Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства
На правах рукописи
Ягудин Тимур Анверович Гуманизация антител против возбудителей чумы и бешенства Специальность 03.01.04 – «Биохимия»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2010 г
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГосНИИГенетика и в лаборатории оптимизации экспрессии генов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.
Научный консультант: кандидат биологических наук С.В. Беневоленский
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Л. Карпов кандидат биологических наук Е.В. Свирщевская
Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН
Защита диссертации состоится « 2 » декабря 2010 года в « 14 » часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу:
119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, корпус 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.
Автореферат диссертации разослан « 29 » октября 2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, А.Ф. Орловский кандидат биологических наук
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Бешенство и чума являются особо опасными инфекционными заболеваниями. По данным Всемирной организации здравоохранения более 55 тысяч человек в мире ежегодно умирают от бешенства, более половины из них - дети до 15 лет (Информационный бюллетень ВОЗ, 2008). В случае развития симптомов болезнь становится практически неизлечимой и приводит к быстрой смерти (Hildegund, 2009).
После контактов третьей категории, к которым относятся укусы, а также для людей с ослабленной иммунной системой, ВОЗ рекомендует пассивную иммунизацию, то есть введение анти-рабического иммуноглобулина (Информационный бюллетень ВОЗ, 2008). Оптимальными являются рекомбинантные человеческие иммуноглобулины, предохраняющие от развития симптомов бешенства, например, гуманизированные моноклональные антитела (мАт) 1С5 против гликопротеида вируса бешенства, способные нейтрализовать вирус (Грибенча и др., 1991а;
Грибенча и др., 1991б).
В год фиксируется около 2000 случаев заболевания чумой, и Всемирная Организация Здравоохранения недавно признала чуму как вновь циркулирующее заболевание (Cornelis, 2000). Особо опасна легочная форма чумы, при которой симптомы болезни нарастают лавинообразно, и в течение часов после заражения может наступить смерть. Для экстренной нейтрализации воздействия чумного микроба на организм человека целесообразно вводить в кровоток иммуноглобулин, специфичный к возбудителю чумы - бактерии Yersinia pestis. Наиболее подходящим кандидатом для этого выглядит гуманизированное мАт F19 против F1 антигена Y. pestis (Ягудин и др., 2010).
Выбор рекомбинантных человеческих или гуманизированных иммуноглобулинов обусловлен тем, что клиническое использование мышиных или иных чужеродных мАт, особенно для повторного применения, может быть ограничено человеческим иммунным ответом на эти белки, способным привести к снижению терапевтической эффективности (Graziano et al., 1995).
Разработаны различные методы для снижения антигенных свойств мышиных антител при сохранении аффинности (Staelens et al., 2006).
Простейшим, но мало эффективным способом является химеризация.
Развитием этого метода является более эффективный и распространнный метод гуманизации, представляющий собой модификацию чужеродных каркасных аминокислотных остатков при сохранении последовательностей антигенсвязывающих областей (Rosok et al., 1996).
В свою очередь, существуют различные методы гуманизации, такие как трансплантация (grafting) мышиных антигенсвязывающих областей (CDR) в каркасные области антител человека (Rosok et al., 1996), перекладка (resurfacing) вариабельного домена (Staelens et al., 2006), метод позиционного консенсуса (Couto et al., 1995), метод ближайшего гомолога (Singer et al., 1993), управляемая селекция (Rosok et al., 1996), трансплантация SDR (specificity determining residues) (Nishida et al., 2008), супергуманизация (Tan et al., 2002), метод Mix&Match; (Shearman et al., 1991).
Цель работы: разработка комплексного метода гуманизации антител на примере мАт против гликопротеида вируса бешенства (1С5) и F1 антигена Y.
pestis (F19) и системы их продукции.
Задачи:
1) Установить нуклеотидные последовательности клонированных генов мАт 1С5 и F19;
2) Сконструировать и синтезировать гены гуманизированных Fab фрагментов мАт 1С5 и F19;
3) Получить дрожжевые штаммы – продуценты гуманизированных Fab фрагментов мАт 1С5 и F19;
4) Наработать препараты и определить Kd гуманизированных Fab фрагментов мАт 1С5 и F19.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Клонированы и секвенированы гены мАт 1С5 против гликопротеида вируса бешенства и F19 против F1 антигена Y. pestis.
