Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию f-актина

На правах рукописи

ПИВОВАРОВА Анастасия Викторовна Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Дмитрий Иванович Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сергей Сергеевич Шишкин доктор биологических наук, профессор Евгений Николаевич Добров

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится октября года в часов на заседании «30» 2008 _ диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу:

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « 25 » сентября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актин – один из наиболее распространенных белков в природе.

Образуемые им филаменты (F-актин) являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, где содержание актина очень высоко, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения. Различные неблагоприятные условия (такие, как тепловой шок) могут приводить к денатурации актина и его последующей агрегации. Накопление агрегированного белка представляет серьезную угрозу для клетки и это особенно опасно в случае белков, представленных в большом количестве, – таких как актин. Для предотвращения формирования нерастворимых белковых агрегатов в клетке существуют различные механизмы, одним из которых является экспрессия малых белков теплового шока (sHSP).

sHSP – большая и гетерогенная группа белков с молекулярными массами от 12 до кДа, характерной особенностью которых является наличие консервативного участка (-кристаллинового домена) в С-концевой части. Многие sHSP образуют большие олигомерные комплексы, которые могут различаться по структуре и количеству мономеров. Было показано, что in vitro они могут функционировать как молекулярные шапероны и предотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков, причем эта их способность зависит от четвертичной структуры sHSP. В клетках многие sHSP подвергаются фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что сопровождается изменением их олигомерного состояния и шаперонной активности.

К настоящему времени в литературе накоплен огромный материал о защитном действии sHSP на агрегацию различных белков-мишеней в процессе их денатурации. При этом, однако, конкретный молекулярный механизм такого шаперонного действия sHSP оставался зачастую совершенно неясным. Так, например, не было однозначного ответа на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP:

влияют ли они на денатурацию белка-мишени, приводящую к его агрегации, или же лишь препятствуют агрегации частично или полностью денатурированного белка. Многие авторы, наблюдая in vitro лишь подавление агрегации различных белков-мишеней малыми белками теплового шока, делали вывод о том, что sHSP препятствуют денатурации исследуемого белка, не имея на то достаточных оснований.

В ответ на различные неблагоприятные воздействия, такие как тепловой шок, экспрессия некоторых sHSP (B-кристаллин, Hsp27) значительно увеличивается, и их наибольшее количество обнаруживается именно в мышечных тканях, где содержание актина также очень велико. Можно предположить, что одна из функций таких sHSP заключается во взаимодействии с актином. В ряде исследований были сделаны попытки проанализировать взаимодействие некоторых sHSP (B-кристаллин, Hsp27, Hsp20) с нативными актиновыми филаментами. Результаты этих исследований, однако, весьма противоречивы и не подтверждают того, что sHSP могут связываться с нативным F актином. Было показано, что в ответ на стресс sHSP могут перемещаться из цитозоля и локализоваться в области цитоскелета, причем такое перемещение может приводить к стабилизации актиновых филаментов. Исходя из этих данных, более вероятным кажется предположение, что sHSP взаимодействуют с актином только при неблагоприятных условиях, таких как тепловой шок, но конкретный молекулярный механизм этого взаимодействия оставался до недавнего времени совершенно неясным. В частности, оставалось неясным, способны ли sHSP взаимодействовать с нативными актиновыми филаментами и оказывать влияние на их денатурацию. Все еще оставалось неизвестным, какую роль в защите актина от агрегации может играть фосфорилирование sHSP и их олигомерное состояние. Выяснение этих вопросов и составило главную цель данной диссертационной работы.

Цель и задачи работы. Итак, целью работы было детальное изучение защитного действия малых белков теплового шока на агрегацию актиновых филаментов, вызываемую их тепловой денатурацией. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние sHSP на тепловую денатурацию F-актина.

2. Проанализировать процесс агрегации F-актина при его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии sHSP.

3. Сравнить шаперонные свойства нефосфорилированного малого белка теплового шока и его мутантной формы, имитирующей фосфорилирование.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Малые белки теплового шока эффективно защищают актиновые филаменты от агрегации, вызываемой тепловой денатурацией, но при этом они не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не оказывают влияния на сам процесс тепловой денатурации F-актина.

2. Защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов малых белков теплового шока с денатурированным актином.

3. Исходное олигомерное состояние малых белков теплового шока, определяемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность sHSP предотвращать агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации и образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.

Научная новизна. Разработан новый подход на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для исследования взаимодействия sHSP с F-актином в процессе его тепловой денатурации. Впервые удалось получить ответ на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP, – а именно выяснить, что они предотвращают тепловую агрегацию белка мишени, но не препятствуют его тепловой денатурации, предшествующей агрегации.

Установлено, что защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. При совместном использовании методов ДСК, динамического светорассеяния, седиментационного и флуоресцентного анализа проведены исследования свойств таких комплексов. Показано, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP, вызываемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность sHSP образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином. Получены данные, впервые позволяющие описать механизм защиты актинового цитоскелета от аморфной агрегации, приводящей к гибели клеток при различных неблагоприятных воздействиях.

Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют знания в области механизма, лежащего в основе шаперонной активности sHSP, и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии. Разработанный нами экспериментальный подход – параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации F-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии sHSP, может использоваться (и уже успешно используется) для изучения взаимодействия sHSP с другими белками-мишенями.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2004;

2006;

2008), на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005» (г. Москва, 2005), на 33-й, 34-й и 35-й Европейских мышечных конференциях (о. Эльба, Италия, 2004;

г. Дебрецен, Венгрия, 2005;

г. Гейдельберг, Германия, 2006), на 30-м Международном конгрессе FEBS (г.

Будапешт, Венгрия, 2005), на 2-ой Международной конференции по проблемам стресса (г.

Будапешт, Венгрия, 2007) и на конкурсе лучших научных работ, выполненных в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2005 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ ( статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников). Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 35 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах F-актина и малых белков теплового шока, а также анализируются имеющиеся в литературе данные о взаимодействии между этими белками.

Материалы и методы исследования Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации. За час до использования мономерный G-актин полимеризовали, добавляя MgCl2 до конечной концентрации 2 мМ, и использовали в F форме. Рекомбинантные малые белки теплового шока Hsp25-wt (белок дикого типа), Hsp25-3D (мутант с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 77 и 81 на остатки аспарагиновой кислоты), Hsp27-wt, Hsp27-3D (мутант с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты) и Hsp20 были любезно предоставлены профессором Н.Б.

Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова).

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Все эксперименты проводили в буфере 30 мМ Hepes/KOH (pH 7,3), содержащем 1 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl (или KCl). Для получения кривых теплопоглощения препарат белка или смеси белков с концентрацией 0,5–3,0 мг/мл в соответствующем буфере помещали в ячейку прибора и прогревали со скоростью 1–2oC в минуту с 10 до 90оС при постоянном давлении 2,2 атм. Базовую линию записывали, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения образцов проводили их повторное сканирование.

Для обработки и анализа кривых теплопоглощения изученных белков использовали пакеты программного обеспечения “Origin 1.16” и “Origin 7.0” фирмы “MicroCal” (США).

Калориметрическую энтальпию (Нcal) определяли как площадь под пиком теплопоглощения.

