Поиск модуляторов активности шаперона hsp70 и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы при помощи методов молекулярного моделирования
На правах рукописи
Черноризов Кирилл Александрович Поиск модуляторов активности шаперона Hsp70 и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы при помощи методов молекулярного моделирования Специальность 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА – 2011 г.
Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в Научно исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова
Научный консультант: д.х.н., профессор Швядас В.К.
Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Курочкин И.Н.
д.б.н., профессор Долгих Д.А.
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита состоится «_» апреля 2011 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд.202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «_» марта 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.
-2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Поиск лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с агрегацией нейрональных белков, является одной из актуальных проблем медицины и фармакологии. Перспективными мишенями для создании новых лекарственных препаратов являются белки теплового шока (шапероны), которые способны предотвращать агрегацию разворачивающихся белков и помогать им сворачиваться в нативные конформации, а также глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (ГАФД) - один из важнейших ферментов гликолиза. Hsp70 является ключевым белком в функционировании шаперонного механизма клетки. Модуляция его функционирования в нейронах представляет собой перспективный путь терапии таких заболеваний как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа активно исследуется в связи с поиском лекарственных препаратов против заболеваний, ассоциированных с агрегацией белков, обладающих полиглутаминовыми хвостами (болезнь Хантингтона, спинобульбулярная мышечная атрофия и др.). Большие возможности при поиске путей модуляции активности Hsp70 и ГАФД, а также детальном исследовании трехмерных структур белков и их взаимодействия с ингибиторами представляют методы молекулярного моделирования, эффективность которых в последнее время существенно увеличилась в связи с развитием суперкомпьютерных технологий.
Цели и задачи исследования • построение и исследование трехмерных структур белков Hsp70 и ГАФД;
• изучение функционирования исследуемых белков с использованием построенных моделей;
• разработка стратегии модулирования активности Hsp70 и ГАФД;
• in silico поиск лигандов, способных модулировать функционирование исследуемых белков.
Научная новизна Впервые создана и изучена модель полноразмерной трехмерной структуры Hsp70 человека, при помощи молекулярного моделирования исследован механизм взаимодействия его АТФазного и субстрат-связывающего доменов. Предложена стратегия модуляции активности шаперона путем ингибирования связывания комплекса Hsp70:АДФ:Субстрат с фактором нуклеотидного обмена, предложены два участка для связывания ингибиторов, выявлены низкомолекулярные модуляторы, ингибирующие связывание фактора нуклеотидного обмена с комплексом Hsp70:АДФ:Субстрат.
Обнаружены ингибиторы, способные образовать ковалентный комплекс с мышечной ГАФД человека, а также селективный ингибитор сперматозоидной ГАФД человека.
Практическая значимость Построенная модель Hsp70 человека может быть использована для дальнейшего изучения механизмов функционирования шаперона, а также для in silico поиска модуляторов Hsp70. Предложенные модуляторы активности Hsp70 человека и найденные ковалентные ингибиторы ГАФД являются прототипами новых лекарственных препаратов.
Апробация работы Результаты работы были представлены на конференциях: «Ломоносов 2007» и «Ломоносов-2010», г. Москва, 2007 и 2010 гг.;
Итоговых конференциях по -3 результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 годы в рамках приоритетного направления «Живые Системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 2008 и 2009 гг.
Публикации По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 4 тезиса конференций.
Объем и структура работы: Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (2 главы), экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения ( глав), выводов и списка используемой литературы, включающего 136 ссылок. Работа изложена на 117 страницах, содержит 60 рисунков, 10 таблиц.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Обзор литературы содержит общую информацию о шаперонах, детальное рассмотрение данных рентгеноструктурного анализа (РСА), описание строения шаперона Hsp70, цикла его функционирования и роли в клетке, анализ литературы о существующих фармакологических стратегиях модуляции активности шаперона. В литературном обзоре также собрана информация о строении и функциях глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФД), рассмотрены роль фермента в развитии апоптоза и нейродегенеративных заболеваний, основные стратегии модуляции активности фермента низкомолекулярными соединениями, проведен анализ данных РСА по структуре ГАФД.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для молекулярного моделирования использовали программы VMD 1.8.6, ChemSketch, сервис гомологического моделирования SwissModel и пакет программ AmberTools 1.2.
Симуляции молекулярной динамики и анализ молекулярнодинамических траекторий проводили в пакетах программ Gromacs 3.3.3 и Amber 10. При использовании Gromacs расчеты осуществляли в силовом поле OPLSAA, при использовании Amber - в поле Amber ff99SB. Для молекулярного докинга и скрининга баз данных низкомолекулярных соединений использовали программу Lead-Finder. Поиск потенциальных лидерных соединений методом виртуального скрининга проводили в библиотеках химических соединений VitasM-Laboratory (около 300000 соединений), BioPharmics LLC ( соединений) и DrugBank (4093 соединения).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поиск ингибитора взаимодействия Hsp70 с фактором нуклеотидного обмена Hsp70 – двудоменный АТФ-зависимый белок из класса шаперонов. АТФазный домен, образованный субдоменами I и II, гидролизует АТФ, в то время как субстрат-связывающий домен (SBD), образованный альфа-спиральным (SBD) и бета-листовым субдоменами (SBD), связывает гидрофобные пептиды (Рис. 1). В процессе функционирования АТФазный и субстрат-связывающий домены расходятся, оставаясь связанными лишь междоменным линкером.
