Электрохимический анализ кардиомаркеров в плазме крови
На правах рукописи
Шумков Андрей Алексеевич ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КАРДИОМАРКЕРОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук
Научный консультант: доктор биологических наук, Шумянцева Виктория Васильевна
Официальные оппоненты: Курочкин Илья Николаевич доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, заведующий лабораторией Соловьёва Нина Ивановна доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, заведующая лабораторией
Ведущая организация: ФГБУН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита состоится « 14» ноября 2013 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН) по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., д.10, стр. 8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.
Автореферат разослан «» октября 2013 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Карпова Е.А.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы Сердечно–сосудистые заболевания являются одной из основных проблем Российского здравоохранения. Подход к персональной оценке рисков и правильному диагнозу должен включать в себя следующие критерии: профиль лабораторных данных, клинические и визуальные данные пациентов [Никулин Б.А., 2007].
В настоящее время в клинико-диагностических лабораториях для определения кардиомаркёров (белков-маркёров) основным методом остаётся иммуноферментный анализ, с нижним диапазоном определяемой концентрации белка 10 пг/мл. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод требует большого объёма исследуемого образца (от мкл), дополнительных расходных материалов, а сама процедура анализа занимает два часа.
Кроме того, иммуноферментный анализ проводится в лабораториях стационаров, больниц и диагностических центрах, таким образом, время постановки диагноза составляет в среднем часов [Hasanzadeh M. et al., 2013]. Необходимость диагностики инфаркта миокарда в ранние сроки продиктована тем, что тромболитическая терапия в первые 2-6 часов снижает смертность в среднем на 30%, а терапия, начатая через 7-12 часов – лишь на 13% [Ткачук В.А., 2008]. Тест-системы, которые разработаны на данный момент, и могли бы быть использованы в качестве профилактических тест-систем («point-of-care») и на скорой помощи, не нашли широкого применения, так как являются полуколичественными и имеют высокий порог чувствительности, что может приводить к появлению большого количества ложноотрицательных результатов. Следовательно, необходимы новые диагностические подходы к определению белков-маркёров инфаркта миокарда, которые бы отвечали требованиям, предъявляемым к профилактическим тест-системам: портативность, минимальное время анализа, сменный тип сенсорного элемента, чувствительность и селективность к определению белков-маркёров [Lewandrowski K. et al., 2009;
Christenson R.H.
et al., 2009]. Создание диагностических систем нового поколения, отвечающих требованиям, предъявляемым к профилактическим тест-системам, а также выявление новых белков маркёров инфаркта миокарда, является одним из приоритетных направлений в современных биомедицинских исследованиях.
В лаборатории биоэлектрохимии ФГБУ «ИБМХ» РАМН с 2008 года ведутся научные разработки новых подходов к определению белков-маркёров острого инфаркта миокарда в плазме крови. Были получены патенты по прямому электрохимическому методу определения кардиомиоглобина на поверхности печатного графитового электрода. Определение кардиомиоглобина в плазме крови основано на прямом переносе электронов между гемовой (простетической) группой кардиомиоглобина и поверхностью электрода [Арчаков А.И. и др., 2008, 2009]. В то же время, большинство белков-маркёров острого инфаркта миокарда не содержат простетической группы и находятся в достаточно низком диапазоне концентраций, например тропонин I (20,4 пг/мл (0,9 пМ)) [Xu Q. et al., 2009]. Определить такие белки на немодифициронной поверхности электрода, без дополнительного усиления сигнала не представляется возможным. В связи с этим необходимо разработать новый электрохимический подход к селективному определению кардиомаркеров острого инфаркта миокарда.
Цель исследования: разработка принципов электрохимического анализа биохимических маркёров острого инфаркта миокарда.
В соответствии с поставленной целью в диссертационной работе были сформулированы следующие задачи:
1. Разработать метод определения белков-маркёров инфаркта миокарда в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по сигналу наночастиц металлов методами инверсионной, квадратно-волновой вольтамперометрии и с помощью потенциометрического анализа.
2. Отработать условия модификации печатных графитовых электродов:
а) наночастицами золота, полученными химическим синтезом и электросинтезом, б) наночастицами серебра, полученными химическим синтезом и электросинтезом, в) магнитными наночастицами на основе оксидов железа.
3. Найти оптимальные параметры электрохимической регистрации наночастиц металлов на поверхности электрода с помощью инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.
4. Разработать условия связывания антител с соответствующими белками-маркёрами инфаркта миокарда плазмы крови (кардиомиоглобин, тропонин I, тропонин T, сердечный белок, связывающий жирные кислоты) на модифицированных электродах.
Провести сравнительный анализ иммуносенсоров по следующим параметрам:
5.
аналитическая и диагностическая чувствительность, воспроизводимость.
Научная новизна работы В процессе проведения исследования впервые разработаны методы:
–электрохимического определения белков-маркеров острого инфаркта миокарда, таких как сердечный белок, связывающий жирные кислоты, кардиомиоглобин, тропонин I и Т в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по интенсивности сигнала наночастиц металлов (наночастиц золота, серебра и магнитных наночастиц на основе оксидов железа), на поверхности печатного графитового электрода с помощью высокочувствительных электрохимических методов: инверсионной и квадратно волновой вольтамперометрии.
–определения белка-маркёра тропонина I в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда потенциометрическим методом анализа, с использованием электродов, модифицированных наночастицами золота, полученными электросинтезом.
Показано, что аналитическая чувствительность потенциометрического метода анализа для разработанного электрохимического иммуносенсора на тропонин I составляет 18,0 пг/мл (0, пМ).
Личный вклад автора Соискателем проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации.
Соискатель лично принимал участие в планировании экспериментов, осуществлял подбор необходимых условий в методиках и выполнении основных экспериментов.
Практическая значимость исследования Результаты диссертационной работы имеют практическую ценность в решении задач ранней диагностики острого инфаркта миокарда, а также возможности своевременной постановки диагноза, и, как следствие, начала лечения, в больницах и отделениях скорой помощи. Разработанные электрохимические иммуносенсоры на основе одноразовых печатных графитовых электродов, модифицированных наночастицами металлов, для определения белков-маркёров инфаркта миокарда (сердечный белок, связывающий жирные кислоты, кардиомиоглобин, тропонина I и Т) обладают высокой чувствительностью:
диапазон минимально–определяемых концентраций в плазме крови составляет 2,7 – 4,3 пМ.
