Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем
На правах рукописи
ВЕРШИНИНА ЗИЛЯ РИФОВНА Лектины бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем 03.01.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (ИБГ УНЦ РАН) Доктор биологических наук
Научный консультант:
Баймиев Алексей Ханифович ИБГ УНЦ РАН Доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Шакирова Фарида Минихановна ИБГ УНЦ РАН Кандидат биологических наук Сафронова Вера Игоревна Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Учреждение Российской академии наук
Ведущая организация:
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится «_» 2010 г. в «» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133. при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом – на сайте ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: [email protected]
Автореферат разослан «» 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. На сегодняшний день важнейшей задачей сельского хозяйства является обеспечение быстрорастущего населения земли продовольствием. Широкое внедрение в производство высокоурожайных сортов возможно лишь при наличии в почве больших количеств легкодоступных соединений азота и это является основным лимитирующим фактором повышения продуктивности агроэкосистем. Применение азотных удобрений не может полностью решить данную проблему, что обусловлено экономическими и экологическими причинами.
Микробиологическая фиксация атмосферного азота позволяет избежать значительных затрат энергетических ресурсов, так как осуществляется за счёт энергии Солнца. Кроме того, это единственный экологически чистый путь снабжения растений доступным азотом, при котором принципиально невозможно загрязнение почв, воды и воздуха (Умаров, 2001). В связи с этим одной из перспективных задач для современного сельского хозяйства является максимальное использование и преумножение симбиотического потенциала культурных растений.
Конечной целью большинства современных экспериментов симбиотической биоинженерии является создание устойчивых эндосимбиотических компартментов в растениях, которые в природе не вступают в эффективный азотфиксирующий симбиоз (Kovalskaya et al., 2003;
Гончар и др., 2007). Эти эксперименты основаны на том, что развитие подобных структур, в частности инфекционных нитей, симбиосом и самих клубеньков, можно рассматривать как совокупность реорганизованных процессов нормального гистогенеза и цитодифференцировки, регулируемых новыми сигналами, поступающими от микросимбионтов (Brewin, 1998).
Поэтому успехи в изучении генетических систем азотфиксирующего симбиоза позволяют приступить к направленному повышению эффективности подобных мутуалистических взаимоотношений, а также к созданию новых симбиотических комплексов. Одним из подходов для этого является модификация процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий, во время которых растение выбирает оптимального партнера из состава обширной и генетически разнородной микробной популяции (Тихонович, Проворов, 2005).
Азотфиксация при бобово-ризобиальном симбиозе является наиболее эволюционно продвинутой и эффективной по сравнению с другими симбиотическими системами и создание небобовых трансгенных растений, вступающих в азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями является перспективным направлением в биоинженерии симбиотических систем. Одним из ключевых факторов на пути формирования бобово ризобиального симбиоза являются лектины, которые обеспечивают узнавание растением-хозяином специфической для него бактерии. Эти белки, благодаря своим углеводсвязывающим свойствам, определяют избирательные взаимодействия растений с ризобиями, участвуя в адгезии бактерий к корневым волоскам, формировании инфекционных нитей и образовании клубеньков (Kijne et al., 1992). Поэтому эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов бобовых, позволяют расширять круг микросимбионтов растений и являются важным этапом в создании новых симбиотических систем.
Цель данного исследования заключалась в получении трансгенных по генам лектинов бобовых растений модельных корневых систем на люцерне посевной, астрагале нутовом, облепихе крушиновидной, рапсе сорта Hanna и табаке линии SR1 и изучении симбиотических взаимодействий полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Клонировать последовательности генов лектинов бобовых растений в векторе pCambia 1305.1 и трансформировать полученными конструкциями клетки Agrobacterium rhizogenes 15834.
2. Разработать методы получения трансгенных по генам лектинов «бородатых корней» на люцерне, астрагале, облепихе, рапсе и табаке.
3. Изучить симбиотические взаимодействия полученных корневых систем с различными клубеньковыми бактериями.
4. Путем трансформации Agrobacterium tumefaciens создать трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и изучить симбиотические взаимодействия корней с микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum bv. viciae.
Научная новизна работы Разработан метод получения трансгенных по генам лектинов бобовых растений «бородатых корней» на астрагале, облепихе, рапсе и табаке. Впервые показана возможность формирования клубенек-подобных структур на актиноризных растениях с участием ризобий. Обнаружено усиление ризобиальной колонизации на трансгенных по гену лектина «бородатых корнях» рапса и табака. Созданы трансгенные растения табака, несущие ген лектина гороха посевного, и впервые описаны скручивания корневых волосков полученных растений под воздействием микросимбионта гороха посевного.
Впервые обнаружена спонтанная светонезависимая регенерация проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней».
