Функционально-экологическая оценка микроорганизмов биодеструкторов для разложения и утилизации полиэтиленов высокого давления
На правах рукописи
Белова Мария Сергеевна ФУНКЦИОНАЛЬНО-ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МИКРООРГАНИЗМОВ БИОДЕСТРУКТОРОВ ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ И УТИЛИЗАЦИИ ПОЛИЭТИЛЕНОВ ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ 03.02.08 – экология (биология)
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2012
Работа выполнена в проблемной научно-исследовательской лаборатории биологической защиты сырья и продуктов питания Московского Государствен ного университета прикладной биотехнологии Научный руководитель доктор технических наук, Легонькова Ольга Александровна Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева Градова Нина Борисовна доктор биологических наук, профессор кафедры почвоведения Владимирского государственного университета Шушкевич Нина Ивановна Ведущая организация Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН
Защита диссертации состоится «14» марта 2012 года в 17 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д-220.043.03 при Российском государст венном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева Адрес: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, Ученый совет РГАУ МСХА имени К.А.Тимирязева.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К. А.
Тимирязева.
Автореферат разослан «13» февраля 2012 г. и размещён на сайте универ ситета – www.timacad.ru Отзывы на автореферат (в 2-х экземплярах, заверенных печатью), просим направлять по адресу: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49;
факс: 8(499)976-24- Учёный секретарь диссертационного совета Селицкая О. В.
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. В настоящее время экологическим вопро сам, связанным с утилизацией полимерного мусора, уделяется недостаточное внимание. Исследование процессов физико-химических превращений синтети ческих и природных полимерных материалов (ПМ) в условиях воздействия ок ружающей среды, является фундаментальной задачей науки о материалах как при решении вопросов их биостойкости, так и получении биоразлагаемых из делий. Знание механизма процессов биодеструкции или относительной био стойкости должно позволить прогнозировать изменение функциональных па раметров, находить способы как продления «сроков жизни», так и ускорения процесса их распада.
Проблема утилизации упаковочных материалов остается нерешенной, становясь все более и более международной. На сегодня можно встретить сле дующие данные:
- Объем образования муниципальных отходов в государствах – членах ЕС в среднем 524 кг на каждого жителя ЕС. Из общего количества образовавшихся муниципальных отходов 40% было захоронено на полигонах, 20% сожжено в энергетических целях, 23% переработано в качестве вторичных материальных ресурсов и 17% подверглось компостированию.
- в России по различным источникам (поскольку полноценный статисти ческий учет не ведется) уже много лет проскальзывает цифра 400 кг на чело века в год (из них 100-150 кг отходов упаковки). Годовой уровень накопления полимерных отходов составляет 710 тыс. т. В среднем 61% ТБО выбрасывается на свалку, только 24% вторично перерабатывается, 15% сжигается. В Рос сийской Федерации полимерные отходы не выделяются из общего объема ТБО, действующее законодательство не содержит определения термина «отходы упаковки». Для этих отходов не предусмотрено отдельной системы сбора и утилизации.
Состав ТБО следующий: бумага и картон – 25-30%, пищевые отходы – 20-30%, металлолом – 10-12%, полимеры – 10-12%, прочие – 5-10%. Создается впечатление, что почти все полимерные упаковочные материалы переходят на свалки. Эти 10-12% полимерных отходов включают полиэтилены (до 38%), по ливинилхлориды и его производные (до 20%), полистирол (до 15%), полипро пилен (до 8%), другие пластики (полиэтилентерефталат, полиамиды и др. до 19%).
Нельзя сказать, что для решения проблемы утилизации полимерных ма териалов ничего не делается. Отходы захоранивают, сжигают, подвергают пи ролизу, вторично перерабатывают.
Убежденность многих экспертов в том, что благодаря биополимерам насту пит перелом в охране окружающей среды, и решится проблема мусорных сва лок, может оказаться слишком оптимистичной. Вопрос, что же делать с огром ными свалками, уже существующими и продолжающими разрастаться, остает ся нерешенным. Следовательно, задачи повторного использования, восстанов ления и рециклинга полимерных отходов в этом широкомасштабном потоке отходов становятся все более и более актуальными.
Материалы на основе полиэтиленов высокого давления (ПЭВД) нашли широкое применение в различных сферах жизнедеятельности человека благо даря своим физико-химическим характеристикам: температурой плавления (105-1080С), стойкостью к различным химическим средам (исключая окисли тели), низкой газопроницаемостью и хорошими изоляционными свойствами.
ПЭВД является наиболее широко применяемым упаковочным полимером, од на треть всех упаковочных пластиков составляет именно эти материалы. Со став полимерных отходов на 38% состоит из полиэтиленов (ПЭ) различных марок.
Многие ученые в России и за рубежном занимаются вопросами создания экологически чистых полимеров: Н.А. Платэ, Г.Е. Заиков, О.А. Легонькова, D.L. Kaplan, A. Jimenes, J. Donate-Robles и др. Однако, эта проблема еще дале ка от решения.
