авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Механизм связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой

На правах рукописи

ОСПАНОВ РУСЛАН ВАИТОВИЧ МЕХАНИЗМ СВЯЗЫВАНИЯ ТИАМИНДИФОСФАТА С АПОТРАНСКЕТОЛАЗОЙ 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н.Баха РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Г.А.Кочетов доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.Н.Чернов доктор химических наук, профессор А.К.Гладилин

Ведущая организация: Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН, Пущино

Защита состоится «10» апреля 2007 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Транскетолаза (ТК*, седогептулозо-7-фосфат: Д-глицеральдегид-3 фосфатгликольальдегидтрансфераза, КФ 2.2.1.1) – ключевой фермент пентозофосфатного пути превращения углеводов. Фермент катализирует перенос остатка гликольальдегида с кетозы (субстрат-донор) на альдозу (субстрат-акцептор) и является простейшим представителем группы тиаминдифосфат-зависимых ферментов. Функцию кофакторов выполняют двухвалентные катионы – Ca2+, Mg2+ и др.

ТК из Saccharomyces cerevisiae, которая является объектом настоящего исследования, достаточно хорошо изучена. Фермент является гомодимером, имеет два структурно эквивалентных активных центра с идентичной каталитической активностью. Проведен рентгеноструктурный анализ ТК, идентифицированы функциональные группы апобелка и кофермента. Показаны существенные различия в свойствах фермента в зависимости от типа катиона, используемого в качестве кофактора. Интенсивно изучается механизм транскетолазной реакции в рамках общей проблемы тиаминового катализа. Что касается кинетического механизма функционирования ТК, механизма ее взаимодействия с ТДФ, характеристики индивидуальных стадий этого процесса, то сведения здесь достаточно ограничены.

Показано, что связывание ТДФ с апоТК происходит в две стадии: первая – быстрая и легко обратимая, приводящая к образованию неактивного промежуточного комплекса фермент-кофермент. Вторая стадия – относительно медленная, связанная с конформационными изменениями активного центра и приводящая к образованию каталитически активного холофермента. В литературе были указания на существование взаимодействий между кофермент-связывающими центрами, однако строгий анализ этих взаимодействий не проводился из-за отсутствия соответствующей теоретической модели. Данные вопросы и предстояло исследовать в диссертационной работе.

*Список сокращений: ТК – транскетолаза, ТДФ –тиаминдифосфат.

Целью настоящей работы является исследование механизма связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Построить теоретическую модель взаимодействия димерного белка с лигандом, с учетом двухстадийного механизма его связывания.

2. Рассчитать значения равновесных и кинетических констант связывания ТДФ с апотранскетолазой.

3. Исследовать влияние субстрата на связывание ТДФ с апотранскетолазой.

4. Исследовать кооперативные взаимодействия между активными центрами транскетолазы.

Научная новизна работы Разработана модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами в димерной молекуле белка. Модель включает стадию конформационного изменения субъединицы, связавшей лиганд. В рамках этой модели получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом.

Проведен теоретический анализ кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для модели Моно, Уаймена, Шанже и Кошланда, Немети, Филмера. Для этой цели разработан новый метод анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами белка с помощью графика зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом.

Проведен количественный анализ кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами в молекуле транскетолазы.

Составлены кинетические уравнения, описывающие кинетику связывания ТДФ с апоТК. Определены константы скорости для индивидуальных стадий процесса образования каталитически активного холофермента из апо- и кофермента при использовании Ca2+ и Mg2+ в качестве кофактора, в отсутствие и в присутствии субстрата.

Практическая значимость Разработанная модель для белка с взаимодействующими лиганд связывающими центрами может быть использована для анализа процесса связывания лиганда с любым аллостерическим белком, имеющим два лиганд связывающих центра.

Предлагаемый новый метод характеристики кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами белка с помощью графика зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения его лигандом может быть использован для теоретического анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для различных моделей аллостерических ферментов.