Сконструированы гены гуманизированного Fab-фрагмента мАт F19 с помощью перекладки вариабельного домена, метода позиционного консенсуса, а также метода Mix&Match.; Получены дрожжевые штаммы-продуценты функционально активных гуманизированных вариантов Fab-фрагмента мАт F19. На основе анализа Kd полученных Fab-фрагментов разработан комплексный метод гуманизации антител.
С помощью разработанного метода сконструированы гены гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5. Получен дрожжевой штамм продуцент функционально активного гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5.
С помощью введения гена протеин-дисульфид-изомеразы человека в штамм-продуцент гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5 достигнуто увеличение уровня продукции более чем в шесть раз по сравнению с уровнем продукции исходного штамма-продуцента. При высокоплотном культивировании штамма-продуцента гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5 достигнуто увеличение уровня продукции почти на два порядка по сравнению с уровнем продукции в колбах.
Полученные гуманизированные Fab-фрагменты мАт 1С5 и F19 могут быть использованы в терапии бешенства и чумы, соответственно.
Разработанные способы оптимизации продукции могут быть использованы для наработки препарата гуманизированных антител для доклинических испытаний в препаративных количествах. Разработанный комплексный метод гуманизации может быть использован для создания человеческих рекомбинантных антител.
Апробация работы. Работа была представлена на международной научной школе-конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.
Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2009) и на межлабораторном семинаре ИНБИ РАН.
Публикации. По основным результатам диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в рецензируемых российских журналах, 1 статья в международном журнале, 2 тезисов в сборниках материалов конференций и 2 патентные заявки.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на странице и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами. Список литературы содержит источника.
Результаты Клонирование и секвенирование генов вариабельных доменов антитела против F1 антигена Y. pestis.
Первым шагом при гуманизации антител является определение аминокислотной последовательности их вариабельных VH и VL доменов. Для этого из клеток гибридомы F19, продуцирующей мАт против F1 антигена Y.
pestis, выделена суммарная РНК. Затем полученная РНК использована для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы и синтетических олигонуклеотидов A26 и L-m-r (Рис. 1 и 2).
Далее синтезированная кДНК использована в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР), с помощью которой подбирались праймеры, необходимые для клонирования генов мАт F19. В качестве прямых праймеров использован набор вырожденных олигонуклеотидов, гомологичных сигнальным последовательностям антител. В качестве обратных праймеров использовались олигонуклеотиды A26 для тяжелой цепи и L-m-r для лгкой цепи.
Анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле показал, что использование пары праймеров B8 и A26 приводит к образованию ПЦР-фрагмента с ожидаемой для тяжлой цепи Fab-фрагмента длиной п.н. Аналогично, использование праймеров С4 и L-m-r приводит к образованию ПЦР-фрагмента с ожидаемой для лгкой цепи Fab-фрагмента длиной 700 п.н.
Для каждой из цепей в независимых ПЦР получено по два ДНК фрагмента. Полученные ПЦР-фрагменты были очищены, фосфорилированы с использованием T4 полинуклеотидкиназы и клонированы в плазмидном векторе pUC18, расщепленном по сайту рестрикции SmaI. После трансформации полученными векторами клеток отобраны E.coli рекомбинантные плазмиды, содержащие вышеупомянутые ДНК-фрагменты.
После секвенирования в двух направлениях определены нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов.
Анализ нуклеотидной последовательности пары независимых клонов тяжлой цепи показал, что они идентичны (Рис. 1). Анализ нуклеотидной последовательности пары независимых изолятов лгкой цепи показал, что V и J соединены в одну рамку считывания (Рис. 2).
Рисунок 1. Нуклеотидная последовательность ПЦР-фрагмента с геном тяжлой цепи Fab-фрагмента мАт F19. Праймеры B8 и A26, использованные для клонирования, подчркнуты.
Рисунок 2. Нуклеотидная последовательность ПЦР-фрагмента с геном лгкой цепи Fab-фрагмента мАт F19. Праймеры С4 и L-m-r, использованные для клонирования, подчркнуты.
