Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах bacillus subtilis
На правах рукописи
КИРИЛЛОВА ЮЛИЯ МАРСЕЛЬЕВНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СУБТИЛИЗИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ Bacillus intermedius В РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММАХ Bacillus subtilis 03.00.07 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань – 2006
Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии ГОУВПО Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Шарипова Маргарита Рашидовна доктор биологических наук, старший научный
Официальные оппоненты:
сотрудник Коксин Владимир Петрович (РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ, г. Казань) кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Давыдова Марина Николаевна (Казанский институт биохимии и биофизики РАН, г. Казань)
Ведущая организация: Московский государственный университет, кафедра микробиологии, г. Москва
Защита диссертации состоится 2006 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете, 420008, г.Казань, ул.Кремлевская,
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета Автореферат разослан 2006 г.
И.о. ученого секретаря диссертационного совета доктор биологических наук, профессор З.И.Абрамова Актуальность проблемы. В основе механизма адаптации бактерий лежит способность экспрессировать гены, которые обеспечивают максимальный рост в неблагоприятных условиях их существования. Для мониторинга и ответа клетки на разнообразие внешних сигналов служит сложноорганизованная сеть сигнальной трансдукции, в основе которой лежит двухкомпонентная система регуляции экспрессии генов. Бактерии, относящиеся к роду Bacillus, реагируют в ответ на изменившиеся условия синтезом различных внеклеточных ферментов для всестороннего использования альтернативных источников питания, секрецией антибиотиков, индукцией подвижности и, в конечном итоге, инициацией споруляции. Бактериальное спорообразование является простой моделью клеточной дифференцировки и характеризуется последовательными и радикальными изменениями в физиологии бактериальной клетки, обусловленными активацией определенных генов регуляторной системой Spo0A-фосфопередачи. Оценить роль этой системы в контроле экспрессии генов можно с использованием штаммов, мутантных по составляющим ее регуляторным белкам. Поскольку протеиназы бацилл, относящиеся к «поздним» белкам, широко используются в практическом отношении, знание молекулярных механизмов регуляции синтеза этих ферментов позволит целенаправленно влиять на уровень их продукции. Результаты исследования регуляции экспрессии соответствующих генов могут быть использованы в биотехнологии, например, для повышения выхода целевых белков путем клонирования и модификации соответствующих генов.
Грамположительные спорообразующие бактерии B.intermedius секретируют различные сериновые протеиназы, одна из которых относится к группе субтилизиноподобных сериновых протеиназ, обладающих широкой субстратной специфичностью (Балабан с соавт., 1993). Фермент был выделен из культуральной жидкости, очищен до гомогенного состояния, изучены его физико-химические свойства. Клонирование гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius открыло возможность для исследования механизмов регуляции синтеза фермента и его взаимосвязи с клеточной физиологией.
Целью работы явилось выяснение механизмов контроля экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius, продуцируемой рекомбинантными штаммами B.subtilis на разных стадиях роста бактерий.
В работе решались следующие задачи:
1. Изучение регуляции биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis.
2. Определение значимости катаболитной репрессии в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius на разных фазах роста рекомбинантным штаммом B.subtilis.
3. Выяснение роли регуляторных белков - компонентов сигнально-сенсорной системы KinA/Spo0F/Spo0A в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.
4. Определение вклада Spo0E, Spo0K - белков, участвующих в инициации спорогенеза, в регуляцию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантными клетками B.subtilis 5. Исследование влияния спороспецифичных Н и Е-факторов транскрипции на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.
Исследования поддержаны грантами РФФИ 01-04-48037, 05-04-48182, Академии Наук Республики Татарстан 03-3.10-295 и программой CRDF Rec 007.
Научная новизна. В работе установлены основные закономерности экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius, которая синтезируется и секретируется в период стационарного роста рекомбинантного штамма B.subtilis. Впервые показано, что в поздней стационарной фазе роста экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы не регулируется по типу катаболитной репрессии, в отличие от фермента, синтезируемого в начале стационарной фазы роста. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius подвергается позитивной регуляции со стороны регуляторных белков – компонентов системы сигнальной трансдукции KinA/Spo0F/Spo0A и спороспецифичных Н и Е – факторов транскрипции. Выявленные закономерности расширяют представления о функционировании субтилаз у бацилл.
Практическая ценность работы. Полученные нами сведения о механизмах контроля экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы на разных стадиях роста, включая переход к клеточной дифференцировке, могут быть полезны при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бацилл.
Данные о механизмах функционирования регуляторных систем катаболитных генов, экспрессия которых продолжается при переходе клеток в состояние анабиоза, могут послужить основой для направленной модификации промоторной области гена с целью получения высокопродуктивных штаммов в условиях ограниченного роста бацилл. Разработаны среды культивирования для выделения протеиназ, соответствующих разным стадиям роста бацилл.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Международном конгрессе FEMS “Bacillus-2003” (Словения, 2003), Международном конгрессе “Биотехнология – состояние и перспективы развития” (Москва, 2002), Международных научных студенческих конференциях “Студент и научно технический прогресс” (Новосибирск, 2002, 2003, 2005), научных конференциях программы CRDF "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2000, 2001, 2003, 2005), школах-конференциях для молодых ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2003), XII юбилейной конференции “Ферменты микроорганизмов” (Казань, 2001), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу (Томск, 2002), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001), республиканском конкурсе научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2001, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит таблицы и 38 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали штамм B.intermedius 3-19 из коллекции Казанского государственного университета, штамм B.subtilis AJ73, дефектный по собственным внеклеточным протеиназам, любезно предоставлен для работы проф. Ю.Йомантасом (Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов), штаммы B.subtilis, дефектные по spo0-, kin-, sig- генам, а также соответствующие им штаммы с полноценными системами регуляции получены из Bacillus Genetic Stock Center (университет Охайо, США). В работе использовали мультикопийную плазмиду pCS9, сконструированную на основе вектора pCB22, с геном субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius под собственным промотором, которая получена и любезно предоставлена для работы проф. С.В. Костровым, Институт молекулярной генетики РАН.