Полученные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы при чтении лекций по энзимологии, биохимии и ферментативной кинетике на кафедрах биохимии биологических факультетов и медицинских институтов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на ХI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), на ХII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах и состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 91 литературный источник.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ранее было показано (Кочетов, Изотова, 1973), что процесс образования холоТК происходит как минимум в две стадии (схема 1). На первой (быстрой и легко обратимой) стадии происходит Kd k+1 взаимодействие ТДФ с апоТК, в...

TK + ТДФ TK ТДФ TK*-ТДФ результате чего образуется k- промежуточный, легко диссоциирующий Схема 1. Связывание тиаминдифосфата с транскетолазой.

неактивный комплекс ТК···ТДФ. Затем осуществляется изомеризация формы ТК···ТДФ в форму ТК*-ТДФ с образованием достаточно стабильного, каталитически активного холофермента.

Вторая стадия, в отличие от первой, медленная, связанная с конформационными изменениями молекулы белка.

Модель с взаимодействующими лиганд-связывающими центрами.

Рассмотрим теперь модель двустадийного связывания лиганда с димерным белком, когда существует взаимодействие между лиганд связывающими центрами (схема 2). Здесь EE – исходный димер белка, содержащий два лиганд-связывающих центра;

L – лиганд;

EE и EE – димерные формы белка, содержащие один K1 EEL конформационно измененный лиганд Kd EEL K1 K Kd Kd LEEL связывающий центр (E);

EE – димерная LEEL LEEL K1 K EE форма белка с двумя конформационно LEEL Kd Kd LEE Kd K измененными лиганд-связывающими LEE центрами;

Kd – микроскопическая константа Схема 2. Связывание лиганда с взаимодействующими лиганд- диссоциации комплекса белок-лиганд;

K1 и связывающими центрами димерного белка. K2 – равновесные константы конформационного перехода для первого лиганд-связывающего центра, связавшего лиганд, и второго центра, связавшего лиганд после того, как лиганд связался в первом центре, соответственно. Предполагается, что оба лиганд связывающих центра структурно идентичны и поэтому лиганд может равновероятно связаться как с «левым», так и с «правым» центром димера ЕЕ.

В этом случае образуется либо форма LЕЕ, либо форма ЕЕL (этот переход описывается константой Kd: далее в скобках будет указана константа, характеризующая конкретную стадию), которые между собой неразличимы, кроме положения лиганда. Форма LЕЕ или ЕЕL затем либо связывает второй лиганд с образованием формы LЕЕL (Kd), либо в лиганд-связывающем центре, содержащем лиганд, происходит его конформационное изменение, в результате чего образуется форма LЕЕ, или ЕЕL, соответственно (K1). В форме LЕЕL равновероятно происходит образование форм LЕЕL или LЕЕL (K1), но для форм LЕЕ и ЕЕL образование форм LЕЕL и LЕЕL происходит в соответствии с положением лиганд-связывающего центра, не занятого лигандом (Kd). На последней стадии связывания лиганда происходит завершающее конформационное изменение в том центре, в котором оно еще не произошло, что приводит к образованию формы LЕЕL, соответственно, из форм LЕЕL, или LЕЕL (K2).

Запишем функцию для доли форм белка, связанных с лигандом (Y), через все формы белка, содержащие лиганд:

2[EEL] + 2[E EL] + 2([LEEL] + 2[LEEL] + [LEEL]) (1) Y=.

2[E] Подставив в полученное уравнение (1) выражения для форм белка, получим:

[L] 1 [L] 2 (1 + ) + (1 + + ) K1 K1 K 2 K d K1 K d (2) Y=.

1 2 [L] [L] 2 1 + (1 + ) + (1 + + ) K1 K1 K 2 K d K1 Kd Теперь запишем выражение функции для доли конформационно измененных форм белка (Z) так же, как и для (Y), но только через сумму всех конформационно измененных форм белка:

2[E EL] + 2[LEEL] + [LEEL], (3) Z= 2[E] Так же как и для уравнения (2) подставляем выражения для форм белка:

[L] [L] + (1 + ) K1 K d K 2 K1 K d (4) Z=.