Научно-практическая значимость работы Полученные результаты расширяют представление об участии лектинов в формировании различных видов азотфиксирующего симбиоза. Разработанный экспериментальный подход, основанный на модификации процессов узнавания и ранних симбиотических взаимодействий с помощью лектинов бобовых растений, в перспективе может быть использован для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями. Возможность спонтанной регенерации проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней» открывает новые перспективы в использовании астрагалов в качестве источников биологически активных веществ.
Конкурсная поддержка работы Работа проводилась при финансовой поддержке программы «Государственная поддержка молодых российских ученых и ведущих научных школ России» (гранты МД-43.2008.4 и НШ-649.2008.4), ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (госконтракт 02.518.11.7138) и гранта по инновационным исследованиям «У.М.Н.И.К.» (ГР 001200850086).
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 2-й международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), 2-м всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2007), всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008» (Москва, 2008), международной научной конференции «Физико химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009).
Публикации По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в Перечень ВАК.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 145 страницах, содержит 17 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего работ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Объектами исследования в данной работе служили бобовые растения умеренного климата: люцерна посевная (Medicago sativa) и астрагал нутовый (Astragalus cicer);
актиноризное растение: облепиха крушиновидная сорта Золотой початок (Hippophae rhamnoides L.);
несимбиотрофные растения: рапс сорта Hanna (Brassica napus L. var. napus) и табак (Nicotiana tabaccum линии SR1).
В экспериментах были использованы ген семенного лектина гороха Pisum sativum (PSL) и химерные конструкции на основе этого лектина, углеводсвязывающий участок которого заменен на аналогичные фрагменты ДНК, кодирующие углеводсвязывающие домены лектинов астрагала нутового Astragalus cicer (PSL/AGL), эспарцета песчаного Onobrychis arenaria (PSL/OAL) и клевера лугового Trifolium pratense (PSL/TPL) (Губайдуллин и др., 2006).
При проведении экспериментов по клонированию использовали штамм E. coli XL1-Blue и фагмиду pBluescript II KS(-), содержащую гены лектинов.
Для трансформации растений была использована бинарная векторная конструкция pCambia 1305.1, для трансформации микросимбионтов в целях дальнейшего скрининга - вектор pCambia 1304. Для получения «бородатых корней» и трансгенных растений применяли штаммы A. rhizogenes 15834 и A. tumefaciens AGL0, соответственно.
В опытах по выявлению симбиотических реакций на трансгенных корнях использовали следующие микросимбионты: бактерии Sinorhizobium meliloti (микросимбионт люцерны), Rhizobium leguminosarum bv. viciae (микросимбионт гороха), Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (микросимбионт клевера), бактерии из клубеньков эспарцета песчаного, близкие по генам 16S рРНК к Phyllobacterium trifolii (GenBank Ac. No DQ372661), бактерии из клубеньков астрагала нутового, близкие по генам 16S рРНК к Agrobacterium tumefaciens (GenBank Ac. No. DQ372662), и актиномицеты Frankia (микросимбионты облепихи).
Методы исследования. Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, подготовку компетентных клеток, их трансформацию плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. Для экспериментов по оценке экспрессии гена лектина в «бородатых корнях» кДНК, комплементарную мРНК, получали при помощи фермента AMW ревертазы. Гистохимический gus-анализ проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с небольшими модификациями (Kosugi et al., 1990).
Трансгенные растения табака получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок (Horsh, Fry, 1985). Для микротомирования полученных на «бородатых корнях» облепихи клубеньков использовали фиксатор Карнуа. Срезы толщиной 6-8 мкм окрашивали гематоксилином Бемера и водным раствором эозина и затем микроскопировали (Limpens et al., 2005).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Клонирование химерных конструкций гена лектина в бинарном векторе pCambia 1305. Ген семенного лектина гороха (PSL), а также его производные PSL/AGL, PSL/OAL и PSL/TPL были клонированы в Т-ДНК вектора для трансформации растений pCambia 1305.1 (рис.1). Поскольку в маркере устойчивости к антибиотику в экспериментах с «бородатыми корнями» не было необходимости (так как трансформированные ткани легко определяются по морфологии), мы выщепили из состава Т-ДНК вектора ген hptII, находящийся под контролем двойного конститутивного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты, рестриктазой Xho I и клонировали по этому сайту гены химерных лектинов и ген лектина PSL семян гороха. Тем самым мы одновременно решили проблему переноса «лишних» копий 35S промотора в геном трансгенных тканей, часто приводящую к «молчанию» целевого гена. Полученные генетические конструкции pCambia 1305.1-лектин были введены в клетки A. rhizogenes 15834, содержащие Ri-плазмиды дикого типа, методом электропорации.
Рис. 1. Схема клонирования генов химерных лектинов и гена лектина PSL семян гороха в составе вектора pCambia 1305.1.
