Изучение кольцевых и фибриллярных белков, преобразующих энергию деполимеризации микротрубочек в движение.
На правах рукописи
ВОЛКОВ Владимир Алексеевич ИЗУЧЕНИЕ КОЛЬЦЕВЫХ И ФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ, ПРЕОБРАЗУЮЩИХ ЭНЕРГИЮ ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИИ МИКРОТРУБОЧЕК В ДВИЖЕНИЕ.
03.01.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный консультант:
д.б.н., проф. Ф.И. Атауллаханов Москва, 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук.
Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор И. А. Воробьев доктор биологических наук, профессор Е. С. Надеждина Ведущее учреждение – Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
Защита состоится мая 2011 г. в 11 часов « 19 » на заседании диссертационного совета Д.002.252.01 при Учреждении Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Автореферат разослан « 19 » апреля 2011 г.
Ученый секретарь доктор медицинских наук, диссертационного совета Николаева И. С.
-2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Основная задача делящейся клетки – обеспечить равное разделение генетического материала между дочерними клетками (Алов 1972). Каждая из двух сестринских хроматид в хромосоме должна уйти в свою клетку. Это возможно с помощью полярных белковых полимеров – микротрубочек, которые во время митоза образуют веретено деления.
Микротрубочки являются механическими элементами цитоскелета, и в то же время высоко динамичны. Своими минус-концами они прикрепляются к полюсам веретена деления, а плюс-концы постоянно удлиняются и укорачиваются, и способны присоединяться к хромосомам и двигать их.
Хромосомы присоединяются к микротрубочкам с помощью белкового суперкомплекса, называемого кинетохором (McIntosh et al. 2002, Maiato et al.
2004, Westermann et al. 2007). Каждая хроматида из пары, составляющей хромосому, прикрепляется к микротрубочкам, идущим от своего полюса.
Кинетохоры крепко связываются с динамическими концами (плюс-концами) микротрубочек, однако субъединицы тубулина по-прежнему могут добавляться или отсоединяться от концов микротрубочек. Понимание механизма, который бы позволял этому закреплению быть одновременно стабильным (нестабильные закрепления приводят к потере хромосом и анеуплоидии) и в то же время динамичным (нарушение динамики микротрубочек останавливает митоз) – один из основных вопросов в области биологии, изучающей деление клетки. Сегодня известно более 100 белков, входящих в состав кинетохора, однако ясной картины механической машины, обеспечивающей его связь с микротрубочкой, до сих пор нет. Сложность связана как с разнообразием теоретических представлений о потенциальном принципе работы такого устройства, так и с тем, что экспериментальная проверка подобных гипотез зачастую была невозможна из-за отсутствия биохимических кандидатов на роль этих устройств.
В связи с этим актуальны исследованиия сопрягающих свойств наиболее вероятных кандидатов на роль посредника между микротрубочкой и кинетохором. Такими кандидатами в настоящее время считаются комплекс а -3 Dam1/DASH, а также компоненты супер-комплекса KMN (KNL-1, Mis12, Ndc80). Комплекс Dam1/DASH может существовать в виде колец и спиралей, также предполагается существование олигомеров меньшего размера.
Компоненты суперкомплекса KMN Ndc80 и KNL1 имеют форму фибрилл. В качестве необходимого этапа такие исследования должны включать сравнение полученных данных с математическими моделями передвижения груза разбирающейся микротрубочкой посредством кольца (Efremov et al., 2007) или фибрилл (McIntosh et al., 2008).
Цель работы: Экспериментальное исследование движения белковых комплексов Dam1, Ndc80, Mis12 и белка KNL1 за деполимеризующимися микротрубочками.
Задачи исследования:
Исследовать свойства кольцевых и иных комплексов 1.
Dam1, взаимодействующих с деполимеризующимися микротрубочками.
Выяснить возможный механизм сопряжения движения груза с деполимеризацией микротрубочки при помощи кольцевых комплексов Dam1.
Выяснить экспериментальную возможность работы такого 2.
сопрягателя на основе фибриллярных белковых комплексов.
Научная новизна.
В работе впервые установлено, что комплекс Dam1 образует на динамических микротрубочках как кольца, так и комплексы меньшего размера.
Показано, что максимальный размер олигомера, который способен двигаться под действием деполимеризации микротрубочки, не превышает одиночного кольца. Установлено, что кольца замедляют разборку микротрубочки, причем размер и скорость двигающегося комплекса не изменяются во время движения.
При этом, если олигомеры большего размера образуются спонтанно или в результате столкновения двух колец, то разборка микротрубочки приостанавливается до тех пор, пока кольцо, находящееся ближе к плюс-концу -4 микротрубочки, не разрушится. Показано, что существует два различных механизма движения груза (стеклянного шарика) за концом микротрубочки с участием комплексов В случае, когда шарик прикреплен к Dam1.
микротрубочке через кольцо, шарик двигается медленно, не меняя своей ориентации относительно микротрубочки. Если же шарик, покрытый Dam1, прикреплен без участия кольца, то он двигается быстро и катится по поверхности микротрубочки. На основании совокупности полученных данных сделан вывод, что движение хромосом в клетке почкующихся дрожжей происходит с участием колец. Методами флюоресцентной и электронной микроскопии установлено, что комплексы Dam1, которые не образуют колец, весьма разнообразны по своему размеру и форме. Показано, что такие комплексы также способны двигаться с концом разбирающейся микротрубочки.
