Совершенствование методов диагностики оспы овец и оспы коз

На правах рукописи

Орлова Елена Сергеевна СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ 03.00.06 «Вирусология»

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Владимир - 2007

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г.Владимир) Научный руководитель - кандидат биологических наук ЩЕРБАКОВ Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:

- РЫБАКОВ Сергей Сергеевич доктор биологических наук, профессор (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир);

- ЦЫБАНОВ Содном Жамьянович, доктор биологических наук, профессор (ГНУ ВНИИВиМ, г. Покров)

Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва)

Защита диссертации состоится « 15 » мая 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Автореферат разослан « 13 » апреля 2007 года Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М. Семёнова 1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Оспа овец и оспа коз – высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных. По классификации МЭБ они относятся к трансграничным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. Оспа овец и оспа коз эндемичны на Ближнем Востоке, в Центральной Азии, Индии, Китае, а также в Центральной и Южной Африке. В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. В России оспа регистрировалась в 1994-2000 и 2002-2003 гг.

(World Animal Health, 1996-1997).

Возбудителями болезней являются близкородственные, но таксономически самостоятельные виды – вирус оспы овец (ВОО) и вирус оспы коз (ВОК), – относящиеся к роду Caprypox семейства Poxviridae. ВОО и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то, что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев (Kitсhing R.P. and Carn V.M, 2000). Это делает актуальной задачу видовой дифференциации возбудителей оспы.

Для специфической профилактики оспы используются живые аттенуированные вакцины. Вакцинированные животные в результате контакта с эпизоотическими штаммами могут становиться бессимптомными носителями вируса и служить резервуаром инфекции. В связи с этим, при обнаружении у вакцинированных животных вируса оспы возникает необходимость в дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов.

Лабораторная диагностика оспы основана на обнаружении вируса или его составляющих (белков, ДНК) в клиническом материале, либо антител к вирусу в сыворотке крови животных.

Традиционные методы диагностики оспы овец и коз (реакция нейтрализации, выделение вируса на культуре клеток) не способны дифференцировать вирусы оспы овец и оспы коз друг от друга и, тем более, вакцинные штаммы вирусов от эпизоотических. На сегодняшний момент различать вирусы рода Caprypox можно только методом рестрикционного картирования или нуклеотидного секвенирования вирусных геномов. Однако в силу сложности и трудоемкости они неприменимы для рутинной диагностики.

В соответствии с требованиями МЭБ при подозрении на оспу овец и коз патологический материал должен тестироваться также и на наличие вируса контагиозной эктимы (ВКЭ). Этот парапоксвирус вызывает заболевание, которое, также как и оспа, проявляется поражениями кожи, однако не относится к особо опасным болезням из-за незначительной смертности среди пораженных животных.

Метода обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР в России пока разработано не было.

Для выявления антител к ВОО и ВОК традиционно используется реакция нейтрализации. Метод достаточно дорог, отличается невысокой чувствительностью и может выполняться лишь в условиях специализированных лабораторий с высоким классом биологической защиты. Первые попытки применения ИФА для выявления антител к ВОО и ВОК были основаны на использовании в качестве антигена частично очищенных препаратов вируса (Sharma et al., 1988b;

Rao, 1997). Однако из-за невозможности избавиться от примесей клеточных белков в препаратах антигена специфичность реакции была низкой. С целью решения этой проблемы. H.G.Heine et al. (1999) предложили для выявления антител к ВОО и ВОК ИФА, основанный на использовании рекомбинантного антигена Р32, полученного экспрессией в E.coli.

Разработанный метод ИФА имел ряд преимуществ перед традиционными тест системами, поскольку рекомбинантный антиген был биологически безопасен, дешев в получении и легко чистился, что обеспечивало высокую специфичность реакции.

Однако в России подобные работы не проводились.