Цель работы. Функциональная оценка микроорганизмов-биодеструкторов, выявление механизмов биоповреждения полиэтиленов высокого давления раз личных марок для разработки путей экологически безопасной утилизации по лимерных отходов.
Задачи исследования. В соответствии с целью были поставлены следую щие задачи:
1) Разработать методический подход к выделению почвенных микроорга низмов-биодеструкторов синтетических полимерных материалов.
2) Проанализировать разнообразие микроорганизмов, выделенных из ряда почв России, потенциальных биодеструкторов полиэтиленов высокого давления (ПЭВД) различных марок.
3) Оценить степени биоповреждений полиэтиленов высокого давления раз личных марок под действием микроорганизмов-биодеструкторов.
4) Выявить механизмы биоповреждений полиэтиленов высокого давления различных марок под действием почвенных микроорганизмов.
Научная новизна исследования. Установлено, что все изученные об разцы почв содержали микромицеты, способные вызывать биоповреждения ПЭВД различных марок. Наибольшим биоразнообразием отличается технозем с регулируемой свалки Московской области. Выделено более 100 изолятов, из которых составили рабочую коллекцию. Выяснили, что все изученные об разцы почв содержали микромицеты, способные обрастать полиэтилены высо кого давления различных марок. Разработан микробиологический подход к вы делению биодеструкторов синтетических полимерных материалов. Выявлены активные штаммы микроорганизмов, вызывающие биоповреждения исследо ванных марок ПЭВД. Впервые установлено, что определяющим фактором сте пени грибостойкости полимеров является плотность полимерного материала.
Показана идентичность глубины биоповреждений субстратов химического происхождения, основанных как на непосредственной метаболической актив ности микроорганизмов, так и на выделении ими продуктов жизнедеятельно сти. Получены данные, подтверждающие, что выделенные органические соеди нения при биоповреждении ПЭВД экологически безопасны при их утилизации инкубированием в почвах.
Практическая значимость исследования. Результаты выполненного исследования могут быть использованы для создания биоразлагаемых компо зиционных материалов и промышленных изделий из них, позволяя утилизиро вать отходы ПЭВД. Положения, сформулированные в работе, ряд эксперимен тальных данных и предложенных методов включены в качестве учебного мате риала при чтении лекций и проведении практических занятий по дисциплинам «Полимерное материаловедение», «Микробные биотехнологии в сельском хо зяйстве», «Экологическая биотехнология».
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на:
The Second International Conference on Biodegradable Polymers and Sustainable Composites (Spain, 2009);
Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (Москва, 2009);
IX Ежегодной международная молодежной конфе ренции «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2009);
Междуна родная конференция «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010);
VI Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 11 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объём работы. Диссертация представлена введением, обзо ром литературы по данной тематике, описанием объектов, методов и условий экспериментов, экспериментальной частью и её обсуждением, заключением с выводами и рекомендациями.
Объём диссертационной работы составляет 197 с., из них 65 с. приложе ния. Работа включает 48 таблиц, 108 рисунков, список литературы из 179 на именований (в том числе 63 на иностранном языке).
Объекты и методы исследования В качестве объектов были исследованы образцы различных марок полиэти лена высокого давления, широко используемые при упаковке пищевых продук тов и изготовлении изделий различных назначений, ГОСТ 16337-77: следую щих марок 15303-003, 15803-020, 10803-020 (Таблица 1).
Таблица Физико-механические характеристики полиэтиленов Марка ПЭВД ПТР, г/10 Прочность Деформация Плотность, г/см мин при разрыве, при разрыве, % МПа ПЭВД 153 03-003 0,3 13,7 600 0, ПЭВД 158 03-020 2,0 11,5 600 0, ПЭВД 108 03-020 2,0 12,2 550 0, Для сравнительного анализа поведения образцов полиэтиленов были взя ты образцы широко известного в качестве биоразлагаемого материала, поли лактида (PLA) фирмы Nature Works. Биоразлагаемый, биосовместимый, термо пластичный, алифатический полиэфир, мономером которого является молочная кислота.
Для выделения микроорганизмов-биодеструкторов были исследованы сле дующие образцы почв (Таблица 2).
Таблица Характеристика образцов почв № п/п Место отбора образцов Тип почвы 1 Краснодарский край, поле Чернозем южный 2 Самарская область, поле Чернозем выщелоченный 3 Тульская область, поле Серая лесная 4 Московская область, сад Дерново-подзолистая 5 Московская область, Технозем нерегулируемая свалка 6 Московская область, Технозем нерегулируемая свалка 7 Московская область, Технозем регулируемая свалка Численность микроорганизмов различных групп определяли методом по сева по общепринятой методике (Теппер и др, 2004): бактерии, использующие органические формы азота – на мясопептонном агаре (МПА), инкубация посева при 28°С;
бактерии, использующие минеральные формы азота (в том числе ак тиномицеты) – на крахмало-аммиачном агаре (КАА);
микроскопические гри бы- на минеральной среде Чапека (с добавлением молочной кислоты);
аэробные целлюлозоразлагающие микроорганизмы - на среде Гетчинсона. Результаты анализа выражали численностью колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г массы абсолютно сухой почвы.
