМ KCl, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7.
1 80 0 10 20 30 40 50, мВ С, мкМ 4 A, % - - - 100x10-9 1x10-6 10x10-6 100x10-6 1x10-3 10x10-3 100x10- - C, мМ Рис.16. Зависимость амплитуды Рис.17. Зависимость -потенциала липосом, фотоинактивации грамицидина А в приготовленных из липида E.coli, от мембране из смеси DPhPC/DPhPG (70/30%) концентрации фталоцианинов. Кривая 1 – от концентрации фотосенсибилизаторов. AlPcPym8, кривая 2 – ZnPcPym8, кривая 3 – Кривая 1 – ZnPcChol8, кривая 2 – AlPcS4, кривая 4 – ZnPcS4. Буферный AlPcPym8, кривая 3 – ZnPcPym8, кривая 4 – раствор содержал 10 мМ KCl, 5 мМ MES, AlPcS4, кривая 5 – ZnPcS4. Буферный мМ Tris, рН 7.
раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7.
На Рис.17 видно, что добавление AlPcPym8 и ZnPcPym8 вызывает значительно больший рост абсолютной величины электрокинетического потенциала в случае липосом, образованных из липида E.coli (кривые 1 и 2), чем добавление тетрасульфированных алюмо- и цинкфталоцианинов (кривые 3 и 4). Следовательно, AlPcPym8 и ZnPcPym эффективнее связываются с липосомами из E.coli, чем AlPcS4 и ZnPcS4.
Эти данные позволяют нам заключить, что значительно большая эффективность октакатионных фталоцианинов по сравнению с анионными фталоцианинами в фотоинактивации грамицидиновых каналов в отрицательно заряженной мембране связана с различным сродством этих фотосенсибилизаторов к мембране.
Одним из основных результатов настоящей работы явилось доказательство корреляции между связыванием фталоцианинов с мембраной и эффективностью их фотодинамического воздействия. Эта корреляция, уже отмеченная ранее (Rokitskaya et al., 2000), находится в соответствии с локальным характером действия генерируемых сенсибилизатором активных форм кислорода. Другим значительным результатом работы стало выявление нового фактора, определяющего процесс связывания металлофталоцианинов с мембранами, а именно координационной связи центрального атома металла с фосфатной группой фосфолипида. Особенно важным этот вид взаимодействия становится в случае многозарядных гидрофильных фталоцианинов, которые нашли применение как при фотодинамической терапии рака (сульфированные фталоцианины), так и в качестве антибактериальных агентов (поликатионные фталоцианины). Ранее в литературе было показано, что для связывания некоторых ионов металлов с липидными мембранами необходимо наличие на их поверхности фосфатных групп (Ермаков и др., 1992). Однако, большое значение координационного взаимодействия с фосфатными группами фосфолипидов в случае металлофталоцианинов было установлено впервые. Из литературы было также известно, что связывание с мембранами заряженных молекул существенно зависит от поверхностного потенциала мембраны (McLaughlin, 1989). Однако не было данных об электростатическом взаимодействии фталоцианинов с мембранами, имеющими различный поверхностный заряд. В настоящей работе не только изучено такое взаимодействие, но и продемонстрирована его значительная роль в фотодинамическом действии фталоцианинов.
ВЫВОДЫ:
1. Фотодинамическая активность металлокомплексов фталоцианинов, несущих различные анионные и катионные заместители, изучена в модельной системе на примере фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов в плоских бислойных мембранах различного липидного состава. Показано, что фталоцианины алюминия и цинка, имеющие от 4 до 8 положительно заряженных заместителей, так же как и сульфированные фталоцианины с такими же центральными атомами, проявляют высокую активность в данной системе.
2. Продемонстрировано ингибирующее влияние фторид-анионов на фотодинамическую активность как анионных, так и катионных фталоцианинов алюминия.
3. С помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии, а также измерения электрофоретической подвижности липосом исследовано связывание замещенных металлофталоцианинов с бислойными липидными мембранами. Полученные концентрациоонные зависимости связывания изученных фталоцианинов коррелируют с соответствующими зависимостями их активности, измеренной по фотоинактивации грамицидиновых каналов.
4. Совокупность полученных данных свидетельствует в пользу того, что связывание замещенных металлофталоцианинов с фосфолипидной мембраной определяется в значительной степени координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида.
5. Обнаружена существенная зависимость фотодинамической активности замещенных фталоцианинов цинка и алюминия от заряда липидной мембраны.
Качественные различия в этой зависимости для фталоцианинов с катионными и анионными заместителями свидетельствуют о значительном вкладе электростатического взаимодействия в процесс связывания металлофталоцианинов с мембраной.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1. Pashkovskaya A.A., Sokolenko E.A., Sokolov V.S., Kotova E.A., Antonenko Y.N., Photodynamic activity and binding of sulfonated metallophthalocyanines to phospholipid membranes: contribution of metal-phosphate coordination. Biochim. Biophys. Acta Biomembranes 1768 (10), 2459-2465, 2007.
2. Pashkovskaya A.A., Maizlish V.E., Shaposhnikov G.P., Kotova E.A., Antonenko Y.N. Role of electrostatics in the binding of charged metallophthalocyanines to neutral and charged phospholipid membranes. Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes 1778 (2), 541-548, 2008.
3. Пашковская A.A., Перевощикова И.В., Майзлиш В.Е., Шапошников Г.П., Котова E.A., Антоненко Ю.Н. Взаимодействие тетразамещенного катионного фталоцианина алюминия с искусственными и природными мембранами. Биохимия, 74 (9), 1252-1259, 2009.
4. Пашковская А.А., Котова Е.А., Дурантини Э.Н., Антоненко Ю.Н. Сравнение фотосенсибилизирующего действия отрицательно и положительно заряженных фталоцианинов в модельной мембранной системе. IV Съезд фотобиологов России, 2005, С. 155.
5. Pashkovskaya A.A., Sokolenko E.A., Sokolov V.S., Kotova E.A., Antonenko Y.N. Metal phosphate coordination determines the adsorption and photodynamic activity of sulfonated metallophthalocyanines on phospholipid membranes. XII Congress of the European Society for Photobiology, 2007, P. 150.
6. Sokolenko E.A., Pashkovskaya A.A., Kotova E.A., Sokolov V.S., Antonenko Y.N. Interaction of sulfonated metallophthalocyanines with bilayer lipid membranes: photochemical activity versus adsorption on the membrane surface. 51st Biophysical Society Annual Meeting, 2007, P.239a.
7. Пашковская А.А., Котова Е.А., Майзлиш В.Е., Антоненко Ю.Н.
Фотосенсибилизированное повреждение ионных каналов грамицидина А в бислойной липидной мембране в присутствии катионных металлофталоцианинов: роль связывания фотосенсибилизатора с мембраной. V Съезд Российского фотобиологического общества, 2008, С. 173.
8. Pashkovskaya A., Kotova E., Strakhovskaya M., Kireev V., Kuznetsova N., Yuzhakova O., Antonenko Y. Impact of electrostatic interactions with membranes on photodynamic activity of cationic phthalocyanines. V International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines, 2008, P. 508.