1 2 [L] [L] 2 1 + (1 + ) + (1 + + ) K1 K1 K 2 K d K1 Kd При [L] значение Z приближается к предельному значению:

1 + K. (5) Z пред = 1 + 2 K 2 + K1K Нормированное значение Z принимает вид [L] [L] (1 + 2 K 2 + K1K 2 ) + (1 + ) K 2 K1 K d K1 K d Z Z норм = =. (6) [L] Z пред 1 2 [L] 2 (1 + K 2 )1 + (1 + ) ) + (1 + + K 1 K1 K 2 K d K1 Kd Построение графиков зависимостей степени насыщения белка лигандом (Y), степени конформационных изменений (Z) и нормированной степени конформационных изменений (Zнорм) от концентрации лиганда L В тех случаях, когда экспериментальные данные позволяют рассчитать степень насыщения белка лигандом и степень 1, 0, конформационных изменений при 0, м Zнор различных концентрациях лиганда, может 0, 1, 0, быть построен трехмерный график, 0,5 0, связывающий величины Zнорм, Y и [L].

Y 0,0 5 M [L], мк Типичный график подобного типа Рис.1. Трехмерный график зависимости степени насыщения Y представлен на рис.1. Из данного графика и нормированной степени можно построить проекцию на плоскость конформационных изменений Zнорм от концентрации свободного Zнорм(Y) и проанализировать эту лиганда [L] (Kd = 800, K1 = 0.01, K2 = 1). График рассчитан по зависимость.

уравнениям (2) и (6).

При K1 1 (например, при K1 = 0,01;

рис. 2а) отклонения от прямой, проходящей под углом 45, могут наблюдаться только в случае кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами. На графиках зависимости Zнорм от Y подобные отклонения проявляются в виде кривых, располагающихся выше прямой, проходящей под 1,0 1, 1, в а б K1 = 1 K1 = = K1 = 0, = = = Zнорм Zнорм Zнорм 0,5 0, 0,5 = = 0. = 100 = 0, = 0. = 0, = = 0. 0,0 0, 0, 0,5 1,0 0,5 1, 0,5 1, Y Y Y Рис.2. Теоретические зависимости Zнорм от Y при следующих значениях параметра K1: а – K1 = 0,01, б – K1 = 1, в – K1 = 100. Цифры около кривых соответствуют значению параметра ( = K2/K1). Графики рассчитаны по уравнениям (2) и (6).

углом 45°, и выражены тем сильнее, чем больше значение параметра. Эти отклонения соответствуют отрицательной кооперативности.

При значении константы K1 1 (например, при K1 = 100;

рис. 2в) отклонения от прямой, проходящей под углом 45, могут наблюдаться только в случае положительной кооперативности взаимодействия между лиганд связывающими центрами. На графиках Zнорм от Y эти отклонения проявятся в виде кривых, расположенных ниже прямой, проходящей под углом 45°, и выражены тем сильнее, чем меньше значение (рис. 2в).

При K1 = 1 (рис. 2б) отклонения от прямой, проходящей под углом 45, могут быть связаны как с положительными, так и с отрицательными кооперативными взаимодействиями между лиганд-связывающими центрами.

Возможность практического применения разработанной нами модели мы проверили на транскетолазе. В качестве экспериментальных данных использовали результаты спектрофотометрического титрования апотранскетолазы коферментом, тиаминдифосфатом, полученных в отделе биохимии живой клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского Московского Государственного Университета [1, 2]. Сущность метода спектрофотометрического титрования заключается в том, что при взаимодействии ТДФ с ТК в спектре поглощения фермента появляется новая полоса в области 300-340 нм, которая отсутствовала у исходных компонентов [3-6]. Появление этой полосы характеризует образование каталитически активного холофермента и ее интенсивность строго коррелирует с количеством кофермента, связавшегося с активными центрами транскетолазы.