Таким образом, в диагностике оспы овец и оспы коз нерешенными оставался ряд проблем. Отсутствовали простые и быстрые методы видовой и штаммовой дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз. Не разрабатывались в России и высокоспецифичные иммуноферментные методы для выявления антител к этим вирусам.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в совершенствовании методов диагностики оспы овец и оспы коз.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома вирусов рода Caprypox, выявить участки генома, пригодные для видовой дифференциации каприпоксвирусов и для дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов этих возбудителей;

- разработать простой и быстрый метод обнаружения и дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз, основанный на ПЦР и не требующий проведения таких дополнительных процедур, как рестрикционный анализ или нуклеотидное секвенирование ампликонов;

- разработать метод, позволяющий различать вакцинные и эпизоотические штаммы вируса оспы овец;

- для проведения дифференциальной диагностики оспы овец и оспы коз от контагиозной эктимы разработать на основе ПЦР метод обнаружения вируса контагиозной эктимы;

- получить рекомбинантные антигены вируса оспы овец экспрессией в E.coli;

- на основе рекомбинатных антигенов разработать иммуноферментный метод для выявления антител к вирусам оспы овец и оспы коз.

Научная новизна исследований. Впервые разработан экспресс-метод, позволяющий выявлять и дифференцировать виды каприпоксвирусов только на основе ПЦР, без дополнительных исследований (рестрикционного анализа или нуклеотидного секвенирования).

Предложен метод дифференциации вакцинных штаммов «НИСХИ», «ВНИИЗЖ» и «Б 5/96» вируса оспы овец от эпизоотических изолятов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом ампликонов, не имеющий аналогов в диагностике оспы овец.

Предложен метод дифференциальной диагностики вируса оспы овец и вируса оспы коз от вируса контагиозной эктимы.

Экспрессией в E.coli получены рекомбинантные белки Р17, Р18 и Р32 вируса оспы овец.

Разработан непрямой вариант ИФА с использование рекомбинантных белков Р17 и Р18 в качестве антигенов для обнаружения антител к каприпоксвирусам в сыворотках крови мелких жвачных.

Практическая значимость исследований. В результате проведённых исследований разработано 5 методик, которые успешно прошли комиссионные испытания, одобрены учёным советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:

«Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

«Методика обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

«Методика дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР» (2005 г.);

«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р17 вируса оспы овец» (2006 г.);

«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р18 вируса оспы овец» (2006 г.).

Разработанные методики используются в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в диагностических исследованиях.

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано научных работ, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (Владимир, 2004 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в период 2002-2006 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

Метод обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной ПЦР (мПЦР).

Метод дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР.

Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием ПЦР.

Получение рекомбинантных антигенов вируса оспы овец и оценка их антигенной активности.

Использование рекомбинантных антигенов Р17 и Р18 вируса оспы овец в непрямом варианте ИФА.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 133 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и приложения. Список используемой литературы включает 188 источников, из которых 149 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 16 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы Патологический материал. В работе использовали органы и ткани от экспериментально зараженных оспой овец и коз, от здоровых невакцинированных против оспы овец и коз, а также от коз, больных контагиозной эктимой.

Вирусы. В работе использовали штамм “ВНИИЗЖ” и изоляты “Афганский”, “Приморский”, “ЕАО” вируса оспы овец, штаммы “ВНИИЗЖ”, “Pellor” и изоляты “Таджикский”, “ЕАО” вируса оспы коз, а также вирус бугорчатки КРС и изолят «Таджикский» вируса контагиозной эктимы из коллекции вирусов ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Вирусы получены из лаборатории «Общих болезней для разных видов животных» и отдела «Биологического и технологического контроля» ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир).

Сыворотки. Использовали полевые сыворотки от овец и коз из хозяйств различных регионов России, а также сыворотки крови от экспериментально зараженных вирусом оспы овец или вирусом оспы коз мелких жвачных животных с подтвержденным в реакции нейтрализации серологическим статусом, предоставленные отделом «Биологического и технологического контроля» ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир).

Плазмиды. Для получения экспрессирующей конструкции была использована плазмида pQE (фирма «Qiagen»).

Бактериальные штаммы. Для трансформации и экспрессии рекомбинантных плазмид использовался штамм M15 E.coli: [pREP4] E.coli K12 (nals, strs, rifs, lac-, ara-, gal-, mtl-, F’-, recA+, uvr+, lon+) pREP4 – kanr. Источник штамма – фирма «Qiagen».

Пероксидазный конъюгат. Использовали коммерческий препарат меченных пероксидазой хрена моноклональных антител, реагирующих с IgG коз и овец (Sigma, США).

Выделение ДНК. Выделение суммарной ДНК из патологического материала и культуры клеток проводили по модифицированному методу О.Г. Грибанова с соавторами (О.Г. Грибанов, 1996).