2. Получение трансгенных «бородатых корней» и композитных растений Получение «бородатых корней» на проростках люцерны, астрагала, облепихи и рапса В среднем через 3 недели после введения инсулиновым шприцем суспензии A. rhizogenes в гипокотиль 1-2 недельных проростков на месте ранения начинали расти «бородатые корни». На растениях, проколотых шприцем со стерильной средой TY, появления «бородатых корней» не наблюдали. Котрансформация Т-ДНК pCambia 1305.1-лектин в полученных корнях была подтверждена активностью содержащего интрон гена -D-глюкоуронидазы, а также ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих участок гена лектина. Также на уровне мРНК была доказана конститутивная экспрессия гена лектина в трансформированных корнях. В качестве контроля были использованы «бородатые корни», полученные с помощью исходного нетрансформированного штамма A. rhizogenes 15834.
Гистохимический и ПЦР анализы в этом случае дали отрицательный результат.
Получение «бородатых корней» на листовых пластинках табака Через неделю после инокуляции у всех листовых эксплантов табака по краям начинали появляться «бородатые корни». На контрольных не инокулированных эксплантах такие корни не были обнаружены.
Более 50% «бородатых корней», полученных с помощью штамма несущего pCambia 1305.1-psl, оказались A. rhizogenes, котрансформированными, что было подтверждено gus-анализом и ПЦР на наличие и конститутивную экспрессию на уровне мРНК гена лектина. В качестве контроля были использованы «бородатые корни», полученные с помощью исходного штамма A. rhizogenes. Гистохимический и ПЦР анализы в этом случае дали отрицательный результат.
Получение композитных растений После того, как «бородатые корни» достигали в длину 3–4 см (по прошествии примерно 3-4 нед.), настоящий корень отрезали и растения пересаживали в стерильный вермикулит.
Проростки, состоящие из трансгенного корня и нетрансгенной надземной части, после 5 мес. роста отличались от контрольных растений, которые имели нормальный корень. Для них были характерны малый рост и/или большое количество стеблей/веток. Данный фенотип обусловлен активностью ауксинов и rol-генов, перенесенных в геном «бородатых корней» A. rhizogenes (Diouf et al., 1995;
Christey, 1997).
3. Обработка трансгенных корней микросимбионтами и анализ полученных клубеньков Для оценки влияния лектина гороха и созданных на его основе гибридных лектинов на симбиотические реакции модельных растений мы провели обработку трансгенной корневой системы композитных растений различными микросимбионтами (табл. 1).
Симбиотические реакции модельных растений люцерны с корнями, трансгенными по PSL Через месяц после обработки ризобиями R. leguminosarum bv. viciae композитных растений люцерны с корнями, трансгенными по гену лектина PSL, в ризосфере были обнаружены клубеньки, схожие с клубеньками, которые формирует ее естественный микросимбионт S. meliloti (рис. 2). Однако высев содержимого клубеньков на чашки Петри с целью идентификации сформировавшего их штамма ризобий показал, что клубеньки пусты, т.е. мы имеем дело с неинфицированными псевдоклубеньками.
Рис. 2. Псевдоклубеньки на люцерне с корнями, трансгенными по PSL (опыт № 4).
Ранее сотрудниками лаборатории было показано, что экзогенная обработка лектином PSL ризобий R. leguminosarum bv. viciae приводит к образованию на корнях люцерны огромных белых псевдоклубеньков, необычной гроздевидной формы (Баймиев и др., 2009). Псевдоклубеньки аналогичной формы наблюдали и Брилл с соавт. при трансформации люцерны геном ее собственного лектина MsLEC1 в антисенс-ориентации (Brill et al., 2004). Таким образом, можно сказать, что лектин PSL необходим на начальных стадиях взаимодействия M. sativa с бактериями R. leguminosarum bv. viciae и его влияния достаточно для развития неинфицированных клубеньков.
