Молекулярно-генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (cucumis sativus l.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе

На правах рукописи

БАЙНАЗАРОВА АННА НИКОЛАЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОМА ОГУРЦА ПОСЕВНОГО (CUCUMIS SATIVUS L.) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГИБРИДНОСТИ СЕМЯН И МАРКИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К МУЧНИСТОЙ РОСЕ Специальности: 03.00.23 – биотехнология, 03.00.15 – генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии и в центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Л.И. Хрусталева кандидат биологических наук Г.И. Карлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ф.С. Джалилов кандидат биологических наук В.В. Соболев

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии

Защита состоится «23» декабря 2009 г. в 16 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г.

Москва, ул. Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан « 23» ноября 2009 г. и размещен на сайте университета http://www.timacad.ru

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Е.А. Калашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Огурец посевной (Cucumis sativus L.) - один из самых древних и популярных видов овощных культур в мире. В современных программах по селекции огурца большое внимание уделяют использованию гетерозисных гибридов с комплексной устойчивостью к наиболее вредоносным заболеваниям. Оценка уровня гибридности семян является важной задачей в семеноводстве гетерозисных гибридов. Наиболее удобными для этих целей являются молекулярные маркеры, их использование позволяет защитить авторские права и контролировать качество полученных семян.

Мучнистая роса – одна из наиболее распространенных болезней огурца.

При поражении огурца мучнистой росой потери урожая достигают 40% (Hou & Ma, 1999). Создание устойчивых форм к этой болезни имеет ряд сложностей: 1) необходимость отбора на инфекционном фоне в больших выборках;

2) наличие нескольких видов грибов-возбудителей;

3) нет единого мнения о природе наследования устойчивости. Применение молекулярных маркеров значительно ускорит и упростит селекцию огурца на устойчивость к мучнистой росе. Выбор метода RGA-ПЦР с праймерами на основе консервативных последовательностей R-генов для маркирования устойчивости к мучнистой росе обусловлен характером устойчивости к этой болезни (Morishita, 2003).

В создании молекулярных маркеров ключевым моментом является поиск полиморфизма в геноме. С помощью RAPD и RFLP маркеров, широко применяемых в селекции растений, был выявлен низкий уровень внутривидового полиморфизма в геноме огурца (Kennard et al., 1994, Horejsi & Staub, 1999).

В поисках полиморфных маркеров мы остановились на таких маркерных системах, как ISSR и SSR, которые успешно были применены на различных сельскохозяйственных культурах (Deng et al., 2000, Cekic., 2001, Reddy et al., 2002, Tikunov et al., 2003, Staub et al, 2007).

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus) с использованием ISSR-, SSR-, RGA-маркеров и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ полиморфизма межмикросателлитных последовательностей генома огурца с использованием ISSR-праймеров на сортах и селекционных линиях.

2. Провести анализ полиморфизма последовательностей аналогов генов устойчивости методом RGA-ПЦР на сортах и селекционных линиях.

3. Изучить наследование устойчивости огурца к мучнистой росе.

4. Идентифицировать возбудителя мучнистой росы огурца на изучаемых популяциях с помощью микроскопического анализа клейстотециев гриба.

5. Провести RGA-анализ образцов огурца, различающихся по устойчивости к мучнистой росе.

6. Оценить эффективность STS- и SSR-маркеров, ассоциированных с локусами количественных признаков (QTL) устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, полученных на селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева.

7. Разработать эффективную систему оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов F1, основанную на SSR-маркерах.

Научная новизна. Впервые проведен анализ генома огурца с использованием ISSR-ПЦР, позволивший выявить высокий уровень полиморфизма. Наиболее полиморфными оказались межмикросателлитные последовательности, выявляемые праймером К28 на основе динуклеотидного повтора [GT]8A (83%). Такие результаты дают нам основание предположить, что данные повторы ДНК наиболее подвержены изменениям в процессе эволюции огурца. В геноме огурца выявлен высокий полиморфизм как длины самих микросателлитов, так и межмикросателитных последовательностей ДНК.

Полученные нами результаты расширяют современные представления об эволюции генома огурца.

Проведен анализ наследования устойчивости к мучнистой росе, вызываемой Podosphaera xanthii. Впервые на огурце применен метод RGA-ПЦР для маркирования признака устойчивости к мучнистой росе. С помощью RGA праймеров XLLRf-r из LRR-группы был амплифицирован фрагмент, связанный с устойчивостью к фитопатогену.