Расчёт и синтез праймеров. Расчёт праймеров выполняли на основе нуклеотидных последовательностей каприпоксвирусов, представленных в базе данных GenBank. Синтез праймеров осуществляла фирма «Синтол» (Москва).

ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава: 2,5 мкл 10 буфера для Taq-полимеразы, 3 мМ Mg2+, 0,2 мМ dNTPs, 1,0 ед. Taq-полимеразы, по 10 пмоль праймеров, 3 мкл раствора вирусной ДНК и вода до конечного объема 25 мкл.

Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе PTC-100 (MJ Research, США) при следующем температурном режиме: 2 мин. предварительной денатурации при 94С, 35 циклов амплификации (30 с денатурации при 94С, 30 с отжига праймеров при 55С, 30 с элонгации при 72С) и 2 мин. заключительной элонгации. При необходимости проводили второй раунд амплификации с внутренними праймерами в смеси аналогичного состава в течение 20-25 циклов. Продукты реакции анализировали с помощью электорофореза в 2,0% агарозном геле, содержащем 0,001% бромистого этидия, при силе тока 50 мА.

Молекулярное клонирование продуктов ПЦР. Продукты ПЦР очищали от компонентов реакционной смеси по методике, аналогичной выделению ДНК. Реакции рестрикции и лигирования проводили в соответствии с рекомендациями фирм изготовителей ферментов. Трансформацию и приготовление компетентных клеток E.coli проводили по методике Ханаана (1988). Культивирование E.coli проводили в среде LB и на LB-агаре при 370С. Скрининг клонов, несущих рекомбинантные плазмиды, проводили с помощью аналитического выделения плазмид и последующего рестрикционного анализа. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli осуществляли методом щелочного лизиса, модифицированного Н.Г.

Холодиловым (1990).

Экспрессия рекомбинантных белков. Экспрессию рекомбинантных белков проводили добавлением индуктора (ИПТГ) в культуру клеток E.coli, достигшую логарифмической фазы роста.

Очистка рекомбинантных белков. Очистку рекомбинантных белков проводили с помощью металл-хелатной хроматографии. Осадок клеток E.coli обрабатывали лизирующим буфером, затем центрифугировали 5 мин. при об/мин. К надосадку добавляли Ni-NTA agarose («Qiagen») и инкубировали при помешивании 15 мин. Сорбент дважды промывали лизирующим буфером. Белки элюировали с сорбента с помощью раствора имидазола. Уровень экспрессии и степень очистки препарата белка оценивали с помощью электрофореза в ПААГе.

Концентрацию белков определяли по Бредфорду (Т. Маниатис и др., 1984).

Непрямой вариант ИФА. Тестирование сывороток в ИФА методом последовательных разведений проводили по общепринятой методике с некоторыми модификациями (Егоров, 1991).

Статистическая обработка результатов. Определение среднего арифметического (х ) при количестве опытов (n), среднего квадратичного отклонения () средней арифметической проводили согласно руководству И.В.Полякова (1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка мультиплексной ПЦР для индикации и видовой дифференциации каприпоксвирусов В результате анализа полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов, представленных в базе данных GenBank, были установлены видоспецифичные участки для ВОО, ВОК и вируса бугорчатки (ВБ). На основе этих данных для видовой дифференциация каприпоксвирусов были сконструированы видоспецифичные праймеры: S1 и S2 - для ВОО, G1 и G2 - для ВОК.

Род каприпоксвирусов, кроме ВОО и ВОК включает и ВБ, также вызывающий особо опасное заболевание животных. Несмотря на то, что этот вирус поражает преимущественно КРС, описаны случаи, когда он вызывал заболевание у овец и коз.

Поэтому мы ввели третью пару праймеров (L1 и L2), специфичных для вируса бугорчатки, чтобы сделать метод логически законченным.

Видоспецифичные праймеры были рассчитаны таким образом, что синтезируемые с их участием ампликоны имели разную длину: 415 п.н. для ВОК, 311 п.н. для ВОО и 254 п.н. для ВБ. Это позволяло использовать все три пары праймеров в одной реакции и различать продукты мультиплексной ПЦР по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле. Взаимное расположение праймеров на геноме представлено на рисунке 1.