Для выделения чистых культур использовали метод посева из разведений почвенных суспензий на плотные питательные среды двумя различными спо собами: 1. Путем создания элективных условий по общепринятой методике на агаризованных средах Чапека с добавлением молочной кислоты (2 мл на 1 литр среды), КАА, сусло-агаре и МПА. 2. Методом выделения аэробных микроор ганизмов на агаризованной среде Гетчинсона, где в качестве единственного ис точника углерода были использованы образцы ПЭВД. Этим методом выделяли микроорганизмы из образцов почв №№ 6 и 7 (техноземов Московской области с нерегулируемой и регулируемой свалок). После выделения чистых культур, продолжили работу только с грибами. Идентификацию микромицетов прово дили по культурально-морфологическим признакам с использованием опреде лителей почвенных грибов. Рабочую коллекцию составили 25 изолятов, кото рые были протестированы на способность развиваться на образцах ПЭВД.
Культивирование микроорганизмов на выбранных марках ПЭВД проводили на основании ГОСТ 9.048-89, ГОСТ 9.049-91. Оценивали грибостойкость каждого образца по интенсивности развития мицелия (Таблица 3).
Таблица Характеристики баллов оценки грибостойкости Балл Характеристика балла 0 Под микроскопом прорастания спор и конидий не обнаружено 1 Под микроскопом видны проросшие споры и незначительно развитый мицелий 2 Под микроскопом виден развитый мицелий, возможно спороношение 3 Невооруженным глазом мицелий и (или) спороношение едва видны, но отчетливо видны под микроскопом 4 Невооруженным глазом отчетливо видно развитие грибов, покрываю щих менее 25% испытуемой поверхности 5 Невооруженным глазом отчетливо видно развитие грибов, покрываю щих более 25% испытуемой поверхности Определение физико-механических свойств образцов ПЭВД различных марок до и после воздействия микроорганизмов Измерение физико-механических свойств ПЭВД различных марок до и по сле инокуляции микрооганизмами проводили на универсальной машине для механических испытаний “Autograph AGS-10kNG” фирмы Shimadzu, которая может испытывать образцы на растяжение, сжатие и изгиб с усилием от 0, Ньютона до 10 КилоНьютона (от 0,5 до 1 т) в зависимости от скорости переме щения траверсы от 0,05 до 100 мм/мин;
точность измерения усилий от 0,5 до 1%;
в соответствии с ГОСТ 14236.
Характеристиками прочности являлись: разрушающее напряжение при растяжении, рассчитанное на первоначальное сечение образца (р), деформа ция при разрушении (р), модуль упругости, а также кривая растяжение в коор динатах = f() при комнатной температуре и скорости перемещения нижнего зажима 100 мм/мин.
Все результаты эксперимента обрабатывали статистически. Разброс экспе риментальных данных не превышал 10% Измерение убыли веса образцов Измерения веса образцов производили на электронных аналитических ве сах фирмы OHAUS, марки Adventurer Pro (AV).
Дискретность 0,1 мг. Измеряли образцы до и после инокуляции.
Электронная Микроскопия Оценка изменений поверхности испытуемых образцов полиэтиленов вы сокого давления различных марок производили по состоянию поверхности ме тодом растровой электронной микроскопии (JEOL - JEM-5300LV, Япония).
Хроматомасс-спектрометрический метод исследования Продукты деструкции определяли при помощи хроматографа марки Hew lett Packard модель HP – 6890 (США). Для идентификации хроматограмм ис пользовали базу данных NIST 98 и WILEY275. Газо-хроматографическое раз деление примесей осуществляли на капиллярной кварцевой колонке НР-5 МС с геометрическими размерами: 30м 0,25мм0,25 мкм. Образцы пленок до и по сле обработки растворителями сушили на фильтровальной бумаге при комнат ной температуре и взвешивали на аналитических весах. Пленки помещали в бюксы, заливали 2 мл метанола, встряхивали вручную в течение 5 минут и ста вили в УЗВ на 15 мин., после чего отбирали растворитель и концентрировали его до объема 0,2 мл, обдувая поверхность жидкости потоком азота, затем мкл «рабочего» образца вводили в испаритель хроматографа. Образцы пленок, не бывших в контакте с микроорганизмами, обрабатывали вышеприведенным способом и использовали как «контрольные». При сравнении хроматограмм исключали пики с одинаковыми временами удерживания («метод вычитания»).
Оставшиеся пики на хроматограммах идентифицировали.
Статистическая обработка данных Результаты эксперимента были обработаны с помощью статистического метода дисперсионного анализа (Ивашкин Ю.А. и др.,1987).
Задача дисперсионного анализа заключались в определении изменчиво сти признака под влиянием каких-либо контролируемых переменных факторов (анализ вариативности).
Цель дисперсионного анализа заключалась в следующем: определить при заданном уровне значимости, взаимозависимость прочности, убыли веса и степени обрастания полимера (результативный признак) и вида микроорганиз ма (фактор).