Процесс тепловой агрегации F-актина контролировали, регистрируя температурные зависимости светорассеяния F-актина как в присутствии, так и в отсутствие sHSP.

Светорассеяние измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Varian), инкубируя образец при постоянной температуре 43oC или нагревая его с постоянной скоростью 1°С в минуту от 25°С до 75–90°С при скрещенных монохроматорах и длине волны 350 нм.

Одним из методов, используемых для характеристики формы и размера макромолекул в растворе, является аналитическое ультрацентрифугирование. Опыты по седиментации проводили на аналитической ультрацентрифуге «Beckman» модели Е.

Образцы белков центрифугировали в роторе на 6 двухсекторных ячеек с использованием контрбаланса. Через определенные промежутки времени после достижения скорости вращения ротора 30000, 40000 или 56000 об/мин регистрировали распределение вещества, поглощающего при 290 нм, по длине ячейки. Для получения данных в цифровом виде было использовано программное обеспечение, разработанное А.Г. Жаровым (www.ADClab.ru). Для определения коэффициента седиментации и коэффициента диффузии использовали уравнение Ламма, моделирующее распределение вещества в секторной ячейке при ультрацентрифугировании. Для решения этого уравнения и анализа получаемых седиментограмм использовали программу SEDFIT (http://www.analyticalultracentrifugation.com).

Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС) широко используется для определения размеров наночастиц в анализируемой суспензии по измерению динамики флуктуаций (колебаний) интенсивности рассеянного света. Исследования проводили при помощи коммерческой установки фотометра рассеянного лазерного света Photocor (Photocor Instruments Inc., USA;

www.photocor.com), с He–Ne лазером мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632,8 нм. Сигнал светорассеяния от образца наблюдали под углом 90о. Температуру образца можно контролировать при помощи ПИД регулятора с (пропорционально-интегрально-дифференциального) PhotoCor-TC, точностью до ± 0,1°C;

такой регулятор позволяет также осуществлять нагрев образца с постоянной скоростью. Анализ данных и контроль работы прибора выполняли с помощью программы PhotoCor версии 5.3.3. Анализ корреляционных функций для полидисперсных частиц проводили при помощи программного обеспечения DynaLS (Alango, Израиль), версия 2.5.2.

При центрифугировании на больших скоростях филаменты актина осаждаются.

Если в растворе есть небольшие молекулы, способные связываться с актиновыми филаментами, то они также будут обнаруживаться в осадках вместе с ними.

Следовательно, анализируя осадки и супернатанты после ультрацентрифугирования, можно делать выводы о способности небольших белков взаимодействовать с F-актином.

Для проведения таких экспериментов по соосаждению использовали ультрацентрифугу Airfuge фирмы «Beckman» с ротором 18о. Подготовленные растворы белков объемом 100– 200 мкл центрифугировали в течение 20 минут при 140000 g. Затем отбирали супернатанты, а осадки суспендировали в буфере того же объема, что и исходный объем образца. Содержание белков в супернатантах и осадках анализировали при помощи SDS электрофореза в полиакриламидном геле.

Белковый состав проб анализировали методом вертикального SDS-электрофореза по методу Лэммли. В работе использовали 13% и 15% разделяющие гели. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean 3 Сell (Bio-Rad) при постоянном напряжении 200 В. Гель окрашивали раствором Кумасси R-250. Полученные гели сканировали, используя планшетный сканер Umax Astra 6700. Электрофореграммы обрабатывали с помощью программы ImageQuant 5.2.

Для изучения взаимодействия денатурированного актина с Hsp27-3D методом гель фильтрации использовали колонку Superdex 200 HR 10/30 (хроматограф ACTA FPLC, Amersham Pharmacia Biotech). Для этого на колонку Superdex 200, уравновешенную буфером 30 мМ Hepes/КОН (рН 7,3), содержащим 1 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl, наносили растворы белков объемом 500 мкл и затем элюировали со скоростью 0,5 мл/мин.

Основные результаты и их обсуждение Исследование процессов тепловой денатурации F-актина и малых белков теплового шока.

Известно, что температура максимума тепловой денатурации (Tm), измеряемая методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), для F-актина может варьировать в зависимости от условий проведения эксперимента, таких как концентрация белка, концентрация добавленных нуклеотидов и скорость прогрева, и находится в пределах 58–67оС. В природных условиях такая высокая температура может привести к гибели клетки. В работах, посвященных изучению функционирования живых организмов в условиях теплового шока, как правило, используют инкубацию при температурах 42–43оС.

Для того чтобы понять, как условия теплового шока влияют на актиновые Доля денатурированного F-актина, % Доля филаменты, мы провели следующий денатурированного белка эксперимент. F-актин в концентрации 1 мг/мл Светорассеяние, отн. ед.

Светорассеяние инкубировали при постоянной температуре 43оС, через разные периоды времени отбирая аликвоты и исследуя их методом ДСК. Для того, чтобы оценить долю денатурированного актина, мы из значения энтальпии (площади под кривой теплопоглощения) для нативного белка (H0 = 411 кДж/моль) вычитали 0 1 2 3 4 5 6 7 8 о Время инкубации при 43 С, часы значения энтальпии прогретого белка для Рис. 1. Зависимости тепловой агрегации каждого момента времени, а затем F-актина, измеренной по приросту полученные величины делили на H0.

светорассеяния, и доли денатуриро Параллельно с экспериментом по ДСК мы ванного белка, измеренной методом ДСК, от времени инкубации F-актина при 43оС. регистрировали процесс вызываемой денатурацией агрегации F-актина, инкубируемого при 43оС, снимая зависимость светорассеяния от времени в непрерывном режиме. Мы сопоставили кривую агрегации и график увеличения доли денатурированного белка от времени (рис. 1);

оказалось, что они очень хорошо коррелируют между собой. То есть, действительно, в условиях теплового шока актиновые филаменты вполне могут, подвергаться тепловой денатурации и последующей агрегации (хотя и довольно медленно).

Мы также провели серию контрольных экспериментов по исследованию тепловой денатурации различных sHSP. В таблице 1 приведены основные калориметрические характеристики для различных sHSP. Кооперативность тепловых переходов для всех малых белков теплового шока была невысокой. Полученные результаты хорошо согласуются с известными из литературы данными для некоторых sHSP.

Таблица 1. Характеристики тепловой денатурации различных sHSP, полученные методом ДСК.

Tm, oC Белок Обратимость тепловой денатурации -кристаллин 60,3 ~50% Полностью обратима Hsp27-wt 70, Полностью обратима Hsp27-3D 70, Необратима Hsp20 63, Плавится некооперативно Hsp Помимо этого, провели сравнительный анализ тепловой денатурации Hsp27 дикого типа (Hsp27-wt) и его мутантной формы с заменой трех остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты, в дальнейшем именуемого Hsp27-3D. Эти мутации, как было показано ранее, имитируют фосфорилирование Hsp27 под действием MAPKAP2 киназы, происходящее in vivo при воздействии неблагоприятных факторов и в условиях стресса. Нам не удалось обнаружить заметных различий в характере тепловой денатурации между Hsp27-wt и Hsp27-3D, что свидетельствует об отсутствии существенных различий в третичной структуре этих белков.