Таблица 1. Варианты и результаты обработки корней контрольных (К) и композитных (комп) растений микросимбионтами Инокулируемое растение Ризобии (инокулят) Лектин, который Фенотипические ответы растения № несут корни опыта 1 К или комп M. sativa любой лектин + случаи видимых проявлений нет — его отсутствия 2 К или комп M.sativa многочисленные розовые клубеньки S. meliloti 3 К или комп M.sativa R. leguminosarum bv. viciae видимых проявлений нет — 4 R. leguminosarum bv. viciae PSL розовые клубеньки без бактерий комп M.sativa 5 К или комп M.sativa бактерии из клубеньков O. arenaria видимых проявлений нет — 6 бактерии из клубеньков O. arenaria PSL/OAL скручивания корневых волосков комп M.sativa 7 К или комп M.sativa R. leguminosarum bv. trifolii видимых проявлений нет — 8 R. leguminosarum bv. trifolii PSL/TPL скручивания корневых волосков комп M.sativa 9 К или комп M.sativa бактерии из клубеньков A. cicer видимых проявлений нет — 10 бактерии из клубеньков A. cicer PSL/AGL розовые клубеньки c бактериями комп M.sativa 11 К или комп A. cicer видимых проявлений нет — любой лектин + случаи 12 К или комп A. cicer бактерии из клубеньков A. cicer клубеньки с бактериями, его отсутствия скручивания корневых волосков 13 К или комп A. cicer R. leguminosarum bv. viciae видимых проявлений нет — 14 R. leguminosarum bv. viciae PSL скручивания корневых волосков комп A. cicer 15 К или комп H. rhamnoides видимых проявлений нет — 16 К или комп H. rhamnoides Frankia любой лектин + случаи клубеньки в виде кораллов c актиномицетами его отсутствия 17 К или комп H. rhamnoides R. leguminosarum bv. viciae или видимых проявлений нет R. leguminosarum bv. trifolii 18 К или комп H. rhamnoides Frankia +R. leguminosarum bv. viciae — клубеньки в виде кораллов c актиномицетами Frankia +R. leguminosarum bv. trifolii клубеньки с разной морфологией: в виде 19 Frankia + R. leguminosarum bv. viciae PSL кораллов, содержащие актиномицеты;
и комп H. rhamnoides округлые, содержащие ризобии 20 Frankia + R. leguminosarum bv. trifolii PSL/TPL комп H. rhamnoides клубеньки в виде кораллов c актиномицетами 21 К или комп B. napus любой лектин + случаи видимых проявлений нет — его отсутствия 22 К или комп B. napus R. leguminosarum bv. viciae или бактерии из клубеньков A. cicer адгезия клеток в среднем кол-ве 3.8 10 кл/г — 23 R. leguminosarum bv. viciae PSL комп B. napus адгезия клеток в среднем кол-ве 14010 кл/г 24 бактерии из клубеньков A. cicer PSL/AGL комп B. napus адгезия клеток в среднем кол-ве 21610 кл/г Симбиотические реакции модельных растений люцерны с корнями, трансгенными по PSL/OAL, PSL/TPL, и астрагала с корнями, трансгенными по PSL После инокуляции композитных растений люцерны с корнями, трансгенными по гену PSL/TPL микросимбионтами R. leguminosarum bv. trifolii, образования клубеньков не происходило, однако были обнаружены многочисленные изгибы и скручивания корневых волосков (рис. 3a).
Аналогичные результаты были получены на «бородатых корнях» люцерны с PSL/OAL и астрагала с PSL, после обработки соответствующими штаммами ризобий (опыты № 6 и № 14).
Рис. 3. Корневые волоски люцерны через двое суток после обработки R. leguminosarum bv. trifolii на а) трансгенных по PSL/TPL (опыт № 8);
b) нетрансгенных (опыт № 7) «бородатых корнях».
Можно предположить, что наблюдаемая деформация корневых волосков вызывается действием лектина, т.к. просто инокуляция гетерологичными ризобиями такой эффект не вызывает (рис. 3b). Причем корневые волоски деформируются именно в первые 20 дней после инокуляции, когда в нормальных условиях завязываются клубеньки, в то время как на 40 сутки скручиваний становилось заметно меньше, что подтверждает стимулирующий эффект лектина на симбиотические взаимодействия на стадии преинфекции.
Симбиотические реакции модельных растений люцерны с корнями, трансгенными по PSL/AGL После инокуляции композитных растений люцерны с корнями, трансгенными по гену PSL/AGL, ризобиями A. cicer в ризосфере были обнаружены клубеньки (рис. 4), схожие с клубеньками, которые формирует S. meliloti (опыт № 2). Рассев содержимого клубеньков на питательную среду выявил наличие в них бактерий, которые оказались идентичны бактериям, использованным для инокуляции. Таким образом, в данном варианте наблюдались нетипичные симбиотические отношения между люцерной и клубеньковыми бактериями астрагала с образованием инфицированных клубеньков. Полученные результаты полностью совпадают с таковыми в работе, где применялась экзогенная обработка корней люцерны лектином PSL/AGL в присутствии ризобий из клубеньков A. cicer (Баймиев и др., 2009).
Рис. 4. Клубеньки на люцерне с корнями, трансгенными по PSL/AGL (опыт № 10) Показано, что иногда чужеродные лектины способны усиливать чувствительность растений к факторам «чужих» ризобий. Например, трансгенный по гену лектина гороха PSL красный клевер становился отзывчивым не только на ризобии гороха R. leguminosarum bv. viciae, но и формировал псевдоклубеньки при инокуляции его неспецифичными Mesorhizobium loti и S. meliloti (Diaz et al., 2000).