Культивирование мутантных штаммов B.subtilis проводили на среде LB (Sambrook et al., 1989). При культивировании клеток рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9) в качестве исходной использовали среду следующего состава (%): пептон – 2.0;
дрожжевой экстракт – 1.0;
CaCl2х2H2O - 0.1;
MgSO4х7H2O - 0.05;
NaCl - 0.3;
MnSO4 - 0.01;
NH4Cl - 0.01;
Na2HPO4 - 0.035;
pH - 8.5. При культивировании клеток B.intermedius 3–19 в качестве исходной использовали среду следующего состава (%): пептон - 2.0;
CaCl2х2H2O - 0.06;
MgSO4х7H2O - 0.05;
NaCl 0.3;
MnSO4 - 0.01;
NH4Cl - 0.02;
Na2HPO4 - 0.02;
pH - 8.5.
В среду добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл, т.к. плазмида pCS несет ген устойчивости к данному антибиотику. Раствор неорганического фосфата (Na2HPO4), растворы NH4Cl и C6H6O7(NH4)2, желатина, казеина, дрожжевого экстракта, глюкозы (1%) и других углеводов, цитрата натрия, а также растворы (в конечной концентрации L-аминокислоты - 50 мг/л, аминокислот DL-аминокислоты - 100 мг/л) и солей металлов вносили стерильно перед посевом.
Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм.
Удельную активность определяли как отношение активности фермента в культуральной жидкости к количеству биомассы и выражали в условных единицах или процентах. Активность субтилизиноподобной протеиназы определяли по гидролизу синтетического хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa (Люблинская с соавт., 1977). Активность -галактозидазы определяли по методу, описанному в работе (Миллер, 1976).
Для выявления эндоспор мазок окрашивали по Граму (Гусев, Минеева, 1992).
Подсчет клеток со спорами проводили в режиме фазово-контрастной микроскопии не менее чем в 5-ти полях зрения. Подсчитывали общее количество вегетативных и спорулирующих клеток (100%), число последних выражали в процентах. Споры также выявляли с помощью метода, основанного на обработке хлороформом, при последующем высеве на чашку титрования и подсчета жизнеспособных колоний (Ferrari et al., 1988). Фазы спорообразования рассчитывали, как описано в работе (Шлегель, 1987).
Выделение плазмид проводили стандартными методами (Гловер, 1988).
Трансформацию клеток B.subtilis проводили, как описано в работе (Anagnostopolous, Spizizen, 1961).
Статистическую обработку результатов проводили в программной среде Microsoft Exel путем расчета среднеквадратичного отклонения (). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении 15%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая P 0.05 за достоверный уровень значимости.
Наряду с традиционными методами исследования влияния экзогенных факторов проводили многофакторные эксперименты. Обработка результатов экспериментов проводилась с помощью программы STATGRAPHICS Plus for Windows.
Регуляторную область гена apr Bi (AY754946) анализировали при использовании программы BLAST network (Altschul et al., 1997), представленной на сервере the National Center for Biotechnology Information’s (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Закономерности синтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis Исходный штамм B.intermedius 3-19 обладает способностью синтезировать субтилизиноподобную сериновую протеиназу с молекулярной массой 30 кД, изоэлектрической точкой 9,1-9,3 (Балабан с соавт., 1993). Полный ген фермента клонирован на мультикопийной плазмиде pCS9. Для изучения экспрессии гена плазмиду трансформировали в протеазо-дефицитный штамм B.subtilis AJ73, поскольку нативный штамм B.intermedius секретирует в среду несколько внеклеточных протеолитических ферментов - субтилизиноподобную протеиназу, глутамилэндопептидазу и металлопротеазу. Синтез каждого из них может корегулироваться определенными факторами среды, что затрудняет анализ продукции каждого из ферментов у исходного штамма.
1. Динамика роста бактерий, биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius и спорообразования рекомбинантного штамма B.subtilis. На рис. представлены динамика роста и накопления активности протеиназы в культуральной жидкости рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9). Характер роста и накопления активности фермента сохраняются такими же, как у исходного штамма B. intermedius 3-19: обнаружены два пика протеолитической активности на 28-й и 48-й ч, что соответствуют ранней и поздней стационарной фазе роста бактерий.
Эти результаты свидетельствуют о корректном протекании процессов биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в рекомбинантных клетках B.subtilis и об адекватности использованной нами векторной системы для изучения экспрессии гена протеиназы. Удельная скорость накопления субтилизиноподобной протеиназы () в культуральной жидкости рекомбинантного штамма нарастала в период, когда удельная скорость роста культуры (µ) падала (рис. 1). Уровень накопления “позднего” фермента в 3 раза превышает таковой в ранней стационарной фазе.