Специфические изменения спектра при связывании ТДФ и обнаруженные при этом закономерности давали возможность детально исследовать процесс взаимодействия кофермента с апобелком и влияние на него лигандов.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТДФ С апоТК В ПРИСУТСТВИИ Mg2+ В КАЧЕСТВЕ КОФАКТОРА Определение константы диссоциации, Kd, комплекса ТК···ТДФ (схема 1) Если попытаться определить четыре микроскопические константы при математической обработке данных спектрофотометрического титрования, а именно Kd, K1, K2 и, то можно столкнуться 0, с тем, что достоверно определить 0,04 4, одновременно все эти параметра из 3 0, A экспериментальных данных нельзя. В 0, теоретических уравнениях присутствует 0, произведение двух констант (Kd·), поэтому 0, 2 4 6 8 найти каждую из них одновременно не Время, с представляется возможным. Выйти из Рис.3. Кинетика реконструкции холотранскетолазы в присутствии данной ситуации можно, если один из Mg2+ с использованием различных концентраций ТДФ: 0,15;

0,3;

1;

2 и параметров будет известен. В частности, из 3 мМ (соответственно, кривые 1-5).

экспериментальных данных, полученных 25 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6;

2,5 мМ MgС12;

6,75 мкМ ТК методом остановленного потока (рис. 3), [1]. На рисунке показаны начальные участки кривых, для которых были можно определить значение константы проведены касательные с целью определения начальной скорости диссоциации первичного комплекса связывания. ТДФ с апоТК.

ТК···ТДФ (Kd на схеме 1).

Для этого, сначала необходимо найти зависимость начальной скорости связывания ТДФ с апоТК от концентрации кофермента. Для определения значений начальных скоростей связывания ТДФ с апотранскетолазой необходимо для каждого начального участка кривой (для конкретной концентрации ТДФ) построить касательную. Данный участок будет характеризовать значение начальной скорости;

это будет значение тангенса угла наклона касательной.

Полученная зависимость начальной 0, скорости связывания (v0) от концентрации ТДФ (рис. 4) описывается vo, A320 / сек простой гиперболической функцией:

0, v0,пред [ТДФ ], (7) v0 = K d + [ТДФ ] 0, где v0,пред предельное значение v0 при 1 2 [ТДФ], мM [ТДФ], а Kd – микроскопическая Рис.4. График зависимости начальной скорости (v0) взаимодействия ТДФ с константа диссоциации комплекса апоТК от концентрации ТДФ. о – TK···ТДФ.

рассчитанные значения начальной скорости для соответствующей Значение v0,пред характеризует концентрации ТДФ, сплошная линия – результат математической обработки с скорость конформационного перехода помощью уравнения (7) для рассчитанных значений v0. EEL EL.

v 0,пред = 2k +1 [E] 0, (8) где – коэффициент молярной экстинкции комплекса ТДФ с конформационно измененным активным центром (), а k+1 – константа скорости конформационного перехода EEL EL или LEE LE.

В результате математической обработки данных рис.4 мы получили следующие значения параметров v0,пред и Kd: v0,пред = 0,0029 ± 0.0004 А320/сек и Kd = 1,6 ± 0,1 мM.

Определение равновесных констант K1 и K Значение Kd было использовано нами для анализа функции насыщения ТК тиаминдифосфатом, приведенной на рис. 5 (кривая 1). Для описания зависимости A320 от концентрации кофермента мы использовали уравнения (2) и (4). В выражение для Z входит концентрация свободного ТДФ, [Т], которая связана с общей концентрацией кофермента ([Т]общ) следующим соотношением:

[Т] = [Т]общ – 2[E]0Y. (9) Увеличение оптической плотности (A320) при титровании апоTK тиаминдифосфатом может быть рассчитано так:

A320 = 2[E]0Z. (10) Для выяснения соответствия Рис. 5. Титрование апотранскетолазы теоретического уравнения тиаминдифосфатом в отсутствие (1) и в присутствии (2) 2,5 мМ экспериментальным данным использовали субстрата-донора, гидроксипирувата программу Scientist (MicroMath, США), в (50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6, 2,5 мМ MgCl2, апоТК 0, результате чего мы получили K1 = 0,0006 ± мг/мл [2]). Точки – экспериментальные данные, кривые 0,0002, K2 = 0,0066 ± 0,0007, = 0,00269 ± рассчитаны с помощью уравнений (2), (4), (9) и (10).