В наших экспериментах лектин PSL/AGL способствовал понижению специфичности симбиоза люцерны посевной с микросимбионтами, возможно, благодаря тому, что замена углеводсвязывающего участка лектина гороха участком лектина астрагала изменила специфичность лектина к моносахаридам, расширив их спектр (Губайдуллин и др., 2006). В связи с этим можно предположить, что подобные гибридные лектины с «расшатанной» специфичностью к углеводам могут вызывать симбиотические реакции у более широкого круга ризобий, чем природные лектины, что мы, возможно, и наблюдали.
Симбиотические реакции модельных растений облепихи с корнями, трансгенными по PSL Через три месяца после начала экспериментов трансгенные по генам лектинов PSL и PSL/TPL «бородатые корни» обрабатывали микросимбионтами:
актиномицетами и ризобиями в различных вариантах. В качестве контроля были использованы те же сочетания микроорганизмов, но на трехмесячных растениях с естественной корневой системой и на композитных растениях с бородатыми корнями, не содержащими ген лектина.
Аналогично результатам, описанным в статье Diouf с соавт. (Diouf et al., 1995), клубеньки, полученные на трансгенных корнях через четыре недели после обработки монокультурой Frankia, не отличались по форме и размерам от клубеньков, полученных на соответствующих контрольных растениях, и представляли собой густые сплетения корней, разветвленных наподобие кораллов и прекративших рост (опыт № 16). Клубеньки такой формы являются характерными для облепихи (Gardner et al., 1984). Трансгенность некоторых клубеньков была подтверждена наличием активности гена -D-глюкуронидазы.
В опыте с обработкой монокультурой ризобий на контрольных и композитных растениях результатов инфицирования получено не было (опыт № 17). В случае использования сочетаний «Frankia+R. leguminosarum bv. trifolii» на контрольных и композитных растениях были получены лишь клубеньки, характерные для Frankia (опыт № 20).
При этом в эксперименте, где было использовано сочетание «Frankia +R. leguminosarum bv. viciae» (опыт № 19), через 3 мес. после обработки на трансгенных по гену PSL корнях облепихи, кроме обычных актиноризных клубеньков (рис. 5а), были получены структуры, отличающиеся от клубеньков, образуемых Frankia, малым количеством выростов модифицированных боковых корней и, скорее, напоминающие клубеньки бобовых (рис. 5b).
Поперечный срез структур выявил центральное расположение проводящих пучков и наличие активной меристемы, что является характерным для актиноризных клубеньков (Savka et al., 1992). На корнях контрольных нетрансгенных растений в этом варианте обработки были получены лишь клубеньки, идентичные образуемым Frankia (опыт № 18).
Рис. 5. Клубеньки, полученные на композитных растениях облепихи с корнями, трансгенными по PSL (опыт № 19): а) сходные с клубеньками, образуемыми Frankia;
b) сходные с клубеньками, образуемыми Rhizobium Для того, чтобы проверить, какие именно микросимбионты принимали участие в образовании клубенек-подобных структур, был проведен RAPD анализ ДНК бактерий, выделенных из этих структур. В качестве сравнения использовались штаммы Frankia и R. leguminosarum. Анализируемые штаммы имели схожий RAPD-профиль с R. leguminosarum, и не было ни одного штамма, который бы имел фрагменты ДНК одинакового размера с Frankia. Таким образом, впервые была показана возможность формирования клубенек подобных структур на актиноризных растениях с участием ризобий.
Можно предположить, что ризобии, благодаря лектину гороха посевного, прикрепились к корневым волоскам трансгенных корней и запустили цепь реакций, приводящих к образованию клубеньков. Одной из первых реакций этой цепи является образование преинфекционных нитей, которые впоследствии заселяются симбиотическими бактериями и становятся уже инфекционными нитями. Показано, что за образование этих структур отвечает недавно открытый ген SYMRK (от symbiosis receptor kinase, Markmann et al., 2008);
данный ген встречается во всех растениях, которые способны сожительствовать хотя бы с одним из трех типов внутриклеточных симбионтов:
грибов (микориза), актиномицетов (актинориза) и ризобий, при этом у растений, образующих клубеньки (актиноризные или ризобиальные) в геноме содержится вполне определенный “длинный вариант” гена SYMRK. Возможно, что и у полученных нами композитных растений облепихи трансклеточное распространение ризобий в кортексе корня до клубеньковых примордиев происходило с участием преинфекционных нитей. Актиноризный тип строения клубенька при этом был продиктован растением-хозяином.
Симбиотические реакции композитных растений рапса и «бородатых корней», полученных на листовых пластинках табака Через три месяца после начала экспериментов трансгенные по генам лектинов PSL и PSL/AGL «бородатые корни» композитных растений рапса обрабатывали соответствующими штаммами ризобий (опыты №23, №24).