А Б µ;
OD590, А OD 590;
активность 8 0,45 Споры,% галактозидазы,ед/г 1 8 0, 7 3 7 0,35 0,3 5 5 0 II - VI VII 0, 4 4 0, 3 0, 2 0,1 1 0,05 5 7 0 0 6 14 22 30 38 46 54 6 16 26 36 46 Время,ч Время, ч Рис. 1. Динамика роста (1), протеолитической активности (2), удельной скорости роста (µ) (3), и удельной скорости накопления фермента () (4), спорообразования (5), -галактозидазной активности (6) и количество спор (7), полученных путем титрования хлороформустойчивых форм, рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9) ( 10%) С применением репортерного белка -галактозидазы, нами установлено, что второй пик протеолитической активности не является результатом накопления белка в культуральной жидкости вследствие лизиса клеток, а секретируется рекомбинантным штаммом B.subtilis AJ73 (pCS9) и по времени соответствует стадиям созревания эндоспоры (стадии V-VI, рис. 1). Итак, образование первого пика протеиназы рекомбинантным штаммом соответствует стадии инициации споруляции, второго – стадии созревания эндоспор и автолиза спорангия.
2. Влияние факторов среды на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis. Для выяснения условий биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis провели исследование влияние ряда факторов среды на эффективность продукции фермента в стационарной фазе роста.
Влияние пептона и неорганического фосфата на экспрессию гена протеиназы. В результате постановки многофакторных экспериментов установлены различия в содержании основных компонентов питательной среды – пептона и неорганического фосфата. В ранней стационарной фазе роста рекомбинантного штамма для синтеза фермента требуется меньшая концентрация неорганического фосфата (0,24 г/л) в среде и большая концентрация пептона (30 г/л), чем для биосинтеза фермента исходным штаммом B.intermedius. Потребность в пептоне для продукции фермента рекомбинантным штаммом, как в ранней, так и в поздней стационарной фазе возрастает по сравнению с исходным штаммом в 1,1-1,4 раза. Возможно, это объясняется большей потребностью в источниках питания для клеток рекомбинантого штамма. Нами показано, что для биосинтеза протеиназы в поздней стационарной фазе роста потребность бактерий в фосфоре и пептоне незначительно отличается от соответствующих данных для синтеза фермента в раннем стационаре того же штамма.
Влияние белковых субстратов и дрожжевого экстракта на экспрессию гена протеиназы. Удельная активность бактерий B.subtilis AJ73 (pCS9) в отношении синтеза протеиназы первого и второго пика увеличивается при внесении в питательную среду казеина и желатина в концентрациях 0,5% и 1% (рис. 2). Однако для активации биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом в поздней стационарной фазе роста (на 48-й час) необходимы более низкие концентрации добавок по сравнению с “ранним” ферментом.
При исследовании влияния дрожжевого экстракта на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом, установлено, что его внесение в среду культивирования в концентрации 0,5% оказывало положительный эффект на синтез “раннего” фермента (увеличение в 1,5 раза) и незначительно стимулировало синтез “позднего”.
Б Удельная активность, % Удельная активность,% A 200 0,5 1 0,5 1 Субстрат,% Субстрат,% Рис. 2. Влияние желатина (1) и казеина (2) на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом B.subtilis на 28-й (А) и 48-й (Б) часы культивирования. За 100 % приняты значения удельной активности на среде, не содержащей органических субстратов.
Дальнейшее увеличение концентрации дрожжевого экстракта до 2% приводило к снижению удельной активности фермента на 60% - 90%. По-видимому, низкие концентрации дрожжевого экстракта необходимы рекомбинантному штамму B.intermedius в качестве дополнительного фактора роста. Однако его более высокие концентрации, возможно, регулируют синтез фермента по типу репрессии конечным продуктом. Изменения в уровне экспрессии гена apr Bi на разных стадиях роста под влиянием различных экзогенных факторов свидетельствуют о возможных изменениях в регуляции синтеза фермента на разных фазах роста.
Влияние сахаров на экспрессию гена протеиназы. Для сериновых протеиназ описана репрессия синтеза ферментов глюкозой. У рекомбинантных штаммов потребность в легкоусвояемых источниках углерода может быть иной, чем у исходного штамма. При исследовании воздействия различных моносахаридов (глюкоза, галактоза, маннит) и дисахаридов (сахароза, мальтоза, лактоза) на продукцию рекомбинантным штаммом субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius, нами установлено, что во всех случаях рост рекомбинантного штамма интенсифицировался, параллельно снижалась удельная активность субтилизиноподобной протеиназы (рис. 3).
А Б 140 Б сахароза мальтоза галактоза маннит Удельная активность, % Удельная активность,% глюкоза 120 лактоза 20 0 0,5 1 2 0,5 1 Концентрация углевода, % Концентрация углевода, % 28 ч 48ч 28 ч 48ч 28 ч 48ч 28 ч 48ч 28 ч 48ч 28 ч 48ч Рис. 3. Влияние моно- (А) и дисахаридов (Б) на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом B.subtilis на 28-й и 48-й часы культивирования. За 100% приняты значения удельной активности на среде, не содержащей сахаров.
Ингибирующее действие более выражено в отношении глюкозы и мальтозы.