-4 Рис. 1. АТФазный домен Hsp70 человека (слева;
pdb ID: 1HJO) и SBD DnaK E.сoli (справа;
зеленым отмечен SBD, желтым – SBD, красным – субстратный пептид;
pdb ID: 1DKZ).
Находясь на поверхности клетки в комплексе с субстратным пептидом, Hsp70 способен активировать специфический иммунный ответ по отношению к клеткам, содержащим на своей поверхности представленный Hsp70 пептид. Данное свойство актуально в разработке стратегий противоопухолевой терапии: продлив время связывания Hsp70 с пептидами опухолевой клетки, можно усилить иммуногенный эффект внеклеточного Hsp70, а также улучшить эффективность вакцин типа Oncophage1. Комплекс Hsp70 с пептидом образуется после стадии гидролиза АТФ, его разрушение сопровождается присоединением фактора нуклеотидного обмена (NEF) к субдоменам IB и IIB АТФазного домена Hsp70 (Рис. 1).
Предложенная стратегия модуляции активности шаперона предполагает предотвращение взаимодействия комплекса Hsp70:АДФ:S с NEF за счет связывания низкомолекулярного ингибитора с АТФазным доменом. Таким образом, цикл функционирования шаперона будет нарушен и субстратный пептид останется связанным в субстрат-связывающем домене.
Решение задачи проводили в четыре этапа:
1) Описание и анализ зоны взаимодействия Hsp70 с фактором нуклеотидного обмена.
Анализ проводили на основании структуры 1HX1, описывающей комплекс Hsp70 с Bag доменом фактора нуклеотидного обмена Bag-1, с использованием метода симуляции молекулярной динамики. На основе проведенного исследования был сделан вывод о том, что взаимодействие Hsp70 и Bag-1 основывается на 5 солевых мостиках и 5 стабильных (т.е. существовавших на протяжении 50 % траектории) водородных связях;
2) Построение модели АТФазного домена Hsp70 человека. АТФазный домен является функциональным (т.е. осуществляет гидролиз АТФ в изолированном состоянии) и обладает стабильной пространственной структурой. На данный момент установлена трехмерная структура близкого гомолога Hsp70 человека - Hsc70 быка (PDB ID: 1YUW;
Рис. 1, слева).
Mazzaferro V, Coppa J, Carrabba MG, Rivoltini L, Schiavo M, et al. Clin. Cancer Res. 2003;
9(9):3235-3245.
-5 Идентичность шаблона с моделируемой структурой составила 89.4%. На основании этой структуры было проведено моделирование АТФазного домена Hsp70 человека;
3) Выбор участков связывания модулятора с АТФазным доменом Hsp70 человека. На поверхности АТФазного домена были выбраны 2 участка для связывания потенциальных ингибиторов. Первый (участок А) находится в области cубдомена IIB. Он состоит из спирали и элемента -листа и включает в себя ключевые для взаимодействия с Bag- аминокислотные остатки, т.е. является потенциальным участком конкурентного ингибирования по отношению к фактору нуклеотидного обмена. Второй участок (участок B) находится на границе субдоменов IIB и IIA в «шарнирном» районе, конформация которого меняется при раздвижении створок АТФазного домена. Стратегия ингибирования на этом участке заключается в том, чтобы механически лишить створки АТФазного домена возможности раскрыться, заткнув полость, являющуюся «буфером» для движения субдомена IIB. Участок B является мишенью для ингибирования образования комплекса Hsp70 с Bag-1, не конкурируя при этом с Bag-1 за место связывания.
4) Скрининг баз данных низкомолекулярных соединений. В процессе поиска ингибиторов взаимодействия Hsp70 с NEF с помощью программы Lead-Finder был проведен скрининг трех баз данных низкомолекулярных соединений: VitasM-Laboratory (около соединений) - найдено 17 потенциальных ингибиторов связывания Hsp70 с NEF, BioPharmics LLC (1856 соединений) и DrugBank (4093 соединения) - отобраны соединения.
Экспериментальная проверка ингибирующей способности отобранных соединений проводилась в Институте Цитологии РАН (Санкт-Петербург). Предварительно подтверждено ингибирующее действие трех соединений из базы данных Vitas-M. Однако интерпретация экспериментальных результатов затруднена из-за недостатка знаний о структуре и функционировании Hsp70 человека, в частности, о пространственном взаимодействии АТФазного и субстрат-связывающего доменов. Для изучения междоменных взаимодействий требовалась полноразмерная структура Hsp70 человека.