Для увеличения аналитической чувствительности метода система была дополнена двумя внешними родоспецифичными праймерами C1 и C2, универсальными для всех трех видов каприпоксвирусов.

703 /693 п.н.

415 п.н.

G G 311 п.н.

S1 S 254 п.н.

L1 L С1 С 5’ 3’ ОРС Рис. 1. Схема расположения на геноме родо- и видоспецифичных праймеров для видовой дифференциации каприпоксвирусов С1, С2 - родоспецифичные праймеры;

S1, S2 - видоспецифичные праймеры для вируса оспы овец;

G1, G2 - видоспецифичные праймеры для вируса оспы коз;

L1, L2 - видоспецифичные праймеры для вируса бугорчатки.

Cверху указана длина фрагментов ДНК, получаемых в ПЦР, 703 п.н. – для ВОК, 693 п.н. – для ВОО и ВБ.

Для оценки специфичности метода видовой дифференциации каприпоксвирусов было исследовано 11 проб, содержащих различные каприпоксвирусы. Среди них были вируссодержащие клеточные культуры со штаммом «ВНИИЗЖ» и изолятами «Афганский», «Приморский», «ЕАО» вируса оспы овец, штаммами «ВНИИЗЖ», «Pellor» вируса оспы коз, вирусом бугорчатки;

а также изолятами «ЕАО» и «Таджикский» ВОК в виде суспензии кожи больных животных.

Кроме того, были приготовлены пробы, содержащие смесь двух и трех видов каприпоксвирусов одновременно.

После проведения первого раунда ПЦР с универсальными праймерами С1 и С специфический фрагмент расчетной длины (693/700 п.н.) был получен как для проб, содержащих ВОО, ВОК или ВБ, так и для проб с их смесью (рис. 2А). Полученные результаты подтвердили универсальность праймеров С1 и С2 для всех трех видов каприпоксвирусов.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 В.

Рис. 2. Обнаружение и видовая дифференциация каприпоксвирусов.

Электрофорез в 2%-ном агарозном геле продуктов ПЦР А – первый раунд ПЦР с универсальными праймерами С1 и С2;

В – второй раунд ПЦР с видоспецифическими праймерами (мультиплексный вариант);

1 – отрицательный контроль;

7 – ВОК, эпизоотический изолят 2 – маркер (снизу вверх – 100, 200, 300, “Таджикский”;

400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

8 – ВОК, вакцинный штамм 3 – ВОО, вакцинный штамм “ВНИИЗЖ”;

“ВНИИЗЖ”;

4 – ВОО, эпизоотический изолят 9 – ВОК, эпизоотический изолят “ЕАО”;

“Афганский”;

10 – ВОК, эпизоотический штамм 5 – ВОО, эпизоотический изолят “Pellor”;

“Приморский”;

11 – вирус бугорчатки;

6 – ВОО, эпизоотический изолят “ЕАО”;

12 – смесь ВОО и ВОК;

13 – смесь ВОО, ВОК и ВБ Специфический фрагмент ДНК отсутствовал в пробах, содержащих изоляты “Таджикский” и “ЕАО” ВОК. Эти пробы отличались от остальных тем, что представляли собой суспензию органов и, вероятно, содержали вирус в концентрации, недостаточной для обнаружения с помощью одного раунда ПЦР.

Результаты второго раунда ПЦР подтвердили это предположение.

На рисунке 2В отражены результаты второго раунда ПЦР с видоспецифичными праймерами (мультиплексной ПЦР). В пробах, содержащих ДНК ВОО, был получен ампликон длиной 311 п.н., что соответствует расчетному значению. Фрагмент длиной 415 п.н. синтезировался в пробах с генетическим материалом ВОК.

Ожидаемый результат – ампликон длиной 254 п.н. – был получен и в пробе с ДНК ВБ. В пробах, содержащих смесь ДНК ВОО и ВОК, синтезировались два фрагмента, а со смесью ДНК ВОО, ВОК и ВБ - три ампликона соответствующей длины.

Неожиданный результат был получен при анализе пробы, содержащей изолят “Таджикский” ВОК. Электрофорез продуктов мультиплексной ПЦР показал наличие в этой пробе фрагмента длиной 311 п.н., специфичного для ВОО, вместо ожидаемого фрагмента размером 415 п.н., характерного для ВОК. На основании полученных результатов было выдвинуто предположение, что изолят «Таджикский» в действительности является вирусом оспы овец. Дальнейшие исследования другого фрагмента генома подтвердили это предположение.