0,00002 мкM–1 cм–1.

С учетом полученных значений (K1, K2, Kd, ), мы проанализировали кинетические данные по связыванию ТДФ с транскетолазой, представленные на рис. 6. Сначала, с помощью уравнения (8), мы определили константу скорости k+1. Она оказалась равной 1,33 ± 0,2 с–1. Затем, подставив значения k+ и K1 в уравнение k-1 = k+1K1, мы определили константу скорости обратного конформационного перехода: k-1 = 0,0008 ± 0,0001 с–1.

Определение констант скорости конформационного перехода ТК···ТДФ ТК*-ТДФ во втором активном центре ТК.

Для расчета констант скорости прямого и обратного конформационного перехода (соответственно, k+2 и k-2) для второго кофермент-связывающего активного центра фермента мы использовали в соответствии со схемой приводимые ниже кинетические уравнения. Сначала мы разделили все формы фермента на три пула:

P1 = [EE]+[ТEE]+[EEТ]+[ТEE], (11) P2 = [EТ]+[ТE]+[ТEТ]+[ТEТ], (12) P3 = [ТТ]. (13) Сумма всех пулов равна общей концентрации активных центров ТК, [E]0.

Конформационные изменения между пулами описываются следующими дифференциальными уравнениями:

dP dt = [E ET] k1P2 + [TE ET]k1P2 [EET] k+1P1 2 [TEET] k+1P dP = [E ET] k1P2 [TEET] k1P2 + [EET]k+1P1 + 2 [TEET] k+1P1 [TEET]k+2 P2 + 2k2 P3. (14) dt dP dt = [TEET]k+2 P2 2k2 P В этих уравнениях – доли форм [EET], [TEET], [E ET], [TE ET] фермента в соответствующих пулах:

2 K d [T], (15) [EET] = K + 2 K d [T] + [T] d [T], (16) [TEET] = K d2 + 2 K d [T] + [T] Kd, (17) [E ET] = K d + [T] Рис. 6. Кинетика связывания ТДФ транскетолазой при использовании в [T]. (18) [TE ET] = качестве кофактора Mg2+ (50 мМ глицин- K d + [T] глициновый буфер, pH 7,6, 6,75 мкМ (димер) ТК). Кинетические кривые получены при Принимая во внимание концентрациях ТДФ 150, 300, 1000, 2000 и выражения для константы 3000 мкМ (кривые 1–5, соответственно). На вставке – кинетика связывания ТДФ диссоциации транскетолазой в присутствии 1 мМ гидроксипирувата;

[ТДФ] = 150 мкМ [1].

2[EE][T] [EET][T] [E ET][T] (19) Кривые рассчитаны с помощью уравнений Kd = = = [EET] 2[TEET] [TEET] (11)–(20).

и уравнения материального баланса, [EE] + [EET] + [TEET] = 1 и [E ET] + [TE ET] = 1, получаем следующее выражение, характеризующее изменение поглощения во времени:

dP dP dA = 2 + 2 3. (20) dt dt dt Мы использовали уравнения (14) и (20) для анализа кинетических кривых связывания ТДФ с ТК, приведенных на рис. 6. При этом, значение k+2 было рассчитано для каждой кинетической кривой. Математический анализ был осуществлен с помощью программы Scientist. Среднее значение k+2 составило 0,42 ± 0,01 с–1. Теперь, зная K2 и определив k+2, можно рассчитать константу скорости k-2: k-2 = K 2 k+2 = 0,0028 ± 0,0001 с–1.