Получение дрожжевых штаммов – продуцентов рекомбинантного мышиного Fab-фрагмента мАт F19.
Гены тяжлой и лгкой цепей Fab-фрагмента мышиного мАт (ммАт) F клонированы в вектора pPICZA (Invitrogen) и pPICZA -PmeI, соответственно. При этом к C-концу тяжлой цепи добавлен гексагистидин (His6Tag). После секвенирования BglII –BamHI фрагмент вектора с лгкой цепью клонирован в BglII сайт вектора с тяжлой цепью. Таким образом, получен вектор pPICZA-F1-LH-mouse, в котором гены обеих цепей Fab фрагмента ммАт F19 слиты в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью гена МF1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae и находятся под контролем AOX1 промотора. Схематическое изображение векторов, использовавшихся для экспрессии Fab-фрагментов антител, представлено на Рисунке 3.
Рисунок 3. Карта вектора pPICZA- F1-LH.
Плазмида pPICZA-F1-LH-mouse была линеаризована по PmeI и введена в клетки штамма Pichia pastoris GS115 (Invitrogen) с помощью электропорации.
Трансформанты отобраны на полной среде с глюкозой (YPD), содержащей Zeocin в концентрации 100 мкг/мл. Интеграция линеаризованных векторов в геном рекомбинантных клонов P.pastoris подтверждена с помощью ПЦР с использованием специфичных последовательности мАт F19 праймеров и геномной ДНК трансформантов в качестве матрицы.
Отобранные трансформанты выращены на полной среде с глицерином (BMGY) и перенесены на полную среду с метанолом (BMMY) для индукции экспрессии генов Fab-фрагмента. Содержание в культуральной среде Fab фрагментов мАт F19 контролировали твердофазным ИФА на F1 белке и методом иммуноблоттинга.
Характеризация рекомбинантного Fab-фрагмента ммАт F Рекомбинантные Fab-фрагменты ммАт F19, имеющие в своем составе His6Tag, выделяли из культуральной жидкости клеток P.pastoris, трансформированных плазмидой pPICZA-F1-LH-mouse металло-хелатной хроматографией на колонке с Ni. Измеренная константа диссоциации (Kd) свидетельствует о том, что аффинность полученного рекомбинантного Fab фрагмента превышает не только аффинность полученного протеолизом Fab фрагмента, но и аффинность исходного полноразмерного ммАт F19 (Табл. 1).
Полученные данные свидетельствуют о том, что гены антитела против F антигена Y. pestis клонированы успешно.
Таблица 1. Kd полноразмерного ммАт F19 и его Fab- фрагментов.
Fab-фрагмент, Полноразмерное Рекомбинантный полученный энзиматическим ммАт F19 Fab-фрагмент расщеплением 4,5x10-9M 1,4x10-8M 4,6x10- Гуманизация мАт F19.
Идентифицированные аминокислотные последовательности VH и VL доменов мАт F19 использованы для конструирования гуманизированных вариантов мАт F19 с использованием трх методов гуманизации, описанных ниже.
Метод перекладки вариабельного домена заключается в замене экспонированных аминокислот каркасных областей на аминокислоты, находящиеся на соответствующих позициях в последовательностях антител человека. Для каждого вариабельного домена с помощью программы BlastP (Altschul et al., 1997) из всех баз данных невырожденных белковых последовательностей отобрано по 50 последовательностей антител мыши и человека с наибольшей гомологией с F19. Несколько систематических различий найдено при сравнении мышиной выборки с человеческой выборкой, и такие аминокислоты выбраны кандидатами на замену. После этого, с помощью пространственной модели вариабельного домена ммАт F определены аминокислоты, экспонированные на поверхности (доступность больше 30 %). Экспонированные на поверхности кандидаты на замену были заменены на человеческие консенсусные аминокислоты. В результате была получена последовательность Fv-фрагмента гуманизированного мАт F19, обозначенная „sur (Рис. 4).
Метод позиционного консенсуса представляет собой трансплантацию антигенсвязывающих областей в каркасную область, составленную из консенсусных последовательностей ближайших гомологов. Для каждого из фрагментов каркасных областей с помощью BlastP в базах данных невырожденных белковых последовательностей найдено 100 ближайших гомологов мАт F19 из которых составлены консенсусные последовательности.