Установлено, что фибриллярные белки, которые не могут образовывать колец в принципе, также способны преобразовывать усилие, развиваемое при деполимеризации микротрубочки, в движение груза. Этот результат подтверждает опубликованные данные о разной роли компонентов супер комплекса KMN в связывании кинетохора с микротрубочкой.
Научно-практическое значение.
Фундаментальным результатом данной работы является вклад в понимание механизмов присоединения кинетохоров к микротрубочкам во время деления клетки.
Основные положения, выносимые на защиту:
Описаны два принципиально отличающихся механизма 1.
взаимодействия комплекса Dam1 с микротрубочкой: кольца (19 ± гетеродекамеров), и более мелкие олигомеры (9 ± 1 гетеродекамеров).
Более крупные олигомеры не двигаются по микротрубочке.
Охарактеризованы два механизма, с помощью которых 2.
Dam1 трансформирует энергию деполимеризации микротрубочки в -5 движение груза. Первый механизм существует в отсутствие колец, и шарик в этом случае быстро катится по микротрубочке. Второй механизм представляет собой медленное скольжение шарика, связанного с кольцом на микротрубочке.
Фибриллярные комплексы, входящие в состав супер 3.
комплекса KMN, охарактеризованы в отношении их сопрягающих свойств. Наилучшими сопрягателями из них являются белок KMN и комплекс Ndc80, которые обеспечивают непрерывное движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Dam1 (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.
Апробация работы состоялась 15 февраля 2011 г. на заседании межлабораторного семинара лаборатории молекулярных механизмов гемостаза и лаборатории физиологии и биофизики клетки в Учреждении Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Материалы диссертации докладывались на международной конференции 48th annual meeting of American Society for Cell Biology (San Francisco, CA, США, 13-17 декабря 2008 г.) и международной конференции 54th Annual Meeting of the Biophysical Society (San Francisco, CA, США, 20- февраля 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 2-х конференций и 3 статьи.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 95 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав (глава 1 – обзор литературы, глава 2 – материалы и методы исследования, глава 3-5 – описание результатов, глава 6 – обсуждение результатов) и библиографического указателя, включающего 77 источников. Диссертация содержит 1 таблицу и рисунка. Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии наук Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в -6 лаборатории физиологии и биофизики клетки (зав. лабораторией д.б.н. проф.
Атауллаханов Ф.И.) и в Университете штата Колорадо (зав лабораторией проф.
Ричард Макинтош).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Современные представления. Микротрубочки – элементы цитоскелета клетки, играющие важнейшую роль при ее делении и образующиеся в результате полимеризации тубулина в присутствие гуанозинтрифосфата (ГТФ).
Димеры и -тубулина формируют линейные цепи, протофиламенты, которые латерально соединяются и образуют полые трубочки диаметром 25 нм. По мере полимеризации микротрубочки ГТФ, связанный с молекулами тубулина в ее стенке, гидролизуется, и равновесная конформация протофиламентов меняется с выпрямленной на изогнутую, затем происходит деполимеризация микротрубочки Показано, что микротрубочки, (Chretien et al., 1995).
деполимеризующиеся in vitro, способны переносить грузы (Coue et al. 1991) и развивать силу без участия дополнительных структур (Grishchuk et al. 2005).
Сила, которая потенциально может быть развита микротрубочкой, была экспериментально оценена в 70 пН (Молодцов 2007), что на порядок превышает силы, развиваемые АТФ-зависимыми молекулярными моторами.
Теоретические исследования потенциальных механизмов преобразования силы, развиваемой выгибающимися протофиламентами, в полезное движение, предсказали, что оптимальным с энергетической точки зрения сопрягающим устройством является кольцо, диаметр которого на 3-5 нм больше диаметра микротрубочки (Molodtsov et al. 2005). Подобный белковый комплекс, названный Dam1 или DASH, был найден в клетках почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae и было показано, что удаление его компонентов из клетки ведет к нарушению связи микротрубочек с хромосомами во время митоза и гибели клетки. При экспрессии всех 10 компонентов этого комплекса в бактериальных клетках, последующей биохимической очистке и исследовании смеси очищенного препарата Dam1 и микротрубочек in vitro -7 было обнаружено, что на микротрубочках образуются кольца диаметром около 35 нм (Miranda et al. 2005, Westermann et al. 2005).
Более детальное теоретическое исследование кольца Dam1 было проведено в работе (Efremov et al. 2007). Было предсказано два потенциальных механизма движения подобного кольца вдоль микротрубочки. Если кольцо связано с микротрубочкой слабо, работает механизм «ограниченной диффузии»:
тепловые движения кольца вдоль микротрубочки ограничены лишь раскрытым «венчиком» протофиламентов на плюс-конце микротрубочки. В этом случае кольцо не должно замедлять разборку микротрубочки, и максимальная сила, которую может развить микротрубочка на груз, присоединенный через такое кольцо, не превышает 15 пН. В случае же сильного связывания кольца с микротрубочкой работает механизм движения»:
«вынужденного самопроизвольные тепловые движения кольца на микротрубочке пренебрежимо малы и протофиламентам необходимо приложить усилие, чтобы сдвинуть кольцо. В этом случае кольцо замедляет скорость разборки микротрубочки в 2- раза, а максимальная сила составляет около 40 пН.