Специфичность определения белков-маркёров обеспечивается за счёт нанесения на поверхность печатного графитового электрода, модифицированного наночастицами металлов, моноклональных антител к соответствующим белкам-маркёрам инфаркта миокарда. Диагностическая чувствительность составляет 87%. Относительное стандартное отклонение среднего результата не превышает 9%. Анализ требует малого количества исследуемого образца (1 мкл плазмы или сыворотки крови), измерение занимает 2 минуты и может проводиться с помощью портативного электрохимического анализатора.
Разработанные иммуносенсоры могут быть использованы в качестве профилактических тест систем для самоконтроля.
Положения, выносимые на защиту:
–Разработка метода электрохимического определения белков-маркёров острого инфаркта миокарда в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда по сигналу наночастиц металлов методом инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.
анализ аналитической и диагностической чувствительности –Сравнительный разработанных иммуносенсоров для определения белков-маркёров в плазме и сыворотке крови.
–Определение тропонина I потенциометрическим методом анализа с помощью электродов, модифицированных золотыми наночастицами, полученными электросинтезом, в плазме крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей в периодических изданиях, включённых в перечень ВАК и 5 публикаций в сборниках докладов научных конференций.
Апробация работы Основные положения диссертации были представлены на IV Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2009), VII Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2012), II всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт–Петербург, 2012).
Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), изложения результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 186 источников. Работа иллюстрирована 63 рисунками, 8 таблицами и приложением.
Материалы и методы Реактивы: Калибровочные растворы тропонина I (USBiological);
тропонин Т (USBiological), моноклональные антитела к сердечному белку, связывающему жирные кислоты (АтсБСЖК) (Hycultbiotech);
моноклональные антитела к кардиомиоглобину, тропонину T и I (АтсМБ, АтT и АтI, соответственно) (USBiological);
магнитные наночастицы Fluid-MAG CMX (Chemicell);
диметилдидодециламмония бромид (ДДАБ) (Sigma);
сыворотка крови, очищенная от миоглобина (USBiological). Образцы плазмы крови больных острым инфарктом миокарда и здоровых доноров были предоставлены из банка данных крови ОАО РЖД ЦКБ №1 в рамках государственного контракта № 16.512.11.2212 с информированного согласия здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда. Концентрация тропонина I и кардиомиоглобина была подтверждена на промышленно выпускаемом анализаторе RAMP (Response Biomedical Corp., Канада, http://www.analytica.ru). Все остальные используемые в работе вещества были по степени очистки не ниже ос.ч.
В работе использовались трехконтактные печатные электроды, рабочий (диаметр мм) и вспомогательный электроды – графитовые, электрод сравнения – хлорсеребряный (ООО НПП «Автоком», Москва, www.membrans.ru).
Электрохимические измерения проводились с использованием потенциостата Autolab PGSTAT 12 (Eco Chemie, Нидерланды), с программным обеспечением GPES. Все потенциалы приведены относительно хлорсеребряного электрода сравнения (Ag/AgCl).
Получение наночастиц золота и серебра (химический синтез). Наночастицы золота и серебра были получены из тетрохлорзолотой кислоты или нитрата серебра с восстановителем боргидридом натрия и стабилизатором диметилдидодециламмония бромидом (Auх/ДДАБ и Agх/ДДАБ, соответственно) согласно ранее описанной методике [Shumyantseva V.V. et al., 2004]. Полученные наночастицы были охарактеризованы спектрально с помощью спектрофотометра Cary 100 (Varian Inc, Нидерланды). Максимум поглощения для Auх/ДДАБ в хлороформе соответствует длине волны 523 нм, а для Agх/ДДАБ 407 нм, что коррелирует с литературными данными [Кавецкая И.В., 2009;
Tan H.
et al., 2012]. Относительное стандартное отклонение среднего результата аналитического сигнала для наночастиц составило 10%.
Получение наночастиц золота (электросинтез). На поверхность печатного графитового электрода в горизонтальном режиме наносили 60 мкл 0,005 М раствора HAuCl4/0,1 М HCl. Электронанесение проводили в течение 180с (tэл) при потенциале –0,5 В.
Затем поверхность электрода промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе.
Получение наночастиц серебра (электросинтез). На поверхность печатного графитового электрода в горизонтальном режиме наносили 60 мкл 0,005 М раствора AgNO3/0,1 М НNO3. Электронанесение проводили в течение 180с при потенциале –1,2 В.
Затем поверхность электрода промывалась дистиллированной водой и высушивалась на воздухе.
проводилась сотрудником (СЭМ) Сканирующая электронная микроскопия лаборатории нанобиотехнологии отдела персонализированной медицины ФГБУ «ИБМХ» РАМН С.Л. Конашенко. Изображения модифицированных электродов, получены с помощью микроскопов S-3400N и S-5500 Hithachi Scanning Electron Microscope. Анализ изображений показал, что размер Auх/ДДАБ составляют 5 – 10 нм, а Agх/ДДАБ 5 – 15 нм (рисунок 1А и Б, соответственно). На рисунке 1В и 1Г представлена поверхность печатного графитового электрода, модифицированная Auэ/ДДАБ и Agэ/ДДАБ, соответственно. Средний размер Auэ/ДДАБ, полученных на поверхности электрода составил 100 – 700 нм, а Agэ/ДДАБ 200 – 1000 нм.
Рисунок 1. СЭМ. А) Auх/ДДАБ (5 – 10 нм), Б) Agх/ДДАБ (5 – 15 нм), В) ПГЭ/Auэ/ДДАБ (100 – 700 нм), Г) ПГЭ/Agэ/ДДАБ (200 – 1000 нм).
Приготовление электродов для анализа оксидов железа в составе магнитных наночастиц Ковалентная иммобилизация антител проводилась согласно методике предлагаемой фирмой-производителем магнитных наночастиц [http://www.chemicell.com/]. К 3 мкл плазмы крови добавляли 3 мкл магнитных наночастиц с ковалентно иммобилизованными антителами. Инкубация белка-маркёра и антитела проводилась в течение 15 мин при 37С.