Моделирование полноразмерной трехмерной структуры Hsp Полноразмерной трехмерной структуры Hsp70 в базе данных белковых структур (PDB) не обнаружено. В связи с этим была предпринята попытка создать максимально полную структуру Hsp70 человека (hHsp70) с помощью методов молекулярного моделирования.
-6 Построение модели проходило в три стадии:
основываясь на первичной последовательности человеческого Hsp70 и третичной структуре Hsc70 из организма быка (PDB ID: 1YUW) была построена модель, описывающая АТФазный домен, SBD и -спираль ‘А’ SBD Hsp70 человека.
Структура описывает контакт АТФазного домена с субстрат-связывающим доменом в состоянии, когда домены жестко сцеплены друг с другом. Идентичность сконструированной структуры и шаблона составила 88,6%. Для получения полноразмерной структуры требовалось достроить оставшуюся часть SBD, охватывающую -спирали ‘B’, ‘C’, ‘D’. Она была построена по гомологии с SBD нематоды Caenorhabditis elegans (PDB ID:
2P32;
Рис. 2). В активный центр итоговой модели добавляли молекулу АТФ для того, чтобы изучить стабильность структуры белка как со свободным, так и с занятым АТФазным доменом.
Модели свободного hHsp70 и его комплекса с АТФ изучали при помощи молекулярной динамики. Данные среднего квадратичного отклонения (RMSD) и визуальный анализ траектории показали, что построенная структура (Рис. 2) стабильна, в виду чего она была принята в качестве рабочей для Рис. 2. Схема построения модели Hsp70 человека дальнейшего изучения междоменных (см.текст). АТФазный домен обозначен синим взаимодействий шаперона.
цветом, SBD - желтым, SBD – зеленым.
Изучение междоменных взаимодействий hHsp В процессе функционирования исследуемого шаперона образующие его домены расходятся c разрывом всех нековалентных взаимодействий, в результате чего остаются связанными исключительно междоменным линкером. С помощью метода управляемой молекулярной динамики было проведено исследование расхождения доменов, выявившее ключевые для этого процесса солевые мостики и показавшее, что обратное сближение доменов не зависит от изменения конформации АТФазного домена. Исследование проводили на построенной в предыдущей части работы модели hHsp70 со свободным АТФазным доменом.
-7 Разрыв солевого мостика Arg171:Glu516.
По литературным данным (Jiang J. et al. 2 ) расхождение доменов начинается с опосредованного кошапероном Hsp40 разрыва солевого мостика Arg171:Glu516, соединяющего -спираль ‘А’ субстрат-связывающего домена с субдоменом IА АТФазного домена. Моделирование рызрыва было проведено с помощью метода управляемой молекулярной динамики путем раздвижения С-атомов вышеуказанных аминокислотных остатков с 12 до 22.
Рис. 3. Перестройка солевых мостиков при расхождении доменов hHsp70. Красным отмечен лист, включающий Glu218 и петлю, фиксирующую АТР. Вторая петля, принимающая участие в фиксации, отмечена серым цветом.
Общая работа, затраченная на раздвижение указанных атомов, составила 34.3 ккал/моль.
Примечательно, что после фактического разрыва солевого мостика Arg171:Glu516 среднее расстояние между петлями АТФазного домена, фиксирующими - и -фосфаты АТФ, сократилось на 2 (с 8 до 6 ;
Рис. 3). Теоретически подобное движение в нативном ферменте может вызывать гидролиз АТФ. Можно предположить, что солевой мостик Arg171:Glu516 сдерживает АТФазный домен hHsp70 от спонтанного гидролиза АТФ, а кошаперон, разрывая мостик, инициирует гидролиз.
Поведение полученной структуры было изучено с помощью симуляции молекулярной динамики. Тенденций к восстановлению разорванной связи Arg171:Glu516, как и к дальнейшему расхождению доменов, при этом выявлено не было.
Jiang J., Maes E.G., Taylor A.B., Wang L., Hinck A.P., et al. // Mol. Cell. 2007. 28(3). P. 422-433.
-8 Разрыв солевого мостика Arg416:Glu Разрыв мостика Arg171:Glu516 привел лишь к частичному отделению доменов друг от друга, однако окончательного расхождения не произошло. В связи с этим предстояло выявить наиболее стабильные в процессе предыдущих молекулярнодинамических исследований нековалентные связи, разрыв которых мог бы привести к полному расхождению доменов hHsp70.
На основании аннотации и исследования междоменных контактов было сделано предположение о том, что ключевым для расхождения доменов взаимодействием остается солевой мостик Arg416:Glu218, соединяющий один из поворотов -субдомена SBD с субдоменом IIA АТФазного домена. Имитация разрыва выбранного солевого мостика заключалась в увеличении расстояния между С-атомами взаимодействующих аминокислотных остатков с 12.2 до 22.2. Общая работа, затраченная на разрыв этого солевого мостика, составила 33.4 ккал/моль. Кривая, отображающая этот процесс (Рис. 4), свидетельствует, что для увеличения расстояния с 13.4 до 14.7, связанного с разрывом взаимодействия, необходимо около 7 ккал/моль.