В экспериментах in vitro было показано, что флюоресцентные комплексы способны передвигаться за концами деполимеризующихся Dam микротрубочек (Westermann et al. 2006). При этом на основании комбинации этих данных с исследованиями при помощи электронной микроскопии был сделан вывод о том, что за концом микротрубочки могут следовать кольца и комплексы из многих колец. Известно, что пробоподготовка для электронной микроскопии весьма специфична и часто приводит к частичному искажению клеточных структур (Hg et al. 2010), поэтому такой метод определения строения двигающихся комплексов Dam1 кажется сильно опосредованным.
В другой работе к динамическим микротрубочкам присоединялись микросферы, покрытые Dam1 (Asbury et al. 2006), и затем движения шариков отслеживались при помощи лазерного пинцета. В этом исследовании было установлено, что на шарики, присоединенные к микротрубочкам через Dam1, способны двигаться за концом разбирающейся микротрубочки как без нагрузки, так и при постоянной приложенной нагрузке в 0.5-3 пН. На основе того, что -8 шарик, передвигаемый ловушкой, не мог продвинуться дальше предполагаемого места прикрепления микротрубочки к покровному стеклу, авторы делают вывод о том, что шарик прикреплен к микротрубочке посредством кольца. Однако такой метод определения структуры олигомера также является весьма непрямым и спорным. Кроме того, дальнейшие исследования, проведенные этой группой, показали, что даже мономеры Dam способны связываться с микротрубочкой и передвигаться по ней (Gestaut et al.
2008), следовательно кольца не являются необходимыми для поступательного движения Dam1 по микротрубочке.
Гомологи Dam1 не встречаются за пределами царства грибов, другие кольцеобразующие комплексы также пока не обнаружены. Считается, что основным устройством, сопрягающим разборку микротрубочек с передвижением хромосом в высших эукариотах служит супер-комплекс KMN, состоящий из двух фибриллярных микротрубочко-связывающих комплексов Knl1 и Ndc80 и соединяющего их комплекса Mis12 (Cheeseman et al. 2006).
Удаление любого из этих комплексов из делящихся клеток ведет к практически полному отсутствию связывания между микротрубочками и кинетохорами хромосом. Исследование возможности прямого сопряжения передвижения груза с деполимеризацией микротрубочки с помощью этих комплексов in vitro является важной, но еще не решенной задачей.
Материалы и методы исследования.
Реагенты и белки. Dam1 выделялся и метился как описано в работе (Westermann et al. 2005). Тубулин очищался из коровьего мозга по методу циклической полимеризации с последующим разделением на фосфо целлюлозной смоле как описано в работе (Weingarten et al., 1975), и затем метился родамином по стандартному протоколу (Hyman et al. 1991).
Негидролизуемый аналог ГТФ, GMPCPP, был приобретен у Jena Bioscience.
Микро-шарики были приобретены у Bangs Laboratories, Inc. и Spherotech.
Остальные реактивы закупались у Sigma-Aldrich.
Работа с динамическими микротрубочками. Приготовление проточных камер и очистка тубулина проводились как описано в работах (Grishchuk et al., -9 2005;
Grishchuk and Ataullakhanov, 2010). В экспериментах, где требовалось геометрически заблокировать образование колец, микротрубочки полимеризовались из смеси немеченного и биотинилированного тубулина в соотношении 2.5:1, стабилизировались добавлением таксола и прикреплялись к покровному стеклу, покрытому стрептавидином. В остальных экспериментов для нуклеации микротрубочек использовались адсорбированные на покровное стекло очищенные аксонемы, полученные из хламидомонад, или инактивированные клетки Tetrahymena. Рост микротрубочек индуцировался вмыванием в проточную камеру, находящуюся под микроскопом при температуре 32°С, 1-3 мкМ тубулина в 40 мкл буферного раствора, содержащем 1 мМ ГТФ, 80 мМ K-Pipes pH 6.9 (BRB-80), 0.5 мг/мл казеина и 1 мМ DTT.
После 5-10 минут инкубации немеченый тубулин заменялся на меченый родамином, а ГТФ – на GMPCPP. После еще 5-10 минут инкубации тубулин и нуклеотиды удалялись и в камеру вводился раствор, содержащий 1-20 нМ Dam или 0.01% стрептавидиновых шариков, покрытых анти-пентагистидиновыми антителами и затем Dam1 (по массе). Для приготовления шариков с неравномерной флюоресценцией мы использовали монослой равномерно покрытых анти-пентагистидиновыми антителами шариков диаметром 0.97 мкм путем кратковременного центрифугирования через фильтр с диаметром пор 0. мкм (Nanosep MF, Pall corp.). Затем на нижнюю поверхность фильтра наносилась 1-микролитровая капля немеченного Dam1 и фильтра оставлялся на 10 минут, чтобы белок мог продиффундировать вверх к шарикам, но не выше 0.5 мкм. Затем шарики отмывались и насыщались флюоресцентным Dam1.
Шарики, покрытые компонентами KMN. Для преодоления этого препятствия полистиреновые шарики с ковалентно 0.97-микронные присоединенным стрептавидином (Bangs Laboratories) до инкубаций с белками помещались в 2% желатиновый гель, что предотвращало их взаимодействие друг с другом во время инкубаций, но позволяло взаимодействие с растворенными белками. Шарики затем инкубировались с биотинилирован ными анти-пентагистидиновыми антителами, либо с биотинилированными F(ab) фрагментами анти-кроличьих вторичных антител (Invitrogen) и затем с приготовленными в лаборатории Иена Чизмана кроличьими антителами к - 10 специфическим субъединицам белковых комплексов (анти-Spc24 или анти Spc25 для комплекса Ndc80, анти-KBP1 для комплексов Mis12 и Mis12-KNL1, анти-KNL1 для белка KNL1 и анти-Nuf2 для «головы» комплекса Ndc80, состоящей из белков Ndc80 и Nuf2). Результаты, полученные для анти пентагистидиновых и специфичных антител, не различались, поэтому были сгруппированы. После отмывки и 3-часовой инкубации с необходимым компонентом комплекса KMN гель расплавлялся при 37°С и шарики отмывались еще два раза. Присоединение шариков к микротрубочкам проводилось как описано выше.