Если в человеческой консенсусной последовательности в определнной позиции не было предпочтительной аминокислоты, то оставляли аминокислоту, которая находится в данной позиции в ммАт F19. Составленная из человеческих консенсусных каркасных областей и мышиных антигенсвязывающих областей последовательность обозначена „con (Рис. 4).
Метод Mix&Match; заключается в трансплантации антигенсвязывающих областей целиком в сборную каркасную область, составленную из наиболее гомологичных фрагментов каркасных областей вариабельных доменов антител человека. Для этого в базе данных IMGT (Giudicelli et al., 2005) с помощью программы BlastP для фрагментов каркасной области 1,2 и 3 лгкой и тяжлой цепей найдены наиболее гомологичные последовательности из гаметной ДНК человека. Затем из мышиных антигенсвязывающих областей, гомологичных фрагментов каркасных областей и J сегментов антител человека составлена последовательность вариабельных доменов гуманизированного варианта мАт F19.
Предварительные конструкции были изучены и некоторые аминокислоты идентифицированы как возможные ключевые остатки в определении связывания с антигеном. А именно, определены аминокислотные остатки, которые являются частью канонических структур конформаций антигенсвязывающих областей, и остатки, которые потенциально участвуют в укладке VL-VH (Chothia et al., 1989).
Была также отмечена низкая частота некоторых аминокислот в специфических позициях. Кроме того, из аминокислотной последовательности предварительного варианта гуманизированнного Fab-фрагмента были удалены потенциальные сайты N-гликозилирования.
Рисунок 4. Аминокислотные последовательности VH (A) и VL (Б) доменов мышиного (ms) и гуманизированных вариантов „sur, „con и „hom Fab фрагмента мАт F19. Аминокислотные остатки гипервариабельных областей подчркнуты.
С учтом этой информации и с использованием пространственной модели вариабельного домена ммАт F19 принималось решение о целесообразности обратной замены конкретного аминокислотного остатка в выбранных каркасных областях антител человека на аминокислотный остаток, который присутствует в данной позиции в вариабельном домене ммАт F19. В результате получена последовательность Fv-фрагмента гуманизированного мАт F19, обозначенная „hom (Рис. 4).
Получение дрожжевых штаммов – продуцентов гуманизированных Fab фрагментов мАт F Для того чтобы оценить эффективность проведнной гуманизации, гены мышиного и гуманизированных VH и VL доменов мАт F19 синтезированы с помощью ПЦР с использованием синтетических олигонуклеотидов и клонированы в экспрессионные кассеты с генами константных доменов антител человека IgG1 каппа-типа CH1 и C, соответственно.
Таким образом были получены гены тяжлой и лгкой цепей гибридного (обозначенного „hyb) и гуманизированных Fab-фрагментов „sur, „con и „hom, расположенные на экспрессионных векторах pPICZА и pPICZА-PmeI, соответственно.
После секвенирования BglII –BamHI фрагменты векторов с лгкой цепью клонированы в BglII сайт векторов с соответствующей тяжлой цепью. В результате получены плазмиды pPICZA-F1-LH-hyb, pPICZA-F1-LH-sur, pPICZA-F1-LH-con и pPICZA-F1-LH-hom.
Полученными плазмидами стандартным способом трансформированы клетки штамма P.pastoris GS115. Штаммы-продуценты гуманизированных Fab фрагментов мАт F19 отобраны аналогично тому, как были отобраны штаммы продуценты мышиных Fab-фрагментов мАт F19. После анализа культуральных жидкостей трансформантов с помощью ИФА получены штаммы GS115/F1-hyb, GS115/F1-sur, GS115/F1-con и GS115/F1-hom, секретирующие варианты „hyb, „sur, „con и „hom Fab-фрагмента мАт F19, соответственно.
Очистка и анализ гуманизированных Fab-фрагментов мАт F19.
В ДСН-ПААГ геле в отсутствие восстановителей аффинноочищенные Fab-фрагменты дают одиночную полосу с мобильностью, соответствующей предполагаемой молекулярной массе 50 кДa. Электрофорез в восстанавливающих условиях дат полосы, соответствующие предполагаемой массе свободных тяжлых и лгких цепей. Следовательно, тяжлые и легкие цепи Fab-фрагментов собраны правильно.
