Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидантного действия лекарственных препаратов
На правах рукописи
ЗАЙЦЕВ Валерий Геннадьевич МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ 14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Волгоград — 2001
Работа выполнена в Волгоградской медицинской академии Министерства Здравоохранения РФ НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
доктор медицинских наук, профессор Закревский В.И.
доктор медицинских наук, профессор Островский О.В.
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор медицинских наук, профессор И.Н. Тюренков доктор медицинских наук, профессор В.Б. Бородулин ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
НИИ фармакологии РАМН, г. Москва
Защита состоится «» 2001 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при Волгоградской медицинской академии (400066, Волгоград, пл. Павших борцов, 1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградской медицинской библиотеки.
Автореферат разослан «_» _ 2001 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук А.Р. Бабаева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы Существование живых организмов на Земле (за исключением некоторого количества облигатных анаэробных микроорганизмов) невозможно себе представить в отсутствии кислорода, являющегося неотъемлемым компонентом метаболических процессов в жи вых клетках. Однако существование организмов в богатой кислородом окружающей сре де несет в себе и постоянную угрозу для их существования (K.J. Davies, 1995;
J.S. Valen tine e.a., 1998).
При включении кислорода в процессы жизнедеятельности организмов постоянно в существенном количестве образуются различные активные формы кислорода (АФК) (Ю.А. Владимиров, 1998;
J.S. Valentine e.a., 1998). Одновременно, биомолекулы могут легко подвергаться окислению и разрушению под действием АФК (Е.Е. Дубинина, И.В.
Шугалей, 1993;
А.В. Пескин, 1997;
R.T. Dean e.a., 1997;
I. Fridovich, 1998;
B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999). Соответственно, выживание организмов в кислородной среде весьма сильно зависит от предотвращения и репарации окислительных повреждений в организме (K.J. Davies, 1995).
Для ограничения интенсивности свободнорадикальных процессов и уровня окисли тельных повреждений в живых организмах в ходе эволюции возникла особая антиокси дантная система (АОС), состоящая из большого числа согласованно работающих специ фических ферментов и группы низкомолекулярных природных антиоксидантов (АО) (Ю.А. Владимиров, 1998;
I. Fridovich, 1997;
B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999;
C.E. Pip penger e.a., 1998). При различных отклонениях от нормального функционирования орга низма может развиться дисбаланс между интенсивностью продукции АФК и свободнора дикального окисления (СРО) и уровнем функциональной активности АОС. Это, в свою очередь, вызывает усиление окислительных повреждений биомолекул, развитие дис функции клеток и тканей и, в конечном итоге, гибель организма (В.З. Ланкин и др., 2000;
B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999). При патологических состояниях у человека рассмот ренный дисбаланс может быть полностью или частично скорректирован применением в качестве лекарственных средств природных или синтетических АО (O.I. Aruoma, 1998;
C.A. Rice-Evans, A.T. Diplock, 1993).
К настоящему времени накоплен обширный материал о многих тонких механизмах протекания процессов СРО и предложено для медицинского применения значительное число антиоксидантных препаратов. Выяснены некоторые механизмы действия отдель ных групп химических соединений, проявляющих антиоксидантные свойства (Е.Б.Бурлакова и др., 1998;
Ю.А.Владимиров, 1998;
О.В. Васильева и др., 1998;
M. Patel, B.J. Day, 1999). Выявлены структурные компоненты, наличие которых в молекуле веще ства является необходимым или существенным фактором для проявления антиоксидант ных свойств. Однако использование разными исследовательскими группами отличаю щихся подходов для выявления антиоксидантных свойств у химических соединений соз дает определенные сложности в сравнении результатов (L.L. De Zwart e.a., 1999;
H. Ester bauer, 1996;
B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1995). Важнейшей методологической пробле мой является отсутствие детально разработанного комплекса систем моделирования СРО in vitro, позволяющего унифицированным образом осуществлять скрининг новых АО с требуемыми свойствами. Важной в этом плане представляется разработка модельных систем перекисного окисления липидов (ПОЛ), с помощью которых можно не только вы являть наличие антиоксидантных свойств у химических соединений в ходе систематиче ских скрининговых исследований, но и изучать одновременно механизм и особенности действия этих веществ в различных условиях протекания процессов ПОЛ.
Применение в таких исследованиях тест-систем с длительным протеканием ПОЛ мо жет позволить выявить отдаленные эффекты АО в условиях, когда с течением времени концентрация АО уменьшается, а интенсивность ПОЛ возрастает. Указанный подход мо жет оказаться полезным для моделирования in vitro поведения АО при длительном окис лительном стрессе организма, когда повышенная интенсивность ПОЛ наблюдается на фоне истощения пула АО (B. Halliwell, J.M.C. Gutteridge, 1999;
J.G. Scandalios, 1997).
Важно также отметить, что АО способны проявлять прооксидантные свойства (М.
Девис и др., 1999;
В.З. Ланкин и др., 1998;
H. Ohshima e.a., 1998). Условия и химико структурные основы стимуляции СРО под действием АО изучены недостаточно. Основ ными выявленными на сегодняшний день факторами, определяющими возможность ин версии антиоксидантных свойств, являются концентрация самого АО, концентрация и химическая структура субстрата окисления и наличие в реакционной среде катионов ме таллов переходной валентности (В.З. Ланкин и др., 1998;
G.R. Buettner, L. Milne, 1996;
M.J. Burkitt e.a., 1996;
A. Kontush e.a., 1996). В то же время вопрос о влиянии продолжи тельности протекания процесса ПОЛ на возможность возможности проявления проокси дантного действия АО остается открытым.
Понимание взаимосвязи между структурой АО и изменением их свойств в зависимо сти от временного этапа процесса СРО позволит приблизиться к возможности синтеза и выявления химических соединений с максимально предсказуемыми особенностями анти оксидантных свойств, на основе которых могли бы быть созданы новые лекарственные препараты с антиоксидантным действием.
Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской рабо ты Волгоградской медицинской академии и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградской медицинской академии (протокол № 4 от 8 декабря 1999 г.).