Результаты.
Размер комплексов Dam1, следующих за концом микротрубочки. После введения комплексов Dam1, меченых флюоресцентной краской Alexa-488, в проточную камеру с сегментированными микротрубосками, они образовывали вдоль микротрубочек неподвижные зеленые точки различной интенсивности.
После разрушения стабилизирующей шапки на сегментированной микротрубочки, декорированной Alexa488-Dam1, за ее укорачивающимся концом с постоянной скоростью следовала зеленая точка (Рис. 1). На участках линейного движения по трубочке, свободной от других комплексов, яркость концевого комплекса также была неизменной, что указывает на постоянство структуры концевого комплекса. Тем не менее, устойчивое движение комплексов иногда прерывалось. Когда двигающийся комплекс Dam Б А плюс-конец Интенсивность конца, красные точки (у.е.) Длина микротрубочки, синие точки (мкм) 235 с плюс-конец пауза снижение яркости 2 мкм линейные сегменты Время (с) 0 Рис. 1. Кимограмма (А) и обработка (Б) движения Alexa488-Dam1 по деполимеризующейся микротрубочке. Большинство образованных из Dam1 дикого типа точек не двигаются до тех пор, пока до них не дойдет конец микротрубочки.
Диффузия комплексов, помеченногых треугольником, составила 10-13 см2/с.
Вертикальные цветные линии на этой и других кимограммах показывают флюоресцентный канал, в котором производилась съемка.
- 11 сталкивался с другим ярким комплексом на поверхности трубки, движение обычно приостанавливалось. Чаще всего движение продолжалось после снижения суммарной яркости комплекса до начального уровня (Рис. 1), что является сильным аргументом в пользу существования устойчивого размера двигающегося комплекса. Для того, чтобы оценить количество субъединиц Dam1 в двигающихся комплексах, мы вначале измерили кинетику выцветания флюоресценции неподвижно прикрепленных к стеклу точек Alexa488-Dam1.
Если подобные слабо светящиеся точки расфокусированным лучом аргонового лазера с длиной волны в 488 нм их интенсивность снижается ступенчато (Рис.
2). Чтобы удостовериться в этом наблюдении и определить размер единичной ступеньки, мы использовали два алгоритма: аппроксимация распределения интенсивностей функцией Гаусса (Park et al., 2005) или методом распределения попарных разностей (Block et al., 1995). С помощью каждого из методов мы обнаружили статистически достоверное ступенчатое изменение интенсивности флюоресценции (p 10-5). Яркость единичного флюорофора Alexa488 в нашей системе составила по результатам этих алгоритмов, соответственно 15800 ± 1200 или 16362 ± 1990 условных единиц (Рис. 2). Используя молярное соотношение количества флюорофоров и белка (2.1 ± 0.1), из начальной яркости пятна можно вычислить количество субъединиц Dam1 в этом пятне. Тусклые, неподвижно прикрепленные к стеклу точки сождержали в себе 1.9 ± 0.4 (n = 44) А В Б Количество событий пятна Dam Интенсивность·104 (у.е.) Количество событий аппроксимация 5. 40 30 2. 1 ступень 0.0 0 5 10 15 20 25 Количество 0 5 0 0 субъединиц Dam Время (с) Интенсивность ·104 (у.е.) Рис. 2. (А) Типичные кривые выцветания прикрепленных к покровному стеклу тусклых точек Dam1. Размер ступеньки на этих кривых соответствует значению, определенному с помощью двух разных алгоритмов. (Б) Гистограмма интенсивностей для 17 выцветающих точек Dam1 (всего 486 значений интенсивностей) и аппроксимация эквидистантными Гауссовыми распределениями. (В) Распределение размеров комплексов, двигающихся за концом микротрубочки.
- 12 гетеродекамера, то есть являлись димерами. Распределение интенсивностей точек, двигающихся за концом разбирающихся микротрубочек и снятых в тех же экспериментальных камерах и в идентичных условиях, имело отчетливый пик, который, при аналогичном пересчёте, соответствовал 19 ± 3 (n = 18) гетеродекамерам (Рис. 2). Мы делаем вывод, что олигомеры, которые отслеживают концы укорачивающихся микротрубочек, могут быть единичными кольцами, но не двойными.
Взаимодействие покрытых Dam1 шариков с микротрубочками. В предыдущих исследованиях было показано, что шарики, покрытые белком могут поступательно двигаться за концом разбирающейся Dam1, микротрубочки (Westermann et al., 2006;
Asbury et al., 2006;
Franck et al., 2007).
В нашей системе шарики, покрытые Dam1, тоже часто связывались с трубочками, преинкубированными с Alexa488-Dam1, а когда запускалась их разборка, поступательно двигались. В нашей системе шарики, следующие за концом микротрубочки, были крепко связаны с кольцом Dam1, что подтверждается следующими двумя наблюдениями. Во-первых, при низком дистальный комплекс Длина микротрубочки (мкм) шарик 20 70 120 -30 20 70 120 170 Время (с) Рис. 3. Покрытый Dam1 шарик следовал за концом сокращающейся микротрубочки, пока не отсоединился при встрече со связанным со стенкой микротрубочки комплексом Dam1 (черная линия). На вставке показано начальное изображение микротрубочки, декорированной Dam1, с шариком (зеленый) и шапкой (красный).