С использованием серии последовательных разведений вируса была определена аналитическая чувствительность метода. Она составила 102 ЦПД50/мл для первой ПЦР и 10-2 ЦПД50/мл для nested-ПЦР.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан высокочувствительный и специфичный метод, позволяющий выявлять каприпоксвирусы и определять их видовую принадлежность. По результатам комиссионных испытаний «Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» одобрена учёным советом и утверждена директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Разработка метода дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов ВОО Для специфической профилактики оспы овец и коз используются аттенуированные вакцины. В связи с этим при обнаружении у вакцинированных животных вируса оспы возникает необходимость в определении его принадлежности к вакцинному или эпизоотическому штамму. Решение этой диагностической проблемы составляло вторую задачу наших исследований.

В настоящее время в России и странах СНГ для специфической профилактики оспы овец наиболее широко используются вакцины из двух аттенуированных штаммов: “ВНИИЗЖ” (В.И.Диев, 1998) и “Б-5/96” (И.Ф.Вишняков и др., 1999). Оба они являются производными аттенуированного штамма “НИСХИ”, полученного В.Н.Иванющенковым с соавт. путем пассирования в культуре клеток почки ягненка вирулентного штамма “Афганский” (В.Н.Иванющенков и др., 1990;

Ф.П.Курченко и др., 1991).

Мы провели сравнительный анализ известной последовательности генома штамма “НИСХИ” и других каприпоксвирусов и выявили несколько областей, потенциально пригодных для дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов ВОО.

Одним из маркерных признаков штамма «НИСХИ» и его производных “ВНИИЗЖ” и “Б-5/96” является точечная мутация (замена нуклеотида A на T) в триплете, которая приводит к появлению стоп-кодона (АААTAA). В связи с этим у вакцинных штаммов ВОО “ankyrin-repeat” белок состоит из 243 а.о., тогда как у вирулентных штаммов – из 638 а.о. Возникновение данной маркерной мутации у вакцинных штаммов сопровождается появлением сайта ТТТААА, узнаваемого рестриктазой Dra I (жирным шрифтом выделен тимидин, появившийся в результате точечной мутации). Наличие у российских вакцинных штаммов ВОО сайта рестрикции, отсутствующего у эпизоотических штаммов, позволяет дифференцировать их методом рестрикционного анализа. На расстоянии 214 п.н. от этого маркерного сайта геном ВОО (как вакцинных, так и эпизоотических штаммов) содержит еще один сайт для рестриктазы Dra I, отсутствующий в геноме ВОК, что позволяет путем рестрикционного анализа одновременно решать две задачи:

дифференцировать ВОО от ВОК и определять штаммовую принадлежность ВОО.

Принцип разработанного нами дифференцирующего метода показан на рисунке 3. С использованием родоспецифических праймеров проводится амплификация участка гена “ankyrin-repeat” белка длиной 564 п.н. Затем проводится обработка ампликонов рестриктазой Dra I. В пределах амплифицируемого фрагмента генома у эпизоотических изолятов ВОО расположен один сайт рестрикции Dra I, у вакцинных штаммов ВОО – два сайта, у ВОК – таких сайтов нет. Анализ продуктов рестрикции в агарозном или полиакриламидном геле позволяет легко отличать ВОО от ВОК и вакцинные штаммы ВОО от эпизоотических изолятов по характерному набору фрагментов ДНК.

248 п.н. 214 п.н. 102 п.н.

Dra I Dra I ВОО-ВШ 462 п.н. 102 п.н.

Dra I ВОО-ЭИ 564 п.н.

ВОК 5’ 3’ Ген ankyrin-repeat белка Рис. 3. Схема рестрикционного анализа продуктов ПЦР (сверху указаны размеры получаемых фрагментов) ВОО-ВШ – вакцинные штаммы вируса оспы овец;

ВОО-ЭИ – эпизоотические изоляты вируса оспы овец;

ВОК – вирус оспы коз.

Метод штаммовой дифференциации ВОО был проверен на восьми штаммах и изолятах ВОО и ВОК. Для семи из них были получены ожидаемые результаты: у вакцинного штамма “ВНИИЗЖ” ВОО ампликон в результате обработки рестриктазой Dra I расщеплялся на три фрагмента, у всех эпизоотических изолятов ВОО - на два фрагмента, а у вакцинного штамма и двух эпизоотических изолятов ВОК расщепления ампликона не происходило (рис. 4).