Для ответа на вопрос, способны ли sHSP влиять на процесс тепловой денатурации F актина, мы воспользовались методом ДСК. Для этого мы снимали кривые теплопоглощения F-актина в отсутствие и в присутствии различных sHSP;

здесь представлен эксперимент с Hsp27-3D (рис. 2А). Максимум теплового перехода F-актина в отсутствие sHSP приходился на 62оС и его денатурация была полностью необратимой. При исследовании тепловой денатурации F-актина в присутствии sHSP были получены следующие результаты. Смесь F-актина и Hsp27-3D давала точно такую же калориметрическую кривую, что и изолированный актин: максимум теплового перехода F актина не менял своего положения, а пик, соответствующий тепловой денатурации F актина, не менял своей формы (рис. 2А). Исходя из этих результатов, мы можем сделать вывод о том, что добавление малых белков теплового шока никак не влияет на тепловую денатурацию актиновых филаментов. Интересно, что на термограмме тепловой денатурации F-актина в присутствии Hsp27-3D пик, соответствующий денатурации самого Hsp27-3D, никак не проявлялся (рис. 2А). Однако в случае денатурации F-актина в присутствии Hsp25-wt нам удалось заметить небольшой дополнительный тепловой переход при температурах выше 80оС. Не исключено, что взаимодействие с денатурированным актином изменяет термостабильность малых белков теплового шока, защищая их от тепловой Теплопоглощение, µW А денатурации, которая происходит в этом 5 µW случае при более высоких температурах и менее кооперативно.

Рис. 2. Температурные зависимости тепловой денатурации регистрируемой F-актина, методом ДСК (А), и вызываемой ею агрегации, регистрируемой по приросту светорассеяния (Б). Изолированный F-актин (1 мг/мл) (1), Светорассеяние, отн. ед.

Б изолированный Hsp27-3D (1 мг/мл) (2) и F актин (1 мг/мл) в присутствии Hsp27-3D (0, мг/мл) (3) прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин и получали кривые тепловой денатурации или агрегации методами ДСК (А) или светорассеяния (Б).

Для анализа влияния sHSP на агрегацию 30 40 50 60 70 80 90 o Температура, C F-актина, вызываемую его тепловой денатурацией, мы одновременно с изучением тепловой денатурации F-актина методом ДСК исследовали температурные зависимости светорассеяния в тех же самых условиях, используя те же самые растворы белков, и с такой же скоростью прогрева. Результаты такого совместного эксперимента представлены на рис. 2. Хорошо видно, что в отсутствие малых белков теплового шока F актин начинает агрегировать при температурах выше 55оС, а видимая температура полуперехода составляет приблизительно 62оС, что очень хорошо коррелирует с максимумом теплового перехода на кривых ДСК. В присутствии же Hsp27-3D начало агрегации заметно смещается в сторону более высоких температур, вплоть до 80оС, а полупереход – до ~85оС (рис. 2Б). Таким образом, нам удалось показать, что sHSP эффективно защищают F-актин от агрегации, вызываемой нагреванием, сдвигая кривую температурной зависимости светорассеяния F-актина в сторону более высоких температур.

Отметим, что добавление sHSP к пробе, содержащей предварительно прогретый денатурированный и агрегированный F-актин, не приводило к снижению уровня светорассеяния. Это свидетельствует о том, что sHSP препятствуют агрегации денатурированного белка, но не могут разбирать уже сформированные агрегаты.

Влияние малых белков теплового шока на агрегацию F-актина, вызываемую нагреванием Для того, чтобы более подробно изучить влияние sHSP на агрегацию F-актина, вызываемую нагреванием, мы провели серию экспериментов по изучению температурных зависимостей светорассеяния F-актина в отсутствие и в присутствии разных sHSP в A Hsp27-wt различных концентрациях. Условия во всех экспериментах были одинаковыми 100 (30 мМ Hepes, 100 мМ KCl, 2 мМ -МЭ, pH 7,3). Прогрев проводили со скоростью Светорассеяние, отн. ед.

1оС/мин или 2оС/мин при концентрации актина, равной 0,25 или 1 мг/мл.

0 Характерные результаты (на примере Hsp27-3D и Hsp27-wt), представлены на Б 250 Hsp27-3D рис. 3. В отсутствие малых белков 200 теплового шока начинает F-актин агрегировать при температуре ~55оС, а 100 наблюдаемая (кажущаяся) температура полуперехода составляет приблизительно 57оС, тогда как в присутствии sHSP температура начала агрегации заметно 30 40 50 60 70 80 o Температура, C смещается в сторону более высоких значений, вплоть до 80оС, а кажущаяся Рис. 3. Зависимость светорассеяния F-актина температура полуперехода – до ~85оС.

от температуры в отсутствие и в присутствии Hsp27-wt (А) или Hsp27-3D (Б) в различных К сожалению, за агрегацией F-актина концентрациях. Концентрация F-актина следует процесс преципитации – составляла 0,25 мг/мл (А) или 1 мг/мл (Б). F актин прогревали с постоянной скоростью образуются огромные белковые агрегаты, 2оС/мин в отсутствие (кривая 1) или в которые оседают на дно кюветы. В присутствии Hsp27 (кривые 2–4). Весовое соотношение F-актин/Hsp27 составляло 12, 6 и результате при измерениях светорассеяния 3 для кривых 2, 3 и 4, соответственно.

невозможно наблюдать полную кривую агрегации, и, следовательно, нельзя определить точные температуры полупереходов и коэффициенты кооперативности кривых. Тем не менее, на качественном уровне очень хорошо видно, что sHSP эффективно защищают F-актин от агрегации, вызываемой нагреванием, сдвигая кривую температурной зависимости светорассеяния F-актина в сторону более высоких температур.

Необходимо отметить, что этот эффект довольно кооперативный, т. к. он наблюдается при достаточно высоких весовых соотношениях F-актин/sHSP. Для Hsp27-wt и Hsp27-3D тепловая агрегация актина подавлялась уже при весовом соотношении F-актин/sHSP, равном 12/1, что соответствует молярному соотношению F-актин/sHSP, равном ~6/1 (из расчета на мономеры белков). Важно добавить, что результаты, полученные для малых белков теплового шока дикого типа, не отличаются от результатов для их мутантов, имитирующих фосфорилирование этих белков (рис. 3). Таким образом, фосфорилирование sHSP (или его имитация) не оказывает, скорее всего, существенного влияния на их способность защищать актиновые филаменты от агрегации, вызываемой тепловой денатурацией актина.

Результаты описанных выше экспериментов наглядно свидетельствуют о том, что малые белки теплового шока не влияют на тепловую денатурацию F-актина, но эффективно защищают денатурированный белок от последующей агрегации. Это наводит на мысль о том, что эти белки способны связываться лишь с денатурированным актином, но не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами. Для проверки этого предположения и выяснения механизма взаимодействия F-актина с малыми белками теплового шока нами были проведены эксперименты по соосаждению этих белков с F актином после прогрева до определенных температур (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграммы, представляющие распределение белков (актин и Hsp27-3D) в супернатантах (с) и осадках (о) после прогрева F-актина (1 мг/мл) в отсутствие (А) или в присутствии Hsp27-3D (0,33 мг/мл) (Б) до определенной температуры. В обоих случаях пробы прогревали со скоростью 1оС/мин, при температурах 25, 75 и 90оС отбирали аликвоты, центрифугировали их в течение 15 мин при 140000g, после чего методом SDS-ПААГ электрофореза определяли содержание актина и Hsp27-3D в осадках и супернатантах.