То, что гуманизированные Fab-фрагменты связываются с F1 антигеном в ИФА уже говорит о том, что при гуманизации не произошло потери связывания с антигеном. Для сравнения эффективности методик гуманизации необходимо определить константы диссоциации Fab-фрагментов. Аффинноочищенные из супернатанта Fab-фрагменты сравнивали с мышиным Fab-фрагментом по связыванию F1 антигена (Табл. 2). Сравнение проводили с использованием ИФА.
Сравнение связывания мышиного и гибридного Fab-фрагментов говорит о том, что замена мышиных константных доменов на человеческие приводит к ухудшению связывания. Однако гуманизация не только не приводит к ухудшению связывания с антигеном (вариант „sur), но и компенсирует вышеупомянутое падение связывания (варианты „hom и „con).
Сравнение эффективности методик гуманизации, несмотря на разницу в подходах, говорит о том, что поиск человеческой реципиентной последовательности отдельно для каждого фрагмента каркасной области (варианты „hom и „con) более эффективен, чем поиск для всей каркасной области целиком (вариант „sur).
Таблица 2. Характеристики гуманизированных Fab-фрагментов мАт F19.
Метод Количество Штамм- Продукция, Kd аминокислотных продуцент мг/л замен 1,4х 10-8 М F19 мышь 0 - (контроль) 3,2 x 10-7M Гибрид 0 GS115/F1-hyb 0, 3,5 х 10-7М Перекладка VH - 3 GS115/F1-sur 0, VL - 8 х10-8М Позиционный VH - 7 GS115/F1-con консенсус VL - 4,5 х10-8М Ближайший VH - 9 GS115/F1-hom 1, гомолог VL - Поскольку у варианта „hom эффективность связывания выше, чем у варианта „con, то последовательности гаметной ДНК человека предпочтительнее в качестве реципиентных, по сравнению с последовательностями из базы данных невырожденных последовательностей антител человека. Вероятно, это так, потому что в них нет соматических мутаций, возникших в результате созревания аффинности к антигену, отличному от которые могут повлиять на конформацию F1, антигенсвязывающих областей, то есть их структура более общая и позволяет различные варианты конформаций.
Таким образом, из экспериментальных данных следует, что для гуманизации предпочтительны реципиентные человеческие последовательности, состоящие из консенсусных последовательностей ближайших гомологов для каждого фрагмента каркасной области. При этом поиск гомологов следует вести в базе данных гаметной ДНК человека.
Алгоритм, разработанный по результатам гуманизации антитела против F1 антигена Y. pestis, проверен на примере гуманизации антитела против вируса бешенства.
Дизайн и гуманизация мышиного антитела против вируса бешенства.
Гены антитела против гликопротеида вируса бешенства клонированы из гибридомы 1С5 и секвенированы аналогично тому, как это было сделано для мАт F19. Идентифицированная аминокислотная последовательность VH и VL мАт 1С5 использована при гуманизации (Рис. 5).
Для этого сначала были определены границы каркасных областей согласно (Kabat et al., 1987). Для каждого фрагмента каркасной области найдено 50 ближайших гомологов в базах данных последовательностей антител из гаметной ДНК мыши и человека. Несколько систематических различий найдено при сравнении мышиной и человеческих выборок. Аминокислоты в таких позициях рассматривались в качестве кандидатов на гуманизацию.
После этого идентифицированы возможные ключевые аминокислотные остатки в определении связывания с антигеном. А именно, определены аминокислотные остатки, которые являются частью канонических структур формирующих петли антигенсвязывающих областей, предложенных (Chothia et al., 1989), остатки, которые потенциально участвуют в укладке VL-VH, как описано (Chothia et al., 1989), а также найдены аминокислоты, редко встречающиеся в последовательностях антител мыши. При анализе пространственной модели ммАт 1C5 определены Fv-фрагмента аминокислотные остатки, которые находятся в радиусе 5 ангстрем от CDR и наиболее вероятно связываются с антигеном.