Цель исследования:
Разработка модельных тест-систем для скрининга и первичной оценки мишеней и особенностей действия антиоксидантов, а также оценка антиоксидантных и прооксидант ных свойств биологически активных веществ различной химической природы.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительное изучение и выбрать оптимальный метод оценки интенсивно сти перекисного окисления липидов в суспензии липосом.
2. Определить условия применения модельных систем перекисного окисления липидов на основе липосом для скрининга лекарственных препаратов антиоксидантного дей ствия, выявления мишеней и условий проявления антиоксидантной активности.
3. Установить особенности антиоксидантного действия химических соединений в зави симости от природы и свойств функциональных групп, определяющих антиоксидант ную активность соединений, на различных временных этапах перекисного окисления липидов.
4. Выявить у антиоксидантов различной химической природы возможность и условия потери антиоксидантных свойств и их трансформации (инверсии) в прооксидантные.
Научная новизна работы Доказано, что изменение концентрации карбонильных соединений, реагирующих с N (2,4-динитрофенил)гидразином (ДНФГ), может быть использовано для оценки интенсив ности ПОЛ в липосомальных модельных системах, в том числе при инициации ПОЛ ме таллами переходной валентности.
Показано, что использование тиобарбитуровой кислоты (ТБК) для определения про дуктов ПОЛ в целях оценки интенсивности ПОЛ может приводить к неадекватным ре зультатам в случае металлозависимой индукции ПОЛ.
Впервые обнаружено, что эффективность действия АО изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах. Выявлено, что на отсроченных этапах ПОЛ (длительность окисления 24 ч и более) антиоксидантная активность химических соедине ний может усиливаться, пропадать или инвертироваться в прооксидантную активность.
Впервые установлены характерные особенности динамики изменения эффективности антиоксидантного действия АО различной химической природы в ходе длительно проте кающего процесса ПОЛ в липосомальной модельной системе.
Практическая ценность работы Разработанные подходы к построению липосомальных модельных систем ПОЛ и спо соб оценки интенсивности ПОЛ в липосомах могут послужить основой для создания унифицированного комплекса методов выявления и оценки особенностей антиоксидант ного действия веществ различной химической природы в ходе скрининговых испытаний.
Описанная нами модельная система ПОЛ в условиях длительно протекающего окисления липосом позволяет выявлять наличие у конкретных АО зависимой от длительности пе риода протекания ПОЛ трансформации (инверсии) антиоксидантных свойств в проокси дантные.
Реализация результатов исследования Разработанная модельная система используется в исследованиях веществ с антиокси дантной активностью на кафедре фармакологии и в изучении процессов перекисного окисления липидов на кафедре биологической химии Волгоградской медицинской акаде мии. Методика определения карбонильных продуктов ПОЛ с использованием ДНФГ применяется в учебном процессе на кафедре биологической химии Волгоградской меди цинской академии.
Разработанный нами подход к оценке интенсивности ПОЛ в модельных системах оформлен рационализаторским предложением («Способ оценки интенсивности перекис ного окисления липидов в липосомах по содержанию карбонильных соединений», удо стоверение № 10–2001 от 6 февраля 2001 г., выданное Волгоградской медицинской ака демией). Разработаны методические рекомендации «Выявление и оценка особенностей антиоксидантного действия химических соединений в модельной системе на основе ли посом» (утверждены 5 июля 2001 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Модельная система длительно протекающего процесса ПОЛ на основе суспензии фосфатидилхолиновых липосом с использованием различных инициаторов окисления и оценкой уровня ПОЛ по содержанию карбонильных соединений, реагирующих с ДНФГ, может служить тест-системой для скринингового выявления антиоксидантных свойств у лекарственных препаратов различной химической природы.
2. Эффективность действия антиоксидантных препаратов изменяется в ходе длительно протекающего процесса ПОЛ в липосомах. Особенности антиоксидантного действия в зависимости от длительности периода окисления определяются химической природой вещества.
3. Антиоксиданты различной химической природы и различного механизма действия обладают способностью к трансформации (инверсии) антиоксидантной активности в прооксидантную.
Апробация работы Основные положения работы были представлены на научной конференции «Фунда ментальные и прикладные аспекты современной биохимии», посвященной 100-летию ка федры биохимии Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 15 – 17 октября 1998 г.);
на Российской национальной конференции с международным участием «Свободные радикалы и болезни человека» (Смоленск, 19 – сентября 1999 г.);
на научной сессии сотрудников Волгоградской медицинской академии (Волгоград, 5 – 9 октября 1999 г.);
на научной конференции, посвященной 125-летию со дня рождения А.А. Ухтомского (Волгоград, 16 – 17 января 2001 г.);
на 5-й Пущинской от крытой конференции молодых ученых «Биология — наука 21-го века» (Пущино, 16 – апреля 2001 г.);
на конференции «Проблемы медицины и биологии» Кемеровской госу дарственной медицинской академии (Кемерово, 19–20 апреля 2001 г.);
на 66-й Республи канской конференции студентов и молодых ученых Башкортостана (Уфа, 26 апреля 2001 г.);
на заседаниях Волгоградского отделения Биохимического общества РАН в 1999 – 2001 гг.
Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр фармакологии и биологиче ской химии Волгоградской медицинской академии.
Публикации По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введе ния, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 195 источника, из них 39 оте чественных и 156 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и рисунком.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение антиоксидантной активности химических соединений проводили в экспе риментах in vitro с использованием в качестве субстрата ПОЛ мелких моноламеллярных липосом, полученных из яичного фосфатидилхолина методом инжекции этанольного рас твора липида в водную фазу (S. Batzri, E.D. Korn, 1973). Липосомы подвергали спонтан ному и индуцированному окислению при 37 оС. Индукцию ПОЛ липосом вызывали до бавлением сульфата или ацетата меди (II) (конечная концентрация 2,5 мМ в инкубацион ной среде) в отсутствие или при добавлении H2O2 (конечная концентрация 0,8 мМ в ин кубационной среде).