Препараты F-актина (1 мг/мл) в отсутствие и в присутствии малых белков теплового шока прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин в кюветах флуориметра, регистрируя зависимость светорассеяния от температуры. При определенных температурах отбирали аликвоты белковых проб, охлаждали их и подвергали ультрацентрифугированию при 140000g, после чего методом SDS-электрофореза исследовали содержание актина и sHSP в осадках и супернатантах (рис. 4). Как и ожидалось, в отсутствие sHSP нативные актиновые филаменты при комнатной температуре почти полностью обнаруживались в осадке. После прогрева до температуры 70оС и выше изолированный актин полностью денатурировал и агрегировал. Таким образом, в отсутствие sHSP актин всегда обнаруживался в осажденной фракции (рис. 4А). Затем мы исследовали соосаждение F-актина с Hsp27-3D (0,33 мг/мл) Необходимо отметить, что сам по себе Hsp27-3D, существующий главным образом в виде небольших димеров или тетрамеров, не агрегирует при тепловой денатурации и в условиях данного эксперимента не осаждается ни при комнатной температуре, ни после прогрева.

При комнатной температуре практически весь Hsp27-3D находился в супернатанте, а почти весь F-актин – в осадке (рис. 4Б), то есть в разных фракциях. Это свидетельствует о том, что малые белки теплового шока не связываются с нативными актиновыми филаментами. После прогрева до 90оС как актин, так и Hsp27-3D обнаруживаются в осадке (рис. 4Б);

это значит, что взаимодействие этих белков происходит после денатурации F актина. Этот результат вполне согласуется с современными представлениями о механизме работы малых белков теплового шока: они взаимодействуют с денатурированным белком субстратом за счет гидрофобных контактов.

В этом же эксперименте был получен неожиданный интересный эффект – после прогрева до 70оC более 70% актина и почти весь Hsp27-3D одновременно обнаруживались в супернатанте (рис. 4Б). Полученные данные наводят на мысль о том, что после прогрева до 70–75оС малые белки теплового шока образуют с денатурированным актином комплексы, которые не осаждаются при кратковременном высокоскоростном центрифугировании. В этих комплексах актин присутствует уже не в виде филаментов F актина, которые полностью осаждаются при ультрацентрифугировании. Это вполне согласуется с предложенной недавно моделью тепловой денатурации F-актина, согласно которой перед денатурацией происходит диссоциация актиновых филаментов на мономеры или короткие олигомеры. По-видимому, именно эти короткие олигомеры связываются с малыми белками теплового шока, которые защищают их от агрегации, – в результате образуются растворимые комплексы, не осаждающиеся при ультрацентрифугировании. Для исследования характеристик этих комплексов, таких как их размеры и стехиометрия, мы провели дополнительные исследования методами скоростной седиментации, гель-фильтрации и динамического светорассеяния.

Изучение свойств растворимых комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с денатурированным актином.

Для более подробного исследования влияния малых белков теплового шока на агрегацию F-актина, вызываемую его тепловой денатурацией, мы воспользовались рядом аналитических методов. В этой серии экспериментов мы использовали малый белок теплового шока Hsp27-3D. Наш выбор обусловлен тем, что этот белок существует в виде небольших однородных олигомеров (димеров или тетрамеров) – в отличие от Hsp27-wt и многих других sHSP, которые формируют большие, неоднородные по размерам комплексы.

Метод динамического светорассеяния (ДЛС) хорошо применим для оценки размеров частиц, формируемых в процессе тепловой агрегации белка. Мы проводили эксперименты методом ДЛС в тех же условиях и при той же скорости прогрева, что и описанные выше эксперименты по тепловой денатурации, регистрируемой методом ДСК, за исключением того, что использовали более низкие концентрации F-актина (0,5 мг/мл). В этих условиях денатурация F-актина происходит в температурном интервале 55–70оС с максимумом теплового перехода при 61оС. До начала тепловой денатурации, то есть при температурах ниже 55оС, для F-актина наблюдается широкое случайное распределение значений гидродинамического радиуса (Rh) – от 10 до 1000 нм (Рис. 5А и 6A). Определить точные значения Rh для длинных актиновых филаментов разного размера практически невозможно. В отсутствие малых белков теплового шока тепловая денатурация F-актина приводит к образованию очень больших агрегатов со значениями Rh вплоть до 10 мкм (рис.

6Б). Напротив, в присутствии Hsp27-3D тепловая денатурация F-актина сопровождалась полным исчезновением компонент с высокими значениями Rh: мы наблюдали наличие лишь небольших частиц с Rh ~17 нм (Рис. 5А, 6Б). Размеры этих комплексов почти не менялись при прогреве вплоть до 80оС и увеличивались лишь при дальнейшем прогреве.

Так, после прогрева до 84оС значение Rh вырастало до 40–50 нм (рис. 5А). Важно отметить, что это значение Rh для комплексов не менялось после охлаждения до 25оС (Рис. 6Б).

Этот факт имеет большое А Б значение, так как говорит о том, что сформированные комплексы Rh, нм денатурированного актина с Rh, нм малыми белками теплового шока достаточно стабильны и уже не меняют своих размеров в o 70 C зависимости от температуры и с течением времени.

30 40 50 60 70 o Время инкубации Температура, C o при 25 C, мин Рис. 5. Формирование комплексов денатурированного актина с Hsp27 3D, регистрируемое методом ДЛС в процессе тепловой денатурации F-актина. (А) F-актин (0, мг/мл) прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин в присутствии Hsp27-3D (0,125 мг/мл) и строили температурную зависимость значений гидродинамического радиуса частиц (Rh), получаемых в процессе прогрева. (Б) После того, как образец прогрели до 85оС, его остудили до 25оС и построили зависимость значений Rh от времени инкубации при 25оС.

Рис. 6. Распределения частиц по размеру (Rh) для F актина (0,5 мг/мл) в отсутствие и в присутствии 0. Hsp27-3D (0,125 мг/мл), зарегистрированные Относительная интенсивность F-актин А методом ДЛС до начала денатурации (при температуре 30–35оС) (А) и после полной тепловой F-актин 0. + Hsp27-3D денатурации F-актина (при 70оС) (Б). Каждый график был получен как среднее значение из 0. распределений, полученных в температурном интервале 30–35оС на рис. 5А (А) или 0. распределений, полученных в интервале 69–71оС (Б).

0. 0. Сходные эксперименты с использованием F-актин 0. Относительная интенсивность метода ДЛС проводили в условиях, при которых Б F-актин + Hsp27-3D F-актин с постоянной концентрацией 0,5 мг/мл 0. прогревали до 70оС в присутствии Hsp27-3D при 0. различных его концентрациях – от 0,015 до 0, мг/мл (рис. 7). Хорошо прослеживается 0. зависимость размеров комплексов от Rh 0. количества добавленного к образцу sHSP.