Все вышеперечисленные позиции исключены из числа кандидатов на гуманизацию. В итоге получена консенсусная последовательность гуманизированного мАт 1C5, состоящая из аминокислот, наиболее часто встречающихся в человеческих гомологах ммАт 1C5, а также аминокислот ммАт 1С5, определяющих связывание с антигеном (Рис. 5).
Из полученных последовательностей удалены любые потенциальные сайты N- гликозилирования. Кроме этого, сделаны обратные замены на мышиные аминокислоты из-за опасности нарушить конформацию Fv фрагмента (2 для тяжлой цепи и 1 для лгкой). Таким образом, получена последовательность гуманизированного Fv фрагмента мАт 1C5 (Рис. 5).
Рисунок 5. Сравнение мышиной, консенсусной и гуманизированной аминокислотных последовательностей VH (А) и VL (Б) доменов мАт 1С5.
Получение дрожжевых штаммов – продуцентов рекомбинантного гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С Гены гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5 были синтезированы из набора перекрывающихся олигонуклеотидов и клонированы в экспрессионный вектор pPICZA-AR-human-opt-LH аналогично тому, как это было сделано для мАт F19.
Штаммы P.pastoris, полученные в результате трансформации плазмидой pPICZA-AR-human-opt-LH отбирали и выращивали стандартным образом (см.
выше). Культуральные жидкости трансформантов проанализированы с помощью ИФА.
По результатам анализа отобран штамм 7-22-1 (GS115/ pPICZA-AR максимальной продукцией Fab-фрагментов human-opt-LH) c гуманизированного мАт 1С5, составившей 1.8 мг/л.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки P.pastoris секретируют в культуральную жидкость Fab-фрагменты, способные связываться с гликопротеидом вируса бешенства. Это позволяет сделать предварительный вывод о том, что при гуманизации мАт 1C5 сохранена его способность связываться с антигеном. Для подробной характеризации полученного Fab-фрагмента необходимо выделить его в чистом виде. Для этого предприняты меры к повышению продукции данного Fab-фрагмента в клетках P.pastoris.
Оптимизация процесса продукции гуманизированного Fab-фрагмента мАт F Было сделано предположение, что уровень продукции Fab-фрагментов можно повысить путм более эффективного образования дисульфидных связей, так как этот процесс является одним из ключевых при сборке Fab-фрагментов.
Для этого в геном отобранного штамма 7-22-1 введн ген протеин-дисульфид изомеразы человека hPDI. Вероятно, протеин-дисульфид-изомераза человека имеет большее сродство к гуманизированным Fab-фрагментам, чем протеин дисульфид-изомераза дрожжей.
Ген hPDI, слитый с геном сигнального пептида -фактора дрожжей S.
cerevisiae на плазмиде pPH92-GAP-hPDI (Рис. 6) находится под контролем конститутивного промотора гена (глицеральдегид-3-фосфат GAP дегидрогеназы). Вектор pPH92, являющийся производной плазмиды pPIC (Invitrogen), любезно предоставлен А.М.Чулкиным (ИНБИ РАН).
Плазмидой pPH92-GAP-hPDI, предварительно линеаризованной по SalI, штамм 7-22-1 трансформирован путм электропорации. Трансформанты отобраны на минимальной среде (MD).
Рисунок 6. Структура плазмиды pPH92-GAP-hPDI.
Уровни продукции отобранных клонов трансформантов определены аналогично тому, как это сделано для штамма реципиента 7-22-1. По результатам ИФА отобран штамм T117 c максимальной продукцией Fab фрагментов гуманизированного мАт 1С5, составившей 12 мг/л.
Следовательно, в результате введения гена hPDI в геном штамма продуцента гуманизированных Fab-фрагментов мАт 1С5 уровень продукции Fab-фрагмента увеличился более чем в шесть раз. Это позволяет с большой долей уверенности утверждать, что повышение эффективности образования дисульфидных связей приводит к увеличению уровня продукции фрагментов антител.
Высокоплотная ферментация штамма Р. pastoris 7-22- Другим способом повышения продукции Fab-фрагментов является масштабирование процессов культивирования. Для проверки действенности данного метода осуществляли высокоплотное культивирование штамма Р.
pastoris 7-22-1 в ферментерах фирмы Sartorius c сосудами, имеющими рабочий объем 2,0 литра. Использованные ферментры оборудованы системами поддержания температуры, рН, концентрации растворенного кислорода.