Определение констант индивидуальных стадий связывания ТДФ с апоТК в присутствии субстрата-донора Из рис. 5 (кривая 2) видно, что значительная часть начального участка кривой титрования ТК тиаминдифосфатом в присутствии гидроксипирувата представлена прямой линией, что указывает на очень высокое сродство ТДФ к участку связывания кофермента в первом активном центре: весь добавляемый кофермент полностью связывается с апобелком. По этой причине мы не смогли определить значение K1 (а также значение k-1) и во всех последующих расчетах принимали, что константа K1 имеет достаточно низкое значение (10–4). На основании данных, представленных на рис. 5 (кривая 2), использовав уравнения (2), (4), (9), (10) и приняв константу K1 равной 10–4, а константу Kd равной таковой в отсутствие субстрата (1,6 мМ), мы получили = 0,00269 ± 0, мкM–1 см–1 и K2 = 0,008 ± 0,001. Заметим, что те же самые значения и K2 были получены и в том случае, если мы при расчетах использовали значения K1 10–4.

При обработке экспериментальных данных, представленных на вставке рис. 6, с помощью уравнений (14)–(20) получены следующие значения кинетических констант скорости конформационных переходов во втором активном центре: k+2 = 0,037 ± 0,005 с–1 и k-2 = 0,00030 ± 0,00004 с–1.

Определение равновесных и кинетических констант индивидуальных стадий связывания ТДФ с апоТК в присутствии Ca2+ Анализ экспериментальных данных по связыванию ТДФ с апотранскетолазой при использовании в качестве кофактора Ca2+ проводили так же, как и в присутствии Mg2+. Данные по кинетике реконструкции холоТК из апоТК и кофермента, полученные методом остановленного потока, приведены на рис. 7а, а на рис. 7б показана построенная на основании данных рис. 7а зависимость начальной скорости взаимодействия ТДФ с апоТК (v0) от концентрации кофермента. В результате анализа этой зависимости с помощью уравнения (7) получили Kd = 340 ± 80 мкМ и v0,пред = 0,0027 ± 0,0002 А320/с.

0, vo, A320 / с 0, 0 500 [ТДФ], мкM Рис. 7. Кинетика взаимодействия ТДФ с апотранскетолазой (25 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6, 2,5 мМ CaCl2, 6,75 мкМ (димер) апоТК). а – кинетические кривые получены при концентрациях ТДФ 75, 150, 300, 445 и 890 мкМ (кривые 1–5, соответственно). На вставке – кинетика связывания ТДФ транскетолазой в присутствии 1 мМ гидроксипирувата;

концентрация ТДФ = 75 мкМ [1]. Сплошные кривые рассчитаны с помощью уравнений (11)– (20). б – зависимость начальной скорости связывания ТДФ с апоТК (v0) от исходной концентрации ТДФ. Точки получены экспериментально, кривая рассчитана с помощью уравнения (7).

Данные спектрофотометрического титрования апоТК тиаминдифосфатом представлены на рис. 8 (кривая 1). Как и в экспериментах с Mg2+ в присутствии субстрата (рис. 5, кривая 2), сродство кофермента к ТК столь велико, что первые порции добавляемого кофермента полностью связываются с первым активным центром фермента и начальный участок кривой – прямая линия.

Поэтому, как и в случае с Mg2+ в присутствии субстрата, определить значение равновесной константы для первого активного центра K1 (а также значение k-1) было невозможно, и мы приняли константу K1 равной 10–4. Значения остальных параметров, определенные с помощью данных, которые приведены на рис. 7 и 8 (кривая 1), таковы: = 0,00375 ± 0,00002 мкМ–1 см–1, K2 = 0,0013 ± 0, (аналогичные значения для этих параметров были получены при значениях K 10–4), k+1 = 0,8 ± 0,1 с–1, k+2 = 0,23 ± 0,05 с-1, k-2 = 0,00029 ± 0,00006 с–1.