Уровень ПОЛ в суспензии липосом оценивали по концентрации карбонильных со единений (КС), которую определяли оригинальным методом. Для этого к 0,05 мл суспен зии липосом добавляли 0,2 мл реактива, представляющего собой 5 мМ раствор (ДНФГ) в 1,9 М HCl. Через 10 мин к реакционной смеси прибавляли 1 мл 0,75 М NaOH. Еще через 10 мин оптическую плотность реакционной смеси измеряли при длине волны 460 нм про тив соответствующим образом обработанной контрольной пробы (вода). Эталон — пиру ват натрия.
В качестве методов сравнения при оценке интенсивности ПОЛ в препаратах липосом использовали определение концентрации веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ВР-ТБК), в присутствии трихлоруксусной кислоты (H. Esterbauer, K.H.
Cheeseman, 1990) или фосфорной кислоты (Л.И. Андреева и др., 1988) и спектрофотомет рическое определение концентрации конъюгированных диенов (В.Н. Ушкалова и др., 1993) и кротонового альдегида (Р.Г. Примак, О.И. Лебедь, 1986).
В работе было исследовано влияние на процесс ПОЛ в модельной системе 7 химиче ских соединений, входящих в состав лекарственных препаратов (2,3 димеркаптопропансульфоната натрия [унитиола], 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола [ио нола], кверцетина, пробукола, ретинола ацетата, таурина и эргокальциферола), важного природного АО глутатиона (восстановленный) и трех комплексообразующих карбоновых кислот: янтарной, лимонной и винной.
Эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) исследуемого химического соеди нения в каждой серии опытов и для каждой длительности периода окисления липосом рассчитывали по формуле:
[ (C0 – C1) / C0 ] 100 %, где С0 – концентрация КС в суспензии липосом, не содержащей исследуемого соединения (контроль), С1 – концентрация КС в суспензии липосом, содержащей исследуемое соеди нение (опыт).
Если значение показателя ЭАД было положительным, считали, что тестируемое ве щество проявляет антиоксидантное действие;
если значение показателя ЭАД было отри цательным,. считали, что тестируемое вещество проявляет прооксидантное действие.
Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с рекомендациями К. Дёрффеля (1994) и фирмы StatSoft, Inc. (США) (1999). Статистически обработанные данные представлены в виде M SD, где M – среднее арифметическое, SD – стандартное отклонение. Достоверность отличий между средними в различных группах опытов уста навливали с помощью с помощью дисперсионного анализа ANOVA. При значении p 0,001 мы полагали результаты статистического анализа высоко значимыми;
при 0,001 p 0,01 — значимыми (достоверными);
при 0,01 p 0,05 — сомнительными (спорными);
а при p 0,05 — незначимыми.
Для оценочного выявления вида взаимосвязи между двумя показателями использова ли построение диаграмм рассеяния;
количественную меру степени взаимосвязи опреде ляли с помощью численных методов (расчет коэффициента линейной корреляции Пирсо на r). Для оценки линейности зависимости одного показателя от другого вычисляли урав нение линейной регрессии.
Все статистические расчеты проводили с применением пакета прикладных программ Statistica for Windows, Kernel Release 5.5 A фирмы StatSoft, Inc. (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Применимость метода определения веществ, реагирующих с тиобарбитуровой ки слотой, для оценки уровня ПОЛ в модельной системе Хотя определение ВР-ТБК широко используется для оценки уровня ПОЛ в модель ных системах, данному методу присущи определенные недостатки (L.L. De Zwart e.a., 1999;
H. Esterbauer, 1996;
B. Halliwell, S. Chirico, 1993). Нами была изучена возможность применения метода определения ВР-ТБК для оценки уровня ПОЛ в суспензии липосом в присутствии катионов металлов переходной валентности (Fe2+ и Cu2+), широко исполь зуемых для металлозависимой индукции ПОЛ.
Было обнаружено, что добавление солей Fe2+ или Cu2+ к реакционной смеси, содер жащей ТБК и аутоокисленные липосомы, вызывает существенное усиление образования ВР-ТБК, поглощающих при длинах волн 452 и 532 нм (Рис. 1).
Рис. 1. Поглощение при длинах волн 452 нм (А) и 532 нм (Б) хромогенов, образующихся при взаимодействии карбонильных соединений суспензии липосом (2,38 мг липида/мл суспензии), подвергнутых автоокислению при 37 оС, и ТБК в среде трихлоруксусной ки слоты: 1 – в отсутствие катионов металлов;
2 – в присутствии 0,625 мМ Fe2+;
3 – в при сутствии 0,625 мМ Cu2+;
4 – в присутствии 0,625 мМ Fe2+ и 0,625 мМ Cu2+. Усреднение результатов 4 экспериментов.
В последующих опытах было установлено, что катионы Cu2+ способны непосредст венно взаимодействовать с ТБК в отсутствие липосом и значительно влиять на спектр по глощения ВР-ТБК в суспензии липосом (Рис. 2).
Рис. 2. Спектры поглощения веществ, образующихся при взаимодействии ТБК, продук тов ПОЛ фосфатидилхолиновых липосом (2,38 мг липида/мл суспензии) и сульфата меди (II) в среде трихлоруксусной кислоты (спектры сняты относительно раствора ТБК):
1 – ТБК + 0,625 мМ Cu2+;
2 – ТБК + липосомы после 18-часового автоокисления;
3 – ТБК + липосомы после 18-часового автоокисления + 0,625 мМ Cu2+.
Полученные результаты свидетельствуют, что содержание ВР-ТБК не может быть достоверным показателем содержания продуктов ПОЛ в анализируемом образце, если в нем присутствуют катионы Fe2+ или Cu2+, поскольку, с одной стороны, катионы металлов переходной валентности стимулируют образование в ходе анализа дополнительных коли честв ВР-ТБК, а с другой стороны, катионы Cu2+ способны непосредственно взаимодей ствовать с ТБК.
Применимость метода определения карбонильных соединений с использованием ДНФГ для оценки уровня ПОЛ в модельной системе ДНФГ, в отличие от ТБК, не реагирует как с различными солями Cu2+ (сульфат, хлорид, ацетат), так и с продуктами их реакции с H2O2.