Результаты высокоплотной ферментации штамма Р.pastoris 7-22-1 приведены на Рисунке 7.
Рисунок 7. Высокоплотная ферментация штамма Р.pastoris 7-22-1 при температуре 26оС и значении рН 7,0. () – оптическая плотность культуральной жидкости, () – концентрация гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1C5.
В результате оптимизации процесса культивирования штамма Р.pastoris 7-22-1 уровень накопления Fab-фрагментов в культуральной жидкости увеличился на два порядка и составил 170 мкг/мл.
Полученный уровень продукции позволяет выделить препарат Fab фрагмента гуманизированного мАт 1С5 в достаточных количествах для его последующей характеризации.
Анализ и очистка гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1C Культуральную жидкость, полученную в результате высокоплотной ферментации штамма Р. pastoris 7-22-1, исследовали методом электрофореза в 10% ДСН-ПААГ геле (Рис. 8А).
Рисунок 8. Свойства гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5.
А. Электрофорез в 10% ДСН-ПААГ. Дорожка 1, стандарты (кДа);
дорожка 2, ЭФ в невосстанавливающих условиях;
дорожка 3, ЭФ в восстанавливающих условиях. Б. Вестерн-блот в невосстанавливающих (дорожки 1-3) или в восстанавливающих (дорожки 4-6) условиях. Инкубацию проводили либо с антителами против каппа цепей иммуноглобулинов человека (дорожки 1 и 4), либо с антителами против His6Tag (дорожки 2 и 5), либо с антителами против каппа цепей иммуноглобулинов мыши (дорожки 3 и 6).
Fab-фрагменты при окрашивании Кумасси дают одиночную полосу с подвижностью, соответствующей предполагаемой молекулярной массе Fab фрагмента 50 кДа. Электрофорез в восстанавливающих условиях дат полосы, соответствующие предполагаемым массам свободных тяжлых и лгких цепей.
Отсюда следует, что гуманизированные Fab-фрагменты обладают нативной структурой, а именно состоят из двух цепей, соединнных межцепочечной дисульфидной связью.
Степень гуманизации полученных Fab-фрагментов определяли анализом Вестерн блот. Результаты этого анализа представлены на Рисунке 9.
На высокую степень гуманизации мАт 1С5 указывает тот факт, что поликлональные антитела, специфичные к каппа-цепям иммуноглобулинов человека, узнают гуманизированный Fab-фрагмент (Рис. 8Б, дорожки 1 и 4), тогда как антитела против каппа-цепей иммуноглобулинов мыши гуманизированный Fab-фрагмент практически не связывают (Рис. 8Б, дорожки 3 и 6).
Следовательно, полученный Fab-фрагмент обладает нативной структурой и высокой степенью гуманизации. Для определения способности полученного Fab-фрагмента связываться с антигеном был получен препарат Fab-фрагмента с высокой степенью очистки.
Очистку гуманизированных Fab-фрагментов из культуральной жидкости осуществляли методом одностадийной аффинной металло-хелатной хроматографии, так как целевой продукт имеет His6Tag на С-конце тяжелой цепи (Рис. 8Б, дорожки 2 и 5).
Определение константы диссоциации гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1C5.
Аффинночищенный из супернатанта Fab-фрагмент сравнивали по связыванию гликопротеида вируса бешенства с мышиным Fab-фрагментом и полноразмерным ммАт. При определении Kd для полноразмерного ммАт 1С5 и его мышиного использовали антимышиный Fab-фрагмента иммунопероксидазный конъюгат (-специфичность). Для гуманизированного Fab-фрагмента 22-1 использовали античеловеческий иммунопероксидазный конъюгат (-специфичность).
Результаты, представленные в таблице 3, указывают на то, что гуманизированный Fab-фрагмент, обладают аффинностью не меньшей, чем у исходного полноразмерного ммАт 1С5.
Таблица 3. Kd полноразмерного ммАт 1С5, мышиного Fab-фрагмента и гуманизированного Fab-фрагмента мАт 1С5.