Разрыв солевого мостика R416E ь л о м / л а К к , а т о б а Р 12 14 16 18 20 22 Расстояние между С?-атомами Arg416 и Glu218, A Рис. 4. Работа, затраченная на второй этап симуляции расхождения АТФазного и субстрат-связывающего доменов.
Именно такое количество энергии выделяется при разрыве макроэргической связи в АТФ.
Так как Glu218 является частью -листа (Рис. 5), один из -поворотов которого непосредственно фиксирует - и -фосфаты молекулы АТФ, можно предположить, что гидролиз АТФ сопряжен с разрывом солевого мостика Arg416:Glu218. -лист является жесткой структурой и его опосредованное гидролизом АТФ смещение способно вызвать разрыв ключевого для расхождения доменов солевого мостика.
-9 Рис. 5. Структура hHsp70 после симуляции расхождения доменов. Красным отмечен -лист, движение которого сопровождается разрывом второго солевого мостика Glu218:Arg416.
Пунктиром обозначен образовавшийся после расхождения доменов солевой мостик Glu516:Arg416.
Симуляция разрыва солевого мостика Arg416:Glu218 привела к полному расхождению доменов. В процессе моделирования этого процесса был выявлен интересный факт:
освободившиеся при разрушении солевых мостиков остатки Arg416 и Glu516 в процессе дальнейших исследований образовали друг с другом новый солевой мостик (Рис. 5). При этом аналогичный солевой мостик стерически возможен и для остатков Arg171 и Glu218.
Проведенное моделирование позволило сделать вывод о важной роли междоменных солевых мостиков Arg171:Glu516 и Arg416:Glu218 в функционировании hHsp70. Они являются ключевыми для связывания АТФазного и субстрат-связывающего доменов, однако по мере расхождения доменов происходит перестройка партнеров и образуются солевые мостики Arg171:Glu218 и Arg416:Glu516, которые стабилизируют новое структурное состояние шаперона.
Симуляция раздвижения субдоменов I и II В процессе нуклеотидного обмена АТФазный и субстрат-связывающий домены сходятся обратно, однако силы, заставляющие их это сделать, достоверно неизвестны.
Стохастический характер схождения доменов представляется маловероятным. Ввиду того, что нуклеотидный обмен проходит при разобщенных доменах и сопровождается взаимодействием АТФазного домена с фактором обмена нуклеотидов, естественно - 10 предположить, что раздвижение субдоменов I и II фактором нуклеотидного обмена теоретически способно повлиять на схождение АТФазного и субстрат-связывающего доменов. Было проведено моделирование этого процесса. При симуляции раздвижения субдоменов I и II точками приложения силы являлись атомы азота основной цепи аминокислотных остатков Thr14 и Gly203, которые непосредственно взаимодействуют с АТФ/АДФ. Исходное расстояние между ними составляло 7.3, конечное – 14.3.
Моделирование показало, что изменение расстояния между субдоменами I и II не сказывается на взаимодействии доменов друг с другом, т.е. действие фактора нуклеотидного обмена на створки АТФазного домена не влияет на схождение доменов Hsp70.
На основании проведенного исследования предложена следующая схема функционирования hHsp70: при взаимодействии с J-доменом кошаперона Hsp происходит разрыв солевого мостика Arg171:Glu516, который приводит к сближению петель, фиксирующих АТФ, и способствует гидролизу АТФ. Гидролиз АТФ, в свою очередь, сопровождается смещением -листа, содержащего одну из петель, фиксировавших АТФ, и расположенного в области междоменного контакта остатка Glu218, что влечет за собой разрыв солевого мостика Arg416:Glu218. Разрыв солевого мостика Arg416:Glu приводит к расхождению АТФазного и субстрат-связывающего доменов, а остаток Arg образует солевой мостик с остатком Glu516, относящимся к субстрат-связывающему домену. Остаток Arg171, в свою очередь, образует новый солевой мостик с Glu218, т.е.
происходит перегруппировка солевых мостиков, ранее связывавших АТФазный и субстрат связывающий домены hHsp70.
Построенная и уравновешенная модель Hsp70 человека представлена в депозитарии PMDB (PMDB id: PM0076412).
Моделирование ГАФД с ковалентно модицифированным Cys Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (ГАФД, EC 1.2.1.12) – NAD+-зависимый фермент гликолиза, осуществляющий реакцию образования 1,3-дифосфоглицерата из глицеральдегид-3-фосфата. Фермент представляет собой гомотетрамер, состоящий из аминокислотных остатков (масса ~150кДа, Рис. 6). Активные центры ГАФД расположены между субъединицами и состоят из NAD-связывающего участка, субстрат-связывающего участка и каталитического центра, ключевым аминокислотным остатком которого является Cys149.
http://mi.caspur.it/PMDB/main.php - 11 Рис. 6. Глобула ГАФД. Цветами отмечены 4 цепи фермента, алым - молекулы кофактора NAD+.