В качестве контроля были использованы те же сочетания микроорганизмов, но на трехмесячных растениях с естественной корневой системой и на композитных растениях с бородатыми корнями, не содержащими ген лектина (опыт №22). Подсчет количества адсорбированных на поверхности корней ризобий показал увеличение численности бактерий на трансформированных корнях (в среднем 37 раз в случае PSL и в 57 в случае PSL/AGL) по сравнению с контрольными «бородатыми корнями» (табл. 2). Относительно большее количество адсорбированных на поверхности корней бактерий в случае композитных растений, несущих ген PSL/AGL, возможно, объясняется тем, что гибридные лектины с расширенным спектром сахароспецифичности, прочнее связывают бактерии на первичных этапах симбиотического взаимодействия (Губайдуллин и др., 2006).
Таблица 2.
Количество ризобий, адгезированных на поверхности «бородатых корней» Количество бактерий, адгезированных на корешках, кл/г «бородатые Повтор корни» бактерии ность табак рапс конт. - 2.01 – 2.25 3.76 – 3. PSL 22.6 – 38.2 105 – R. leguminosarum bv. viciae PSL/AGL из клубеньков - 165 – Astragalus cicer Котрансформированные геном лектина гороха и контрольные (без этого гена) «бородатые корни» на эксплантах табака были обработаны микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum. Подсчет количества адсорбированных на поверхности корней ризобий показал более чем на порядок увеличение численности бактерий на трансформированных PSL корнях (в среднем 14 раз) по сравнению с контрольными «бородатыми корнями» (табл. 2).
Табак (Nicotiana tabaccum) и рапс (Brassica napus L. var. napus) входят в число несимбиотрофных видов растений, которые не вступают в симбиоз ни с ризобиями, ни с актиномицетами, поэтому большой интерес вызывает создание искусственных ассоциативных симбиозов этих растений с клубеньковыми бактериями. На сегодняшний день существуют лишь несколько работ с описанием попыток создания азотфиксирующих симбиотических ассоциаций табака с различными микросимбионтами, в частности, с цианобактериями (Баулина и др., 1984;
Горелова и др., 2004) и ризобиями (Gibson et al., 1976).
Для рапса же показано, что при обработке целлюлазой и пектолиазой корневых волосков проростков в присутствии ризобий происходит образование клубеньков, морфологически и структурно подобных клубенькам бобовых и обладающих незначительной нитрогеназной активностью (Cocking et al., 1991).
Следовательно, если обеспечить специфическое взаимодействие ризобий с трансгенными по гену лектина корневыми волосками, то можно добиться если не получения настоящих клубеньков, то хотя бы полноценных ассоциативных отношений между несимбиотрофными растениями и ризобиями.
Создание искусственных азотфиксирующих ассоциаций культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. На сегодняшний день уже выделены штаммы Rhizobium, которые успешно колонизируют в природе корни небобовых растений. Например, показано, что наиболее перспективными штаммами для создания азотфиксирующих ассоциаций риса являются ризобии клевера R. leguminosarum bv. trifolii R4, так как эти бактерии способны колонизировать корни и заселять межклетники, способствуя увеличению урожая (Biswas et al., 2000;
Chi et al., 2005;
Perrine-Walker et al., 2007). В случае кукурузы и латука в качестве подобного штамма можно использовать ризобии фасоли R. leguminosarum bv. phaseoli P31 и R1, которые успешно колонизируют корни этих растений в почве (Chabot et al., 1996;
Gutierrez-Zamora, Martnez-Romero, 2001). Использование лектинов бобовых растений в качестве трансгенов может стать следующим шагом к получению стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями.
4. Создание полностью трансгенных по гену лектина растений Как уже было отмечено, трансгенные «бородатые корни» - это модель корневой системы для изучения симбиотических взаимодействий. Однако объективная оценка влияния лектинов бобовых растений на симбиоз требует создания полностью трансгенных по генам лектинов модельных растений.
На сегодняшний день самым распространенных подходом для создания трансгенных растений является трансформация с помощью Agrobacterium tumefaciens. Хотя методы агробактериальной трансформации разработаны для большинства видов сельскохозяйственных культур, они применимы в пределах каждого вида только к немногим генотипам (сортам), которые регенерируют in vitro с высокой частотой. Поэтому создание трансгенных по генам лектинов модельных симбиотрофных и несимбиотрофных растений является достаточно трудоемкой задачей.
Создание трансгенных растений табака В данной работе были созданы трансгенные по гену лектина гороха PSL модельные растения табака Nicotiana tabaccum линии SR1. Трансгенность полученных растений была подтверждена ПЦР на присутствие и экспрессию на уровне мРНК гена лектина PSL, а также анализом активности gus-гена в тканях листа. Проведенный гистохимический анализ показал, что полученные растения-регенеранты обладали сильной gus-активностью, и после инкубации сегментов листьев этих растений в гистохимическом реактиве появлялось характерное синее окрашивание. Максимальная интенсивность окрашивания наблюдалась в мезофильных клетках листа, а также в его проводящих тканях.