Повышение концентрации экзогенных сахаров до 2 %, приводило к увеличению эффекта ингибирования синтеза фермента. Эффект репрессии в большей степени наблюдался по отношению к субтилизиноподобной сериновой протеиназе ранней стационарной фазы роста. В меньшей степени понижение удельной активности субтилизиноподобной протеиназы на обеих фазах роста вызывали лактоза, галактоза и маннит (30-60%). Низкие концентрации сахарозы (0,5 %) оказывали стимулирующее действие на биосинтез фермента в раннем и позднем стационаре (на 20-40%), увеличение ее концентрации до 2 % приводило к снижению удельной активности фермента в поздней стационарной фазе роста (на 10%). По нашим данным, экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы регулируется по механизму катаболитной репрессии глюкозой. Возможно, что невысокие концентрации (0,5%-1%) других легкоусвояемых источников углерода, таких как сахароза и маннит, необходимы для роста и синтеза фермента рекомбинантным штаммом в качестве дополнительного источника углерода.
Влияние ионов двухвалентных металлов на экспрессию гена протеиназы. Ионы двухвалентных металлов и, в частности, ионы Ca2+ играют важную роль при формировании каталитически активной конформации протеиназ (Siezen et al., 1991).
В третичной структуре субтилаз (термитазы и протеиназы К) обнаружены три поверхностных Ca - связывающих сайта (Betzel et al., 1990). Ионы Са2+ стабилизируют третичную структуру фермента, повышая термостабильность и препятствуя частичному разворачиванию белковой глобулы. Последовательное удаление поверхностных Са–связывающих сайтов из структуры белковой глобулы путем делеций образующих их аминокислотных остатков приводило к снижению молекулярной активности субтилизина на 10-20%, вследствие неправильного сворачивания белка (Leloup et al., 1997). Нами изучено влияние ионов двухвалентных металлов на накопление субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis в ранней и поздней стационарной фазе роста.
Оптимальным условием для биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы ранней стационарной фазы является присутствие в среде ионов Ca2+ (5 мМ) (рис. 4).
Ca2+ Активация ионами эффективнее выражена в отношении фермента, синтезируемого рекомбинантными клетками на 48-й ч роста.
А Б Mn Mg Сa Mn Mg Ca Б Zn Fe Cu Zn Fe Cu 120 Co Удельная активность,% Co Удельная активность,% 20 1 2 5 10 1 2 5 10 Концентрация, мМ Концентрация, мМ Рис. 4. Влияние ионов двухвалентных металлов на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом B.subtilis AJ73 (pCS9) на 28-й (А) и 48-й (Б) часы культивирования.
Интересные данные получены при исследовании влияния ионов Mg2+ и Mn2+:
оба подавляли активность фермента в раннем стационаре и не влияли на уровень активности протеиназы на 48 час роста. Остальные ионы металлов Zn2+, Co2+, Fe2+ и Cu2+(1-15 мМ) подавляли рост и биосинтез протеиназы в ранней и поздней стационарной фазе роста (рис. 4).
Влияние аминокислот на экспрессию гена протеиназы. Протеиназы целесообразно рассматривать не только как деградативные ферменты, но и как ферменты, создающие запасы аминокислот для биосинтетических целей.
Исследовали влияние на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом индивидуальных аминокислот и их комплексов. Установлен стимулирующий эффект на синтез фермента цистеина (180%), гистидина (150%), аспарагина (140%), триптофана (140%), глутамина (130%), и глутамата (130%) (рис. 5). Лейцин стимулировал биосинтез фермента ранней стационарной фазы и не влиял на продукцию позднего фермента. Остальные аминокислоты не оказывали влияния на синтез фермента (рис. 5).
Нами показано, что казаминовые кислоты в концентрации 0,1-1% стимулировали продукцию протеиназы рекомбинантным штаммом на 20-50%.
28 час Удельная активность,% 48 час 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Аминокислоты Рис. 5. Влияние индивидуальных аминокислот на продукцию субтилизиноподобной протеиназы рекомбинантным штаммом B.subtilis AJ73 (pCS9) на разных фазах роста. За 100% принята удельная активность культуры в отношении синтеза протеиназы без добавления аминокислот в среду 1- L-аланин;
2 – L-валин;
3 – DL-лейцин;
4 – DL-цистеин;
5 – DL-аспарагин;
6 – DL-глутамин;
7 – DL-триптофан;
8 – DL-гистидин;
9 – DL-глутаминовая кислота;
10 – L-аспарагиновая кислота (L - 50 мг/л, DL - 100 мг/л).
Увеличение концентрации до 2 % приводило к ингибированию синтеза фермента. Стимулирующий эффект аминокислот и их комплексов, по-видимому, связан с их использованием бактериями в качестве дополнительного источника азота необходимого для культивирования рекомбинантного штамма.
Таким образом, закономерности синтеза субтилизинподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантными клетками B.subtilis в стационарной фазе роста не отличаются от таковых для синтеза других сериновых протеиназ бактерий:
биосинтез фермента активируется в присутствии белковых субстратов – казеина и желатина, неорганического фосфата, ионов кальция. Однако каждый из исследуемых экзогенных факторов не одинаково влияет на синтез фермента на разных стадиях, и это может быть отражением смены механизмов регуляции фермента в стационарной фазе роста. Характерной особенностью является отсутствие подавления синтеза фермента в поздней стационарной фазе роста легкометаболизируемыми источниками углерода по типу катаболитной репрессии, что также свидетельствует в пользу предположения о смене механизмов регуляции экспрессии гена протеиназы в поздней стационарной фазе роста.