Проверка гипотезы о равенстве групповых математических ожиданий (в случае, если фактор не влияет на результирующий признак) осуществляли по критерию Фишера. Если расчётное значение F-критерия меньше критического для заданного уровня значимости и числа степеней свободы, то наблюдения не подтверждают влияния фактора на признак. В противном случае влияние фак тора на результирующий признак подтверждается.
Результаты и обсуждение Мониторинг почвенных микромицетов на различных средах Все изученные образцы почв содержали виды микромицетов, способных деструктировать самые разнообразные субстраты (Domsch, et al., 1980;
Лугау скас и др., 1987). Наиболее распространенными были следующие виды (в зави симости от образцов почв):
Образец почвы № 1 (Чернозем Южный, Краснодарский Край) Aspergillus ochraceus G. Wilh., А. sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church, A. versicolor (Vuill.) Tirab., Penicillium aurantiogriseum Dierckx, Р. chrysogenum Thom, P.citrinum Thom;
Образец почвы № 2 (Чернозем выщелоченный, Самарская область) Acrostalag mus luteoalbus (Link) Zare, Aspergillus sydowii, Fusarium solani (Mart.) Sacc., Penicillium aurantiogriseum, P. citrinum W. Gams et Schroers;
Образец почвы № 3 (Серая лесная, Тульская область) Aspergillus niger Tiegh., A.
sydowii, A. versicolor, Penicillium aurantiogriseum, P. chrysogenum, P.сitrinum;
Образец почвы № 4 (Дерново-подзолистая, Московская область) Aspergillus ochraccus, A. glaucus (L.) Link, A. sydowii, Penicillium chrysogenum, P. citrinum;
Образец почвы № 5 (Технозем 1, нерегулируемая свалка Московской области) Aspergillus sydowii, A. terreus Thom, Penicillium chrysogenum;
Образец почвы № 6 (Технозем 2, нерегулируемая свалка Московской области) Aspergillus glaucus, A. sydowii, A. ustus (Bainier) Thom et Church, Mucor circinelloides Tiegh, Penicillium canescens Sopp, Talaromyces helicus (Raper et Fennell) C.R. Benj., Trichoderma harzianum Rifai;
Образец почвы № 7 (Технозем 3, регулируемая свалка Московской области) Ac remonium kiliense Grtz, Acrostalagmus luteoalbus, Actinomucor elegans (Eidam) C.R. Benj. et Hesselt., Aspergillus glaucus, A. niger,, A. terreus Thom, A. sydowii, A.
versicolor, Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud, Botryotrichum piluliferum Sacc. et Marchal, Cadophora fastigiata Lagerb. et Melin, Clonostachys solani (Harling) Schroers et. W.Gams, Coniothyrium fuckelii Sacc., Fusarium oxysporum Schltdl., F. solani, Gliomastix murorum (Corda) S. Hughes, Lecanicillium psalliotae (Treschew) Zare et W. Gams, Paecilomyces inflatus (Burnside) Carmichael, Paraconiothyrium sporulosum (W. Gams et Domsch) Verkley, P. canescens, P.
funiculosum Thom, P. rubrum Sopp, P. leveillei Boerema et G.J. Bollen, P. variabile Sopp, P. aurantiogriseum Dierckx, P. brevicompactum Dierckx, P. glabrum (Wehmer) Westling, P. rugulosum Thom. Pseudallescheria boydii (Shear) McGinnis, Scopulariopsis brumptii Salv.-Duval, Stachybotrys chartarum (Ehrenb.) S. Hughes, Trichoderma harzianum Rifai, Geomyces pannorum (Link) Sigler et J.W. Carmich, Trichocladium asperum Harz, Actinomucor elegans (Eidam) C.R. Benj. et Hesselt, Mortierella sp., Gliomastix murorum (Corda) S. Hughes, Fusarium merismoides Corda, Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., Trichurus spiralis Hasselbr., Conio thyrium sp.
Всего было выделено и идентифицировано более 100 штаммов микроор ганизмов. Наибольшее разнообразие видов было обнаружено в техноземах, в особенности в образце почвы № 7 (технозем с регулируемой свалки Москов ской области). Результат можно отнести к ожидаемым, т.к. в этой почве, со держащей технические и бытовые отходы, что естественно, сформировано со общество микроорганизмов, адаптированных к разнообразным субстратам раз личного химического происхождения. Далее мы рассчитали частоту встречае мости интересующих нас выявленных микроорганизмов из наиболее «богатой» почвы, технозем 3 (Московская область, регулируемая свалка). Преобладали такие виды как: Aspergillus sydowii, Pseudallescheria boydii, Paecilomyces inflatus, Fusarium oxysporium (рисунок 1).
Наша задача состояла в выявлении как можно большего количества мик роорганизмов почв различных зон России с целью проверки их на способность вызывать биоповреждения полиэтиленов. Для ответа на поставленные задачи и выявления наиболее «активных» микроорганизмов с точки зрения их биопо вреждающей способности по отношению к ПЭВД, образцы пластика были ино кулированы всеми идентифицированными штаммами из всех образцов почв.
Рис.1 Наиболее распространенные штаммы, выделенные из технозема 3 (ре гулируемая свалка Московской области) Рабочую коллекцию в работе составили 25 микроорганизмов (таблица 4).