Для изолята «Таджикский» ВОК была получена картина рестрикции, характерная для эпизоотических изолятов вируса оспы овец. Данный изолят был впервые выделен от больной козы, в связи с чем рассматривался как ВОК. Однако проведенный нами анализ двух областей генома вируса с применением разных тестов (мПЦР с видоспецифичными праймерами и рестрикционным анализом гена “ankyrin repeat” белка) доказывает, что в действительности изолят “Таджикский” является ВОО. Данный пример свидетельствует о том, что вид животного, от которого выделен вирус оспы, не может служить достоверным критерием при определении его видовой принадлежности, и убедительно демонстрирует необходимость генетического анализа каприпоксвирусов.

1 2 3 4 5 6 7 8 564 н.

462 н.

248 н.

214 н.

102 н.

Рис. 4. Электрофорез в полиакриламидном геле продуктов рестрикции 1 – маркер (снизу вверх – 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

2 – ВОО, вакцинный штамм “ВНИИЗЖ”;

3 – ВОО, эпизоотический изолят “Афганский”;

4 – ВОО, эпизоотический изолят “Приморский”;

5 – ВОО, эпизоотический изолят “ЕАО”;

6 – ВОК, вакцинный штамм “ВНИИЗЖ”;

7 – ВОК, эпизоотический изолят “ЕАО”;

8 – ВОК, эпизоотический изолят “Таджикский”;

9 – ВОК, эпизоотический штамм “Pellor”.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований разработан метод, позволяющий отличать вакцинные штаммы ВОО от эпизоотических изолятов.

Одновременно, данный метод позволяет дифференцировать ВОО от ВОК, то есть может служить дополнением к методу видовой дифференциации каприпоксвирусов, основанному на мПЦР.

Метод штаммовой дифференциации ВОО прошел комиссионные испытания, одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы Для осуществления дифференциальной диагностики оспы овец и коз и контагиозной эктимы мы дополнительно разработали метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР. Для этого были рассчитаны две пары видоспецифичных праймеров. Внешние праймеры позволяют в первом раунде ПЦР амплифицировать фрагмент генома вируса длиной 400 п.н., внутренние праймеры предназначены для использования во втором раунде ПЦР и ограничивают фрагмент длиной 320 п.н.

Специфичность метода проверяли на пяти каприпоксвирусах и двух имевшихся в нашем распоряжении образцах вируса контагиозной эктимы: изоляте «Таджикский» - культуральном вируссодержащем материале из коллекции вирусов ФГУ «ВНИИЗЖ» и изоляте «Рязанский» - полевом материале (соскобах кожи) от больной козы из Рязанской области (рис 5).

В результате ПЦР со специфичными для вируса эктимы праймерами фрагмент ДНК расчетной длины после первого раунда ПЦР был получен для обеих проб, содержащих ВКЭ. В пробах, содержащих каприпоксвирусы, в ПЦР не наблюдалось синтеза фрагментов ДНК. Аналогичные результаты были получены и во втором раунде ПЦР с парой внутренних праймеров. Таким образом, полученные результаты подтвердили специфичность метода.

Метод обнаружения вируса контагиозной эктимы прошел комиссионные испытания, одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Получение рекомбинантных белков Р17 и Р18 ВОО в системе экспрессии E. coli Важным инструментом диагностики оспы овец и оспы коз является обнаружение антител к каприпоксвирусам в сыворотке крови животных. В связи с этим, одна из задач нашей работы состояла в разработке иммуноферментного метода для выявления антител к ВОО и ВОК.

А: 1 2 3 4 5 6 7 8 В: 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 5. Обнаружение вируса контагиозной эктимы.

Электрофорез в 2%-ном агарозном геле продуктов ПЦР А – первый раунд ПЦР с видоспецифичными праймерами Эк1 и Эк4;

В – второй раунд ПЦР с видоспецифичными праймерами Эк2 и Эк3;

треки: 1 – отрицательный контроль;

2 – маркер (снизу вверх – 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 – вирус контагиозной эктимы, изолят «Таджикский»;

4 – вирус контагиозной эктимы, изолят «Рязанский»;

5 – ВОО, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

6 – ВОО, эпизоотический изолят «Афганский»;

7 – ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

8 – ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;

9 – вирус бугорчатки.