Затем проводилась стадия магнитного сепарирования и нанесение (1 мкл) комплекса (магнитные наночастицы–антитело–тропонин I) на поверхность печатного графитового электрода. Модифицированный электрод высушивали в течение 10 мин при 37С, затем наносили 1 мкл 0,1 М диметилдидодециламмония бромида в хлороформе. Электрод перед измерением сигнала помещали в электрохимическую ячейку с 1мл фосфатного буфера (0,1 М KH2PO4 + 0,05 М NaCl), pH 7,4 на 15 мин при комнатной температуре. Измерения проводили в 1 мл 0,2 М цитратного буфера (Na3C6H5O7) рН 6,0 в диапазоне развёртки потенциалов от – 0,6 В до +0,2 В, амплитуда сигнала 0,019 В, частота 10 Гц.
Приготовление модифицированных электродов для анализа На рабочую поверхность печатного графитового электрода, наносили 2 мкл золотых или серебряных наночастиц, полученных химическим синтезом (ПГЭ/Auх/ДДАБ и ПГЭ/Agх/ДДАБ, соответственно). На рабочую поверхность электрода, модифицированного наночастицами золота или серебра, полученными электросинтезом, наносили 1 мкл 0,1 М ДДАБ (ПГЭ/Auэ/ДДАБ и ПГЭ/Agэ/ДДАБ, соответственно). Затем наносили 1 мкл раствора антител к соответствующему белку-маркёру (кардиомиоглобину, сердечному белку, связывающему жирные кислоты, тропонину I и Т) на рабочую поверхность электрода ПГЭ/Agэ/ДДАБ/Ат, ПГЭ/Auх/ДДАБ/Ат, ПГЭ/Agх/ДДАБ/Ат) и (ПГЭ/Auэ/ДДАБ/Ат, высушивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Иммуносенсоры на основе наночастиц металлов оставляли на 12 часов при 4C. Затем на рабочую поверхность иммуносенсора, модифицированного наночастицами золота или серебра, наносили 1 мкл исследуемого образца. Связывание белка-маркёра со специфическими антителами для электродов, модифицированных наночастицами серебра, проводилось в течение 15 мин (tинк) при 37С, а для электродов модифицированных наночастицами золота, 45 мин при 37С.
Перед измерением электрод помещали в электрохимическую ячейку (1 мл 0,1 М калий фосфатного буфера 0,05 М NaCl, pH 7,4) на 5 мин (tотм) при 25С для ПГЭ/Ag, и на 30 мин при 37С для ПГЭ/Au. Тестирование каждого образца плазмы крови и стандартных растворов проводилось по три раза (n = 3). Относительное стандартное отклонение среднего результата аналитического сигнала по трём измерениям (плазмы крови или стандартных растворов), было сопоставимо с относительным стандартным отклонением среднего результата аналитического сигнала электродов, модифицированных наночастицами металлов, и составило 9-12% (n = 3).
Измерение электрохимического сигнала наночастиц золота Сигнал регистрировали методом инверсионной вольтамперометрии с линейной развёрткой потенциала. Фоновая кривая (Iфон) для наночастиц золота, полученных электросинтезом, регистрировалась в диапазоне развёртки потенциалов от +0,6 до –0,6 В, = 0,05 В/с. Затем, прикладывался фиксированный потенциал +1,2 В в течение 30с (tок), после чего регистрировали сигнал (Iсигнал).
Аналитическим сигналом служила высота катодного (восстановительного) пика оксида золота, которая рассчитывалась по полученной вольтамперометрической кривой (I = Iсигнал – Iфон) с использованием программного пакета GPES (рисунок 2А). Для наночастиц золота, полученных химическим синтезом, измерение и расчёт интенсивности сигнала производился аналогично.
А0 Б Iсигнал Iфон - Ток, мкА Ток, мкА - I=Iсигнал-Iфон I = Iсигнал - Iфон - - Iфон - Iсигнал - 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0. Потенциал, В (Ag/AgCl) Потенциал, В (Ag/AgCl) Рисунок 2. А. Расчёт высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота.
Условия эксперимента: на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 60 мкл 0,005 M HAuCl4/0,1 M HCl, потенциал –0,5 В, tэл = 180с. Условия измерения сигнала: Еок = +1,2 В, tок = 30с, диапазон развёртки потенциала от +0,6 до –0,6 В, = 0,05 В/c, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3. Б. Расчёт высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра. Условия эксперимента: на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения наносили 60 мкл 0,005 М AgNO3/0,1 M HNO3, потенциал –1,2 В, tэл = 180с. Условия измерения: диапазон сканирования от –0,4 до +0,6 В, = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3.
Измерение электрохимического сигнала наночастиц серебра Сигнал наночастиц серебра, полученных электросинтезом, регистрировали методом инверсионной вольтамперометрии с линейной развёрткой потенциала в диапазоне от –0,4 до +0,6 В, = 0,05 В/с.
Аналитическим сигналом служила высота анодного пика (окислительного) наночастиц серебра, которая рассчитывалась по полученной вольтамперометрической кривой с использованием программного пакета GPES (рисунок 2Б). Для (I = I сигнал– I фон) наночастиц серебра, полученных химическим синтезом, измерение и расчёт интенсивности сигнала производился аналогично.
Измерение сигнала при проведении потенциометрического титрования На электрод в горизонтальном режиме наносили 55 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4), внесение образцов проводилось с интервалом 400с.
Аналитическим сигналом служило изменение потенциала рабочего электрода (E = E1 – E2), рассчитанное по полученной потенциометрической кривой с использованием графического пакета Origin 8,5 (рисунок 3).
-0. E1, B -0. E2, B E = E2 - E E, B -0. -0. -0. 350 375 400 425 450 Время, с Рисунок 3. Расчёт изменения потенциалов (E). Условия измерения: в горизонтальном режиме наносилось 55 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4), внесение образцов проводилось с интервалом 400с, объём вводимого образца 5 мкл. n = 3.
Диагностическая чувствительность (ДЧ) рассчитывалась по формуле Результаты и их обсуждение Разработка оптимальных условий модификации электродов наночастицами золота и серебра (электросинтез) Метод электросинтеза основан на восстановлении катионов металла электронами, поставляемыми с поверхности рабочего электрода. Величина электрохимического сигнала наночастиц золота или серебра, воспроизводимость, стабильность и чувствительность метода зависит от количества осаждённых наночастиц. В связи с этим, были отработанны оптимальные условия электрохимического получения наночастиц золота и серебра. На рисунке 4А представлен график зависимости высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от потенциала и времени электросинтеза наночастиц золота. На рисунке 4Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от потенциала и времени электросинтеза наночастиц серебра на поверхности печатного графитового электрода.