На основе нуклеотидной последовательности полученного фрагмента сконструированы SCAR-праймеры, позволяющие выявлять растения огурца с различной степенью устойчивости.

Впервые был разработан простой и эффективный метод анализа уровня гибридности гетерозисных гибридов F1 огурца, основанный на применении микросателлитных маркеров в агарозном геле.

Практическая значимость. В наших исследованиях ISSR-ПЦР зарекомендовал себя как хорошо воспроизводимый метод, позволяющий выявлять высокий уровень полиморфизма. Поэтому данный метод может быть рекомендован для использования в селекции огурца при подборе пар для скрещиваний.

На основании оценки эффективности SSR- и STS-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе, на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, мы можем рекомендовать данные маркеры для выявления устойчивости исходного материала и сортов огурца к мучнистой росе: EACMCTG116STS – как доминантный маркер, EAAGMCAT280-282STS – как кодоминантный маркер.

Разработана эффективная система оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов F1 огурца на основе SSR– маркеров, которая рекомендуется для контроля качества полученных семян.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», 2005;

на международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова – фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают 37 рисунков, 10 таблиц.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы.

Список цитируемой литературы включает 221 наименований, из них иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: 18 образцов огурца посевного, включая селекционных линий, обозначенных в тексте Л1-Л14, гибриды F1 Белый ангел и Малыш, сорта Natsufushinari и Феникс из коллекции компании «Гавриш»;

инбредных линий и 9 гибридов между ними, обозначаемых в тексте гибридными комбинациями под соответствующими номерами ГК1 – ГК9, а также гибриды F1 под номерами 46, 47, 49, 50, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 68, 98 и 99, предоставленные селекционно-семеноводческой фирмой «Манул»;

гибриды F1:

Кураж, Атлет, Аббат, Циник, Амир, Раис, Аль-Бируни, Карим и Айкас, предоставленных компанией «Гавриш». 113 образцов популяции F2 огурца посевного от скрещивания неустойчивого к мучнистой росе сорта Ива с устойчивым гибридом Астерикс, а также 2 изогенные линии АРС 3-221 (ИЛ1) и АРС 3-224 (ИЛ2), различающиеся по устойчивости к мучнистой росе (ИЛ1 полностью устойчивая линия, ИЛ2 – линия со средней устойчивостью) (селекционная станция им. Н.Н. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А.

Тимирязева.

Растительный материал выращивали в пленочной теплице. Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24оС.

Выделение ДНК. ДНК для ISSR- и RGA-анализа выделяли из молодых проростков по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями. ДНК для SSR-анализа выделяли по методам (1) – (Hong, 1992), (2) – (Chen Wen-ye, 2006) c модификациями, (3) – (Hemmer,1997) c модификациями, (4) – (de Micco P, 1992, (5) – (Brunel, 1992) c модификациями.

ПЦР-анализ. Межмикросателлитный анализ (ISSR-ПЦР) выполняли с помощью следующих ISSR-маркеров: К13, К15, К16, К17, К18, К19, К 20, 21, К24А, К24В, К25, К 26, К27, К28, К30, К31, К32, К33, К34 (Tikunov et al., 2003).

Анализ полиморфизма последовательностей аналогов генов устойчивости проводили методом RGA-ПЦР с использованием следующих пар праймеров:

RLRRf-r, XLLRf-r, CLLRf-r, ANO1-2, AS1-S1, AS3-S2, NBSf-r, PTOkin1-2, PTOkin3-4, PTOfen – s-as (Zhang et al., 2002).

Оценку эффективности STS- и SSR-маркеров осуществляли с помощью следующих пар праймеров: EAACMCAC391-395STS, EAAGMCAT280-282STS, EAAGMCTG171-179STS, EAAGMCAG154STS, EAACMCTG144-143STS, EACMCTG116STS, C31, C35, C80, C162 (Sakata et al., 2006).

Для микросателлитного анализа были использованы следующие пары праймеров: FO3, 2AS, 7C, I2A, I2C, CT23, LKO2, AGO1, 1S, ASO1, FLK1, GO6, AGT04, CT12Z, AG13C, CT33, GA09, TG10, ACC01 (Fazio, Staub, Katzir, 2002).

Все праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва).