II. Взаимосвязь синтеза внеклеточной субтилизиноподобной сериновой протеиназы со спорообразованием Образование стратегических ферментов - внеклеточных протеиназ, участвующих в белковом обмене между клеткой и средой, связывают с различными физиологическими процессами бактерий, и в частности, со споруляцией.
Спорообразование – это сложный процесс клеточной дифференцировки, приводящий к образованию материнской клеткой зрелых эндоспор, которые затем освобождаются в среду. Обычно процесс эндогенного спорообразования стимулируется недостатком питательных веществ в среде. По нашим данным в период перехода вегетативных клеток к спорообразованию бациллы продолжают эффективно секретировать протеиназы.
1. Роль катаболитной репрессии в регуляции экспрессии гена протеиназы на разных фазах роста рекомбинантного штамма и спорообразовании. Нами установлено, что добавление 1% глюкозы к исходной среде до начала культивирования или в период ранней стационарной фазы роста вызывало снижение количества спор на 90 %. Внесение глюкозы на 26-й час роста и далее приводило к снижению количества спор на 8-10 %. Таким образом, наличие глюкозы в среде до стадии инициации приводит к полному или частичному подавлению споруляции по механизму катаболитной репрессии, внесение глюкозы после инициации спорообразования не оказывает влияния на дальнейшее осуществление процесса цитодифференцировки.
При исследовании влияния глюкозы (1 %), внесенной в питательную среду на разные часы роста культуры, на экспрессию протеиназы рекомбинантным штаммом B.subtilis, нами установлено, что ее добавление в среду до начала культивирования или в период ранней стационарной фазы роста на 21-й, 24-й и 26-й часы роста резко снижало уровень синтеза фермента (рис. 6). Внесение глюкозы в среду культивирования на 28-й ч и позже после инициации процесса спорообразования не вызывало последующего снижения уровня удельной активности протеиназы. Из полученных данных следует, что катаболитная репрессия регулирует биосинтез “раннего” фермента и не влияет на синтез “позднего”. Эти данные свидетельствуют, что при переходе бактерий к клеточной дифференцировке происходит смена механизмов регуляции экспрессии поздних генов, которые также активны в период стационарного роста, но их активация, по-видимому, происходит иными способами, чем в период вегетативного роста.
Удельная активность, у.е.
30 20 0 21 24 26 28 32 36 40 44 48 Время, ч Рис. 6. Влияние глюкозы на удельную активность субтилизиноподробной протеиназы рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9). Стрелками указано время внесения глюкозы (1%-й) в среду культивирования. 1 – удельная активность на среде без глюкозы, 2 – удельная активность на среде с глюкозой, 3-9 – удельная активность на средах с глюкозой, внесенной на разные часы роста.
2. Влияние spo0A мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius. При переходе бактерий к споруляции ключевая роль принадлежит регуляторному белку Spo0А. Синтез многих клеточных белков, экспрессия которых продолжается в этот период, находится под его положительным контролем. Представляло интерес провести поиск Spo0А-боксов (TGNCGAA) в промоторной области гена apr Bi субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.
Анализ нуклеотидной последовательности позволил выявить участки с 70-86% гомологией для взаимодействия со специфическим регуляторным белком Spo0A (рис. 7). Они располагаются в виде прямых тандемных повторов. Такое строение промоторной области должно способствовать увеличению частоты инициации транскрипции в условиях активации Spo0A-белка.
Выявленные сайты регуляции в промоторной области гена apr Bi позволили предположить возможное участие двухкомпонентной системы Spo0A фосфопередачи в регуляции экспрессии гена apr Bi.
1 GAATGGAAGGTCCTTGATTACAACGTGGTCAGCCATTTACTCCATCCTCCCCTT 1 55 TTTAAAGAACCTGTTATTGTAACAGGTTNTTTTTNAATGCCAAAACCAAAAAAT 109 AATATTTTTTTATATCGAAATTCGAAATAGATGCTAGACGTTTCTACCTATTTTA 164 AGGCTTTTCGGGTATCGAATATTTGTCCGAAAATGGATCATAAGAAAAAAAGCAC 219 ACTTCCTTTTTAATAGATAACCGCTGAAACAGCAGAACAAACATATTTTCCCAAC 274 GTTTCCAAGTGACTTAATTCCCCAATTTTCGCTAGGACTTTCACAAAAATTCGGG 7 8 329 TCTACTCTTATTTGCCTACTTCCCTTAAACTGAATATACAGAATAATCAAACGAA - -35 SD 384 TCATTCTTATAGACTACGAATGATTATTCTGAAATAAGAAAAAAGGGATGTGGAT 439 TGTGCGTGAAAAAGAAAAATGTGATG Рис. 7. Промотор гена apr Bi. Последовательность Шайна-Дельгарно (SD), сайт инициации трансляции (GTG) выделен жирным, –10 и –35 области обозначены жирным, курсивом и подчеркнуты. Потенциальные Spo0A-боксы выделены рамкой. Участки с 86% гомологией к Spo0A-боксу: (2;
3;
4;
7;
8;
9;
10), участки с 71% гомологией: (1;
5;
6). TGNCGAA –Spo0A-бокс.