A Б Высота катодного пика, мкA Высота анодного пика, мкA 8 2 600 360 -0.6 -1.4 ) Вр g Cl l) -0.5 Вр 180 -1. A gC ем /A -0. (A g ем A g/ 30 -1. я, -0.3 -0. В( я, -0. мВ с ал, а л, с -0.1 -0. н ци нци е е П от П от Рисунок 4. А. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от потенциала и времени электросинтеза наночастиц золота на поверхности печатного графитового электрода. Условия эксперимента: на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 60 мкл 0,005 M HAuCl4 / 0,1 M HCl, потенциал от –0,1 до +0,5 В, tэл = от 5 до 600с. Условия измерения сигнала: Еок = +1,2 В, tок = 30с, диапазон развертки потенциала от +0,6 до –0,6 В, = 0,05 В/c, 1 мл 0, М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3. Б. Зависимость высоты анодного (окислительного) пика серебра от потенциала и времени электросинтеза наночастиц серебра на поверхности печатного графитового электрода. Условия эксперимента: на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 60 мкл 0,005 M AgNO3/0,1 M HNO3, потенциал от +0,6 до –1,4 В, tэл от до 600с. Условия измерения: диапазон развёртки потенциала от –0,4 до +0,6 В, = 0, В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3.
На основе полученных данных, были выбраны оптимальные условия электровосстановления наночастиц золота и серебра на поверхности электрода. Так, наночастицы золота получали при электрохимическом потенциале восстановления –0,5 В и времени электросинтеза 180с, а для наночастиц серебра электрохимический потенциал восстановления составил –1,2 В и время электросинтеза 180с. Относительное стандартное отклонение среднего результата электрохимического сигнала для наночастиц золота (Auэ) или серебра (Agэ), составило 9% и 12%, соответственно.
Отработка оптимальных условий связывания белков-маркёров с антителами, иммобилизованными на поверхности иммуносенсора Интенсивность электрохимического сигнала наночастиц металлов зависит от наличия на поверхности электрода биологического материала. Для повышения чувствительности метода были отработаны оптимальные условия связывания белков-маркёров с антителами, иммобилизованными на поверхности модифицированного электрода. Эксперименты проводились на примере электродов, модифицированных наночастицами золота или серебра, полученными электросинтезом, и антителами к тропонину I (АтI) (ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI/ и ПГЭ/Agэ/ДДАБ/АтI/). На рабочую поверхность иммуносенсора наносили 1 мкл плазмы крови больного острым инфарктом миокарда с концентрацией тропонина I 5,09 нг/мл (0,22 нМ).
На рисунке 5А представлена зависимость величины катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода, для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/AтI/плазма крови, при 37C. На рисунке 5Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода, для модификации ПГЭ/Agэ/ДДАБ/AтI/плазма крови, при 37C.
Б 0. А Высота катодного пика, мкА Высота анодного пика, мкA 0. 28 0. 0. 0. 0. 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 Время, мин Время, мин Рисунок 5. А. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода при 37C, для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/AтI/плазма крови.
Условия измерения сигнала: tотм = 5 мин при 25C, Еок = +1,2 В, t = 30с, диапазон развёртки потенциала от +0,6 до –0,6 В, = 0,05 В/c, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3. Б. Зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени связывания белка-маркёра с антителами, иммобилизованными на поверхности электрода при 37C, для модификации ПГЭ/Agэ/ДДАБ/AтI/плазма крови.
Условия измерения: tотм = 5 мин при 25C, диапазон развёртки потенциала от –0,4 до +0, В, = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3.
Из представленных графиков следует, что величина электрохимического сигнала возрастает с увеличением времени инкубации. Однако для наночастиц золота (рисунок 5А) максимальная величина катодного (восстановительного) пика оксида золота достигается к мин инкубации (30 мкА), а к 60 мин наблюдается некоторое уменьшение электрохимического сигнала (до 29 мкА), что связано, по-видимому, с началом процесса диссоциации белка маркёра и антитела. В то же время, для наночастиц серебра (рисунок 5Б) высота анодного (окислительного) пика наночастиц серебра начинает уменьшаться спустя 15 мин. Таким образом, для наночастиц золота было выбрано время инкубации равное 45 мин, а для наночастиц серебра 15 мин при 37C.
Плазма крови в своём составе содержит достаточно большое количество разнообразных биологических компонентов (фибриноген, маркёрные белки, глобулины, липопротеиды и т.д.). Такие компоненты могут влиять на электрохимический сигнал, поэтому необходимо проводить стадию удаления неспецифически связавшихся компонентов с поверхности иммуносенсора. В связи с этим, были выполнены эксперименты по отработке оптимальных условий удаления биологических компонентов с поверхности иммуносенсора.
Эксперименты проводились на примере электродов, модифицированных наночастицами золота или серебра, полученными электросинтезом, и антителами к тропонину I (АтI) (ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI/ и ПГЭ/Agэ/ДДАБ/АтI/). На рабочую поверхность иммуносенсора наносили 1 мкл плазмы крови больного острым инфарктом миокарда с концентрацией тропонина I 5,09 нг/мл (0,22 нМ).
На рисунке 6А представлена зависимость величины катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени удаления с поверхности иммуносенсора неспецифически связавшихся компонентов, для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/AтI/плазма крови, при 37C. На рисунке 6Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени удаления неспецифически связавшихся компонентов с поверхности иммуносенсора, для модификации ПГЭ/Agэ/ДДАБ/AтI/плазма крови, при 37C.