Присутствие субстрата-донора при титровании ТК тиаминдифосфатом сопровождается повышением сродства кофермента к апобелку (ср. кривые 1 и на рис. 8). Поэтому ограничения, используемые при определении кинетических характеристик индивидуальных стадий процесса взаимодействия ТДФ с апоТК в отсутствие субстрата, естественно, сохраняются и в данном случае. С этими ограничениями при анализе данных, приведенных на рис. 6 и на вставке рис. 7а, были получены следующие значения исследуемых параметров: = 0,00375 ± 0,00002 мкМ–1 см–1;

K2 = 0,00061 ± 0,00004;

k+2 = 0,32 ± 0,04 с–1 и k-2 = 0,00019 ± 0,00002 с–1 (значение Kd при расчетах принимали равным полученному в экспериментах без субстрата).

Итак, на первой стадии взаимодействия ТДФ с апоТК (схема 1), когда образуется промежуточный комплекс ТК···ТДФ, значение константы его диссоциации (Kd) определяется типом катиона, используемого в качестве кофактора: в присутствии Mg2+ оно равно 1,6 мМ, а в присутствии Ca2+ – 0,34 мМ (табл. 1).

Рис. 8. Реконструкция холоТК из Однозначно показано, что в апоТК и кофермента в отсутствие субстрата (1) и в присутствии 2, присутствии Mg2+, как и в присутствии Ca2+ мМ гидроксипирувата (2) (50 мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6, существует отрицательная кооперативность 2,5 мМ CaCl2, апоТК 0,67 мг/мл, температура 25°). Точки получены между активными центрами ТК при экспериментально [2], сплошные связывании ТДФ, причем, во втором случае кривые рассчитаны с помощью уравнений (2), (4), (9) и (10).

она выражена в большей степени.

В присутствии субстрата-донора значение равновесной константы изомеризации в первом активном центре (K1 на схеме 2) уменьшается, как минимум, в 6 раз. Значение аналогичной константы во втором активном центре, K2, в присутствии субстрата осталось, по существу, неизменным, в противоположность опытам с Ca2+, где ее значение в присутствии субстрата снижается (табл. 1).

Таблица 1. Значения равновесных и кинетических констант индивидуальных стадий связывания тиаминдифосфата транскетолазой 103, мкМ- Kd, см- k+1, с-1 k-1, с-1 k+2, с-1 k-2, с- мМ K1 K с Mg2+ в качестве кофактора 1,6 0,0006 1,33 0,0008 0,0066 0,42 0,0028 2, Без субстрата ±0,1 ±0,0002 ±0,2 ±0,0001 ±0,0007 ±0,01 ±0,0001 ±0, В присутствии 1,6 0,008 0,037 0,00030 2, гидрокси- 0,0001 - ±0,1 ±0,001 ±0,005 ±0,00004 ±0, пирувата с Ca2+ в качестве кофактора 0,34 0,0013 0,23 0,00029 3, 0,0001 0,8 Без субстрата ±0,08 ±0,0001 ±0,05 ±0,00006 ±0, В присутствии 0,34 0,00061 0,32 0,00019 3, гидрокси- 0,0001 - ±0,08 ±0,00004 ±0,04 ±0,00002 ±0, пирувата ВЫВОДЫ 1. Получены строгие математические выражения, описывающие кривые спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в рамках схемы с взаимодействующими лиганд связывающими центрами в димерной молекуле фермента. Для характеристики кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат связывающими центрами предложено использовать зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом.

2. Зависимости степени конформационных изменений белка от степени насыщения белка лигандом использованы для теоретического анализа кооперативных взаимодействий между лиганд-связывающими центрами для различных теоретических моделей димерных аллостерических ферментов.

3. На основании данных спектрофотометрического титрования апотранскетолазы тиаминдифосфатом в равновесных условиях были рассчитаны равновесные константы связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой в присутствии ионов Ca2+ и Mg2+. Проведен количественный анализ кооперативных взаимодействий между тиаминдифосфат-связывающими центрами в молекуле транскетолазы.