ГАФД стабилизирует и доставляет проапоптотический белок Siah1 в ядро. Ключевым для образования комплекса ГАФД:Siah1 аминокислотным остатком является Cys149.
Ковалентная модификация цистеина может предотвратить связывание с Siah1 и таким образом блокировать один из путей развития апоптоза (который наблюдается, в частности, при болезни Паркинсона). Основываясь на этом предположении, был проведен поиск низкомолекулярных ковалентных ингибиторов фермента.
Изучение ковалентных комплексов фермента с потенциальными ингибиторами проводили с помощью метода симуляции молекулярной динамики. Был предложен алгоритм моделирования ГАФД с ковалентно модифицированным Cys149. При моделировании тиоэфирного интермедиата (в присутствии NADH и со свободным NAD-связывающим центром) особое внимание уделялось расположению фосфатных групп в Pi- и Ps-сайтах.
Соответствие полученных данных о положении фосфатных групп субстрата в активном центре литературным данным позволило сделать вывод об адекватности предложенного алгоритма.
При проведении молекулярного моделирования была использована структура ГАФД из мышц человека (PDB ID: 1U8F;
Рис. 6Ошибка! Источник ссылки не найден.), при изучении действия ингибиторов на сперматозоидную ГАФД - модель химерного гетеротетрамера ГАФД, состоящего из трех субъединиц ГАФД E.сoli и одной субъединицы сперматозоидной ГАФД крысы (PDB ID: 2VYN). Перед моделированием и проведением - 12 докинговых исследований обе структуры были уравновешены с помощью симуляции молекулярной динамики.
Конструирование и параметризация ГАФД с модифицированным Cys Для конструирования модели ГАФД с ковалентно модифицированной SH-группой каталитического цистеина требовалось решить проблему отсутствия в силовом поле Amber ряда необходимых силовых параметров для связей, валентных и двугранных углов интересующих нас комплексов, а также определить частичные заряды атомов соединений небелковой природы, «пришиваемых» к каталитическому цистеину.
Алгоритм моделирования:
1) Структуру ГАФД уравновешивали с помощью симуляции молекулярной динамики;
2) В уравновешенной структуре убирали водород с серы каталитического цистеина (Cys149), изменяя тип аминокислотного остатка с CYS (протонированная форма цистеина основной белковой цепи) на CYX (форма цистеина основной белковой цепи с атомом серы, образующим ковалентную связь);
3) В программе ChemSketch минимизировали структуру ковалентно присоединяемого лиганда;
4) На основании полученной в п.3 структуры с помощью программы antechamber (из пакета программ AmberTools) генерировали файл, содержащий частичные заряды, а также координаты и связность атомов лиганда. Расчет зарядов проводили в соответствии с силовым полем GAFF;
5) С помощью программы parmchk получали силовые и геометрические параметры для связей, а также валентных и двугранных углов исследуемой молекулы (файл модификаций силовых параметров);
6) Программа для расчета молекулярнодинамических траекторий Sander поддерживает и силовое поле Amber, и GAFF, однако типы атомов в них обозначаются по-разному. В случае работы с нековалентным комплексом типы атомов белка обозначаются в соответствии с силовым полем Amber, лиганд параметризуется в соответствии с GAFF, и в результате такая структура не вызывает ошибок при проведении молекулярнодинамических расчетов. Однако в случае ковалентного присоединения лиганда к белку происходит конфликт в описании связи, валентных и двугранных углов между белком и лигандом. Для решения этой задачи необходимо прописать параметры «гибридных» связей и углов, содержащих как типы атомов белка (описанные в формате силового поля Amber), так и лиганда (описанных в формате силового поля GAFF). Для решения этой проблемы, в ChemSketch создавали молекулу, структура которой полностью описывает ковалентную связь цистеина и ковалентно связанного с ним лиганда (в том числе валентные и двугранные углы, содержащие связь серы цистеина и соответствующего атома лиганда);
7) Для построенной промежуточной структуры получали frcmod-файл (см. п.4 и п.5), в котором типы атомов, относящиеся к цистеину белка, заменяли соответствующими обозначениями из Amber. Полученный гибридный frcmod-файл в дальнейшем подавался на вход программе для расчета молекулярной динамики;
8) Полученные комплексы уравновешивали с помощью метода симуляции молекулярной динамики.