0. A Б Высота катодного пика, мкА Высота анодного пика, мкA 0. 0. 0. 20 0. 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 Время, мин Время, мин Рисунок 6. А. Зависимость величины катодного (восстановительного) пика оксида золота от времени удаления неспецифического компонента с поверхности иммуносенсора при 37C для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/AтI/плазма крови. Условия измерения: tинк = 45 мин при 37C, Еок = +1,2 В, tок = 30с, диапазон развёртки потенциала от +0,6 до –0,6 В, = 0,05 В/c, мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3. Б. Зависимость высоты анодного (окислительного) пика наночастиц серебра от времени удаления неспецифического компонента с поверхности электрода при 37C для модификации ПГЭ/Agэ/ДДАБ/AтI/плазма крови. Условия измерения: tинк = 15 мин 37C, диапазон развёртки потенциала от +0,4 до – 0,6 В, = 0,05 В/с, 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4). n = 3.
Как видно из представленного рисунка 6А, при времени отмывки 30 – 60 мин наблюдается максимальный электрохимический сигнал, который стабилизируется и составляет 32 – 33 мкА. К 60 мин инкубации и отмывки (рисунок 5А и 6А, соответственно) наблюдается уменьшение электрохимического сигнала. Таким образом, для удаления неспецифически связавшихся компонентов с поверхности электродов, модифицированных наночастицами золота, было выбрано оптимальное время 30 мин при 37C. Как видно из графика 6Б, при инкубации электродов ПГЭ/Agэ/ДДАБ/AтI/плазма крови более 30 мин, наблюдается уменьшение анодного (окислительного) пика наночастиц серебра. Для 5, 15 и мин при 37C наблюдается одинаковый электрохимический сигнал (0,37 – 0,38 мкА). В то же время, для электродов со временем отмывки 5 мин и при 25C, электрохимический сигнал составляет 0,35 мкА. Таким образом, экспериментально установлено, что оптимальным временем удаления неспецифического компонента с поверхности электродов, модифицированных наночастицами серебра, составляет 5 мин при 25C.
Разработка иммуносенсоров для анализа тропонина I и T Аналитические и диагностические возможности разработанных иммуносенсоров были продемонстрированы на образцах плазм крови и на стандартных растворах тропонина I и Т. Электроды были модифицированы наночастицами золота и серебра, полученными химическим синтезом и электросинтезом, моноклональными антителами к тропонину I или Т. Иммобилизация моноклональных антител на поверхность модифицированных электродов осуществлялась с использованием жидкокристаллического мембраноподобного вещества ДДАБ. Электрохимические параметры, регистрируемые с помощью наночастиц металлов, изменяются в зависимости от количества адсорбированных биологических молекул на рабочей поверхности иммуносенсора. На рисунке 7 представлен график зависимости ln(I/I0) от концентрации тропонина I в образцах плазмы крови для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI.
В качестве базового тока (Io) взят усредненный сигнал наночастиц золота, полученных электросинтезом, для пяти образцов плазм крови здоровых доноров. На вставке рисунка 7, кривая А соответствует образцу плазмы крови здорового донора, кривая Б соответствует образцу плазмы крови больного ОИМ.
32,0 нг/мл (1,3 нM) Б B -1.6 - I, мкА - Ток,µ A -1. - 18,0 нг/мл -1.2 (0,8 нM) - A ln(I/I0) - -1.0 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0. 16,0 нг/мл E, V Потенциал, В (относительно Ag/AgCl) (0,7 нM) -0. -0.6 5,1нг/мл (0,2 нM) -0.4 2,0 нг/мл (87,0 пM) 0,1 нг/мл -0.2 (4,6 пM) K 0. 1 2 3 4 5 6 Образцы плазм крови Рисунок 7. Зависимость ln(I/I0) от концентрации тропонина I в образцах плазм крови для ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI. В качестве базового тока (Io) взят усредненный сигнал высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота для пяти образцов плазм крови здоровых доноров. На вставке кривая А соответствует образцу плазмы крови здорового донора, кривая Б соответствует образцу плазмы крови больного острым инфарктом миокарда.
На основе электродов, модифицированных наночастицами золота и серебра с иммобилизованными на их поверхности антителами к тропонину I или Т, были получены четыре вида иммуносенсоров на тропонин I (ПГЭ/Auх/ДДАБ/АтI, ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI, (ПГЭ/Auх/ДДАБ/АтТ, ПГЭ/Agэ/ДДАБ/АтI ПГЭ/Agх/ДДАБ/АтI) и и тропонин Т ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтТ, ПГЭ/Agэ/ДДАБ/АтТ и ПГЭ/Agх/ДДАБ/АтТ). С помощью данных модификаций были получены калибровочные кривые на соответствующие белки-маркёры инфаркта миокарда для образцов плазм крови и стандартных растворов. В работе использовались образцы плазм крови больных острым инфарктом миокарда и здоровых доноров. Концентрация тропонина I, в плазме крови здоровых доноров по данным анализатора RAMP, составляет 0 нг/мл. Концентрация тропонина Т в плазмах крови не определялась с помощью промышленно выпускаемого анализатора RAMP, поэтому для получения калибровочных кривых были использованы стандартные растворы тропонина Т, с использованием которых была показана аналитическая чувствительность. На образцах плазм крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда была показана диагностическая чувствительность разработанных иммуносенсоров на тропонин Т. По электрохимическим параметрам образцы плазм крови были разделены на две группы:
здоровые доноры и больные острым инфарктом миокарда (рисунок 8). В работе использовалось 22 образца плазм крови: из них 7 образцов плазм крови здоровых доноров, и 15 образцов плазм крови больных острым инфарктом миокарда.
0. Высота катодного пика, мкA 0. Норма 0. 0. 0. 0. Острый инфаркт миокарда 0. 2 4 6 8 10 12 14 Образцы плазм крови Рисунок 8. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от концентрации тропонина T в образцах плазм крови (ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтТ).
По полученным данным, была проведена оценка результатов лабораторных исследований. Были оценены следующие параметры разработанных тест-систем:
ложноположительные (тест имеет положительный ответ, хотя заболевания у пациента не имеется) и ложноотрицательные результаты (тест имеет отрицательный ответ, хотя у пациента имеется заболевание), диагностическая чувствительность теста, которая определяет вероятность положительного результата и показывает, с какой степенью уверенности можно ожидать положительный результат теста у больных.
В таблице представлены аналитические характеристики разработанных иммуносенсоров на основе электродов, модифицированных наночастицами золота и серебра, полученными электросинтезом и химическим синтезом, на тропонин I (n = 3).
Таблица 1. Аналитические характеристики иммуносенсоров для анализа тропонина I.