Таблица Микроорганизмы, вошедшие в рабочую коллекцию № Наименование микроорганизмов п/п 1 Acremonium murorum (Corda) W. Gams 2 Acrostalagmus luteoalbus (Link) Zare 3 Actinomucor elegans (Eidam) C.R. Benj. Et Hesselt 4 Aspergillus ochraceus G. Wilh.
5 Aspergillus glaucus (L.) Link 6 Aspergillus niger Tiegh.
7 Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church 8 Aspergillus terreus Thom 9 Aspergillus ustus (Bainier) Thom et Church 10 Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab.
11 Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud 12 Clonostachys solani (Harling) Schroers et. W.Gams № п/п Наименование микроорганизмов 13 Fusarium oxysporum Schltdl.
14 Fusarium solani (Mart.) Sacc.
15 Lecanicillium psalliotae (Treschew) Zare et W. Gams 16 Mucor circinelloides Tiegh.
17 Penicillium canescens Sopp 18 Penicillium citrinum Thom 19 Penicillium cyclopium Westling 20 Penicillium rubrum Sopp 21 Penicillium variabile Sopp 22 Penicillium chrysogenum Thom 23 Stachybotrys chartarum (Ehrenb.) S. Hughes 24 Talaromyces helicus (Raper et Fennell) C.R. Benj.
25 Trichoderma harzianum Rifai Изучение образцов почв с использованием среды Гетчинсона С целью оптимизации процесса скрининга микромицетов в работе была предпринята попытка выделения потенциальных биодеструкторов полиэтиле нов различных марок с помощью среды, разработанной нами на основе среды Гетчинсона, в которой в качестве единственного источника углерода были ис пользованы образцы полиэтилена высокого давления в качестве единственного источника углерода. На 28 день инокулирования, непосредственно с поверхно сти образцов пластиков, было выделено и идентифицировано около 20 штам мов ( мы использовали 2 образца почв: с регулируемой и нерегулируемой сва лок Московской области). Данные микроорганизмы, также как и полученные чашечным методом, были иммобилизованы на поверхность исследуемых об разцов синтетических полимеров. Десять из них попали в рабочую коллекцию.
Оценку биоповреждений проводили по степени обрастания, убыли веса и изме нению прочности образцов ПЭВД различных марок.
Изучив и сравнив разнообразие микроорганизмов, полученных двумя способами, мы пришли к выводу, что метод выделения микроорганизмов путем использования образцов в качестве единственного источника углерода на ага ризованной среде Гетчинсона нельзя использовать как самостоятельный. Одна ко он являлся существенным дополнением к общепринятому способу, т.к.
именно с его помощью были выделены микроорганизмы, которые не были вы делены чашечным методом, такие, например, как Mucor circinelloides, Talaro myces helicus, Penicillium canescens, Lecanicillium psalliotae.
Разработка методического подхода к оценке степени биоповреждений полиэтиленов под действием почвенных микроорганизмов.
Оценка грибостойкости полиэтиленов высокого давления под действием почвенных микроорганизмов Все изученные почвы содержали микромицеты, способные вызывать биоповреждения полиэтиленов, наибольшее разнообразие видов было выделе но из техноземов. Самые активные штаммы были обнаружены в образце почвы № 7 (Технозем №3 с регулируемой свалки Московской области). В таблице представлено сравнение грибостойкости различных марок ПЭВД при инокуля ции одними и теми же микроорганизмами на 7, 14, 21 и 28 дни.
Таблица Грибостойкость ПЭВД Интенсивность раз Марка полимера Виды микроорганизмов вития мицелия, балл 7 14 21 дн. дн. дн. дн.
ПЭВД 153 03-003 4 4 4 Actinomucor elegans ПЭВД 158 03-020 4 4 5 Actinomucor elegans ПЭВД 108 03-020 5 5 5 Actinomucor elegans ПЭВД 153 03-003 3 4 4 Aspergillus versicolor ПЭВД 158 03-020 4 4 5 Aspergillus versicolor ПЭВД 108 03-020 5 5 5 Aspergillus versicolor ПЭВД 153 03-003 4 4 4 Aspergillus sydowii ПЭВД 158 03-020 4 4 4 Aspergillus sydowii ПЭВД 108 03-020 4 4 4 Aspergillus sydowii ПЭВД 153 03-003 3 4 4 Aureobasidium pullulans ПЭВД 158 03-020 4 4 4 Aureobasidium pullulans ПЭВД 108 03-020 4 5 5 Aureobasidium pullulans ПЭВД 153 03-003 2 3 4 Penicillium aurantiogriseum ПЭВД 158 03-020 2 2 3 Penicillium aurantiogriseum ПЭВД 108 03-020 3 4 4 Penicillium aurantiogriseum ПЭВД 153 03-003 2 4 4 Trichoderma harzianum ПЭВД 158 03-020 2 3 4 Trichoderma harzianum ПЭВД 108 03-020 4 4 5 Trichoderma harzianum Было выявлено, что существует зависимость между степенью обрастания грибами и различными марками полиэтилена. Интенсивность развития мицелия на поверхности полимера с низким показателем текучести (марка ПЭВД 03-003) была ниже по сравнению с марками ПЭВД 108 03-020 и ПЭВД 158 03 020, имеющими более высокое значение ПТР. При одинаковом значении ПТР (марки ПЭВД 158 03-020 и ПЭВД 108 03-020) интенсивность развития мицелия зависела от плотности материала: чем ниже плотность полимера, тем выше степень его обрастания. Таким образом, важным фактором степени грибостой кости полимеров является их плотность.