Значения Rh для комплексов Hsp27-3D с 0. денатурированным актином уменьшаются от 0 1 2 3 4 5 6 10 10 10 10 10 10 10 до 16–17 нм с увеличением концентрации Rh, нм Hsp27-3D в пробе от 0,015 до 0,125 мг/мл и затем не меняются при дальнейшем увеличении концентрации Hsp27-3D вплоть до 0, мг/мл. Этот результат позволяет предположить, что комплексы денатурированного актина с Hsp27-3D образуются при концентрациях Hsp27-3D, превышающих 0,125 мг/мл, т. е. в тех случаях, когда весовое соотношение Hsp27-3D/актин превышает 1/4.

Рис. 7. Зависимость значений Rh для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D от 1 : концентрации Hsp27-3D, добавленного в исходную смесь. Концентрация Hsp27-3D варьировала от Rh, нм 0,015 до 0,5 мг/мл, концентрация F-актина была постоянной и равной 0,5 мг/мл. Средние значения 1 : Rh рассчитывали из распределений, полученных 1: методом ДЛС при температуре 70оC. Для каждой 1:4 1: 20 1: точки указаны весовые соотношения Hsp27 3D/актин в исходной смеси Hsp27-3D с F-актином. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0. Hsp27-3D, мг/мл Итак, результаты, полученные методом ДЛС, отчетливо демонстрируют процесс формирования стабильных растворимых комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D. Размеры таких комплексов намного меньше, чем соответствующие значения для нативных актиновых филаментов и агрегатов актина, полученных в результате прогрева F-актина в отсутствие малых белков теплового шока.

Отметим, что способ оценки размеров частиц из данных динамического светорассеяния имеет ряд определенных недостатков, один из которых – довольно низкая разрешающая способность метода. Поэтому для анализа свойств комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином мы использовали гораздо более чувствительный метод аналитического ультрацентрифугирования.

Пробы, содержащие F-актин (0,5 мг/мл) в отсутствие или в присутствии Hsp27-3D в различных концентрациях (от 0,1 до 0,4 мг/мл), а также пробу, содержащую изолированный Hsp27-3D (0,4 мг/мл), прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин до 75оС, то есть до полной необратимой денатурации актина, одновременно регистрируя кривые зависимости светорассеяния от температуры. Убедившись, что в отличие от F актина, исследуемого в отсутствие sHSP, для проб, содержащих смесь F-актина и Hsp27 3D, не наблюдалось заметного увеличения светорассеяния, мы использовали эти образцы для экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию.

Прогретый до 75оС F-актин вследствие очень большого размера агрегатов осаждался еще на стадии разгона ротора, что не позволяло определить для него коэффициент седиментации. Для того, чтобы определить значения коэффициентов седиментации оставшихся полидисперсных образцов, мы воспользовались методом, предложенным Шуком. Разработанная им компьютерная программа SEDFIT позволяет выявить несколько компонентов, различающихся по величинам коэффициентов седиментации, и определить их относительное содержание. Графики распределения компонентов с различным коэффициентами седиментации для комплексов, полученных путем прогрева F-актина (0, мг/мл) до 75оС в присутствии Hsp27-3D в различных концентрациях (0,4, 0,2 и 0,1 мг/мл), а также для прогретого в тех же условиях изолированного Hsp27-3D (0,4 мг/мл) представлены на рис. 8.

Анализ седиментации прогретого Hsp27-3D демонстрирует наличие нескольких составляющих. Основной пик распределения приходится на компоненту с коэффициентом седиментации 3,1 S;

помимо нее в системе присутствуют еще две компоненты с максимумами 6,7 и 8,9 S (Рис. 8Г). Этот результат хорошо согласуется с литературными данным, в которых показано, что нативный Hsp27-3D имеет коэффициент седиментации 2,7 S, что соответствует димерам. Что касается распределения c(s, f/f0) для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D, то во всех случаях распределения были представлены набором плохо разрешенных пиков, коэффициенты седиментации которых зависели от концентрации добавленного Hsp27-3D. При самой низкой концентрации Hsp27-3D (0,1 мг/мл) образцы демонстрировали коэффициенты седиментации в пределах 10–45 S (рис. 8 В). Увеличение концентрации Hsp27-3D в два раза, до 0,2 мг/мл, привело к практически полному исчезновению фракций с коэффициентами седиментации s 30 S (рис. 8 Б). В этом случае распределение c(s, f/f0) представлено основным пиком с высокой амплитудой и максимумом при 21,6 S, и несколькими небольшими дополнительными пиками. Дальнейшее увеличение концентрации Hsp27-3D до 0,4 мг/мл привело к полному исчезновению компонент, имеющих коэффициенты седиментации выше 30 S, сужению распределения и сдвигу всей кривой в сторону более низких значений коэффициента седиментации (рис. 8А). Все распределения c(s, f/f0) для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D также содержат пик с максимумом при 3,0–3,2 S (рис. 8А–В). Этот пик отражает, скорее всего, седиментацию димеров Hsp27-3D, не связавшихся с 0. А денатурированным актином. С 0. c(s,*) увеличением концентрации Hsp27-3D в 0. пробе увеличивается и амплитуда пика с 0. максимумом в районе 3,2 S;

что 0. указывает на то, что количество свободного Hsp27-3D увеличивается с 0. Б повышением концентрации c(s,*) 0. добавленного Hsp27-3D.

0. Седиментационный анализ 8.

Рис.

0. комплексов, образуемых Hsp27-3D с денатурированным актином. Комплексы 0. В получали путем прогрева F-актина (0, c(s,*) мг/мл) до 75оС при постоянной скорости 0. 1оС/мин в присутствии Hsp27-3D при 0. разных его концентрациях: 0,1 мг/мл (А), 0, мг/мл (Б) или 0,4 мг/мл (В). На плоте (Г) 0. представлено распределение коэффициентов седиментации для изолированного Hsp27-3D 0. (0,4 мг/мл), прогретого в тех же условиях, Г c(s,*) что и остальные образцы. Ультрацентри 0. фугирование образцов проводили при скорости вращения ротора 30000 об/мин и температуре 20оС. Рассчитывали дифферен 0. циальные распределения коэффициентов 0 10 20 30 40 седиментации с(s, f/f0);

на рисунках Коэффициент седиментации, S представлены одномерные распределения по параметру s.

Проанализировав эти результаты, можно сделать вывод, что в условиях эксперимента лишь часть Hsp27-3D вовлекается в образование стабильных растворимых комплексов с денатурированным актином. Коэффициенты седиментации таких комплексов находятся в пределах 8–40 S со средним значением около 17–20 S, в зависимости от концентрации добавленного Hsp27-3D. Чем больше Hsp27-3D в пробе, тем компактнее выглядит распределение комплексов по коэффициентам седиментации и тем меньше среднее значение этих коэффициентов.

Зная общую концентрацию добавленного Hsp27-3D и определив долю свободного Hsp27-3D, мы могли бы вычислить количество Hsp27-3D, включенного в комплексы с денатурированным актином, и таким образом оценить стехиометрию Hsp27-3D/актин в этих комплексах. К сожалению, аналитическое ультрацентрифугирование не позволяет получить точные количественные данные о концентрации свободного Hsp27-3D в пробах.

Для этой цели мы воспользовались методом гель-фильтрации.