Укорененные побеги табака в дальнейшем были использованы для получения семян. Во втором поколении F2 оценивали экспрессию гена лектина и влияние этого белка на симбиотические реакции с R. leguminosarum bv. viciae.
После обработки корней трансгенных растений этим микросимбионтом с помощью микроскопирования были выявлены немногочисленные скручивания корневых волосков, которых не наблюдалось в случае обработки данными бактериями контрольных растений без гена лектина. Подобные деформации, несомненно, являются следствием адгезии бактерий к поверхности корневых волосков и их колонизации благодаря связыванию с лектином гороха посевного, что говорит о правильном синтезе и функциональности данного белка в трансгенном табаке. Однако для инициации полноценных симбиотических взаимоотношений необходимы факторы, которые присутствуют у актиноризной облепихи и отсутствуют у несимбиотрофного табака. Поиск данных факторов и должен стать задачей исследователей в ближайшем будущем.
Спонтанная регенерация трансгенных по гену лектина PSL проростков астрагала из культуры «бородатых корней» Одним из интересных способов получения растений, несущих нужный ген, является регенерация трансгенных растений из культуры «бородатых корней». Известно, что практически половина видов двудольных растений спонтанно регенерируют из такой культуры, что намного облегчает трансформационный процесс.
В данной работе через 2 месяца культивирования композитных растений астрагала нутового с корнями, трансгенными по гену лектина гороха PSL, а также контрольных композитных растений (без PSL) было выявлено образование на «бородатых корнях» оранжевых каллусных структур (рис. 6а), из которых появлялись вторичные корни, что является характерным для трансформированных корней многих двудольных растений (Christey, 1997).
Рис. 6. a) Каллусные структуры (указаны стрелкой), сформировавшиеся на «бородатых корнях» через 2 месяца;
b) и с) трансгенные проростки астрагала нутового (указаны стрелками), спонтанно регенерировавшие из каллуса на «бородатых корнях» спустя 6 месяцев после посадки композитных растений на вермикулит.
Регенерация проростков астрагала нутового из каллуса наблюдалась через 6 месяцев культивирования у 55% композитных растений (рис. 6b и 6с).
Известно, что подобная регенерация может зависеть или не зависеть от освещения (Christey, 1997). В работах, посвященных Astragalus sinicus L., регенерация была гормонозависимой и светонезависимой (Cho, Widholm, 2002).
В случае астрагала нутового регенерация происходила без экзогенной гормональной обработки, но также была светонезависимой.
Трансгенность полученных растений была подтверждена ПЦР на присутствие и экспрессию на уровне мРНК генов PSL, rolB, а также анализом активности gus-гена в тканях листа.
Через 5 месяцев культивирования регенерированные проростки отличались от контрольных растений астрагала нутового того же возраста в раз большей биомассой корней и в 2 раза большей биомассой надземной части.
Повышенная продуктивность, а также такие черты регенерированных проростков, как короткие междоузлия, высокая разветвленность и узкие листья обусловлены активностью rol-генов, перенесенных в геном растения A. rhizogenes (Christey, 1997).
Возможность спонтанной регенерации проростков астрагала нутового из культуры «бородатых корней» предполагает, что и другие представители рода Astragalus, в частности редкие и эндемичные виды, возможно, также могут обладать такой способностью. Регенерация надземной части растения превращает культуру «бородатых корней» в полноценный источник БАВ, и таким образом, решается проблема недостатка лекарственного сырья без ущерба для популяции редких видов Astragalus.
Использование лектинов бобовых растений в качестве трансгенов является перспективным направлением в биоинженерии симбиотических систем. В данной работе были обнаружены нетипичные симбиотические реакции с гетерологичными штаммами ризобий на трансформированных лектином корнях люцерны и астрагала;
показана возможность формирования клубенек-подобных структур этими микросимбионтами на «бородатых корнях» актиноризных растений и обнаружены специфические реакции на обработку ризобиями на трансгенных корнях несимбиотрофных растений.
Таким образом, возможность симбиотических взаимодействий между ризобиями и трансгенными по генам лектинов корнями открывает новые горизонты на пути рационализации азотного питания важных сельскохозяйственных культур за счет расширения их симбиотический азотфиксирующей активности и создания новых симбиотических взаимоотношений.
ВЫВОДЫ 1. На основе вектора для генетической трансформации растений pCambia 1305.1 созданы конструкции, содержащие в области Т-ДНК ген семенного лектина гороха PSL, а также его производные PSL/AGL, PSL/OAL и PSL/TPL под управлением 35S промотора вируса мозаики цветной капусты.