В ходе оптимизации метода количественного анализа карбонильных продуктов ПОЛ с использованием ДНФГ были изучены спектры поглощения динитрофенилгидразонов КС, образующихся при спонтанном и Cu2+-индуцированном ПОЛ липосом. Было уста новлено, что образующиеся хромогены имеют широкую полосу поглощения. В большин стве случаев спектры образующихся продуктов имели широкий пик при 450–470 нм с максимумом при 460 нм, что близко к максимуму поглощения динитрофенилгидразона 4 гидроксиноненаля (456 нм), являющегося одним из основных продуктов ПОЛ in vivo и в модельных системах. Область линейной зависимости оптической плотности образую щихся хромогенов от концентрации карбонильных групп — от 0,1 до 2 мМ.
Для сравнения результатов оценки уровня ПОЛ методом с использованием ДНФГ с основными распространенными методами определения продуктов ПОЛ было проведено определение содержания различных продуктов ПОЛ в липосомах, подвергнутым авто окислению и Cu2+ + H2O2-индуцированному ПОЛ. Динамика накопления в липосомах КС, реагирующих с ДНФГ, в ходе спонтанного и индуцированного окисления качественно сходна с динамикой накопления других продуктов ПОЛ, определяемых с использованием общепринятых методов. В то же время, количественно накопление КС в период между 3 м и 24-м часами окисления (и при автоокислении, и при индуцированном ПОЛ) было наиболее выраженным (Рис. 3).
Важно отметить, что метод с использованием ДНФГ позволяет наиболее полно опре делять количество КС, образующихся в ходе ПОЛ, что согласуется с литературными дан ными (В.Н.Ушкалова и др., 1993;
H.H.Draper e.a., 1993;
H.Esterbauer e.a., 1991;
B.Halliwell, J.M.C.Gutteridge, 1990;
Y.Yamamoto e.a., 1984). В то же время, метод определения ДНФГ реактивных продуктов ПОЛ отличается простотой и низкой трудоемкостью выполнения в сравнении с общепринятыми методами определения продуктов ПОЛ нерадикальной при роды.
Рис. 3. Изменение содержания различных продуктов ПОЛ в суспензии липосом (2,38 мг липида/мл) в период с 3 к 24 ч автоокисления (А) и ПОЛ, индуцированного 2,5 мМ Cu(CH3COO)2 и 0,8 мМ H2O2 (Б). За 100 % принято значение соответствующего показа теля после 3 ч окисления. Продукты ПОЛ: конъюгированные диены (1);
кротоновый аль дегид (2);
карбонильные соединения, взаимодействующие с ДНФГ (3);
ВР-ТБК, опреде лявшиеся по методу Андреевой с соавт. (1988): в отсутствие Fe2+ (4а), в присутствии Fe2+ (4б);
ВР-ТБК, определявшиеся по методу Esterbauer, Cheeseman (1990): в отсутствие Fe2+ (5а), в присутствии Fe2+ (5б). Усреднение данных 7 экспериментов.
Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют возможность использо вания определения ДНФГ-реактивных КС для адекватной оценки интенсивности ПОЛ в опытах in vitro независимо от способа инициации окисления.
Зависимость накопления карбонильных соединений в липосомах от длительности периода окисления и особенностей инициации процесса ПОЛ Была изучена динамика накопления КС в ходе ПОЛ липосом в зависимости от дли тельности периода окисления и вида используемой системы инициации ПОЛ (табл. 1).
Установлено, что динамика изменения концентрации КС в липосомах в процессе их окисления существенно зависит от того, какое именно вещество (смесь веществ) было использовано для инициации ПОЛ. В течение первых 24–48 часов окисления скорость накопления карбонильных соединений непостоянна и существенно зависит от способа инициации ПОЛ.
При автоокислении существенное возрастание содержания КС происходит только к 24-му часу. При автоокислении в течение 48 ч и дольше содержание КС практически не изменяется (p0,5). Добавление к инкубационной среде H2O2 несколько ускоряет накоп ление КС в первые часы процесса ПОЛ в сравнении с автоокислением (p0,01), однако на отсроченных этапах окисления (24 ч и дольше) содержание КС в суспензиях липосом, подвергнутых автоокислению и H2O2-индуцированному окислению, значимо не отлича ется (p0,2).
Таблица 1.
Содержание карбонильных соединений в суспензии липосом, подвергнутых спонтанному и индуцированному окислению при 37 оС Период Индукция ПОЛ* окисле- A HP CS CSHP CA CAHP ния, ч 1 0,113 0,169 0,107 0,169 0,157 0, 0,038 0,047 0,028 0,054 0,056 0, 3 0,141 0,219 0,175 0,270 0,300 0, 0,049 0,057 0,043 0,103 0,072 0, 6 0,189 0,357 0,303 0,417 0,560 0, 0,065 0,079 0,113 0,186 0,103 0, 24 0,908 0,988 1,214 1,270 1,238 1, 0,200 0,177 0,141 0,139 0,148 0, 48 1,228 1,184 1,387 1,392 1,259 1, 0,296 0,164 0,160 0,158 0,150 0, 72 1,486 1,437 1,386 1,376 1,201 1, 0,061 0,028 0,044 0,048 0,033 0, 96 1,296 1,422 1,373 1,373 1,212 0, 0,209 0,072 0,032 0,022 0,039 0, Усреднение результатов 15–22 экспериментов в группе.
* Условные обозначения видов индукции: А – автоокисление;
НР – H2O2;
CS – CuSO4;
CSHP – CuSO4 + H2O2;
CA – Cu(CH3COO)2;
CAHP – Cu(CH3COO)2 + H2O2. Конечная концентрация H2O в инкубационной среде 0,8 мМ, солей Cu2+ – 2,5 мМ.
Индукция ПОЛ CuSO4 приводит к достоверному повышению уровня карбонильных продуктов ПОЛ при средних сроках окисления (6 и 24 ч) (p0,006), но не на начальных или отсроченных этапах ПОЛ. Различия в накоплении КС при индукции ПОЛ CuSO4 или H2O2 + CuSO4 статистически сомнительны (0,016p0,042) на начальных этапах окисле ния (1 и 3 ч) и недостоверны (p0,175) при большей длительности окисления. При сроках окисления 1–24 ч концентрация КС в суспензии липосом, подвергнутых CuSO4 + H2O2 индуцированному окислению достоверно выше, чем в суспензии автоокисленных липо сом (p0,003).