Система Spo0A-фосфопередачи, участвующая в инициации споруляции, основана на фосфорилировании Spo0A фактора транскрипции путем передачи фосфата от множественных гистидин киназ на переносчики фосфата Spo0F и Spo0B и затем на Spo0A белок (рис. 8). Spo0A~Р специфически дефосфорилируется фосфатазой Spo0Е, а Spo0F~Р – фосфатазами Rap-семейства (Peregо, Brannigan, 2001), последние ингибируются специфическими олигопептидами, поступающими в клетку через цитоплазматическую мембрану (Reizer et al., 1997). Транспорт олигопептидов в клетку контролируется мембраносвязанным белком Spo0К (Peregо, Brannigan, 2001).
Kin B Kin A Kin C Kin D Kin E Spo0K PhrA, C, E RapA, B, E Spo0F Spo0B Spo0A Spo0E Sporulation Рис. 8. Инициация спорообразования. (Piggot, Hilbert, 2004).
Исследовали характер экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы в различных штаммах B.subtilis, мутантных по гену spo0A, трансформированных плазмидой pCS9 (рис. 9). Установлено более чем 98%-ое ингибирование протеолитической активности субтилизиноподобной протеиназы по сравнению с контрольным штаммом с полноценным геном spo0A. По-видимому, Spo0А белок, участвует в позитивной регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В.intermedius.
Удельная активность, у.е.
К 10 spo0A 22 26 30 34 38 42 46 50 54 Время, ч Рис. 9. Экспрессия гена apr Bi субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов B.subtilis, дефектных по регуляторному белку Spo0A.
3. Влияние супрессорной spo0AabrB мутации на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы. Исследовали характер экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы в супрессорных штаммах B.subtilis, мутантных одновременно по двум генам spo0AabrB, в которых abrB мутация компенсирует дефект spo0A-гена, (рис. 10). В двойных мутантах spo0A12abrB23 экспрессия гена apr Bi восстанавливается и превышает уровень контроля в среднем в 2 - 3 раза (рис. 10). Полученные данные подтверждают участие Spo0А - белка в позитивной регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В.intermedius, а также позволяют нам сделать предположение о репрессирующем действии регуляторного белка AbrB на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы.
Удельная активность, у.е.
spo0A12abrB К 22 26 30 34 38 42 46 50 54 Время, ч Рис. 10. Экспрессия гена apr Bi в мутантных штаммах spo0AabrB.
4. Влияние kinA мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы. Для выяснения роли гистидин киназы KinA, участвующей в регуляторной системе Spo0A – фосфопередачи, в активации гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius исследовали характер экспрессии гена apr Bi в штамме B.subtilis, мутантном по гену kinA82 (рис. 11).
Удельная активность, у.е.
40 К kinA 22 26 30 34 38 42 46 50 54 Время, ч Рис. 11. Экспрессия гена apr Bi рекомбинантного штамма B.subtilis, дефектного по регуляторному белку KinA.
Нами установлено 95% ингибирование протеолитической активности в мутантном штамме по сравнению с контрольным вариантом. Таким образом, результаты свидетельствует о возможном участии гистидин киназы KinA в позитивной регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В.intermedius.
5. Влияние spo0F и spo0B-мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius. Чтобы выяснить участвуют ли компоненты регуляторной системы Spo0A – фосфопередачи в активации гена apr Bi изучали экспрессию данного гена в Spo0F и Spo0B-мутантах. В штамме, B.subtilis JH649, мутантном по фосфотрансферазе Spo0F, уровень экспрессии гена субтилизинопоодобной протеиназы снижался на 85-90% (рис. 12), по сравнению со штаммом с полноценным белком Spo0F. После трансформации плазмиды в spo0B – мутантный штамм уровень протеиназной активности в среде оставался низким при культивировании в течение 50 часов и составил 10% от контроля.
Удельная активность, у.е.
40 К spo0F spo0B 24 28 32 36 40 44 48 Время, ч Рис. 12. Экспрессия гена apr Bi рекомбинантных штаммов B.subtilis, дефектных по регуляторным белкам Spo0F и Spo0В.
Таким образом, белки Spo0F и Spo0B, компоненты регуляторной системы Spo0A – фосфопередачи, должны быть в функционально-активном состоянии для положительной экспрессии гена apr Bi. Результаты свидетельствуют, что данная регуляторная система может участвовать в контроле экспрессии гена протеиназы.
Более того, из этих данных следует, что белок Spo0A, выполняющий роль фактора транскрипции, должен находиться в фосфорилированном состоянии. Именно в активации этого белка участвуют Spo0F и Spo0B-белки, осуществляя это в процессе последовательных фосфотрансферазных реакций (рис. 8). Полученные нами данные подтверждают важную роль фосфотрансфераз Spo0F и Spo0B в потоке фосфата на регуляторный Spo0A – белок.
6. Влияние spo0E и spo0K-мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius. Поток фосфата через систему Spo0A фосфопередачи может быть остановлен специфическими фосфатазами, к которым относится Spo0Е фосфатаза, участвующая в дефосфорилировании белка Spo0A~P. В штамме B.subtilis JH647, мутантном по гену spo0E, уровень экспрессии гена apr Bi снижался в среднем до 20% (рис. 13 А). Полученные нами данные свидетельствуют о слабом влиянии spo0E мутации на экспрессию гена apr Bi.
А Б Удельная активность, у.е.
Удельная активность, у.е.