Амплификацию осуществляли на амплификаторах «Терцик» («ДНК технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA). Продукты ISSR- и SSR-ПЦР разделяли в 2%-ом агарозном геле с буфером ТВЕ при напряжении 6 В/см. Продукты RGA-ПЦР разделяли в 6%-ом полиакриламидном геле с буфером ТВЕ при напряжении 6 В/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp DNA-Ladder» (Fermentas).

Клонирование ПЦР-продуктов Клонирование ПЦР-продуктов.

проводили с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, USA) в соответствии с инструкцией, предложенной производителем.

Секвенирование осуществляли методом Секвенирование.

терминирующих дидезоксирибонуклеотидов на капиллярном сиквенаторе Applied Biosystems 3130 xl.

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copyright© by K. Nicholas), Clone manager 6 version 6.00 (Sci Ed Central). Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытых базах генетических данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Определение гриба–возбудителя. Для определения гриба-возбудителя использовали метод, основанный на морфологических различиях клейстотециев, числе сумок и аскоспор. Наблюдения проводились с помощью микроскопа AXIOPHOT(Carl Zeiss).

Анализ расщепления. Расщепление в популяции F2 анализировали с использованием критерия 2 с помощью программы AGROS 2.11 (автор С.П.

Мартынов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus) с использованием ISSR- метода.

В данном исследовании мы изучили полиморфизм межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК огурца методом ISSR-PCR. Исследование проводили на 18 коллекционных образцах.

ISSR-анализ выявил, что 16 из 19 праймеров обеспечили воспроизводимые электрофоретические профили с общим количеством амплификационных фрагментов, колеблющимся от 5 до 17. 14 ISSR-праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов. Уровень полиморфизма варьировал в широких пределах: от низкого – 10% (К16: 1 полиморфный фрагмент из 10 выявленных) до высокого – 83,3% (К28: 5 полиморфных фрагментов из 6 выявленных). Всего с использованием ISSR-ПЦР было получено 168 бэнда, из них 52 - полиморфных. Средний уровень полиморфизма составил 31%. Продукты амплификации, полученные при использовании праймера К28 на последовательность [GT]8A оказались наиболее полиморфными среди исследованных генотипов. Таким образом, можно предположить, что данный тип повтора подвергался наибольшей изменчивости в процессе эволюции генома огурца.

Рис. 1. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей образцов огурца, полученный при проведении ISSR-ПЦР с использованием праймера К33[CT]8A: 1 гибрид F1 Белый ангел, 2 - гибрид F1 Малыш, 3 - сорт Феникс, 4 - сорт Natsufushinari, 5 - Л1, 6 - Л2, 7- Л3, 8- Л4, 9- Л5, 10- Л6, 11- Л7, 12- Л8, 13- Л9, 14- Л10, 15- Л11, 16 Л12, 17- Л13, 18- Л14.

2. Использование RGA-праймеров для маркирования признака устойчивости к настоящей мучнистой росе.

2.1.Анализ расщепления.

Популяция F2, состоящая из 113 растений, была оценена на зараженность мучнистой росой. Было выявлено 91 – восприимчивых, 11 – устойчивых, 11 – с промежуточной степенью устойчивостью растений (по данным Г.Ф.

Монахоса).

Было выдвинуто 9 гипотез о характере наследования данного признака.

Достоверность каждой из них была проверена с использованием критерия 2.

Единственной достоверной гипотезой явилось расщепление (ААВВ+ААВb+АаВb+ААbb+Ааbb+ааbb): 2 (ааВb): 1 (ааВВ) (13:2:1).

Фактическое значение 2 составило 2,894;

при критическом – 5,990. Данная гипотеза предполагает наличие двух генов (А и В) с разным фенотипическим проявлением: полное доминирование между А и а, неполное доминирование по гену В и b. Ген А подавляет В- и bb.

2.2. Идентификация возбудителя мучнистой росы.

Как известно, существует несколько возбудителей мучнистой росы, из которых (по литературным данным) на территории Московской области встречаются два: Golovinomyces cichoracearum (Erysiphe cichoracearum DC. ex Merat.) и Podosphaera (sect. Sphaerotheca) xantlii (Castagne) U.Braun &N.Shishkoff; (также известная как Sphaerotheca fusca (Fr) и Sphaerotheca fuliginea Schlechtend.:Fr.) Pollacci) (Braun et al, 2002) из класса Аскомицеты.