- 13 уровне декорации микротрубочки комплексами Dam1 поступательно движение шариков было аналогично непрерывному отслеживанию конца микротрубочки комплексами Dam1 на участках микротрубочек, свободных от других комплексов. При более высокой плотности Dam1 на трубочках двигающиеся шарики иногда встречали неподвижные комплексы Dam1. Подобные события часто приводили к отсоединению шарика (Рис. 3), как и ожидалось по результатам описанных выше экспериментов по изучению потери субъениц Dam1. Во-вторых, мы протестировали гипотезу о закреплении через кольцо, изучив движения шариков, которые следовали за концом укорачивающихся микротрубочек, в трех измерениях. Если шарик присоединен к трубочке через кольцо, это движение должно представлять собой простое скольжение вдоль ее стенки, так что любая точка на поверхности шарика, а не только его центр, будет двигаться параллельно оси микротрубочки. Чтобы проверить это предположение, мы пометили одну сторону наших шариков флюоресцентным Dam1, а затем насытили все остальные сайты связывания немеченым Dam1.
Подобная Во-вторых, мы протестировали гипотезу о закреплении через кольцо, изучив движения шариков, которые следовали за концом укорачивающихся микротрубочек, в трех измерениях. Если шарик присоединен к трубочке через кольцо, это движение должно представлять собой простое скольжение вдоль ее стенки, так что любая точка на поверхности шарика, а не только его центр, будет двигаться параллельно оси микротрубочки. Чтобы проверить это предположение, мы пометили одну сторону наших шариков флюоресцентным Dam1, а затем насытили все остальные сайты связывания немеченым Dam1.
Подобная обработка позволила нам получить шарики, однородно покрытые белком, но неоднородно флюоресцентные. Когда такие шарики были помещены в камеру с микротрубочками в присутствии растворимого Dam1, они скользили вдоль трубочек, как и ожидалось при закреплении через кольцо.
Нужны ли кольца для транспортировки шариков разбирающимися микротрубочками? Чтобы ответить на этот вопрос, мы покрыли шарики Alexa488-Dam1, затем тщательно отмыли их от свободного белка. Эти шарики связывались только с частью микротрубочек, выращенной в присутствии GMPCPP, и не связывались с ГДФ-содержащими сегментами. Даже если - 14 шарики были прижаты к стенке трубки с помощью лазерной ловушки, в отстутствие Dam1 в расторе они не связывались с ГДФ-содержащими микротрубочками. Из этого следует, что в отсутствие растворимого Dam1 связи между шариком и микротрубочками образуются с участием только нескольких гетеродекамеров Dam1, а кольцо не образуется. Эти слабые связи, видимо, стабилизируются более высокой аффинностью Dam1 к GMPCPP-содержащим сегментам микротрубочек (Westermann et al., 2005).
После фото-разрушения GMPCPP-содержащих шапок 46% из шариков отсоединились, а остальные поступательно двигались в сторону минус-конца микротрубочек со скоростью 30 ± 1 мкм/мин. Подобное отслеживание конца трубочек шариками, покрытыми Dam1 в отсутствие Dam в растворе, ранее было интерпретировано как результат действия связанных с шариками колец, которые неким образом образовывались из Dam1, отсоединяющегося от шариков (Asbury et al., 2006;
Franck et al., 2007). Если эта интерпретация верна, то добавление растворимого Dam1 в систему не повлияет на кинетику, однако в присутствие Dam1 в растворе скорость движения шариков упала до 8 ± 1 мкм/мин (Рис. 4А). Следует заметить, что шарики, покрытые Dam1, ускоряли деполимеризацию микротрубочек (в нашей системе 22 ± 2 мкм/мин, n = 57), когда в растворе отсутствовал Dam1. В противоречие гипотезе о том, что кольца образуются из отсоединяющегося от шариков белка, А Б 0. в присутствие Dam1 в растворе (N=119) Скорость относительно 160 N= в отсутствие Dam1 в растворе свободной МТ (%) (N=280) 0.2 140 N= Частота N= 0.1 свободная MT 10 102 103 0. Количество комплексов 0 10 30 50 70 90 110 130 скорость движения шарика (мкм/мин) Dam1 на шарике Рис. 4. (А) Распределение скоростей движения покрытых Dam1 шариков под действием разборки микротрубочек. Когда в растворе есть свободный Dam1, шарики движутся значительно медленнее, чем в его отсутствие. (Б) Зависимость относительных скоростей движения покрытых Dam1 шариков (в отсутствие растворимого Dam1) от плотности Dam1 на поверхности шарика, выраженной в числе молекул и отложенной на логарифмической шкале.
- 15 Б A Есть кольцо, шарик скользит присоединен к стеклу покрыт стрептавидином покрыт Dam1 + Dam1 в растворе Нет кольца, шарик вращается покрыт Dam1 без Dam1 в растворе В 0. Стандартное отклонение до начала движения проекций (мкм) во время движения 0. н.д. н.д.