Индукция ПОЛ Cu(CH3COO)2 вызывает усиление ПОЛ в сравнении с CuSO4 на на чальных этапах окисления (различия высоко значимы через 3 и 6 ч, p0,0004). При ини циации ПОЛ Cu(CH3COO)2 + H2O2 накопление КС в липосомах в первые 6 часов инкуба ции было наиболее интенсивным по сравнению со всеми перечисленными выше случая ми (p0,0001).
Влияние аниона уксусной кислоты на накопление карбонильных соединений Поскольку инициация окисления липосом ацетатом меди (II) приводит к более выра женному накопление КС, чем инициация ПОЛ CuSO4, было изучено влияние ацетат аниона на интенсивность ПОЛ в липосомах. Было обнаружено, что добавление ацетата натрия к инкубационной среде (индукция окисления CuSO4 или CuSO4 + H2O2) приводит к возрастанию содержания КС в липосомах при длительности окисления 1–24 ч концен трационно-зависимым образом (Рис. 4). Этот факт говорит о способности ацетат-аниона стимулировать накопление КС при Cu2+-зависимом окислении липосом.
Рис. 4. Концентрация карбонильных соединений в липосомах, подвергнутых индуциро ванному ПОЛ в присутствии различных концентраций ацетата натрия. Окисление липо сом инициировали добавлением 2,5 мМ CuSO4 в отсутствие (А) или при одновременном добавлении 0,8 мМ H2O2 (Б). Усреднение данных 4 экспериментов.
Влияние концентрации фосфатидилхолина на накопление карбонильных соедине ний в липосомах Показано, что от концентрации фосфолипида в суспензии липосом существенно зави сит концентрация КС в липосомах в ходе их длительного окисления. Анализ зависимости концентрации КС от концентрации липида в суспензии липосом при различной длитель ности периода окисления демонстрирует наличие очень жесткой прямой взаимосвязи ме жду указанными показателями (значения коэффициента Пирсона r от 0,959 до 0,996, p0,041) Возможность использования буферных растворов в модельной системе на основе липосом при Cu2+-зависимой индукции ПОЛ При окислении суспензии фосфатидилхолиновых липосом происходит постепенное закисление инкубационной смеси. Скорость закисления при Cu2+-индуцированном ПОЛ относительно медленная, а при автоокислении закисление среды существенно ускоряется длительности окисления больше 24 ч (табл. 2).
Таблица 2.
Изменение значения рН незабуференной суспензии фосфатидилхолиновых липосом в процессе длительного окисления Длительность Автоокисление Индукция ПОЛ Индукция ПОЛ окисления, ч Cu(CH3COO)2 Cu(CH3COO)2+H2O 5,99 0,11 5,90 0,14 5,89 0, 5,83 0,14 5,54 0,08 5,49 0, 5,04 0,09 5,19 0,10 5,19 0, 4,45 0,19 5,08 0,13 5,10 0, Усреднение результатов 5 экспериментов.
Для выяснения вопроса о возможности применения буферных растворов при модели ровании Cu2+-индуцированного ПОЛ в липосомах нами был проведен анализ данных ли тературы и ряд собственных экспериментов. По литературным данным применение фос фатных буферных растворов невозможно из-за образования плохо растворимых фосфатов меди, а широко применяемые в биохимии буферообразующие вещества трис, трицин, глицилглицин, BES и TES образуют прочные комплексы с Cu (Р.Досон и др., 1991;
B.Halliwell, J.M.C.Gutteridge, 1990).
Было изучено влияние буферных растворов на основе солей уксусной, янтарной, ли монной и 2-морфолиноэтансульфоновой (MES) кислот на накопление КС в липосомах.
Было выявлено, что MES способен существенно усиливать накопление КС в ходе как Cu2+-индуцированного, так и спонтанного окисления липосом: прооксидантное действие MES не наблюдалось лишь при индукции ПОЛ Cu(CH3COO)2 + H2O2 (Рис. 5).
Также было обнаружено, что ацетатные буферные растворы стимулируют накопление КС в ходе Cu2+-индуцированного ПОЛ липосом, сукцинатные могут проявлять как про-, так и антиоксидантное действие в зависимости от вида индукции, а цитратные в боль шинстве случаев подавляют накопление КС в липосомах (Рис. 6). Следовательно, буфер ные растворы на основе органических соединений способны оказывать существенное влияние на процесс накопления в липосомах КС как при спонтанном, так и при индуци рованном окислении. Поэтому для целей скрининговой оценки антиоксидантных свойств веществ представляется допустимым применение незабуференной суспензии липосом в экспериментах длительностью до 24 ч.
Рис. 5. Влияние 20 мМ MES–NaOH буферного раствора (рН 6,8) на содержание карбо нильных соединений в липосомах в ходе автоокисления (1) и окисления, индуцированно го: 2,5 мМ CuSO4 (2), 2,5 мМ CuSO4 + 0,8 мМ H2O2 (3), 2,5 мМ Cu(CH3COO)2 (4), 2,5 мМ Cu(CH3COO)2 + 0,8 мМ H2O2 (5). За 100 % принимали значение показателя на соответст вующий момент времени в контрольном незабуференном препарате липосом. Усреднение результатов 4 экспериментов.
Рис. 6. Влияние буферных растворов (рН 6,0) на основе карбоновых кислот на содержа ние КС в липосомах. Окисление инициировали 2,5 мМ CuSO4 (А, Б) или Cu(CH3COO) (В, Г) в присутствии 0,8 мМ H2O2. 1 – ацетатный буфер, 2 – сукцинатный буфер, 3 – цит ратный буфер. Концентрация буферообразующих веществ 2 мМ (А, В) и 10 мМ (Б, Г). За 100 % принимали содержание карбонильных соединений в липосомах после соответст вующего периода окисления в отсутствие карбоновых кислот (пунктирная линия). Усред нение результатов 4 экспериментов.