Рекомбинантный Полноразмерное ммАт Мышиный гуманизированный 1С5 Fab-фрагмент Fab-фрагмент 1,92 х10-9М 2,7 х10-9М 1,15 х10-9М Таким образом, штамм Р. pastoris 7-22-1 секретирует гуманизированный Fab-фрагмент мАт 1С5, который обладает нативной структурой, высокой степенью гуманизации и не меньшей аффинностью, чем у исходного полноразмерного антитела. Это позволяет сделать вывод, что гуманизация ммАт 1С5 проведена успешно. Следовательно, разработанный метод гуманизации эффективен.
Выводы 1. Впервые определена структура Fv-фрагментов моноклональных антител F19 против F1 антигена Y. pestis и 1С5 против гликопротеида вируса бешенства.
2. Разработан метод гуманизации, позволяющий быстро и эффективно получать гуманизированные Fab-фрагменты. Эффективность метода проверена на мАт F19 и 1С5.
3. Показано, что дрожжи P.pastoris способны секретировать функционально активные мышиные и гуманизированные Fab-фрагменты мАт F19 и 1С5.
4. Установлено, что продукция Fab-фрагмента мАт 1C5 в P.pastoris лимитирована на стадии образования дисульфидных связей.
5. При высокоплотной ферментации дрожжей показано, что уровень продукции пропорционален концентрации Fab-фрагмента продуцирующих клеток.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах 1. Ягудин Т.А., Морозкина Е.В., Клячко Е.В., Зацепин С.С., Беневоленский С.В., Солопова О.Н., Шемчукова О.Б., Городецкая С.Б., Борзилов А.И., Баранова Е.В., Бикетов С.Ф., Вейко В.П., Свешников П.Г. Получение рекомбинантного фрагмента нейтрализующего антитела против капсульного белка Y. pestis в свете разработки нового терапевтического средства для профилактики и лечения чумы. Молекулярная медицина, 2010, 4, 41-47.
2. Свешников П.Г., Ягудин Т.А., Морозкина Е.В., Клячко Е.В., Зацепин С.С., Беневоленский С.В., Шемчукова О.Б., Позднякова Л.П., Солопова О.Н.
Получение гуманизированного Fab фрагмента нейтрализующего антитела против вируса бешенства. Вестник Московского университета, 2010, Серия 2:
Химия. 51(3), 185-190.
3. Kozlov D.G., Yagudin T.A. Antibody fragments may be incorrectly processed in the yeast Pichia pastoris. Biotechnol Lett. 2008, 30(9):1661-1663.
Тезисы конференций 1. Ягудин T.A., Марченко А.Н., Зацепин С.С., Городецкая С.Б., Солопова О.Н., Шемчукова О.Б., Свешников П.Г., Беневоленский С.В. “Рекомбинантное гуманизованное антитело против F1 антигена Yersinia pestis”. Тезисы международной научной школы-конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября – 1 октября 2009, Москва-Пущино, т. 1, с. 433-434.
2. Ягудин Т.А., Клячко Е.В., Морозкина Е.В., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Позднякова Л.П., Свешников П.Г. “Разработка комплексного метода белкового дизайна антител для создания нового поколения иммуноглобулинов против бешенства”. Тезисы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». 25 – 27 ноября 2009, Москва, c. Патентные заявки 1. Городецкая С. Б., Свешников П. Г., Солопова О. Н., Шемчукова О. Б., Беневоленский С. В., Зацепин С. С., Марченко А. Н., Клячко Е. В., Морозкина Е. В., Ягудин Т. А. “Мышиные моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном F1 из Yersenia pestis, способ их получения с использованием дрожжей, способ и набор для детекции Yersenia pestis”.
Заявка на патент РФ № 2009124225 от 25.06.2009.
2. Городецкая С. Б., Свешников П. Г., Солопова О. Н., Шемчукова О. Б., Беневоленский С. В., Зацепин С. С., Марченко А. Н., Клячко Е. В., Морозкина Е. В., Ягудин Т. А. “Гуманизованные антитела и Fab, связывающиеся с антигеном F1 из Yersenia pestis и способ их получения с использованием дрожжей”. Заявка на патент РФ № 2009124226 от 25.06.2009.