Пробы для экспериментов по гель-фильтрации готовились так же, как и для экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию, за исключением использования более высоких концентраций белков. F-актин (1,0 мг/мл) в отсутствие или в присутствии Hsp27-3D в различных концентрациях (от 0,25 до 1 мг/мл), а также изолированный Hsp27-3D (0,5 мг/мл) прогревали с постоянной скоростью 1оС/мин до 68оС, то есть до полной необратимой денатурации F-актина. После охлаждения пробы подвергали ультрацентрифугированию (20 мин при 140000 g) для того, чтобы избавиться от белковых агрегатов. Cупернатанты отбирали и использовали для эксперимента по гель фильтрации. Профили элюции нанесенных образцов представлены на рис. 9А. F-актин, прогретый до 68оС в отсутствие малых белков теплового шока, осаждался во время ультрацентрифугирования, поэтому на его профиле элюции никаких пиков не наблюдалось. В тех случаях, когда F-актин прогревали в присутствии Hsp27-3D, после проведения гель-фильтрационной хроматографии этих образцов на профилях элюции можно было обнаружить два пика (рис. 9А). Согласно данным SDS-электрофореза, первые асимметричные пики, элюировавшиеся в исключенном объеме (8–10 мл), содержали в себе как актин, так и Hsp27-3D. Это свидетельствует о том, что данные пики содержали растворимые комплексы, сформированные денатурированным актином и Hsp27-3D.

Второй пик, элюировавшийся в районе 14,2 мл (кажущиеся молекулярные массы около 100 кДа), содержал только Hsp27-3D, т. е. этот пик соответствовал свободному Hsp27-3D, не связавшемуся с денатурированным актином. Размер этого пика явно увеличивался с увеличением концентрации Hsp27-3D, добавленного в пробу (рис. 9А). Для оценки концентрации свободного Hsp27-3D, площади под соответствующими пиками элюции сопоставляли с площадью контрольного пика, полученного для Hsp27-3D (0, мг/мл), прогретого в отсутствие актина. Построив график зависимости концентрации Hsp27-3D, связанного с денатурированным актином, от общей концентрации добавленного в пробу Hsp27-3D, мы попытались определить стехиометрию сформированных комплексов. К сожалению, при постоянной концентрации F-актина (24 мкМ) и концентрации Hsp27-3D, меняющейся в пределах 0–44 мкМ, мы не смогли достичь насыщения (Рис. 9Б). Поэтому мы провели сходный эксперимент, но в несколько иных условиях: теперь мы использовали постоянную концентрацию Hsp27-3D, равную 1 мг/мл (~44 мкМ), и различные концентрации F-актина – от 0,25 до 3 мг/мл (6–70 мкМ) (рис. 10).

Да Да а а а кД 0 к 2 к кД 3 кД Рис. 9. Анализ состава комплексов Hsp27-3D с 9 428 66 денатурированным актином методом гель 1 фильтрации. Комплексы были получены при A постоянной концентрации F-актина (1 мг/мл) и различных концентрациях Hsp27-3D, как описано в тексте. (А) Одинаковые количества (500 мкл) каждого образца наносили на A280, mAu колонку для гель-фильтрации Superdex 200 HR 10/30. Кривая 1 соответствует профилю 20 элюции изолированного Hsp27-3D (0,5 мг/мл).

Кривые 2–4 соответствуют профилям элюции 2-4 комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином, полученных при концентрациях добавленного Hsp27-3D, равных 1,0, 0,5 и 0, 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 мг/мл, соответственно. (Б) Зависимость Объем элюции, мл молярной концентрации Hsp27-3D, Связанный Hsp27-3D, мкM Б связавшегося с денатурированным актином, от молярной концентрации Hsp27-3D, добавленного в исходную пробу.

Как и в предыдущем случае, на профилях элюции наблюдали по два пика 0 10 20 30 Добавленный Hsp27-3D, мкM (рис. 10А). Первый пик содержал комплексы денатурированного актина и Hsp27-3D (рис. 10Б), в то время как второй пик содержал только свободный Hsp27-3D (рис. 10В). Размеры второго пика, зависели от начальной концентрации F-актина – количество свободного Hsp27-3D увеличивалось при уменьшении концентрации добавленного F-актина;

из этих данных вполне можно было извлечь количественную информацию об Hsp27-3D, не связавшемся с актином. Как и в предыдущем эксперименте, сравнив площади под пиками элюции, соответствующими свободному Hsp27-3D (пики 3–7 на рис. 10А), с площадью контрольного пика, полученного для Hsp27-3D (1,0 мг/мл), прогретого в отсутствие F-актина (пик 2 на рис.

10А), мы смогли определить концентрации свободного Hsp27-3D, не связавшегося с актином. Концентрации Hsp27-3D, связавшегося с денатурированным актином, определяли путем вычитания концентрации свободного Hsp27-3D из исходной концентрации добавленного в пробу Hsp27-3D. Построив график зависимости концентрации связанного с актином Hsp27-3D от молярного соотношения F-актин/Hsp27 3D в исходной пробе (рис. 10Г), мы обнаружили, что кривая выходит на плато при молярных соотношениях белков 1:1. Это значит, что в состав комплексов, полученных в условиях насыщения, актин и Hsp27-3D входят в приблизительно эквимолярных концентрациях.

aa Da kD kD a D a 40 122 8 kD 3 k k 69 2 A Г Связанный Hsp27-3D, мкМ 4 A280, mAu 6 0.0 0.5 1.0 1. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 F-актин/Hsp27-3D (моль/моль) Объем элюции, мл Б В Рис. 10. Анализ состава комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином методом гель фильтрации. Комплексы были получены при постоянной концентрации Hsp27-3D (1 мг/мл) и различных концентрациях F-актина путем прогрева проб до 70оС с постоянной скоростью 1оС/мин. (А) Кривые 1 и 2 соответствует профилям элюции изолированного Hsp27-3D (0,5 мг/мл), негретого (1) и прогретого до 70оС (2). Кривые 3–7 соответствуют профилям элюции комплексов Hsp27-3D с денатурированным актином, полученных при концентрациях F-актина 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 мг/мл, соответственно. (Б) Электрофореграмма фракций, собранных с колонки при объеме элюции 8,5–9 мл. Номера дорожек соответствуют кривым на плоте (А). (В) Электрофореграмма фракций, собранных с колонки при объеме элюции 14 мл. Номера дорожек соответствуют кривым на плоте (А). (Г) Зависимость молярной концентрации Hsp27-3D, связавшегося с денатурированным актином, от молярного соотношения F-актин/Hsp27-3D в исходной пробе.

Анализируя описанные выше данные, можно предложить следующий многостадийный механизм взаимодействия Hsp27-3D с денатурированным актином.

Тепловой денатурации F-актина предшествует его диссоциация, т.е. актиновые филаменты денатурируют не целиком, а в виде небольших олигомеров, диссоциирующих с их концов.

Эти олигомеры актина легко подвергаются денатурации, которая в отсутствие sHSP сопровождается аморфной агрегацией. Именно с такими денатурированными олигомерами актина и взаимодействует Hsp27-3D, предотвращая их дальнейшую агрегацию путем образования относительно небольших стабильных растворимых комплексов (рис. 11).