Изучение эффективности липофильных антиоксидантов Была изучена зависимость ЭАД липофильных фенольных (ионол, пробукол, кверце тин) и полиеновых (ретинола ацетат, эргокальциферол) АО в зависимости от длительно сти окисления липосом при различных способах его иницииации (табл. 3). Изученные концентрации АО: 5 мкМ и 100 мкМ.
Таблица 3.
ЭАД липофильных антиоксидантов (%) в ходе длительного окисления липосом АО (концен- Индук Длительность периода окисления, ч трация, мкМ) ция* 1 3 6 24 Ионол (5) А 11,9416,05 9,9612,28 8,81,08 82,173,71 89,355, СА 8,5815,82 35,157,86 62,7016,05 4,763,98 -2,074, САНР 2,812,40 9,097,24 11,436,92 -5,113,01 -7,245, Ионол (100) А 7,2429,26 31,4313,57 39,355,43 83,364,70 82,417, СА 24,606,47 39,204,67 72,671,43 83,784,33 84,373, САНР 21,387,69 47,063,30 67,993,59 81,493,62 81,955, Пробукол (5) А 28,236,46 11,5810,34 43,787,39 82,984,12 91,954, СА 16,1112,28 38,147,62 70,497,00 83,474,94 83,835, САНР 45,596,23 35,954,38 25,738,99 3,723,49 -28,1810, Пробукол А 34,686,99 46,7612,40 22,055,87 80,473,29 85,756, (100) СА 18,603,18 52,261,73 70,812,84 78,253,68 81,124, САНР 44,0211,02 57,1310,07 67,541,51 84,102,56 88,124, Кверцетин А 20,7810,14 27,907,68 30,766,11 51,245,84 60,056, (5) САНР 14,424,65 -9,766,22 -5,523,91 -7,945,07 -11,764, Кверцетин А 34,934,79 13,355,34 33,144,68 67,798,11 72,095, (100) САНР 16,836,54 35,505,92 51,368,39 -0,425,18 -9,358, Ретинола А 13,108,83 4,667,26 7,897,86 -6,315,23 -12,397, ацетат (5) САНР 40,914,92 24,255,40 12,783,97 -6,014,29 -21,646, Эргокальци- А 4,376,89 4,355,91 -38,669,28 -239,6012,56 -315,709, ферол (5) САНР 23,695,78 12,4210,20 5,424,66 -15,507,62 -52,0011, Усреднение результатов 5 – 9 экспериментов в группе.
* Способы индукции ПОЛ: A – автоокисление;
CA – Cu(CH3COO)2;
CAHP – Cu(CH3COO)2 + H2O2.
Ионол и пробукол значимо подавляли накопление КС в липосомах в случае автоокис ления, причем наибольшая ЭАД наблюдалась на отдаленных этапах ПОЛ (24 и 48 ч). При этом только до 6 ч окисления наблюдалась зависимость ЭАД от концентрации АО, в эти же сроки пробукол был несколько более эффективен как АО в сравнении с ионолом. На отдаленных этапах ПОЛ ионол и пробукол в обоих изученных концентрациях были при мерно равноэффективны.
При индукции окисления липосом ацетатом меди заметное антиоксидантное действие на всех этапах ПОЛ было обнаружено у пробукола (в обоих концентрациях) и ионола (в концентрации 100 мкМ), причем ЭАД возрастала с увеличением длительности периода окисления. В концентрации 5 мкМ ионол оказался неэффективен на отдаленных этапах ПОЛ.
При индукции ПОЛ Cu(CH3COO)2 + H2O2 (то есть, при наибольшей начальной интен сивности накопления КС) высокая ЭАД наблюдалась у пробукола и ионола только в кон центрации 100 мкМ. В концентрации 100 мкМ антиоксидантное действие ионола и про букола при длительном протекании ПОЛ инвертировалось в прооксидантное, причем пробукол, более эффективный как АО на начальных этапах ПОЛ, оказался на отдаленных этапах ПОЛ более сильным прооксидантом.
ЭАД кверцетина при автоокислении оказалась несколько выше, чем у ионола, на на чальных этапах ПОЛ и ниже — на отдаленных. При индукции ПОЛ H2O2 +Cu(CH3COO) кверцетин в концентрации 5 мкМ был неэффективен, а в концентрации 5 мкМ сохранял заметную ЭАД только на начальных этапах окисления (подобно низким концентрациям ионола и пробукола).
Поскольку липофильные фенольные АО эффективно перехватывают карбо- и перок си-радикалы, обрывая цепные свободнорадикальные реакции в липидной фазе (Е.Б. Бур лакова и др., 1998;
D. Bonnefont-Rousselot e.a., 1999), антиоксидантное действие таких со единений будет наиболее выраженным при интенсивной пропагации ПОЛ, то есть на от сроченных этапах ПОЛ. В ситуации же, когда эффективная концентрация АО мала отно сительно концентрации зарождающихся свободных радикалов (исходно низкая концен трация АО или низкая остаточная концентрация АО на отдаленных этапах ПОЛ при вы сокой скорости зарождения радикалов), большая часть молекул АО быстро превращается в феноксильные радикалы, которые способны с относительно высокой скоростью вклю чаться в продолжение цепей реакций ПОЛ (Е.Б. Бурлакова и др., 1998). В этом случае АО будет выступать не как ингибитор, а как субстрат реакций СРО, что мы и наблюдаем при длительном Cu(CH3COO)2 + H2O2-индуцированном ПОЛ липосом.
Зависимость ЭАД ретинола ацетата и эргокальциферола от длительности периода окисления липосом существенно отличаются от таковой для фенольных АО (см. табл. 3).
Ретинола ацетата не оказывал достоверного влияния на образование КС при автоокисле нии липосом, проявляя, однако, тенденцию к незначительной стимуляции ПОЛ. Эрго кальциферол, не изменяя уровень ПОЛ в течение первых 3 часов автоокисления, на более поздних временных этапах демонстрировал значительную прооксидантную активность.