Показано, что как в присутствии ионов Ca2+, так и в присутствии ионов Mg2+ наблюдается отрицательная кооперативность. В случае ионов Ca2+ она выражена более отчетливо.

4. Составлены кинетические уравнения, описывающие кинетику взаимодействия ТДФ с апоТК, и на основании экспериментальных данных, полученных методом остановленного потока, рассчитаны константы скорости прямой и обратной реакций для конформационных переходов, следующих за связыванием ТДФ в каждом активном центре.

5. Показано, что субстрат-донор оказывает влияние на скорость прямого и обратного конформационного перехода неактивного промежуточного комплекса тиаминдифосфат-транскетолаза в каталитически активный комплекс, в котором фермент содержит две связанные молекулы кофермента и один из активных центров претерпел конформационный переход.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 06-04-48395.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ospanov, R., Kochetov, G., Kurganov, B. (2006) Theoretical model of interactions between ligand-binding sites in dimeric protein and its application for analysis of thiamine diphosphate binding to yeast transketolase. Biophys. Сhem.

124, 106-114.

2. Оспанов Р.В., Кочетов Г.А., Курганов Б.И. (2007) Влияние субстрата донора на кинетические характеристики индивидуальных стадий процесса взаимодействия тиаминдифосфата с транскетолазой. Биохимия, 72, 100-109.

3. Есакова О.А., Ханова Е.А., Оспанов Р.В., Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. «Неэквивалентность активных центров транскетолазы». Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2004», секция «Биология» (12-15 апреля 2004 года, г.

Москва). М.: МГУ, биологический факультет, стр. 4. Оспанов Р.В., Есакова О.А., Кочетов Г.А., Курганов Б.И. «Анализ отрицательной кооперативности при связывании тиаминдифосфата димерной дрожжевой апотранскетолазой». Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», 2005, г. Тюмень, стр. 88-91.

5. Оспанов Р.В. «Новый подход к анализу отрицательной кооперативности при связывании тиаминдифосфата дрожжевой апотранскетолазой». XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии биотехнологии», секция «Структура и функции белков и пептидов.

Биокатализ» (7-10 февраля, 2005, г. Москва, стр. 45).

6. Оспанов Р.В. «Анализ функции насыщения дрожжевой апотранскетолазы тиаминдифосфатом». Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005», секция «Биоинженерия и биоинформатика» (12-15 апреля 2005 года, г.

Москва). Том 2 - М.: Изд-во МГУ, 2005, стр. 7. Оспанов Р.В. «Исследование кинетического механизма взаимодействия кофермента с транскетолазой». Тезисы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», секция «Биоинженерия и биоинформатика» (12-15 апреля 2006 года, г. Москва). Том 4 - М.: Изд-во МГУ, 2006, стр.

57.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Esakova, O.A., Meshalkina, L.E., Golbik, R., Braner, J., Hbner G., Kochetov, G.A. Which stage of the process of apotransketolase interaction with thiamine diphosphate is affected by the regulatory activity of the donor substrate, IUBMB Life (in press).

2. Esakova, O.A., Meshalkina, L.E., Golbik, R., Hbner, G., Kochetov, G.A.

(2004) Donor substrate regulation of transketolase. Eur. J. Biochem. 271 4189 4194.

3. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Mevkh, A.T. (1973) The role of the charge transfer complex in the transketolase catalyzed reaction. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 54, 1619-1626.

4. Усманов Р.А., Кочетов Г.А. (1978) Изучение различных конформационных состояний транскетолазы методом пертурбационной ультрафиолетовой спектрофотометрии. Биохимия 43, 1796-1804.

5. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Meshalkina, L.E. (1976) The number of active sites in a molecule of transketolase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 839 843.

Мешалкина Л.Е., Кочетов Г.А. (1979) Участие двухвалентных катионов во 6.

взаимодействии тиаминдифосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей. ДАН СССР 248, 1482-1486.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.