В связи с этим нами была проведена работа по идентификации гриба возбудителя на изучаемой популяции F2 и на территории селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева. Было проанализировано более 400 различных образцов огурца посевного, пораженных мучнистой росой. В их число входили как растения восприимчивой к болезни изогенной линии (ИЛ2), так и другие образцы огурца из коллекции селекционной станции им. H. Н.Тимофеева.

В результате микроскопического анализа листьев, пораженных мучнистой росой, мы выявили большое количество клейстотециев гриба с длинными светло-коричневыми придатками (рис.2). В каждом клейстотеции было обнаружено по одной сумке, в которой находились от 4 до 8 аскоспор.

А В Рис. 2. Анализ возбудителя: (А) - лист огурца, пораженный мучнистой росой;

(В) – клейстотеции гриба Podosphaera xanthii. 250.

Данные морфологические признаки характерны для вида Podosphaera xanthii.

2.3. Адаптация метода RGA-ПЦР для анализа генома огурца.

Анализ литературы показал, что метод RGA-ПЦР никогда не был использован на геноме огурца. Этот метод был использован лишь на близкородственном к огурцу виде – дыне (Cucumis melo L.) (Brotman, Silberstein, Kovalski. et al., 2002).

Было выявлено, что все 10 пар праймеров обеспечивают получение полиморфных электрофоретических профилей с общим количеством амплификационных продуктов в пределах от 6 до 28. Уровень полиморфизма варьировал от 10,5% (пара праймеров XLLRf-XLLRr – 2 полиморфных фрагмента из 19 полученных) до 68,7% (пара праймеров Ptofen-s-Ptofen-as – полиморфных фрагментов из 19 общих). Наибольшее число бэндов было получено при использовании пары праймеров AS-S1. Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что LRR-, NBS- и PtoKin-содержащие последовательности обильно представлены в геноме огурца. Размер полученных амплифицированных фрагментов варьировал от 50 до 1300 п.н. В общей сумме было получено 153 фрагмента (ПЦР-продукта), из них 66 – полиморфных. Среди этих фрагментов наибольшее число продуктов было произведено с использованием пары праймеров S1-AS1, наименьшее число парой праймеров Ptokin3-Ptokin4. Праймеры, сконструированные на основе LRR и NBS – доменов амплифицируют большее общее число продуктов, чем праймеры на основе киназной области.

Средний уровень полиморфизма, полученный с использованием RGA праймеров, составил 43,1%. Таким образом, выявленный высокий уровень полиморфизма позволил нам использовать этот метод для маркирования признака устойчивости к настоящей мучнистой росе.

2.4. Анализ RGA-ПЦР.

Популяция F2 была проанализирована с помощью изученных ранее 10 пар праймеров, сконструированных на основе различных групп аналогов генов устойчивости.

При использовании пары праймеров XLLRf-r из LRR–группы был амлифицирован фрагмент, специфичный для всех проанализированных растений огурца, как устойчивых так и с промежуточной устойчивостью к мучнистой росе (рис. 3). Анализ 91 растения, восприимчивых к заболеванию, не обнаружил наличия данного фрагмента.

Рис. 3. Полиморфизм последовательностей аналогов генов устойчивости образцов огурца, полученный при проведении RGA-ПЦР с использованием пары праймеров XLLRf-r.

Клонирование и секвенирование позволило установить нуклеотидную последовательность этого фрагмента. Анализ в базе данных GenBank не выявил гомологии известным последовательностям ДНК. На основании данного сиквенса c использованием программы OLIGO 3.1. были сконструированы праймеры. Тестирование расщепляющейся популяции и образцов изогенных линий с помощью данных SCAR-праймеров выявило различия на электрофореграммах устойчивых и восприимчивых к мучнистой росе образцов огурца (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации SCAR-праймеров.

Полученный нами SCAR-маркер был успешно применен лишь на одной расщепляющийся популяции. В связи с этим SCAR-маркер может быть рекомендован для использования в селекции огурца на устойчивость к мучнистой росе только после его масштабного тестирования.

3. Оценка эффективности SSR- и STS-маркеров ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях.

Результаты анализа расщепления популяции F2 по устойчивости к мучнистой росе (глава 2.1.) дают основание предположить, что устойчивость к этой болезни контролируется локусами количественных признаков (QTL).

Проведенный недавно QTL-анализ (Sakata с сотр., 2006, LIU LongZhou с сотр., 2008) также указывает на количественный характер наследования признака устойчивости. Для проверки этой гипотезы мы провели оценку эффективности STS- и SSR-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе (Sakata с сотр., 2006), на наших популяциях.