2. Созданы композитные растения люцерны, астрагала, облепихи и рапса с корнями, трансгенными по изучаемым генам лектинов, и нетрансгенной надземной частью.
3. Обнаружены нетипичные симбиотические реакции на трансгенных по генам лектинов корнях люцерны после инокуляции соответствующими этим лектинам микросимбионтами (искривление корневых волосков и псевдоклубеньки), а также получены клубеньки, содержащие микросимбионты астрагала на корнях, трансформированных PSL/AGL.
4. Впервые показана возможность формирования клубенек-подобных структур, содержащих ризобии, на корнях актиноризного растения (облепиха), трансгенных по гену лектина гороха и обработанных совместно ризобиями R. leguminosarum bv. viciae (симбионт гороха) и актиномицетами рода Frankia (симбионт облепихи).
5. Экспрессия гена лектина бобовых в корнях рапса и табака способствует адсорбции на них ризобий, что может быть использовано для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с азотфиксирующими бактериями.
6. Созданы модельные растения табака Nicotiana tabaccum линии SR1, трансгенные в F2 по гену лектина гороха PSL. После обработки корней трансгенных растений микросимбионтом гороха выявлены скручивания корневых волосков, подтверждающие участие лектинов в запуске первичных симбиотических реакций.
7. Обнаружена спонтанная светонезависимая регенерация трансгенных проростков A. cicer из культуры «бородатых корней», что может быть использовано для культивирования астрагалов в качестве источников биологически активных веществ.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Вершинина З.Р., Баймиев А.Х., Чемерис А.В. Симбиотические реакции корней облепихи (Hippophae rhamnoides L.) трансгенных по гену лектина гороха посевного // Физиология растений. –2010. – Т. 57, №1. – С. 108– 116.
2. Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х. Разработка метода получения трансгенных бородатых корней, несущих гибридные лектины бобовых, на облепихе, рапсе и люцерне // III Республиканская научно практическая конференция молодых ученых «Научное и экологическое обеспечение современных технологий», Уфа, 2006. – С. 71–72.
3. Баймиев А.Х., Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю. Получение облепихи с трансгенными корнями несущими химерные гены лектинов бобовых растений // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им.
Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006. – С. 24.
4. Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х., Вершинина З.Р., Куликова О.Л.
Генетическое биоразнообразие популяций ризобий Sinorhizobium meliloti, вступающих в симбиоз с бобовыми родов Medicago и Melilotus произрастающих в Башкортостане // Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённая 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна. Москва, 2006. – С. 35.
5. Вершинина З.Р. Спонтанная регенерация проростков астрагала нутового (Astragalus cicer) из трансгенных «бородатых корней» // Школа семинар молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико химической биологии «Биомика – наука XXI века», Уфа, 2007. – С. 20.
6. Вершинина З.Р., Князев А.В., Баймиев Ал. Х. Получение рапса (Brassica napus) трансгенного по гену лектина гороха. // Школа-семинар молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико химической биологии «Биомика – наука XXI века», Уфа, 2007. – С. 18–19.
7. Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х. Получение трансгенных по гену лектина бородатых корней на люцерне, облепихе и рапсе // Материалы докладов Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007. – Часть 3. – С. 229–230.
8. Баймиев А.Х., Князев А.В., Вершинина З.Р. Генетическая модификация рапса (Brassica napus) для исследования влияния экспрессии чужеродных белков на симбиотические реакции // Сборник материалов 2-го Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности», Москва, 2007. – С. 18.
9. Дмитрюкова М.Ю., Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х. Разработка метода получения трансгенных «бородатых корней» и клубеньков на облепихе // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», Саратов, 2007. – С. 10. Вершинина З.Р. Получение небобовых трансгенных растений, вступающих в симбиоз с ризобиями // Материалы 2-й Международной школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», Уфа, 2007. – С.29– 30.
11. Вершинина З.Р. Использование лектинов бобовых для повышения урожайности культурных растений // Материалы XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, 2008. – Том I, Подсекция 1. – С. 12–13.
12. Яруллина Л.Г., Баймиев Ал.Х., Вершинина З.Р., Максимов И.В.
Активные формы кислорода и формирование бобово-ризобиального симбиоза // Материалы международной научной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург, 2008. – С. 462–464.
13. Вершинина З.Р., Баймиев А.Х. Симбиотические реакции трансгенных бородатых корней, полученных на облепихе (Hippophae rhamnoides L.), с актиномицетами и ризобиями // Материалы V съезда съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2008. – С. 9.
14. Вершинина З.Р. Использование лектинов бобовых для повышения урожайности рапса (Brassica napus L.) // Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 2009. – Том I, Подсекция 1. – С. 6.
15. Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х. Симбиотические реакции люцерны с корнями трансгенными по гену лектина гороха // Аграрная Россия. – 2009. – Специальный выпуск. – С. 79.