Auэ/ДДАБ Auх/ДДАБ Agэ/ДДАБ Agх/ДДАБ Аналитическая характеристика Линейный диапазон 0,54 – 5,09 нг/мл 0,54 – 5,09 нг/мл 1,08 – 5,08 нг/мл 0,54 – 5,08 нг/мл определяемых (0,02 – 0,22 нМ) (0,02 – 0,22 нМ) (0,05 – 0,22 нМ) (0,02 – 0,22 нМ) концентраций для стандартных растворов Линейный диапазон 0,1 – 32,00 нг/мл 0,95 – 16,00 нг/мл 1,80 – 32,00 нг/мл 0,95 – 16,00 нг/мл определяемых (0,0043 – 1,34 нМ) (0,04 – 0,68 нМ) (0,08 – 1,34 нМ) (0,04 – 0,68 нМ) концентраций в плазме крови Диагностическая 87% 67% 73% 80% чувствительность Ложноположительные 2 3 2 Ложноотрицательные 2 5 4 Для разработанных иммуносенсоров на тропонин I диапазон определяемых концентраций в плазме крови составляет 0,10 – 32,00 нг/мл (0,0043 – 1,34 нМ) и 0,54 – 5, нг/мл (0,02 – 0,04 нМ) для стандартных растворов тропонина I, диагностическая чувствительность составляет 87%. Относительное стандартное отклонение среднего результата аналитического сигнала по трём измерениям образцов плазм крови или стандартных растворов, было сопоставимо с ранее рассчитанным стандартным отклонением среднего результат аналитического сигнала для каждой модификации электрода и составило 9-12% (n = 3). Время пробоподготовки занимает от 20 до 75 мин, а электрохимический анализ – 2 мин. Объём исследуемого образца плазмы крови 1 мкл.
В таблице представлены аналитические характеристики разработанных иммуносенсоров на тропонин Т (n = 3).
Таблица 2. Аналитические характеристики иммуносенсоров для анализа тропонина Т.
Auэ/ДДАБ Auх/ДДАБ Agэ/ДДАБ Agх/ДДАБ Аналитическая характеристика Линейный диапазон 0,1 – 1,0 нг/мл 1,0 – 3,0 нг/мл 1,0 – 6,0 нг/мл 0,1 – 1,0 нг/мл определяемых (2,7 – 27,0 пМ) (27 – 80,0 пМ) (27,0 – 160,0 пМ) (2,7 – 27,0 пМ) концентраций для стандартных растворов Диагностическая 87% 67% 73% 80% чувствительность Ложноположительные 3 3 3 Ложноотрицательные 3 3 5 Концентрация тропонина Т в норме составляет 0,1 – 0,5 нг/мл (2,7 – 13,5 пМ) [Kawde A.N. et al. 2005]. Диапазон определяемых концентраций иммуносенсоров ПГЭ/Auэ/ДДАБ и ПГЭ/Agэ/ДДАБ 0,1 – 1,0 нг/мл (2,7 – 27,0 пМ). Диагностическая чувствительность для электродов, модифицированных наночастицами золота (Auэ), составила 87%. Среди всех предложенных модификаций лучшие аналитические и диагностические характеристики показали ПГЭ/Auэ/ДДАБ, поэтому для анализа сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и кардиомиоглобина были использованы электроды, модифицированные Auэ/ДДАБ.
Определение сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и кардиомиоглобина Для селективного определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, или кардиомиоглобина на поверхность ПГЭ/Auэ/ДДАБ наносились специфические моноклональные антитела к сердечному белку, связывающему жирные кислоты (АтсБСЖК), или кардиомиоглобину (АткМБ). Аналитическая чувствительность иммуносенсоров к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, была продемонстрирована на стандартных растворах, а диагностическая чувствительность – на образцах плазм крови больных острым инфарктом миокарда и здоровых доноров. В работе использовалось образца плазм крови: из них 7 образцов плазм крови здоровых доноров, и 15 образцов плазм крови больных острым инфарктом миокарда. По электрохимическим параметрам образцы плазм крови были отнесены к одной из двух групп: здоровые доноры и больные острым инфарктом миокарда (ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтсБСЖК) (рисунок 9А). На рисунке 9Б представлен график зависимости высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от концентрации кардиомиоглобина для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АткМБ.
8. А Б 7. Высота катодного пика, мкA Высота катодного пика, мкA 7. Н ор м а 6. 6. 5. 5. 4. 4. О стр ы й и н ф ар кт м и ок ар да 3.5 3. 2. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 О бразцы п лазм к р ов и К о н ц е н т р а ц и я к а р д и о м и о г л о б и н а, н г /м л Рисунок 9. А. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от образцов плазм крови с различной концентрацией сердечного белка, связывающего жирные кислоты для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтсБСЖК. Б. Зависимость высоты катодного (восстановительного) пика оксида золота от концентрации кардиомиоглобина в плазме крови, для модификации ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АткМБ.
В таблице 3 представлены аналитические характеристики разработанных иммуносенсоров для анализа сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и кардиомиоглобина для электродов, модифицированных наночастицами золота, полученными электросинтезом. Относительное стандартное отклонение среднего результата не превышало 9% (n = 3).
Таблица 3. Аналитические характеристики иммуносенсоров.
Сердечный белок, Кардиомиоглобин Аналитическая характеристика связывающий жирные кислоты Диапазон определяемых концентраций для 58,0 – 400,0 нг/мл плазмы крови (3,3 нМ – 23,0 нМ) Диапазон определяемых концентраций для 0,5 – 6,0 нг/мл 10,0 – 600,0 нг/мл стандартных растворов (33,0 – 396,0 пМ) (0,6 – 35,0 нМ) Диагностическая чувствительность 67% 86% Ложноположительные 2 Ложноотрицательные 5 Концентрация кардиомиоглобина в норме по разным литературным данным составляет 70 – 200 нг/мл (4 – 11 нМ) [McDonnell B. et al. 2009;
Apple F.S. et al. 1999]. Однако большинство исследователей придерживаются среднего значения 100 нг/мл (6 нМ) [Kawde A.N., et al. 2005]. Аналитическая чувствительность разработанных иммуносенсоров для анализа кардиомиоглобина составляет 10,0 – 600,0 нг/мл (0,6 – 35,0 нМ) для стандартных растворов кардиомиоглобина, 58,0 – 400,0 нг/мл (3,3 – 23,0 нМ) для плазмы крови, а диагностическая чувствительность иммуносенсоров Для сердечного белка, 86%.