Изучение изменений убыли веса и физико-механических характери стик полиэтиленов при инокуляции почвенными микромицетами Данные по изменению веса образцов полиэтиленовых пленок, бывших в контакте с микоорганизмами, по сравнению с контрольными подтверждают, что почвенные микромицеты вызывают деструктивные процессы полимеров:
для ПЭВД 108 03-020 убыль веса составила 1,4 % ± 0,6 % за 28 дней (рисунок 2), в случае ПЭВД 15303-003 эта величина равна 1,3%±0,4%, ПЭВД 158 03- - 1,7%±0,5%.Результаты подтверждают, что почвенные микромицеты вызыва ют деструктивные процессы полимера. Отличия связаны как с видовой принад лежностью используемых микроорганизмов, так и маркой полиэтилена, отли чающихся важным показателем для биоповреждений – плотностью материала.
Рис. 2 Убыль веса образцов ПЭВД 108 03-020 после инокуляции, % Прочностные характеристики исследуемых образцов были охарактеризо ваны таким параметром, как прочность при разрыве. Для оценки значимости полученных данных по изменению прочности ПЭВД были проведены исследо вания по изменению прочности полилактида (рисунок 3), известного, как био разлагаемый пластик.
В качестве образца почвы (на основании результатов эксперимента с об разцами ПЭВД различных марок, описанного выше) нами сознательно было отдано предпочтение образцу №7 (Технозем №3 с регулируемой свалки Мос ковской области). Образцы полилактида были погружены в регулярно увлаж няемую почву. Прочностные испытания 15 образцов проводили через 8, 9, 10, 14 и 17 недель. Увеличение прочности на 10-ой неделе можно объяснить про явлением релаксационных процессов цепей макромолекул полимера под влия нием сорбированной воды почвы. (А.Е. Чалых, Г.Е. Заиков).
Рис.3 Потеря прочности образцов полилактида при инокуляции в почве, % Также образцы подвергали весовым измерениям до и после проведенного времени в почве (pисунок 4).
Рис. 4. Убыль веса образцов полилактида при инокуляции в почве, % Данные потери прочности, убыли веса образцов полилактида и ПЭВД на ходятся в одинаковых пределах, что подтверждает факт биоповреждений ПЭВД.
Оценка поверхностных биоповреждений полиэтиленов различных марок Для оценки биоповреждений на поверхности инокулированных образцов ПЭВД применяли электронный растровый микроскоп при напылении золотом (Рисунки 5 и 6).
Рис. 5 Электронно-микроскопические фотографии поверхности ПЭВД после инокуляции образцов микромицетами (увеличение х1000) Рис. 6 электронно-микроскопические фотографии поверхности ПЭВД марки 158 03-020 инокулированного Aspergillus glaucus при различных увеличениях Для сравнения на рисунке 7 представлена микрофотография исходного образца полиэтилена высокого давления.
Рис. 7 Электронно-микроскопическая фотография поверхности полиэтилена высокого давления. Уве личение х1000.
На рисунке 6 представлены электронно-микроскопические фотографии поверхности ПЭВД марки 158 03-020 инокулированного Aspergillus glaucus, при различных увеличениях. Образцы отмывали и просматривали поверхности.
Как показывают электронно-микроскопические фотографии (рисунок 5) по вреждения поверхности ПЭВД после инокуляции образцов микромицетами (увеличение х1000) различны как по внешнему виду, так и по степени дефект ности в зависимости от вида микроорганизма и марки полимера.
Дисперсионный анализ данных Результаты эксперимента были обработаны с помощью статистических методов, а именно, с помощью дисперсионного анализа.
Данные о степени обрастания, убыли веса, прочности полимеров, под вергнутых действию различных микроорганизмов, были представлены в виде таблиц, удобных для обработки.
Проанализированные данные для всех трех марок ПЭВД подтверждают, что с методической точки зрения для выделения микроорганизмов биодеструкторов необходимо оценивать следующие изменения поведения по лимерных материалов: прочностные характеристики, обрастание и убыль веса.
Механизм биоповреждений и экологические аспекты утилизации полиэти ленов высокого давления инкубированием в почве Результаты по определению эффективности типов почв при твердофазном культивировании штаммов неоднозначны. Трудно оценить отличие активности штаммов, взятых из образцов почв №1-4 (чернозем южный Краснодарского края, чернозем выщелоченный Самарской области, серая лесная почва Тульской области и дерново-подзолистая почва Московской области), что подтверждается данными газохроматографического анализа: например, штамм Aspergillus sy dowii на подложке ПЭВД 15803-020 продуцирует метиловый эфир бутановой кислоты и 2-этил-1-гексанол независимо от того, из какой почвы он выделен.