0. - Dam1 + Dam покрытые Dam (N=12;
N=12) Рис. 5. (А) Схема экспериментальной системы, в которой исследовалась вращательные движения шариков в присутствие (вверху) и в отсутствие колец (внизу) (не в масштабе). Красным отмечены проекции на ось МТ вектора от центра шарика до яркой флюоресцентной точки. Ротационные движения шариков шариков диаметром 1 мкм, покрытых стрептавидином или Dam1 и прикрепленных к МТ, были исследованы до и после начала деполимеризации МТ (двигались только шарики, покрытые Dam1). Шарики с Dam1 на поверхности исследовались в присутствие и отсутствие Dam1 в растворе, шарики со стрептавидином на поверхности присоединялись к биотинилированным МТ, шарики, прикрепленные к стеклу, служили дополнительным контролем. На (Б) представлены экспериментальные фотографии шариков из четырех исследованных групп.
Вращение яркого пятна относительно центра шарика видно только для шарика, покрытого Dam1 в отсутствие Dam1 в растворе. (В) Средние значения стандартных отклонений проекций вектора, соединяющего центр шарика с центром флюоресцентного пятна, для всей выборки шариков.
- 16 скорость движения шариков увеличивалась еще больше при увеличении концентрации Dam1 на шарике (Рис. 4Б). Кроме того, шарики, покрытые фосфо-миметическим комплексом у которого нарушена Dam1 S4D, олигомеризация (Wang et al., 2007), тоже двигались за концами микротрубочек.
Наконец, Dam1-шарики двигались за концами микротрубочек даже в отсутствие ME. Это означает, что для такого типа движений нужны биохимически иные требования по сравнению с движением колец. Из этих результатов следует, что шарики, покрытые Dam1, могут транспортироваться деполимеризующейся микротрубочкой и в отсутствие колец. В более ранние исследованиях, в которых такие шарики использовались без Dam1 и МЕ в растворе (Asbury et al., 2006;
Franck et al., 2007), скорее всего наблюдались движения, не зависящие от наличия колец.
Ранее высказывалось предположение о том, что шарик, покрытый микротрубочко-связывающим белком, может катиться по поверхности микротрубочки (Lombillo et al., 1995b, Peskin et al., 1995;
Tao et al., 1998). Чтобы проверить эту модель, мы использовали описанный выше подход с использованием неоднородно флюоресцентных шариков. В отсутствие свободного Dam1 некоторые из шариков, покрытых Dam1, явственно вращались во время движения по разбирающейся микротрубочке (Рис. 5Б), что несовместимо с идеей прикрепления через кольцо. Однако вращение было очевидным только в случае, когда плоскость вращения шарика перпендикулярна оптической оси. Поскольку положение шарика случайно, а тепловые движения значительны, для оценки величины вращения шарика мы измеряли проекцию наиболее яркой точки шарика на ось микротрубочки в плоскости изображения (Рис. 6). Шарики, двигающиеся за разбирающейся микротрубочкой, вращались гораздо сильнее, чем (а) те же шарики до начала движения;
(б) шарики, наблюдаемые в присутствие растворимого Dam1;
(в) шарики, неподвижно прикрепленные к трубочке с помощью биотин стрептавидиновой связи или (г) просто шарики, прилипшие к покровному стеклу (Рис. 5В). Хромосомы не вращаются во время митоза, поэтому кажется маловероятным, что механизм, которым некольцевые комплексы Dam обеспечивают движение шариков, имеет отношение к ситуации in vivo.
- 17 Покрытый Dam1 без Покрытый Dam1 + Dam 7 Dam1 в растворе в растворе Y (мкм) центр флюоресценции центр шарика X (мкм) X (мкм) 0 1 234 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 микротрубочки (мкм) 0. проекция на ось SD=0. 0.5 SD=0. 2.5 5.0 7. 0. 0. 10 20 30 40 -0.5 -0. Время (с) Время (с) Прикрепленный к стеклу Покрытый стрептавидином Y (мкм) центр флюоресценции центр шарика 1 X (мкм) X (мкм) 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 микротрубочки (мкм) 0. 0.5 SD=0.08 SD=0. проекция на ось 10 20 25 0.0 0. -0.5 -0. Время (с) Время (с) Рис. 6. Здесь представлены движения одиночных шариков из каждой категории.
На верхних графиках представлены траектории центра шарика (красные кривые) и яркого пятна на поверхности шарика (зеленые кривые). Вставки показывают движения яркого пятна (зеленые кривые) на поверхности шарика относительно его центра (красный кружок). Размер сетки 0.25 мкм. На нижних графиках представлены временные зависимости проекций на ось МТ вектора, соединяющего центр шарика и яркое пятно на его поверхности для этих четырех шариков. Стандартные отклонения этих кривых от среднего значения (SD) были выбраны мерой вращательной активности шариков.