связывающего жирные кислоты, аналитическая чувствительность составляет 0,5 – 6,0 нг/мл (33,0 – 396,0 пМ), в то время как пороговая концентрация в норме 0,7 – 1,2 нг/мл (50,0 – 80, пМ). Диагностическая чувствительность составила 67%. Таким образом, разработанные иммуносенсоры обладают высокой аналитической и диагностической чувствительностью по отношению к сердечному белку, связывающему жирные кислоты и кардиомиоглобину.
Определение тропонина I по электрохимическому сигналу железа в составе магнитных наночастиц В настоящее время в биомедицинских исследованиях в разных формах используются магнитные наночастицы [Tartaj P. et al. 2006]. Использование магнитных наночастиц может повысить аналитическую чувствительность иммуносенсоров для белков, которые находятся в низком диапазоне концентраций. Был разработан электрохимический метод регистрации оксидов железа в составе магнитных наночастиц на поверхности печатного графитового электрода с помощью квадратно-волновой вольтамперометрии. Предложен подход для определения тропонина I в плазме крови по электрохимической регистрации железа в составе магнитных наночастиц, с ковалентно иммобилизованными на их поверхности (ПГЭ/мНЧ–АтI–тропонин антителами На рисунке представлена I/ДДАБ). 10А вольтамперограмма для электродов, модифицированных магнитными наночастицами на основе оксидов железа (I) и для немодифицированных электродов (II). На рисунке 10Б представлена зависимость высоты анодного (окислительного) пика оксидов железа в составе магнитных наночастиц от концентрации тропонина после предварительного I концентрирования с помощью магнитного сепаратора.
Б A 1.8 R =0, Высота анодного пика, нA 1. 1.4 I Ток, мкA 1.2 II 1.0 0.8 0.6 0. -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0. П отенциал, В (Ag/AgCl) 0 5 10 Концентрация тропонина I, нг/мл Рисунок 10А. Вольтамперограмма I – электрод, модифицированный магнитными наночастицами на основе оксидов железа. II – электрод, немодифицированный магнитными наночастицами. Условия измерения: 1 мл 0,2 М цитратного буфера (рН 6,0), диапазон развёртки потенциала от –0,6 до +0,2 В, амплитуда сигнала 0,019 В, частота 10 Гц. Б.
Зависимость высоты анодного (окислительного) пика оксидов железа в составе магнитных наночастиц от концентрации тропонина I в плазме крови.
Таким образом, были отработаны условия регистрации оксидов железа в составе магнитных наночастиц в 0,2 М цитратном буфере (рН 6,0) на поверхности печатного графитового электрода, и предложена методика определения тропонина I. Чувствительность данного метода составила 5,09 нг/мл (0,21 нМ), что существенно ниже по сравнению с ранее разработанным методом инверсионной вольтамперометрии по измерению сигнала наночастиц золота или серебра.
Потенциометрический метод определения тропонина I Метод потенциометрической регистрации основан на уникальных физико-химических свойствах наночастиц металлов, которые обладают высокой чувствительностью к изменению микроокружения. В последнее время в литературе опубликован ряд работ по потенциометрическому определению различных белков-маркеров, таких как С-реактивный белок, онкомаркёры и т.д. Данный метод позволяет определять вещества в достаточно низком диапазоне концентрации. Действие потенциометрических сенсоров основано на измерении разности потенциалов между индикаторным (рабочим) электродом и электродом сравнения, таким образом, чувствительность метода зависит от характеристик рабочего электрода [Будников Г.К. и др., 2003;
Ibupoto Z.H. et al., 2013;
Zelada-Guillen G.A. et al., 2013]. Был разработан потенциометрический метод определения тропонина I как белка, имеющего самый низкий порог концентрации (20,4 пг/мл (0,87 пМ) [Xu Q. et al., 2009]). Для проведения экспериментов были использованы электроды, модифицированные наночастицами золота, полученными электросинтезом, и антителами к тропонину I (ПГЭ/Аuэ/ДДАБ/АтI). Изменение потенциала (E) рабочего электрода ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI/ после введения стандартных растворов тропонина I в систему представлено на рисунке 11А. Изменение потенциала (E) рабочего электрода ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI/ после введения образцов плазм крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда представлено на рисунке 11Б.
1800 0 нг/мл Б 0 нг/мл 0 нг/мл 0 нг/мл 0 нг/мл [Тропонин I] А 0 нг/мл 1000 0 нг/мл 0 нг/мл 0 нг/мл R =0, 0 нг/мл Е, мкВ 45 пг/мл (2пМ) Е,мкВ 128 пг/мл (5 пМ) 18 пг/мл (0,8 пМ) 600 430 пг/мл (18 пМ) 180 пг/мл 400 (8 пМ) 1,6 нг/мл Больной острым инфарктом миокаржа (69,0 пМ) 0 650 пг/мл (28 пМ) 200 Здоровые доноры - 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 400 600 800 1000 1200 1400 Время, с Время, с Рисунок 11. А. Изменение потенциала (E) рабочего электрода ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI/ после – стандартные растворы, не введения стандартных растворов тропонина I в систему.
–стандартные растворы с различной концентрацией содержащие тропонин I.
тропонина I (от 0 до 9,14 нг/мл). Б. Изменение потенциала (E) рабочего электрода ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI/ после введения образцов плазм крови здоровых доноров и больных – образцы плазм крови здоровых доноров. – образцы острым инфарктом миокарда.
плазм крови больных острым инфарктом миокарда (от 18,0 пг/мл до 1,6 нг/мл (0,8 – 69, пМ)). Условия измерения на электрод в горизонтальном режиме, покрывая рабочий, вспомогательный и электрод сравнения, наносили 55 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера 0,05 М NaCl (pH 7,4), внесение образцов проводилось с интервалом 400с, объём вводимого образца 5 мкл. n = 3.
Как видно из представленного графика, для стандартных растворов, не содержащих тропонин I ( ), изменение потенциалов рабочего электрода составляет 794 – 854 мкВ;
для растворов, содержащих тропонин I ( ), происходит уменьшение изменения потенциала рабочего электрода с увеличением концентрации белка на поверхности электрода.