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая F-актин (+) (-) механизм предотвращения агрегации F D D DD D D D DD D D D D D D D D D D D D D D D D D D DD D актина в процессе его тепловой денатурации путем образования (+) (-) комплексов с sHSP. Молекулы АДФ как D D DD D D D DD DDD DD в свободном состоянии, так и связанные DD D DD DDD DDDDD DDD с актиновыми мономерами, обозначены (-) DD D D буквой «D». Штриховкой выделены D D D D DD DD D D актиновые мономеры или короткие D D D (+) D D D DDD D DD олигомеры, отрывающиеся при D D DDD DD D нагревании с «–»-конца актинового филамента и способные присоединиться sHSP Денатурация к «+»-концу того же или другого филамента.

Агрегация Возникает вопрос – влияет ли исходное олигомерное состояние на его способность Hsp предотвращать агрегацию денатурированного актина и образовывать с ним растворимые комплексы? Для ответа на этот вопрос мы провели сравнительный анализ процессов денатурации и агрегации F-актина в присутствии Hsp27 3D, представленного главным образом небольшими димерами или тетрамерами, и белка дикого типа Hsp27-wt, существующего в виде крупных олигомеров.

Hsp27-3D Hsp27-wt Сравнение свойств комплексов, образуемых и с денатурированным актином.

Для того чтобы проанализировать и сравнить влияние Hsp27-wt и Hsp27-3D на агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации, мы провели ряд экспериментов по исследованию температурных зависимостей светорассеяния (рис. 12А), прогревая F актин в отсутствие и в присутствии Hsp27-wt или Hsp27-3D в тех же условиях и с той же скоростью (1оС/мин), что и в предыдущих экспериментах с Hsp27-3D. В отсутствие Hsp прогрев F-актина сопровождался значительным приростом светорассеяния, отражающим агрегацию белка. Для проб, содержащих F-актин и Hsp27-wt или его мутантную форму Hsp27-3D, кривые зависимости светорассеяния от температуры не имеют переходов и практически не отличаются друг от друга (рис. 12А). Это свидетельствует о том, что оба эти белка, несмотря на значительные различия в исходной олигомерной структуре, одинаково эффективно защищают F-актин от агрегации, вызываемой его тепловой денатурацией.

Температурные зависимости Рис. 12.

Светорассеяние, отн. ед.

А вызываемой тепловой денатурацией агрегации F-актина, регистрируемой по приросту светорассеяния и по (А) 3 изменениям величины гидродинамического радиуса Rh, определенной методом ДЛС (Б).

Измерения температурных зависимостей светорассеяния проводили при (А) концентрации F -актина 0,5 мг/мл в отсутствие (кривая 1) и в присутствии 0, мг/мл Hsp27-3D (кривая 2) или 0,125 мг/мл Б Температурные Hsp27-wt (кривая 3).

зависимости Rh (Б) представлены для F актина (0,5 мг/мл) в присутствии Hsp27 3D Rh, нм (0,125 мг/мл) (1) или Hsp27-wt (0,125 мг/мл) (2). Все эксперименты проводили со скоростью нагрева 1оС/мин. Вертикальная пунктирная линия соответствует температуре максимума теплового перехода для F -актина (62оС).

30 40 50 60 70 o Температура, C Для более детального исследования процесса агрегации F-актина в присутствии разных форм Hsp27 мы воспользовались методом ДЛС. Для этого исследовали температурные зависимости значений Rh для образцов, содержащих F-актин и либо Hsp27 3D, либо Hsp27-wt. Результаты эксперимента приведены на рис. 12Б. В обоих случаях до денатурации F-актин демонстрировал хаотическое распределение значений Rh в очень широком диапазоне (от 10 нм до 1000 нм), а тепловая денатурация F-актина сопровождалась полным исчезновением компонент с высокими значениями Rh: остались только небольшие частицы со значениями Rh ~17–18 нм как в случае Hsp27-3D, так и в случае Hsp27-wt (рис. 12Б).

Мы также провели серию экспериментов по определению размеров комплексов, образованных денатурированным актином и Hsp27-wt, в зависимости от концентрации добавленного Hsp27-wt. На рис. 13 сопоставлены зависимости, полученные для F-актина, прогретого в присутствии либо Hsp27-wt, либо Hsp27-3D. Мы показали, что при значениях весового соотношения Hsp27/актин меньших или равных 1/4 кривая, соответствующая комплексам денатурированного актина с Hsp27-wt, практически полностью совпадает с кривой для комплексов с Hsp27-3D. При увеличении доли Hsp27 в пробе оказалось, что значения Rh комплексов с Hsp27-wt несколько превышают соответствующие значения для комплексов с Hsp27-3D (при весовых соотношениях Hsp27/актин, равных 1/2 и 1/4, значения Rh составляли для Hsp27-wt 18,8 и 18 нм, а для Hsp27-3D – 15,9 и 16,5 нм, соответственно). Такое расхождение может быть следствием того, что при весовых соотношениях Hsp27/актин, превышающих 1/2, часть малых белков теплового шока остается несвязанной с денатурированным актином. Так как размеры олигомеров Hsp27-wt значительно превышают размеров димеров или тетрамеров Hsp27-3D, то эти свободные частицы могут давать дополнительный небольшой вклад в значения Rh, определяемые методом ДЛС.

Рис. 13. Зависимость значений Rh, измеренных методом ДЛС, для комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D или Hsp27-wt от исходной Hsp27-3D 55 1: Hsp27-wt концентрации Hsp27, добавленного в исходную смесь. Концентрации Hsp Rh, нм варьировали от 0,015 до 0,5 мг/мл, концентрация была F-актина 1:16 постоянной и составляла 0,5 мг/мл. Для каждой точки указаны весовые 1: 25 соотношения в Hsp27/F-актин 1: 1: 1: 20 исходных пробах. Средние значения Rh рассчитывали из распределений, полученных при температуре 70оC в 0.0 0.2 0.4 0.6 режиме прогрева с постоянной sHSP, мг/мл о скоростью 1 С/мин.

Таким образом, результаты экспериментов по динамическому светорассеянию свидетельствуют о том, что Hsp27-wt, подобно его мутантной форме Hsp27-3D, способен эффективно подавлять агрегацию денатурированного актина, образуя с ним небольшие растворимые комплексы.

Для более подробного сравнения свойств комплексов Hsp27-wt и Hsp27-3D с денатурированным актином мы также использовали гораздо более чувствительный метод аналитического ультрацентрифугирования. Для этих экспериментов мы использовали охлажденные пробы, полученные в экспериментах по светорассеянию (рис. 12А).

Дифференциальные распределения коэффициентов седиментации для комплексов денатурированного актина с Hsp27-wt или Hsp27-3D показаны на рис. 14. В используемых условиях (при весовом отношении Hsp27/актин, равном 1/4) коэффициенты седиментации комплексов денатурированного актина с Hsp27-3D распределялись в диапазоне 10-45 S, а максимум распределения находился в области 23 S (рис. 14). В случае комплексов денатурированного актина с Hsp27-wt распределение ls-g*(s) смещено в сторону больших коэффициентов седиментации (от 18 до 60 S), а его максимум составляет ~32 S (рис. 14).

Это свидетельствует о том, что комплексы, образованные денатурированным актином с Hsp27-wt, в среднем несколько крупнее, чем комплексы, образованные с Hsp27-3D. При этом надо отметить, что большие олигомеры Hsp27-wt исходно имели коэффициенты седиментации ~15 S, что намного превосходит коэффициенты для изолированного Hsp27-3D (~ 3 S).