Однако по интенсивности развития мицелия было очевидно, что наиболее «ак тивными» (интенсивность развития мицелия от 4 баллов) были штаммы микро организмов, выделенных из образца почвы №7 (Технозема 3 с регулируемой свалки Московской области).
В таблицах 6, 7 и 8 представлены результаты идентификации продуктов, образующихся при инокуляции почвенными микроорганизмами поверхности полиэтиленов.
Таблица Идентифицированные органические соединения, образующихся при кон такте ПЭВД 15303-003 с почвенными микромицетами (образец Технозема №3 с регулируемой свалки Московской области) Микроорганизмы Наименование обнаруженных органических соединений тетракозан Aspergillus sydowi метоксифенилоксим, 2,6-ди(t-бутил)-4 Trichoderma harzianum гидрокси-4-метил-2,5-циклогексадиен-1-он, 3 октадецен, метиловый эфир пентадекановой кислоты,1,7,11-триметил-4-(1 метилэтил)циклотетрадекан, докозан 1,2-докозадиен Aureobasidium pullulans 1-метил-2-пропил циклогексан, докозан, гек Aspergillus versicolor силциклогексан, 2-метил эйкозан, 1-октадецен, Н-гептадецил циклогексан, 2-метилтетракозан, пентакозан 1,2,4а,5,6,8а-гексагидро-4,7-диметил-1 Penicillium aurantiogriseum изопропилнафтален, бензофенон, докозан, гек сакозан Таблица Идентифицированные органические соединения, образующиеся при кон такте ПЭВД 15803-020 с почвенными микромицетами Микроорганизмы Наименование обнаруженных органических соединений Trichoderma harzianum (техно- 2-этил-1-гексанол зем №3 с регулируемой свалки Московской области) Aspergillus sydowii (технозем Метиловый эфир бутановой кислоты, 2-этил-1 №3 с регулируемой свалки гексанол Московской области) Actinomucor elegans (технозем Метиловый эфир бутановой кислоты №3 с регулируемой свалки Московской области) Aureobasidium pullulans (тех- Метиловый эфир бутановой кислоты, 2-этил-1 нозем №3 с регулируемой гексанол свалки Московской области) Рenicillium citrinum (чернозем Метиловый эфир бутановой кислоты южный Краснодарского края) Aspergillus sydowii (чернозем Метиловый эфир бутановой кислоты, 2-этил-1 южный Краснодарского края) гексанол Таблица Идентифицированные органические соединения при контакте ПЭВД 10803-020 с почвенными микромицетами Микроорганизмы Наименование обнаруженных органиче ских соединений Aspergillus sydowii (технозем №3 Метиловый эфир бутановой кислоты, 2 с регулируемой свалки Москов- метилдекан, 2,6-ди(t-бутил)-4-гидрокси-4 ской области) метил-2,5-циклогексадиен-1-он, метиловый эфир 9-гексадеценовой кислоты, метиловый эфир 9,12-октадекадиеновой кислоты Actinomucor elegans (технозем №3 Гексакозан с регулируемой свалки Москов ской области) Trichoderma harzianum (технозем 2-этил-1-гексанол №3 с регулируемой свалки Мос ковской области) Aureobasidium pullulans (технозем 2-этил-1-гексанол, 2-метилдекан, 2,6,10 №3 с регулируемой свалки Мос- триметилпентадекан, метиловый эфир 9 ковской области) гексадеценовой кислоты, метиловый эфир цис-10-гептадеценовой кислоты, бутилмети ловый эфир-1,2-бензолдикарбоксильной ки слоты, метиловый эфир 9,12 октадекадиеновой кислоты, трикозан, тетра козан разветвленный, гексакозан 2-этил-1-гексанол, 2-метилдекан, 2,6,10 Penicillium aurantiogriseum (чернозем южный Краснодарско- триметилпентадекан, метиловый эфир 9,12 го края) октадекадиеновой кислоты Aspergillus versicolor (чернозем 2-метилдекан, 2,7,10-триметилдодекан, ме южный Краснодарского края) тиловый эфир 9,12-октадекадиеновой кисло ты, трикозан Молекула полиэтилена не содержит в своем составе атомы кислорода, азота и фрагменты ароматических и насыщенных углеводородов. Выявленные низкомолекулярные соединения, содержащие азот, кислород и насыщенные углеводороды, однозначно свидетельствуют о том, что и продукты метаболиз ма, образующиеся в процессе «расходования» полиэтилена микроорганизмами.
Соединения, представленные в таблицах 6, 7 и 8 можно с большой долей веро ятности отнести к продуктам взаимодействия полимеров и микроорганизмов, в том числе и вторичных метаболитов грибов, так как они отсутствуют в кон трольных образцах.
Концентрация идентифицированных органических соединений находится на уровне 1,010-3 – 5,010-4 %. В работе (Легонькова О.А., 2009) при рассмотре нии механизмов биоповреждений акрилатов, термопластичных полиуретанов, поливиниловых спиртов показано, что концентрация органических соединений находится в тех же пределах. Можно предположить идентичность глубины процессов биоповреждений субстратов химического происхождения, основан ных как на непосредственной метаболической активности микроорганизмов, так и на выделении ими продуктов жизнедеятельности.