Продукты амплификации были получены для 7 из использованных маркеров. Размер продуктов, амплифицируемых у изучаемых образцов, соответствовал литературным данным, кроме маркера EAAGMCAG154STS.

Для этого маркера продукт амплификации должен составлять 134 п.н. Однако, в нашем эксперименте у всех образцов были амплифицированы два продукта размером 270 и 290 п.н.

Праймеры маркеров EAACMCAC391-395STS, C162, C31, C80 (рис.5) обеспечили амплификацию одного фрагмента размером 140 п.н., 269 п.н., п.н. и 201 п.н. соответственно у всех изученных образцов.

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера C80.

Маркер EACMCTG116STS (рис.6) амплифицировал фрагмент размером 95 п.н. у образцов с полной и промежуточной устойчивостью. У неустойчивых образцов амплификация отсутствовала.

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера EACMCTG116STS.

Маркер EAAGMCAT280-282STS амплифицировал 2 полиморфных фрагмента размером 230 и 270 п.н. Фрагмент размером 230 п.н.

амплифицировался у устойчивых, а фрагмент 270 п.н. - у восприимчивых к мучнистой росе образцов. У образцов с промежуточной устойчивостью амплифицировались оба фрагмента.

Наши результаты близки к результатам, полученным китайскими коллегами, которые использовали маркер EAAGMCAT280-282STS на своей популяции (LongZhou et al., 2008). Авторами было показано, что EAAGMCAT280-282STS входил в один из QTL.

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера EAAGMCAT280-282STS. 1 – ИЛ1, 2 – неустойчивая родительская форма популяции F2, 3 – образец с промежуточной устойчивостью, 4, 5, 6 – неустойчивые образцы популяции F2, 7– неустойчивая родительская форма популяции F2, 8 – ИЛ2, 9 устойчивая родительская форма популяции F2;

М – маркер молекулярных размеров.

Проанализировав все опубликованные маркеры из QTL-устойчивости (Sakata с сотр., 2006), мы выявили, что только два из них, а именно EAAGMCAT280-282STS и EACMCTG116STS, пригодны для оценки на устойчивость к мучнистой росе. Причина этого, возможно, кроется в различии донора устойчивости, используемого Sakata с сотр. и нами, а также в различиях расового состава возбудителя.

Таким образом, на основании полученных результатов, мы можем рекомендовать выявленные маркеры для оценки устойчивости исходного материала и сортов огурца: EACMCTG116STS – как доминантный маркер устойчивости к мучнистой росе, EAAGMCAT280-282STS – как кодоминантный маркер устойчивости к мучнистой росе.

4. Разработка эффективной системы оценки уровня гибридности гибридов F1 на основе SSR–маркеров.

Целью работы являлось создание эффективной системы оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов огурца на основе молекулярно генетического полиморфизма микросателлитных локусов ДНК. Подобная система должна удовлетворять таким требованиям как воспроизводимость результатов, доступность методики, быстрое получение результатов, высокая пропускная способность и низкая себестоимость. Создание такой системы предусматривало решение следующих задач:

1. поиск надежного экспресс-метода выделения ДНК;

2. оптимизация условий амплификации SSR-ПЦР;

3. поиск маркеров с кодоминантным типом наследования, способных надежно определять гибридную природу образцов огурца.

4.1. Поиск надежного экспресс-метода выделения ДНК.

Поиск экспресс-метода выделения ДНК был основан на следующих принципах: процедура экстракции должна приводить к получению достаточного количества высокоочищенной ДНК;

метод получения должен быть нетрудоемким, дешевым, и, по возможности, не включать опасных для здоровья человека химических реагентов.

Нами были протестированы 5 различных методик выделения ДНК.

В качестве наиболее пригодного растительного материала были выбраны семядольные листья 4-5-дневных проростков огурца, так как их получение возможно в лабораторных условиях в любое время года. Качество экстрагированной ДНК определяли спектрофотометрическим методом и по выходу ПЦР-продукта. В результате исследований установлено, что наиболее оптимальной методикой, удовлетворяющей заданным требованиям является метод предложенный Hong et al,1992.

4. 2. Оптимизация условий амплификации SSR-ПЦР.

Был проведен ряд экспериментов по оптимизации условий амплификации и подобрана оптимальная температура отжига для каждой из пар праймеров.

4. 3. Анализ SSR-ПЦР.