Выраженность прооксидантного эффекта эргокальциферола усиливалась с увеличением длительности периода окисления. В случае индукции ПОЛ Cu(CH3COO)2 + H2O2 ретино ла ацетата и эргокальциферол заметно снижали содержание КС в липосомах в течение первых 3–6 часов окисления, но при большей длительности ПОЛ оба соединения прояв ляли прооксидантное действие, более выраженное у эргокальциферола. Интересно, что прооксидантный эффект эргокальциферола при индуцированном ПОЛ липосом была су щественно ниже, чем при автоокислении.
Обнаруженная динамика ЭАД ретинола ацетата, возможно, связана с тем, что рети нола ацетат способен эффективно перехватывать радикальные инициаторы реакций ПОЛ (D.C. Liebler, T.D. McClure, 1996) лишь до тех пор, пока содержание ретинола ацетата достаточно для перехвата основного количества образующихся в ходе СРО радикалов (C.A.Rice-Evans, A.T.Diplock, 1993). После истощения пула АО с ненасыщенными связя ми скорость СРО существенно возрастает, тем более, что продукты окисления ретинола ацетата могут вовлекаться в дальнейшее развитие реакций СРО (J.A.Olson, 1996). По видимому, аналогичным образом можно объяснить и анти/прооксидантные эффекты эр гокальциферола.
Изучение эффективности гидрофильных серосодержащих антиоксидантов Было обнаружено, что тиоловые АО глутатион (восстановленная форма) и унитиол (100 мкМ) проявляют заметное антиоксидантное действие только на начальном этапе ПОЛ (1 ч окисления) (табл. 4). При более длительных сроках окисления ЭАД унитиола снижается до незначительной, а глутатион полностью теряет способность подавлять на копление КС в липосомах и становится способным проявлять прооксидантное действие.
Таблица 4.
ЭАД серосодержащих антиоксидантов (%) при длительном окислении липосом АО (концен- Индук Длительность периода окисления, ч трация, мкМ) ция* 1 3 6 24 Глутатион А 18,343,57 -68,639,12 -37,816,94 -43,095,88 -74,577, (100) САНР 21,159,32 -3,967,46 1,168,15 4,757,44 -36,175, Унитиол А 34,503,85 -1,245,25 10,605,35 16,388,75 7,897, (100) САНР 24,04,88 10,75,32 9,794,57 8,01,76 5,856, Таурин (100) А 18,786,65 16,46,84 5,646,81 -7,329,12 -6,78, САНР 24,524,44 2,556,89 8,53,54 17,8710,35 9,807, Усреднение результатов 4 экспериментов в группе.
* Способы индукции ПОЛ: A – автоокисление;
CAHP – Cu(CH3COO)2 + H2O2.
Подобная динамика ЭАД, вероятно, определяется механизмом антиоксидантного действия тиолов, связанным как с окислением SH-групп под действием кислородных ра дикалов, так и с хелатированием катионов металлов переходной валентности (B. Halli well, J.M.C. Gutteridge, 1990). При взаимодействии с радикалами тиол превращается в со ответствующий тиильный радикал, степенью реакционноспособности которого определя ется его способность вовлекаться в дальнейшее развитие ПОЛ. Образующиеся при окис лении глутатиона тиильные радикалы обладают высокой реакционноспособностью, что, можно предположить, приводит к инверсии антиоксидантного действия глутатиона в прооксидантное.
У природной аминосульфокислоты таурина было обнаружено слабое антиоксидант ное действие, исчезающее на отдаленных этапах ПОЛ (см. табл. 4).
Изучение антиоксидантной эффективности солей комплексообразующих карбоно вых кислот Было изучено влияние солей янтарной (натрия сукцинат), винной (калия-натрия тар трат) и лимонной (натрия цитрат) кислот (2 и 10 мМ) на накопление КС в липосомах при индукции ПОЛ сульфатом или ацетатом меди в присутствии H2O2 (табл. 5).
Таблица 5.
ЭАД антиоксидантов – комплексообразующих карбоновых кислот (%) в ходе длительно го окисления липосом АО (концен- Индук Длительность периода окисления, ч трация, мМ) ция* 1 3 6 –13,04 17,86 –43,87 30,60 10,71 17,67 13,63 6, Сукцинат на- CSHP 10,88 9,15 59,63 17,17 63,31 11,70 –3,57 3, трия (2) CAHP –12,75 11,52 –22,67 6,64 3,55 8,13 23,75 8, Сукцинат на- CSHP 3,57 2,25 44,61 6,59 61,15 4,33 11,64 8, трия (10) CAHP –11,67 22,75 –39,52 28,61 1,10 21,15 –6,86 3, Тартрат калия- CSHP 17,37 17,52 51,86 19,78 37,63 14,37 –10,97 1, натрия (2) CAHP –0,98 8,68 –48,00 11,32 –23,40 7,76 –18,60 7, Тартрат калия- CSHP 15,01 9,00 30,81,20 37,12 10,14 –13,65 6, натрия (10) CAHP –6,22 17,09 –18,98 19,86 19,25 6,34 15,80 6, Цитрат натрия CSHP 24,10 11,19 55,51 22,10 63,92 13,92 8,83 24, (2) CAHP 29,41 11,05 14,67 7,60 36,17 5,87 88,13 6, Цитрат натрия CSHP 13,28 5,57 67,51 6,40 78,89 10,21 86,19 5, (10) САНР Усреднение результатов 4 экспериментов в группе.
* Способы индукции ПОЛ: CSHP – CuSO4 + H2O2;
CAHP – Cu(CH3COO)2 + H2O2.
Было обнаружено, что при индукции ПОЛ CuSO4 + H2O2 сукцинат и тартрат прояв ляют в основном прооксидантные свойства, а при индукции ПОЛ Cu(CH3COO)2 + H2O они продемонстрировали выраженное антиоксидантное действие (при длительности окисления до 6 ч). Цитрат, образующий более прочные комплексы с металлами, чем сук цинат и тартрат (Р. Досон и др., 1991), оказался и наиболее эффективным АО среди изу ченных комплексообразователей. При этом у цитрата ни в одном случае не было обнару жено значимого прооксидантного действия.