Выделенные органические соединения при биодеструкции ПЭВД эколо гически безопасны при их утилизации инкубированием в почвах.
ВЫВОДЫ 1. Разработан методический подход к выделению биодеструкторов синтети ческих полимерных материалов, заключающийся в крупномасштабном мо ниторинге почвенных микромицетов на агаризованных средах по показате лям: прочность, убыль веса, степень обрастания.
2. Было выделено более 100 изолятов, 25 из них составили рабочую коллек цию. Все изученные образцы почв содержали микромицеты, способные вы зывать биоповреждения ПЭВД различных марок. Наибольшим биоразнооб разием отличается технозем с регулируемой свалки Московской области.
3. «Активными» микроорганизмами–биодеструкторами для разных марок полиэтиленов высокого давления являются:
ПЭВД 153 03-003 – Acrostalagmus luteoalbus, Aspergillus niger, A. glaucus, A. sydowii, A. versicolor, Aureobasidium pullulans, Penicillium canescens, P.
variabile, P. cyclopium, Fusarium oxysporum, F. solani, Lecanicillium psalliotae,;
ПЭВД 158 03-020 – Fusarium oxysporum, Lecanicillium psalliotae, Penicil lium citriunum, P. cyclopium, P. chrysogenum, Acrostalagmus luteoalbus, Ac tinomucor elegans, Aureobasidium pullulans, Aspergillus versicolor, A. glau cus;
ПЭВД 108 03-020 – Lecanicillium psalliotae, Acrostalagmus luteoalbus, Fusarium solani, Aspergillus sydowii, A. versicolor, Actinomucor elegans, Au reobasidium pullulans, Trichoderma harzianum, Penicillium citrinum, P.
canescens, P. cyclopium, P. chrysogenum.
4. Показана избирательность действия штаммов грибов по отношению к различным марками полиэтилена. Интенсивность развития мицелия на поверхности полимера, снижение прочности, убыль веса не зависят от показателя текучести расплава, а связаны как с природой используемых микроорганизмов, так и маркой полиэтилена. Важным показателем для возникновения биоповреждений является плотностью материала.
5. Показана идентичность глубины процессов биоповреждений субстратов химического происхождения, основанных на непосредственной метабо лической активности микроорганизмов. Полученные данные подтвер ждают способность микромицетов осуществлять деструкцию ПЭВД.
6. Установленно, что выделенные органические соединения при биодест рукции ПЭВД экологически безопасны при их утилизации инкубирова нием в почвах. Концентрация идентифициронных соединений находится на уровне 1,010-3 – 5,010-4 % за 28 дней.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Легонькова О.А., Бокарев А.А., Федотова М.С. Свойства композицион ных материалов на основе наполненных акриловых дисперсий// «Лако красочные материалы и их применение», 2005.- № 9.- С. 22-25;
2. Legonkova O., Fedotova M. Biotechnological Approach to Degradation of Hybrid Synthetic Composites//The Second International Conference on Biode gradable Polymers and Sustainable Composites, Spain, 2009. - 30 Sept–2 Oct.
3. Легонькова О.А., Федотова М.С. Биотехнологический подход к утилиза ции упаковочных отходов// Международная научная конференция сту дентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегаю щие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания»// Москва, МГУПБ, 2009 – С. 122-123;
4. Легонькова О.А., Федотова М.С.// IX Ежегодной международная моло дежной конференции «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы, Моск ва, 2009.-9-11 ноября;
5. Легонькова О.А., Селицкая О.В., Федотова М.С. Микробиологическая деструкция композиционных полимерных материалов в почве// Между народная конференция «Биотехнология: экология крупных городов», Мо сква, 2010.- 15-17 Марта, С. 364;
6. Легонькова О.А., Федотова М.С. Материаловедческие сновы упаковки продуктов животного происхождения// «Пищевая промышленность», 2011.- № 1, - С. 8-14;
7. Легонькова О.А., Федотова М.С. Биоповрежедния клеев на основе терм попластичных полиуретанов под действием почвенных микроорганиз мов// «Клеи, герметики, технологии», 2011, №6, - С. 61-64;
8. Легонькова О.А., Федотова М.С., Селицкая О.В., Александрова А.В.
Биоутилизация крупнотоннажного упаковочного материала в пищевой промышленности// «Пищевая промышленность», 2011.- №5, - С. 74-77;
9. Легонькова О.А., Федотова М.С. Биоразлагаемая упаковка для пищевых продуктов// «Переработка молока», Москва, 2011, - июнь, - С. 61-62;
10. Легонькова О.А., Федотова М.С., Селицкая О.В. Мониторинг почвен ных микроорганизмов основных зональных почв России//VI Междуна родный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2011.- 21-25 марта, С. 93;
11. Легонькова О.А., Белова М.С. Проблемы утилизации упаковочных ма териалов в России и зарубежом// «Пищевая промышленность», 2011. №6, - С. 26-29.