В результате проведенной SSR-ПЦР было показано, что все 19 пар праймеров амплифицировали фрагменты ожидаемой длины у всех изученных генотипов огурца. Профили электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК гибридов сравнивали с родительскими. Выбор праймеров для подобного анализа базируется на выявлении полиморфизма у исходных родительских форм и идентификации их потомства по сумме амплифицированных фрагментов. В нашем исследовании было выявлено 4 пары праймеров, которые обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов.

Праймеры SSR-маркеров FLK01, F03, 1S, GA09 амплифицировали по полиморфных фрагмента у различных гибридов. Так, с использованием праймеров SSR-маркера F03 у гибридов 49, 46, 54, 60, 99 были амплифицированы два фрагмента размером 230 и 260 п.н. Праймеры SSR маркера FLK01 амплифицировали два фрагмента размером 300 и 320 п.н., у гибридов F1 Кураж, Атлет, гибридов под номерами 47, 50, 57, 58, 59, 68, 98, а также у гибридов в комбинациях ГК1, ГК2, ГК3. У родительских форм гибридных комбинаций было получено по одному фрагменту. Праймеры SSR маркера 1S амплифицировали по одному фрагменту размером 180 и 220 п.н. у родительских форм гибридных комбинаций ГК1, ГК2, соответственно, и оба этих фрагмента у их гибридов. Праймеры SSR-маркера GA09 амплифицировали два фрагмента размером 300 и 330 п.н. у гибридов под номерами 60 и 61, а также у гибридов F1 Карим и Айкас.

Таким образом, показана эффективность применения SSR-маркеров F03, FLK01, 1S, GA09 для оценки уровня гибридности 20 из исследованных гибрида F1.

Рис.8. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера FLK1.

РФ1 и РФ2 – исходные родительские линии ГК3.

На основе полученных данных, для вышеперечисленных гибридов F создана эффективная система оценки уровня гибридности, включающая в себя оптимизированные методы экспресс-выделения ДНК и SSR-ПЦР с визуализацией результатов в 2%-ом агарозном геле. Данные маркеры обладают кодоминантным типом наследования и способны надежно определять гибридную природу данных образцов.

ВЫВОДЫ 1. Изучен полиморфизм межмикросателлитных последовательностей генома огурца. Уровень полиморфизма варьировал от 10% до 83%. Праймер К28 ([GT]8A) обеспечил самый высокий уровень полиморфизма.

2. С использованием RGA-ПЦР (праймеры XLLRf-XLLRr) амплифицирован фрагмент, специфичный для растений огурца с полной и промежуточной устойчивостью. На основе ДНК-последовательности этого фрагмента созданы SCAR-праймеры.

3. Микроскопический анализ особенностей анатомии и морфологии плодовых тел гриба (клейстотециев) показал, что все исследованные образцы были поражены только одним возбудителем мучнистой росы, а именно Podosphaera xanthii.

4. Анализ расщепления популяции F2, полученной от скрещивания устойчивых и восприимчивых форм огурца, выявил, что устойчивость к мучнистой росе, вызываемой Podosphaera xanthii обусловлена наличием доминантного гена и гена-супрессора.

5. Показана эффективность использования для оценки устойчивости исходного материала и сортов огурца двух STS- маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе. (EACMCTG116STS – как доминантного и EAAGMCAT280-282STS – как кодоминантного).

6. Разработана эффективная система оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов F1 огурца на основе SSR–маркеров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Сахарова А. Изучение генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) с помощью ДНК-маркеров. / Системная биология и биоинженерия. Материалы международной школы-конференции молодых ученых, Москва: МАКС Пресс, 2005, С. 208.

2. Сахарова А.Н., Карлов Г.И., Хрусталева Л.И. Изучение аналогов генов устойчивости к настоящей мучнистой росе у огурца. // Научный журнал «Вестник» Брянской ГСХА, 2006, С. 3 – 10.

3. Байназарова А.Н., Карлов Г.И., Хрусталева Л.И. Изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) с помощью ISSR маркеров. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2007, № 1, С. 56-60.

4. Байназарова А.Н., Карлов Г.И., Хрусталева Л.И. Маркирование гена устойчивости огурца к мучнистой росе./ Материалы Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова – фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», 27 – 28 ноября 2007 г., М.:

ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007, С. 138 – 139.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК № 02.740.11.0286 и с использованием оборудования ЦКП.