50 40 К К spo0E12 spo0К 0 24 28 32 36 40 44 48 52 58 24 28 32 36 40 44 48 52 Время, ч Время, ч Рис. 13 Экспрессия гена apr Bi рекомбинантных штаммов B.subtilis, дефектных по белкам Spo0Е (А) и Spo0К (Б).
В штамме, дефектном по Spo0K белку, который участвует в транспорте олигопептидов, экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы ингибировалась на 90% (рис. 13 Б). Отсутствие протеолитической активности в штамме, дефектном по Spo0K белку, свидетельствует о зависимости экспрессии гена apr Bi от Spo0K регуляторного белка. Возможно, протеиназа участвует в деградации и процессинге специфических олигопептидов, предназначенных для транспорта внутрь клетки, на наружной стороне мембраны. Ранее установлено, что в процессе секреции в среду каталитически активная форма субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius обнаруживается в мембране и отсутствует в цитоплазме (Шарипова с соавт., 2000).
На этом основании можно предположить, что субтилизиноподобная протеиназа может выполнять регуляторную роль в функционировании системы Spo0A фосфопередачи.
7. Влияние спороспецифичных Н и Е факторов транскрипции на экспрессию гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы. Наряду с двухкомпонентной системой контроль спорогенеза осуществляется путем системной регуляции спороспецифичными сигма – факторами транскрипции. В работе использовали штамм B.subtilis JH651, содержащий мутацию в гене sigH81. В штамме с инактивированным H фактором транскрипции экспрессия гена apr Bi снижалась более чем на 90% по сравнению со штаммами с полноценным геном spo0H (рис. 14 А). Эти данные указывают на влияние spo0Н мутаций на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы. В штамме B.subtilis, не способном к синтезу протеазы, необходимой для процессинга E фактора транскрипции, (рис. 14 Б) наблюдалось 90%-ное снижение уровня экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы.
Удельная активность, у.е.
90 А Б Удельная активность, у.е.
80 70 К 40 К 30 20 sigЕ sigH81 22 26 30 34 38 42 46 50 22 26 30 34 38 42 46 50 Время, ч Время, ч Рис. 14. Экспрессия гена apr Bi рекомбинантных штаммов B.subtilis, мутантных по спороспецифичным Н -фактору транскрипции (А) и Е -фактору транскрипции (Б).
Можно предположить, что регуляция экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы зависит от активации спороспецифичного Е – фактора транскрипции.
Возможно на стадиях созревания эндоспор и автолиза спорангия субтилизиноподобная сериновая протеиназа участвует в расщеплении структурных белков, образующих поверхность материнской клетки, и способствует освобождению эндоспор.
Таким образом, анализ промоторной области гена apr Bi и исследования с использованием мутантных штаммов, позволили нам установить что в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius участвует система сигнальной трансдукции Spo0F/Spo0A-фосфопередачи, ответственная за инициацию спорообразования, а также механизмы глобальной регуляции катаболитная репрессия, AbrB-репрессия и спороспецифичные -факторы транскрипции.
ВЫВОДЫ 1. Штамм B.subtilis AJ73, дефицитный по собственным внеклеточным ферментам, после трансформации в него плазмиды pCS9 с геном субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius (apr Bi), выделяет фермент в среду в стационарной фазе роста с максимальной активностью на 28-й и 48-й часы роста. Первая фракция соответствует стадии инициации споруляции (0 стадия), вторая – завершению формирования эндоспор и выходу зрелых спор в среду (V-VII).
2. Основные закономерности экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis сохраняются на стадиях раннего и позднего стационара - активация в присутствии ионов Ca2+, неорганического фосфата и белковых субстратов. Установлены изменения в уровне экспрессии гена apr Bi в присутствии экзогенных факторов на разных стадиях роста (ионы Mg+2 и Mn+2, белковые субстраты, сахара).
3. Экспрессия гена протеиназы и спорообразование корегулируются катаболитной репрессией в начале стационарной фазы роста и не регулируется этим механизмом в поздней стационарной фазе роста рекомбинантного штамма.
4. В позитивном контроле экспрессии гена apr Bi участвуют белки – компоненты регуляторной системы Spo0A-фосфопередачи: уровень экспрессии в штаммах B.subtilis, мутантных по Spo0А, Spo0В, Spo0F белкам снижается более, чем на 90%. Использование супрессорных штаммов spo0AabrB позволило установить, что регуляция экспрессии гена apr Bi осуществляется по механизму AbrB-репрессии.
5. Экспрессия гена apr Bi не зависит от Spo0E – фосфатазы, участвующей в специфическом дефосфорилировании Spo0А фактора транскрипции, и подвергается позитивной регуляции со стороны Spo0K регуляторного белка, участвующего в транспорте регуляторных олигопептидов.
6. Спороспецифичные Н и Е факторы транскрипции способны участвовать в положительном контроле экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius в клетках B.subtilis.
Публикации по теме диссертации 1. Кадырова Ю.М. Экспрессия гена субтилизина Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю.М. Кадырова, И.А. Зубахина, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов II научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета “Материалы и технологии XXI века”. - Казань, 16–17 марта, 2001. - С.83.
2. Кадырова Ю.М. Биосинтез внеклеточной фосфатазы и спорообразование у бактерий Bacillus intermedius / Ю.М. Кадырова, И.А. Курнева, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов I научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета “Материалы и технологии XXI века”. – Казань, 20-21 октября, 2001. – С.45.