- 18 Некольцевые и фибриллярные сопрягающие устройства. Результаты, описанные выше, свидетельствуют о том, что гетеродекамеры Dam1 могут связываться с микротрубочкой и даже обеспечивать движение шариков, не образуя колец. Тем не менее, структурные исследования методами электронной микроскопии говорят о преобладающе высокой частоте встречаемости колец по сравнению с некольцевыми комплексами (Рис. 3.1 Б, Miranda et al., 2005;
Westermann et al., 2005). Однако если кольца выдерживают пробоподготовку лучше мелких комплексов или просто лучше видны, может наблюдаться систематическая ошибка в оценке частоты их встречаемости. Будет ли Dam1 связываться с микротрубочкой в ситуации, когда кольца не могут образовываться? Для ответа на этот вопрос мы прикрепили биотинилированные трубочки к покровному стеклу, покрытому стрептавидином, по всей длине трубочки, таким образом мешая образованию опоясывающих микротрубочки структур (Рис. 7А). Точки Alexa488-Dam1 по-прежнему связывались с такими микротрубочками, образуя быстро диффундирующие флюоресцентные точки, которые часто соединялись и разъединялись между собой (Рис. 7Б). Как и следовало ожидать для случайно диффундирующих частиц, связанных с субстратом различным количеством связей, скорость движения этих пятен уменьшалась с увеличением числа связей олигомера с микротрубочкой, что положительно коррелировало с интенсивностю флюоресценции (Рис. 7В). При исследовании таких препаратов с помощью электронной микроскопии после легкой фиксации для стабилизации слабых взаимодействий, мы обнаружили комплексы различной формы и размера, некоторые из которых напоминали дуги (Рис. 7Г). Таким образом, гетеродекамеры Dam1 могут связываться с микротрубочками не только в виде кольцеобразных образований (Miranda et al., 2005;
Westermann et al., 2005), но и в виде подвижных, структурно разнообразных комплексов, которые мы назвали «бляшками».
В литературе описаны данные, подтверждающие идею о возможности процессивного движения груза за концом деполимеризующейся микротрубочки с помощью нитевидных белков. Хромосомы могут двигаться за деполимеризующимися трубочками in vitro в присутствие менее 1 нМ свободных нуклеотидов (Coue et al., 1991), и это движение блокируется домен - 19 В A неполные кольца и бляшки 0. диффузии (мкм2/с) 38 пятен Dam1 были иммобилизующий прикрепленная Коэффициент отслежены в течение 0. слой микротрубочка 705 временны х точек 0. 0. покровное стекло Б 10- 0. 0. 10 12 14 16 Интенсивность пятна (у.е.) 20 с 4 мкм Г 1 2 50 нм Рис. 7. (А) Схема экспериментальной системы, позволяющей пространственно помешать образованию колец (не в масштабе). (Б) Кимограмма, иллюстрирующая временные изменения в положении и яркости точек Alexa488 Dam1 на прикрепленной к стеклу микротрубочке. (В) Зависимость коэффициентов диффузии комплексов Dam1 от их начальной интенсивности. (Г) Электронные микрофотографии микротрубочек, присоединенных к иммобилизирующему слою в отсутствие (1) и в присутствие (2, 3) Dam1, полученные методом окраски уранил-ацетатом. Изображение на панели 3 было получено предварительной инкубацией микротрубочек с растворимым Dam1, затем их присоединением к иммобилизирующему слою в присутствие Dam1, так, чтобы могли образоваться и кольца, и некольцевые структуры (отмечены белыми стрелками). На панели 4 показан пример кольца Dam1, которое образуется на микротрубочке, погруженной в раствор.
- 20 специфичными антителами к шейке кинетохорного кинезина CENP-E (Lombillo et al., 1995a). Этот фибриллярный процессивный плюс-концевой мотор может присоединять кинетохоры к микротрубочкам таким образом, чтобы обеспечивалось их минус-концевое движение с концами укорачивающихся трубочками.
Другим кандидатом в фибриллярные сопрягающие устройства служит 57-нанометровый четырехкомпонентный комплекс Ndc80 (Hec1), который является высоко консервативным компонентом кинетохора и необходим для взаимодействия кинетохоров с микротрубочками во многих организмах (Davis and Wordeman 2007). В опубликованном недавно исследовании этот комплекс из C. elegans был восстановлен in vitro (Cheeseman et al., 2006). Это дало нам методическую возможность экспериментально проверить, не может ли он обеспечить движение шариков за деполимеризующимися микротрубочками.
Шарики, покрытые Ndc80, хорошо связывались с трубочками, причем 90% шариков связывалось с родамин-сордержащей стабильной «шапкой» (Рис. 8А, Б). После запуска разборки микротрубочки большинство шариков А Б 1-микронный шарик, покрытый комплексом NDC 0c 10 20 30 40 50 инактивированная клетка Tetrahymena Рис. 8. (А) Схема эксперимента (не в В масштабе). Последовательные (Б) изображения шарика, снятые в 10. указанное время в секундах. Последнее расстояние (мкм) изображение показывает траекторию 7. движения центра шарика (зеленая кривая). (В) Расстояния от шарика до 5. места нуклеации микротрубочки в зависимости от времени для семи 2. отдельных экспериментов. Движение 0. шарика начиналось вскоре после 0 25 50 75 100 разрушения шапки на микротрубочке.
время (с) - 21 Связыва- N (процес Белок или Успешность Скорость Пройденное Мак комплекс на присоедине ние сивных/ движения ± расстояние ± сималь (шариков поверхности ния всего) ст. ошибка ст. ошибка ный (мкм/мин) (мкм) шарика подтвержде на клетку пробег Tetrahyme (мкм) на na) антителами Контроль н. д. н. д. н. д.
(анти- + 0-5 0/ пентагист. АТ) 2-5 на н. д. 42 ± 9 2.3 ± 0. 5/80 5. Стрептавидин аксонему 5-10 на н. д. 37 ± 14 2.3 ± 0. MAP2 и tau 8/107 аксонему 15 ± 2 0.8 ± 0. Mis12 + 2-5 2/48 0. н. д. 24 ± 6 1.7 ± 0. KNL1 5-10 9/56 2. н. д. н. д. н. д. н. д. н. д.