- 13 Проверка алгоритма на модели тиоэфирного интермедиата В литературе предполагается (Moniot et al. 4 ), что при образовании тиоэфира в процессе замены восстановленного NADH на NAD+ фосфатная группа субстрата перемещается из Ps сайта в Pi-сайт (Рис. 7). Это предположение было проверено при помощи молекулярного моделирования. Молекулярная динамика комплекса тиоэфирного интермедиата в холоформе показала, что до выхода NADH из NAD-связывающего центра, фосфатная группа субстрата фиксируется остатками Arg231, Thr179 и 2’-гидроксильной группой рибозы NADH, что соответствует Ps-сайту и согласуется с данными литературы. Когда из активного центра убрали NADH и наблюдали за подвижностью фосфатной группы, она заняла Pi-сайт, образовав водородные связи с аминокислотными остатками Ser148, Thr150 и Thr208, что также согласуется с литературными данными. Полученные результаты свидетельствуют об адекватности использованного алгоритма моделирования.
Рис. 7. Тиоэфирный интермедиат в свободном от кофактора активном центре. Фосфат переместился в Pi-сайт.
Moniot S, Bruno S, Vonrhein C, Didierjean C, Boschi-Muller S, et al. J Biol Chem. 2008;
283(31):21693- - 14 Поиск ковалентных ингибиторов ГАФД in silico Для выполнения задачи был проведен скрининг способности SH-соединений связываться в активном центре ГАФД в непосредственной близости от SH-группы каталитического цистеина. Критерием эффективности ингибитора считали расположение атома серы каталитического цистеина от серы лиганда на расстоянии не превышающем 5 в 50% запусков нековалентного докинга. В результате проведенного скрининга были отобраны три соединения, потенциально способные ковалентно модифицировать каталитический цистеин фермента. Комплексы найденных веществ с ГАФД были изучены с помощью методов ковалентного докинга и симуляции молекулярной динамики. Ингибирующие свойства веществ, отобранных в результате исследования in silico, проверяли экспериментально.
Скрининг и докинг В качестве мишени использовали активный центр мышечной ГАФД (1U8F) как в свободном состоянии, так и со связанным коферментом NAD+. Скрининг потенциальных ковалентных ингибиторов фермента проводили в специально созданной базе данных низкомолекулярных SH-соединений, при скрининге отбирали соединения со свободной энергией связывания G не превышающей -5 ккал/моль. Для отобранных кандидатов проводили детальный анализ структуры фермент-ингибиторных комплексов и расположения лиганда в участке связывания для оценки возможности образования дисульфидной связи. Для каждой структуры было проведено по 20 запусков нековалентного докинга как в свободный активный центр, так и в активный центр с кофактором (Рис. 8). После каждого запуска отбирали лидирующую позицию. на основании анализа 20 лидирующих позиций делали вывод о реакционноспособности и эффективности связывания каждого лиганда.
В результате расчетов были отобраны 3 SH-соединения: GSH (N-(фенилацетил)-глутатион), NAC (N-(феноксиацетил)-L-цистеин) и NMC (N-((R)-манделил)-(S)-цистеин) (Таблица 1).
- 15 Рис. 8. Активный центр ГАФД. Слева изображена молекула кофактора NAD, справа расположен каталитический Cys149.
- 16 Нековалентный докинг Результаты расчетов нековалентного докинга представлены в Таблица 1.
Таблица 1. Результаты расчетов нековалентного докинга потенциальных ингибиторов.
Приведены средние значения по лидирующим позициям 20 запусков.
G Ингибитор Структурная формула Форма фермента (ккал/моль) Свободный - активный центр SH NH GSH NH NH O Комплекс O O O - ГАФД:NAD O O O HS Свободный - активный центр O NH NAC Комплекс - O ГАФД:NAD O O Свободный O -6. активный центр O NH NMC Комплекс - SH ГАФД:NAD HO O Соединение GSH. Нековалентный докинг соединения в свободный активный центр показал, что в 50% запусков атом серы лиганда располагается на расстоянии менее 5 от серы каталитического цистеина, что соответствует критериям предреакционного состояния. Докинг исследуемого соединения в активный центр со связанным NAD показал низкую вероятность предреакционного расположения GSH (10% запусков). Размеров субстрат-связывающего участка в этом случае недостаточно для связывания такой крупной молекулы. Исследуемое соединение способно взаимодействовать лишь со свободным активным центром ГАФД, при этом частично конкурируя с NAD за место в активном центре.
- 17 Соединение NAC. По результатам нековалентного докинга в свободный активный центр ГАФД была выявлена одна четкая позиция связывания, в которой расстояние между атомами серы лиганда и Cys149 превышает 5. При докинге в активный центр с кофактором соединение NAC заняло предреакционное для образования цистеинового мостика положение в 60% запусков. Это позволило предположить, что NAC обладает высоким сродством к активному центру ГАФД в комплексе с кофактором, не конкурируя с ним за место связывания.
Соединение NMC. Результаты расчетов для NMC привлекли внимание тем, что это соединение обладало хоть небольшой, но равной вероятностью связаться в предреакционном положении как со свободным активным центром (25% запусков), так и в активном центре, занятом кофактором (25% запусков).