По всей видимости, связывание в комплекс с анионами карбоновых кислот лишь час тично препятствует вовлечению Cu2+ в реакцию Фентона с продукцией гидроксил радикала, инициирующего реакции ПОЛ в мембране липосом.
В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что использование предложенной модельной системы позволяет выявить у АО различной химической структуры особенности их антиоксидантного действия в зависимости от интенсивности и длительности протекания реакций ПОЛ. Было установлено, что веществам с определен ным механизмом действия свойственна и определенная зависимость ЭАД от длительно сти и интенсивности окисления липосом.
Было обнаружено явление трансформации (инверсии) антиоксидантного действия веществ в прооксидантное в зависимости от длительности периода протекания процесса ПОЛ. Важно отметить, что инверсия антиоксидантных свойств в прооксидантные оказа лась свойственной антиоксидантам различной химической природы и различного меха низма действия. Такая инверсия была выявлена нами у фенольных соединений, веществ с ненасыщенными С=С-связями, тиолов и карбоновых кислот, способных образовывать комплексы с катионами металлов переходной валентности.
Представленные данные демонстрируют возможность использования предложенной модельной системы для выявления наличия и особенностей антиоксидантных свойств химических соединений. Такой комплексный скрининг может иметь важное значение для целенаправленного создания высокоэффективных лекарственных препаратов с конкрет ными особенностями антиоксидантного действия.
ВЫВОДЫ 1. Разработана простая и доступная химическая модельная система для выявления анти оксидантной активности и первичной оценки особенностей антиоксидантного дейст вия лекарственных препаратов различной химической природы в зависимости от дли тельности периода окисления в экспериментах in vitro.
2. Определение концентрации карбонильных соединений, реагирующих с 2,4 динитрофенилгидразином, является простым и воспроизводимым способом оценки интенсивности ПОЛ в липосомальных модельных системах, в том числе при инициа ции ПОЛ металлами переходной валентности. Использование тиобарбитуровой ки слоты для определения продуктов ПОЛ в присутствии металлов переменной валент ности приводит к неадекватной оценке интенсивности ПОЛ.
3. Разработан метод скрининга веществ различной химической природы с целью выяв ления антиоксидантных свойств и уточнения особенностей антиоксидантного дейст вия с использованием модельной системы на основе суспензии фосфатидилхолиновых липосом при различной длительности окисления липосом. Продолжительное окисле ние липосом (24 ч и более) позволяет обнаружить особенности антиоксидантного дей ствия веществ, не выявляющиеся при малой длительности протекания процессов ПОЛ.
4. Эффективность действия изученных фармакологически активных веществ с антиок сидантным действием существенно изменяется в ходе длительно протекающего про цесса ПОЛ в липосомах и зависит от химической природы антиоксиданта, его концен трации и интенсивности ПОЛ, задаваемой способом инициации окисления липосом.
5. Липофильные антиоксиданты фенольной природы более эффективно подавляли нако пление карбонильных продуктов ПОЛ при автоокислении липосом, чем при Cu индуцированном окислении. Эффективность антиоксидантного действия фенольных липофильных антиоксидантов достигает максимума на поздних (24 ч) этапах окисле ния.
6. Липофильные вещества, содержащие ненасыщенные связи, проявляют максимальную эффективность на раннем этапе ПОЛ (1 ч окисления), и их антиоксидантное действие при Cu-индуцированном окислении более выраженно, чем при автоокислении.
7. Содержащие серу гидрофильные антиоксиданты наиболее эффективно подавляют ПОЛ на раннем этапе процесса (1 ч окисления). На более поздних этапах антиокси дантное действие таких веществ исчезает.
8. Карбоновые кислоты, способные образовывать комплексы с катионами металлов, в зависимости от их концентрации и от условий протекания процесса ПОЛ проявляют как анти-, так и прооксидантное действие. Наибольшая эффективность антиоксидант ного действия комплексообразующих карбоновых кислот наблюдается при средней длительности окисления (3 и 6 ч).
9. Трансформация (инверсия) антиоксидантного действия химических соединений в прооксидантное действие наблюдается на отсроченных этапах ПОЛ (длительность окисления 3 часа и более с момента инициации окисления). Проявление инверсии за висит от химической природы и концентрации антиоксиданта, интенсивности проте кания реакций ПОЛ и способа инициации окисления липосом.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Разработка критериев отбора антиоксидантных средств // Российск. национальная на учно-практ. конф. «Свободные радикалы и болезни человека», Смоленск, 19–22 сен тября 1999 г. Сб. трудов.– Смоленск, 1999.– С.74–75 (соавт. Островский О.В., Закрев ский В.И., Косолапов В.А., Дегтярев А.Н.) 2. Моделирование перекисного окисления липидов in vitro. Применение динитрофенил гидразина для оценки интенсивности перекисного окисления фосфатидилхолиновых липосом // Вестник Волгоградской медицинской академии. № 6: Сб. науч. тр.– Т.56, вып.6.– Волгоград: Волгоградская медицинская академия, 2000.– С.130–133 (соавт.
Закревский В.И.) 3. Влияние компонентов буферных растворов на перекисное окисление липидов в фос фатидилхолиновых липосомах // Материалы научн. конф., посвященной 125-летию со дня рождения А.А.Ухтомского: Тез. докл.– Волгоград, 2001.– С. 4. Эффективность действия антиоксидантов и инверсия их антиоксидантного действия в прооксидантное в зависимости от длительности протекания процесса перекисного окисления липидов // Биология — наука 21го века. 5ая Пущинская конф. молодых уче ных. 16–20 апреля 2001 года. Сб. тезисов.– Пущино, 2001.– С.21– 5. Антиоксидантные и прооксидантные свойства пробукола в модельной системе. // Во просы теоретической и практической медицины. Мат. 66-й Республиканской научн.
конф. студентов и молодых ученых Башкортостана. Т.2.– Уфа: Здравоохранение Баш кортостана, 2001.– С. 6. Ацетат и лактат усиливают медь-индуцированное перекисное окисление липидов в липосомах // Проблемы медицины и биологии. Часть 3: Сб. научн. работ.– Кемерово, 2001.– С.