3. Зубахина И.А. Синтез нейтральной протеиназы и субтилизина B. intermedius рекомбинантными клетками B. subtilis / И. А. Зубахина, Ю. М. Кадырова, М. Р.
Шарипова // Тезисы докладов “IV Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов”. - Казань, 11-12 декабря, 2001. – С.122.
4. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. - 2002. Т.71. - №4. - С. 494-499.
5. Шарипова М.Р. Бациллы – продуценты внеклеточных протеиназ / М.Р.
Шарипова, Н.П. Балабан, А.М. Марданова, Л.А. Габдрахманова, Ю.М.
Кадырова, С.В. Костров, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // 1-й Международный конгресс “Биотехнология-состояние и перспективы развития”.
- Москва, 14-18 октября, 2002. - С. 224-225.
6. Кадырова Ю.М. Внеклеточные протеиназы и спорогенез Bacillus intermedius / Ю.М. Кадырова, И.А. Зубахина, О.Р. Латыпов // Материалы XL Международной научной студенческой конференции “Студент и научно-технический прогресс”.
– Новосибирск, 2002. - C. 80.
7. Кадырова Ю.М. Экспрессия в Bacillus subtilis гена субтилизина Bacillus intermedius / Ю.М. Кадырова //Сборник тезисов итоговой конференции Республиканского конкурса научных работ среди студентов и асприрантов на соискание премии им. Н. И. Лобачевского. – Казань, 1-2 марта, 2002. – С. 165.
8. Kadyrova J.M. Expression of Bacillus intermedius serine protease in Bacillus subtilis recombinant strains / J.M. Kadyrova, M.R. Sharipova, N.P. Balaban, A.M.
Mardanova, L.A. Gabdrakhmanova, S.V. Kostrov, G.N. Rudenskaya, I.B.
Leshchinskaya // FEMS Congress of European Microbiologist “Bacillus-2003”. Ljubljania, Slovenia, 1-3 July, 2003. – Р.29.
9. Кириллова Ю.М. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis / Ю.М. Кириллова, Е.О.
Михайлова, М.Р. Шарипова // Сборник тезисов 9-й Пущинской школы конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века”. - Пущино, 18- апреля, 2005. - С. 203.
10. Кириллова Ю.М. Закономерности биосинтеза протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ73 / Ю.М. Кириллова, Е.О.
Михайлова, А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова // Материалы XIII международной научной конференции “Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение”. - Казань, 4-8 апреля, 2005. С. 44-45.
11. Михайлова Е.О. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis / Е.О.
Михайлова, Ю.М. Кириллова, М.Р. Шарипова // Материалы V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов “Наука. Инновации. Бизнес”. - Казань, 9 июня, 2005. - С. 72-73.
12. Кириллова Ю.М. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis AJ 73 / Ю.М. Кириллова, Е.О.
Михайлова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Материалы V научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета “Материалы и технологии XXI века”. – Казань, 26-27 апреля, 2005. - С. 51.
13. Михайлова Е.О. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis AJ 73 / Е.О. Михайлова, Ю.М. Кириллова, М.Р. Шарипова // Материалы Молодежной школы конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”. – Москва,1- ноября, 2005. - С. 97-98.
14. Байрамов Р.А. Биосинтез внеклеточных сериновых протеиназ Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Р.А. Байрамов, Е.О.
Михайлова, А.Р. Сабирова, Ю.М. Кириллова // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции “Студент и научно технический прогресс”. – Новосибирск, 2005. - С. 89-90.
15. Кириллова Ю.М. Условия роста культуры и биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, Н.П. Балабан, Марданова А.М., Руденская Г.Н., Костров С.В., Шарипова М.Р. // Микробиология. –2006. – Т.75.
- №2. – С. 172-178.
16. Кириллова Ю.М. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, Н.П. Балабан, Марданова А.М., Каюмов А.Р., Руденская Г.Н., Костров С.В., Шарипова М.Р. // Микробиология. –2006. – Т.75.
- №2. –С. 179-185.
17. Sharipova M. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedius in Bacillus subtilis / M. Sharipova, N. Balaban, A. Kayumov, Y. Kirillova, L.
Gabdrakhmanova, A. Mardanova, I. Leshchinskaya, G. Rudenskaya, T. Akimkina, D.Safina, I. Demidyuk, S. Kostrov // Microbiol. Res. - 2006. (принята в печать).
Автор выражает глубокую благодарность профессору кафедры микробиологии, д.б.н. Маргарите Рашидовне Шариповой за постоянное внимание к работе, в.н.с., канд. биол. наук Нэлли Павловне Балабан и доценту кафедры микробиологии, канд.
биол. наук Айсылу Миркасымовне Мардановой за оказанную помощь в работе, профессору Сергею Викторовичу Кострову (Институт молекулярной генетики РАН) за любезное предоставление плазмиды pCS9, использованной в работе, и возможность пройти научную стажировку в возглавляемой им научной лаборатории генной инженерии, профессору (Института генетики и селекции промышленных микроорганизмов) Ю. Йомантасу за предоставленный штамм B.subtilis AJ73, профессору Д. Зайглеру из Bacillus Genetic Stock Center (университет Охайо, США) за предоставленные для работы штаммы B.subtilis, дефектные по spo - генам.