Ковалентный докинг и молекулярнодинамическое исследование Для более детального изучения взаимодействия найденных веществ с ГАФД был использован метод ковалентного докинга как в свободный активный центр мышечной ГАФД, так и в активный центр с кофактором. Для комплексов ГАФД:NAC и ГАФД:NMC было проведено также молекулярнодинамическое исследование с целью уточнить расположение ковалентно связанных ингибиторов в активном центре фермента.
По данным ковалентного докинга GSH в свободный активный центр ГАФД концевая карбоксильная группа лиганда связывается с Arg231, карбонильная группа глицина - с His176, карбоксильная группа глутамата GSH обращена в раствор. Положение бензольного кольца варьируется: в наиболее вероятной конформации (60% запусков) оно находится в гидрофобном кармане. В силу своих размеров GSH не способен эффективно связаться с активным центром ГАФД в присутствии NAD.
Устойчивость фермент-ингибиторных комплексов и расположение NMC и NAC в активном центре ГАФД, найденное с использованием ковалентного докинга, уточняли с помощью симуляции молекулярной динамики. По результатам исследования комплекса ГАФД:NAC карбонильная группа NAC образовала водородную связь с Thr179, а карбоксильная – с His176 (Рис. 9). Исследование комплекса ГАФД:NMC показало, что карбоксильная группа лиганда образовала водородные связи с Arg231 и His176, гидроксильная группа – с Ser (см. Рис. 10). Данные проведенного моделирования подтвердили вывод о том, что GSH, NAC и NMC являются потенциальными ковалентными ингибиторами ГАФД.
- 18 Рис. 9. Ковалентно связанный NAC в активном центре ГАФД.
Рис. 10. Ковалентно связанный NMC в активном центре ГАФД.
Для проверки адекватности выводов, полученных при исследовании ингибиторов in silico, было проведено экспериментальное исследование ингибирующих свойств выбранных соединений в условиях in vitro.
- 19 Экспериментальная проверка ингибиторных свойств соединений Изучение ингибирующего действия GSH и NAC на каталитическую активность ГАФД. Результаты экспериментов приведены на Рис. 11. При инкубации соматической ГАФД в присутствии GSH и NAC наблюдали снижение активности фермента во времени: в случае NAC удельная активность снизилась на 35%, в случае GSH – на 55%. Третье из изученных соединений (NMC) не оказывало влияния на активность ГАФД.
удельная активность, % 0 30 60 90 120 время, мин Рис. 11. Изменение активности соматической ГАФД из мышц кролика при инкубации с SH-соединениям: (1) - GSH;
(2) - NAC;
(3) - NMC. Концентрация белка: 14 мкМ в расчете на тетрамер, концентрация лигандов – 0.56 мМ.
Изучение характера связывания NAC и GSH с ГАФД. Так как действие NAC и GSH может приводить к ковалентной модификации сульфгидрильных групп фермента, представлялось необходимым оценить вклад этого процесса в ингибирование ГАФД. Было исследовано ингибирующее действие двух отобранных соединений в присутствии низкомолекулярного дитиола – дитиотреитола. Добавление дитиотреитола полностью предотвращало ингибирующее действие NAC и GSH и свидетельствовало о том, что ингибирование активности фермента происходит в результате ковалентной модификации белка данными лигандами. Таким образом среди природных SH-соединений были выявлены производные цистеина и глутатиона, способные проявлять ингибирующую активность по отношению к мышечной ГАФД. При отборе соединений были использованы два основных критерия. С одной стороны, эти вещества должны были ковалентно модифицировать сульфгидрильную группу активного центра ГАФД, с другой взаимодействовать с NAD-связывающим центром. Последнее свойство позволяло бы - 20 решить сразу две задачи – высокоспецифично модифицировать сульфгидрильные группы именно в активном центре и приводить к модификации только тех активных центров, которые свободны от кофактора или связывают его относительно непрочно.
Действительно, как показали полученные результаты, связывание ингибиторов и последующая модификация сульфгидрильных групп происходит в двух мономерах тетрамера, то есть не затрагивает активные центры, содержащие прочно связанный кофактор. Именно это обстоятельство позволяет получать гибридные формы тетрамерного фермента, обладающие каталитической активностью (около 50% от исходной), но содержащие ковалентно связанные ингибиторы в двух активных центрах из четырех.
Избирательное ингибирование ГАФД сперматозоидов человека Избирательное ингибирование сперматозоидной ГАФД представляет интерес для разработки контрацептивных препаратов, так как гликолиз является основным источником энергии для движения сперматозоидного жгутика. Исследование ингибирующих свойств GSH, NAC и NMC по отношению к сперматозоидной ГАФД человека показало, что действие GSH было аналогичным таковому на мышечную ГАФД (удельная активность фермента снизилась до 40%), а NAC повлиял на сперматозоидную ГАФД несколько сильнее, чем на мышечную (удельная активность фермента снизилась до 50%). В то же время добавление NMC, которое не влияло на активность мышечной ГАФД, вызывало снижение активности сперматозоидной ГАФД на ~50% (Рис. 12).