Минимально определяемая концентрация тропонина I с помощью данного метода составляет 45 пг/мл (2 пМ).
На следующем этапе были проанализированы образцы плазм крови здоровых доноров ( ) и больных острым инфарктом миокарда ( ). На рисунке 11Б представлен график изменения потенциала рабочего электрода ПГЭ/Auэ/ДДАБ/АтI/ после введения образцов плазм крови здоровых доноров и больных острым инфарктом миокарда. Из представленного графика видно, что, как и в случае стандартных растворов тропонина I, для здоровых доноров наблюдается незначительное изменение потенциалов рабочего электрода – от до 1601 мкВ. Для образцов плазм крови, содержащих различные концентрации тропонина I, наблюдается уменьшение изменения потенциала рабочего электрода c увеличением концентрации тропонина I. Линейный диапазон определяемых концентраций для данного метода составляет 18,0 пг/мл – 1,6 нг/мл (0,8 – 69,0 пМ). Таким образом, минимально определяемая концентрация тропонина I потенциометрическим методом составляет 18, пг/мл (0,8 пМ). Потенциометрический метод определения тропонина I более чувствителен по сравнению с методом инверсионной вольтамперометрии, для которого минимально определяемая концентрация составляет 100,0 пг/мл (4,3 пМ).
ВЫВОДЫ 1. Разработаны методики определения белков-маркёров инфаркта миокарда в плазме крови с помощью инверсионной, квадратно-волновой вольтамперометрии и потенциометрического анализа.
2. Отработаны условия модификации печатных графитовых электродов наночастицами золота и серебра, полученными электросинтезом и химическим синтезом, и магнитными наночастицами на основе оксидов железа.
3. Определены оптимальные электрохимические параметры регистрации наночастиц металлов на поверхности электрода с помощью инверсионной и квадратно-волновой вольтамперометрии.
4. Отработаны условия связывания белков-маркёров с соответствующими антителами на (ПГЭ/Agэ/ДДАБ/АтI/плазма разных типах модификаций электродов крови и I ПГЭ/Auэ/ДДАБ/Ат /плазма крови).
5. Проведен сравнительный анализ разработанных иммуносенсоров по следующим параметрам: аналитическая чувствительность, воспроизводимость и диагностическая чувствительность. Наилучшие аналитические характеристики для метода инверсионной вольтамперометрии показали иммуносенсоры, модифицированные наночастицами золота, полученными электросинтезом, (для тропонина I и Т – 0,1 нг/мл (4,3 и 2,7 пМ), соответственно), диагностическая чувствительность – 87 %, относительное стандартное отклонение среднего результата не превышало 9%. Для потенциометрического метода определения тропонина I аналитическая чувствительность составила 18,0 пг/мл (0,8 пМ).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
Статьи:
1. Шумков А.А., Супрун Е.В., Шумянцева В.В., Арчаков А.И. Сенсорные электрохимические системы для анализа кардиомиоглобина // Биомедицина. 2010. №5. С. 146-148.
2. Шумков А.А., Супрун Е.В., Шумянцева В.В., Арчаков А.И. Сенсорный элемент на основе наночастиц золота для определения кардиомаркёров // Биомедицина. 2011. №3. С. 46-49.
3. Шумков А.А., Шумянцева В.В., Арчаков А.И. Новый электрохимический подход к определению тропонина I в плазме крови // Медицинский академический журнал. 2012. Том 12. №4. С. 40-42.
4. Andrey A. Shumkov, Elena V. Suprun, Sophiya Z. Shatinina, Alexander V. Lisitsa, Victoria V.
Shumyantseva, Alexander I. Archakov. Gold and Silver Nanoparticles for Electrochemical Detection of Cardiac Troponin I based on Striping Voltammetry // BioNanoScience. 2013. V. 2. №3.
P. 216-222.
5. Агафонова Л.Е., Шумков А.А., Шумянцева В.B., Арчаков А.И. Новые подходы для определения кардиотропонина I в плазме крови // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2013. №2. С. 75-79.
Материалы конференций:
6. Супрун Е.В., Шумков А.А. Золотые наночастицы как модификаторы поверхности графитовых электродов для электрохимических биосенсоров // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2009. Специальный выпуск №3. C. 288-289.
7. Шумков А.А., Супрун Е.В. Электрохимические биосенсоры на основе наночастиц золота для определения кардиомаркёров тропонинов I и T // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2012. Специальный выпуск №1. C. 215.
8. Шумянцева В.В., Булко Т.В., Супрун Е.В., Агафонова Л.Е., Кузиков А.В., Чаленко Я.М., Шумков А.А., Арчаков А.И. Электрохимические методы в биомедицинских исследованиях // Биотехнология: состояние и перспективы развития. 2013. Материалы конгресса, часть 2. С.
149-150.
9. Shumyantseva V.V., Bulko T.V., Suprun E.V., Agafonova L.E., Kuzikov A.V., Chalenko Ya.M., Shumkov A.A., Archakov A.I. Electrocatalysis and electrochemical methods in biomedical researches // International conference «Biocatalysis-2013»: fundamentals & applications Abstract.
2013. P. 39-40.
10. Шумянцева В.В., Булко Т.В., Супрун Е.В., Агафонова Л.Е., Кузиков А.В., Чаленко Я.М., Шумков А.А., Арчаков А.И. Электрохимические методы в биомедицинских исследованиях // Материалы конференции IX всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии. Уфа-Абзаково. 2013. С. 27-28.
Список сокращений ПГЭ/НЧ/ДДАБ/Ат/ – печатный графитовый электрод, модифицированный наночастицами (таблица 4), ДДАБ и антителами к соответствующему белку маркёру инфаркта миокарда;
Таблица 4. Тип наночастиц Auэ – наночастицы золота, полученные электросинтезом.
Auх – наночастицы золота, полученные химическим синтезом.
НЧ Agэ – наночастицы серебра, полученные электросинтезом.
Agх – наночастицы серебра, полученные химическим синтезом.
АтI – моноклональные антитела к тропонину I;
АтT – моноклональные антитела к тропонину T;
АтсБСЖК – моноклональные антитела к сердечному белку, связывающему жирные кислоты;
АткМб – моноклональные антитела к кардомиоглобину;