0. Седиментационный анализ 14.

Рис.

ls-g*(s) 0. комплексов Hsp27-wt (1) или Hsp27-3D (2) с денатурированным актином, полученных в результате прогрева F-актина (0,5 мг/мл) до 0. 70оС в присутствии Hsp27-3D (0,125 мг/мл) или Hsp27-wt (0,125 мг/мл) и последующего 0. 20оС.

охлаждения до Представлены дифференциальные распределения 0 20 40 60 80 Коэффициент седиментации, S коэффициентов седиментации ls*g(s).

Подводя итоги, следует отметить, что, несмотря на значительную разницу в исходном олигомерном состоянии, как Hsp27-3D, так и Hsp27-wt эффективно предотвращают агрегацию денатурированного актина, образуя с ним растворимые комплексы относительно небольшого размера. Это согласуется с данными литературы о том, что размеры комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с частично или полностью денатурированными белками-мишенями, определяются главным образом свойствами этих белков, но мало зависят от исходного олигомерного состояния sHSP. В то же время важно отметить, что средние размеры растворимых комплексов Hsp27 с денатурированным актином оказались несколько больше в случае Hsp27-wt, чем в случае Hsp27-3D (рис. 14). В литературе уже высказывалось мнение о том, что большие олигомеры Hsp27 могут представлять собой некое «депо», а их диссоциация на более мелкие олигомеры является важным условием для проявления способности Hsp предотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков. Можно предположить, что подобная диссоциация происходит и в нашем случае, при взаимодействии Hsp27-wt с денатурированным актином. Она может быть обусловлена, например, появлением белка-субстрата – частично или полностью денатурированного актина. По всей видимости, относительно небольшие олигомеры, на которые диссоциируют крупные олигомеры Hsp27-wt, все-таки существенно превышают по размерам те димеры или тетрамеры, которые образуются при фосфорилировании Hsp или при его имитации в случае Hsp27-3D. Именно этим можно, по-видимому, объяснить наблюдаемую нами разницу между Hsp27-wt и Hsp27-3D в размерах растворимых комплексов, образуемых ими с денатурированным актином.

ВЫВОДЫ Разработан новый экспериментальный подход к изучению влияния малых 1) белков теплового шока (sHSP) на процессы денатурации и агрегации белков. Этот подход отработан на примере F-актина и включает параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации F-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии sHSP.

Показано, что sHSP не взаимодействуют с нативными актиновыми 2) филаментами и не оказывают влияния на их тепловую денатурацию.

Продемонстрировано, что sHSP эффективно подавляют агрегацию F-актина, 3) индуцированную нагреванием.

Установлено, что подавление агрегации F-актина осуществляется путем 4) образования небольших по размеру, растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. Определен ряд характеристик таких комплексов – гидродинамический радиус (15–25 нм), распределение по коэффициенту седиментации и кажущаяся молекулярная масса (~2000 кДа).

На примере малого белка теплового шока Hsp27, существующего в виде 5) крупных олигомеров, и его мутантной формы Hsp27-3D, имитирующей фофорилированную форму Hsp27 и представленной димерами и тетрамерами, показано, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP не оказывает существенного влияния на их способность предотвращать тепловую агрегацию F-актина и образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:

1. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I. and Gusev N.B. (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1548–1553.

2. Pivovarova A., Chebotareva N., Chernik I., Gusev N. and Levitsky D. (2007) Small heat shock protein Hsp27 prevents heat-induced aggregation of F-actin by forming soluble complexes with denatured actin. FEBS J., 274, 5937–5948.

3. Levitsky D.I., Pivovarova A.V., Mikhailova V.V. and Nikolaeva O.P. (2008) Thermal unfolding and aggregation of actin. Stabilization and destabilization of actin filaments. FEBS J., 275, 4280–4295.

4. Пивоварова А.В., Чеботарева Н.А., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2008) Свойства комплексов, образуемых малыми белками теплового шока с денатурированным актином. Биофизика, т. 53, № 5, с. 766–771.

Тезисы докладов:

1. Chernik I.S., Mikhailova V.V., Pivovarova A.V., Levitsky D.I., and Gusev N.B. (2004) Protective effects of small heat shock proteins (sHSP) on the thermally induced aggregation of actin filaments. Abstracts of International Symposium “Biological Motility” (Pushchino, Moscow region, 23 May–1 June 2004), p. 78.

2. Mikhailova V., Pivovarova A., Chernik I., Gusev N., and Levitsky D. (2004) Small heat shock proteins prevent thermally induced aggregation, but not thermal denaturation of actin filaments.

J. Muscle Res. and Cell Motil., 2004, v. 25, № 3, p. 251. (Abstracts of the 33rd European Muscle Conference, Isola d’Elba, Italy, 19-23 September 2004).

3. Пивоварова А.В. (2005) Малые белки теплового шока предотвращают агрегацию актина, денатурированного нагреванием. Тезисы докладов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005» (Москва, 12–15 апреля 2005г.) с. 177–178.

4. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Gusev N.B., and Levitsky D.I. (2005) Small heat-shock proteins prevent thermally induced aggregation of actin filaments by formation of soluble complexes with denatured actin. The FEBS J., v. 272, Suppl. 1, p. 356. (Abstracts of the 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, 2–7 July 2005).

5. Mikhailova V., Pivovarova A., Chernik I., Chebotareva N., Gusev N., and Levitsky D. (2005) A new insight into “dissociative” mechanism of the thermal unfolding of F-actin by using small heat shock proteins. J. Muscle Res. and Cell Motil., v. 26, № 1, p. 79. (Abstracts of the 34th European Muscle Conference, Hortobagy, Hungary, 17–21 September, 2005).

6. Levitsky D.I., Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chebotareva N.A., and Kurganov B.I. (2006) Thermal denaturation and aggregation of actin filaments. Abstracts of International Symposium “Biological Motility: Basic Research and Practice” (Pushchino, Moscow Region, May 11-15, 2006), p. 29- 7. Gusev N.B., Bukach O.V., Chernik I.S., Pivovarova A.V., and Levitsky D.I. (2006) Small heat shock proteins: probable participation in regulation of muscle contraction. Abstracts of International Symposium “Biological Motility: Basic Research and Practice” (Pushchino, Moscow Region, May 11-15 2006), p. 23-24.

8. Pivovarova А., Mikhailova V., and Levitsky D.I. (2006) Comparative studies on the thermal unfolding of G-actin and F-actin by using ANS fluorescence. J. Muscle Res. Cell Motil,. v. 27, № 5-7, p. 512. (Abstracts of 35th European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, 9- September 2006).

9. Pivovarova A.V. (2007) Small heat shock proteins effectively protect myosin S1 and F-actin from thermally induced aggregation. Abstracts of the 2nd World Conference of Stress, (Budapest, Hungary, 23–26 August 2007), p. 26.

10. Levitsky D.I., Pivovarova A.V., N.A. Chebotareva, N.B Gusev (2008) Stable soluble complexes formed by small heat shock proteins with denatured actin. Abstracts of International Symposium “Biological Motility: Basic Research and Practice” (Pushchino, Moscow Region, May 11-15, 2008), v. 1, p. 39-40.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.