NMC, мГАФД удельная активность, NAC, сГАФД NMC, 40 сГАФД GSH, сГАФД 0 20 40 60 80 100 120 140 160 время, мин.
Рис. 12. Влияние потенциальных ингибиторов GSH, NAC и NMC на активность сперматозоидной ГАФД (см.текст). мГАФД – ГАФД из мышц кролика, сГАФД – ГАФД из спематозоидов человека. Концентрация белка: 14 мкМ в расчете на тетрамер, концентрация лигандов – 0.56 мМ.
- 21 Таким образом было установлено, что NMC является перспективным соединением для избирательного ингибирования сперматозоидной ГАФД. При моделировании в качестве мишени использовали субъединицу сперматозоидной ГАФД крысы из модели 2VYN, идентичность которой со сперматозоидной ГАФД человека составляет 69%, при этом расположение Ps- и Pi-сайтов и Cys149 идентично. Молекулярное моделирование показало, что NMC взаимодействует со свободным активным центром ГАФД, комплекс фермента с ингибитором стабилизирует солевой мостик между карбоксильной группой NMC и аргинином и гистидином активного центра ГАФД. Гидроксильная группа лиганда взаимодействует с Glu314. Молекулярное моделирование взаимодействия SH-соединений со сперматозоидной ГАФД показывает, что эффективность ингибирования может быть увеличена путем модификации соединения.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Предложена стратегия модуляции активности шаперона Hsp70 путем использования низкомолекулярных ингибиторов, способных связываться с АТФазным доменом и предотвращать взаимодействия комплекса Hsp70:АДФ:Субстрат с фактором нуклеотидного обмена;
2. Предложены низкомолекулярные ингибиторы, способные стабилизировать комплекс Hsp70:АДФ:Пептид;
3. Разработана модель полноразмерной трехмерной структуры Hsp70 человека;
4. Проведено молекулярное моделирование и описан процесс взаимодействия АТФазного и субстрат-связывающего доменов Hsp70 человека, ключевую роль в котором играют солевые мостики Arg171:Glu516 и Arg416:Glu218;
5. Проведено моделирование структур тиоэфирного интермедиата в механизме функционирования ГАФД и ковалентных фермент-ингибиторных комплексов с модифицированным аминокислотным остатком Cys149 в активном центре фермента;
6. Найдены новые ковалентные ингибиторы ГАФД, в том числе селективные ингибиторы сперматозоидной формы фермента.
Список работ по теме диссертации 1. Черноризов К.А., Швядас В.К. "Моделирование полноразмерной структуры шаперона Hsp70 человека и изучение его междоменных взаимодействий", Acta Naturae, 2010, т.2, №4(7), с. 69-74;
2. Черноризов К.А., Элькина Ю.Л., Семенюк П.И., Швядас В.К., Муронец В.И. "Новые ингибиторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы: ковалентная модификация NAD - 22 связывающего центра ароматическими тиолами", Биохимия, 2010, т.75, №12, с.1662 1669;
3. Черноризов К.А. «Моделирование полноразмерного белка Hsp70 человека», Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010» 4. В.И. Муронец, В.И. Буник, Е.В. Шмальгаузен, А.П. Плетень, И.Н. Налетова. Н.В.
Позднякова, В.С. Стройлов, К.А. Черноризов, С.В. Стогов, И.А. Севостьянова, Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий (Государственный контракт № 02.512.11.2249 от «07» июля 2008 г. По теме: «Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий»), Материалы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые Системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 25-27 ноября г., стр.59;
5. Черноризов К.А. «Поиск ингибитора образования комплекса между Hsp70 и фактором обмена нуклеотида», Тезисы международной научной студенческой конференции «Ломоносов-2007», стр.45;
6. В.И. Муронец, И.Н. Налетова, И.А. Севостьянова, Е.В. Шмальгаузен, С.В. Стогов, Г.Г.
Чилов, К.А. Черноризов, Д.К. Нилов, Н.В. Шошина, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис, А.А.
Пименова, Е.М. Еременко, А.В. Казначеева, Б.С. Оникиенко, Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий (Государственный контракт № 02.512.11.2249 от «07» июля 2008 г. По теме: «Создание препаратов, стимулирующих шаперонную функцию клетки и предназначенных для терапии нейродегенеративных патологий»), Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые Системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 8-10 декабря 2008 г., с.142;
Список сокращений:
NEF – nucleotide exchange factor, фактор нуклеотидного обмена;
МД – молекулярная динамика;
РСА – рентгеноструктурный анализ;
ЯМР – ядерный магнитный резонанс;
SBD – substrate binding domain, субстрат-связывающий домен;
RMSD – root mean square deviation, среднеквадратичное отклонение;
GSH - N-(фенилацетил)-глутатион;
NAC - N-(феноксиацетил)-L-цистеин;
NMC - N-((R)-манделил)-(S)-цистеин.
- 23