KNL1-Mis12 5- Полный + 10-20 1/7 17.6 0.5 0. суперкомплекс KMN н. д. н. д. н. д.
Ndc80p + Nuf2p + 20 0/ Комплекс 18 ± 3 2.1 ± 0. + 20 21/211 9. Ndc 30 ± Dam1 20 193/420 Флюорес вся длина Dam1 + центный микротрубочки 8± 20 96/200 растворимый Dam Dam Таблица 1. Шарики диаметром 1 или 0.5 мкм покрывались белком или комплексом, указанным в первом столбце, как правило с помощью антител к шести-гистидиновому тэгу (кроме стрептавидина – через биотинилированный альбумин, и MAP – с помощью адсорбции). Специфичность и плотность присоединения оценивались с помощью соответствующих антител, меченых флюоресцентной меткой, или по флюоресценции самого комплекса. Затем шарики вмывались в камеру с динамическими сегментированными микротрубочками, запускалась разборка микротрубочек и изображения шариков записывались в режиме ДИК с частотой 2-5 кадров в секунду. «Н. д.» = нет данных.
отсоединялись, но 10% двигались в сторону минус-конца трубочки (n = 211).
Эти движения были менее длительными, чем движения шариков, покрытых Dam1, – средняя длина пробега составила 2.1 мкм, тем не менее некоторые шарики проходили до 9 мкм (Рис. 8Б, В). Эти движения были однонаправлены с движением деполимеризующегося конца микротрубочки с вероятностью 0.95.
Средняя скорость движения составила 18 ± 3 мкм/мин, примерно такая же, как скорость укорочения микротрубочки в нашей системе. Комплекс Ndc является частью кинетохорного супер-комплекса KMN, состоящего из белка Knl1 и комплексов Mis12 и Ndc80 (Cheeseman et al.,v 2006). При исследовании - 22 компонентов этого комплекса в нашей системе подтвердились полученные биохимически данные по связыванию компонентов этого комплекса с микротрубочкой: шарики, покрытые комплексом Mis12, связывались с МТ и двигались процессивно реже по сравнению с комплексом Ndc80, а Knl1 и полный супер-комплекс связывались и двигались за концом KMN микротрубочки чаще, чем сам Ndc80 (Таблица 1).
Результаты работы вносят важный вклад в понимание тонких механизмов передачи энергии деполимеризации микротрубочек в движение кольцевых сопрягателей и грузов, прикрепленных с их помощью. Кроме того, показаны способы передвижения грузов с помощью некольцевых приспособлений, а именно неполных колец и фибриллярных белковых комплексов.
ВЫВОДЫ.
Исследован характер взаимодействия кинетохорного комлпекса 1.
Dam1 с динамическими микротрубочками in vitro. Обнаружено, что они существуют в виде двух классов олигомеров: одиночных колец, состоящих из 19 ± 3 гетеродекамеров, и более мелких некольцевых олигомеров, содержащих от 2 до 16 гетеродекамеров.
Исследованы свойства этих классов олигомеров в 2. Dam отношении передвижения грузов с концом микротрубочки, обнаружено два различных механизма движения шариков. В отсутствие растворимого Dam шарики катятся по микротрубочке со скоростью 30 ± 1 мкм/мин, а при добавлении Dam1 в раствор шарики скользят вместе с кольцами со скоростью ± 1 мкм/мин.
KNL1 и Nd80, фибриллярные компоненты супер-комплекса KMN, 3.
обеспечивают движение 16 и 10% шариков, соответственно. Эти значения статистически отличаются от контрольного уровня, однако гораздо меньше, чем для шариков, покрытых Dam1 (около 50%). Тем не менее, у высших эукариот низкая эффективность сопрягающих устройств компенсируется увеличенным количеством микротрубочек, связанных с кинетохором.
- 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Grishchuk EL, Spiridonov IS, Volkov VA, Efremov A, Westermann S, Drubin D, Barnes G, Ataullakhanov FI, McIntosh JR. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. (2008), Proc. Natl. Ac. Sci, 105 (19): 6918-6923.
2. McIntosh JR, Grishchuk EL, Morphew MK, Efremov AK, Zhudenkov KV, Volkov VA, Cheeseman IM, Desai A, Mastronarde DN, Ataullakhanov FI. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores: A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. (2008) Cell 135: 322-333.
3. McIntosh JR, Volkov V, Ataullakhanov FI, Grishchuk EL. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. (2010) J Cell Sci 123: 3425-3434.
4. V. A. Volkov, E. L. Grishchuk, I. S. Spiridonov, A. Efremov, N.
Gudimchuk, S. Westermann, D. Drubin, G. Barnes, J. R. McIntosh, and F.
I. Ataullakhanov. Mechanisms of DAM1 complex motility with the ends of shortening microtubules. 48th annual ASCB meeting. December 13-17, 2008. San Francisco, CA.
5. V. A. Volkov, A. Zaytsev, F.I. Ataullakhanov, J.R. McIntosh, E.L.
Grishchuk. In vitro assays to study the coupling properties of the various kinetochore-associated protein complexes. 54th Biophysical Society Meeting. February 22-25, 2010. San Francisco, CA.
6. E.L. Grishchuk, V. A. Volkov, A. Zaytsev, F.I. Ataullakhanov, J.R.
McIntosh. In vitro Assays to Study Tracking of the Shortening Microtubule Ends and Measurement of the Associated Forces. 49th annual ASCB meeting. December 5-9, 2009. San Diego, CA.
- 24