Результаты зарубежных исследований свидетельствуют о перспективности применения рекомбинантных антигенов в ИФА для выявления антител к каприпоксвирусам (Carn, 1994;

Heine, 1999). Рекомбинантные белки биологически безопасны, дешевы в получении и легко подвергаются очистке от примеси клеточных белков, что обеспечивает высокую специфичность реакции ИФА. Кроме того, использование в ИФА родоспецифичных рекомбинантных белков позволяет избежать перекрестной реакции с антителами против вируса контагиозной эктимы, что является существенным недостатком прочих серологических методов.

В данной работе в качестве антигенов для ИФА мы решили использовать рекомбинантные белки Р32, Р26, Р17 и Р18 ВОО. Выбор белков Р26, Р17 и Р18 был обусловлен тем, что их аналоги у других поксвирусов обладают высокой иммуногенной активностью (Hooper et al., 2003;

Ramirez et al., 2002;

Law, Smith, 2001;

Boulanger et al., 1998). Рекомбинантный белок Р32 должен был использоваться в качестве референтного антигена, поскольку он уже применялся успешно другими исследователями (Carn, 1994;

Heine, 1999).

Схема конструирования плазмид, экспрессирующих рекомбинантные белки ВОО, показана на рисунке 6.

Геном вируса оспы овец P18 P26 P P HindIII BamHI ПЦР P17 (P18, P26, P32) HindIII BamHI pQE Лигирование P17 (P18, P26, P32) HindIII BamHI pQE-P (P18, P26, P32) Рис. 6. Схема получения плазмид, экспрессирующих белки Р17, Р18, Р26 или Р32 ВОО ДНК ВОО выделяли из культуральной суспензии, содержащей вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» ВОО. Гены, кодирующие белки Р17, Р18, Р26 и Р32 ВОО, амплифицировали методом ПЦР. В реакции использовали праймеры, в структуру которых были заложены сайты рестрикции Bam HI и Hind III. После обработки соответствующими рестриктазами ампликоны клонировали в экспрессирующий плазмидный вектор pQE.

В результате трансформации рекомбинантными плазмидами компетентных клеток М15 E.coli получили клоны, экспрессирующие белки Р17, Р18, Р26 и Р32 ВОО, содержащие на N-конце шесть остатков гистидина. Молекулярная масса рекомбинантных белков соответствовала расчётной: 20, 23, 28 и 30 кД, соответственно (рис. 7). Из клонов, экспрессирующих белки Р17, Р18, Р26 и Р32 ВОО, выделили рекомбинантные плазмиды и проверили методом нуклеотидного секвенирования на отсутствие нуклеотидных замен и сдвигов в рамке считывания, приводящих к изменению аминокислотного состава рекомбинантных белков.

Экспрессию рекомбинантных белков проводили в течение 4 часов путем внесения в культуру E.coli ИПТГ в концентрации 0,2 мМ. Электрофорез в 12%-м ПААГе показал очень низкий уровень экспрессии для белка Р26, поэтому в дальнейшей работе его не использовали. Рекомбинантный белок Р32 получили в «усеченном» варианте, без С-концевой гидрофобной части, поскольку она значительно снижает уровень экспрессии белка в E.coli.

Р18 Р17 Р32 Р18 Р17 Р A. B.

М 1 2 3 4 5 6 М 12 3 4 116,0 116, 66,2 66, 45,0 45, 35,0 35, 25,0 25, 18,4 18, 14,4 14, Рис. 7. Электрофоретический анализ рекомбинантных белков ВОО в 12%-м полиакриламидном геле М - маркер (кДа: 166,0;

66,2;

45,0;

35,0;

25,0;

18,4;

14,4);

А: 1, 3, 5 – белки E.coli до индукции;

2, 4, 6 – белки E.coli через 4 часа после индукции;

В: 1, 3, 5 – белки E.coli через 4 часа после индукции;

2, 4, 6 – очищенный рекомбинантный белок ВОО Очистку рекомбинантных белков осуществляли методом металл-хелатной хроматографии с применением Ni-NTA агарозы в соответствии с инструкцией производителя («Qiagen»). Выход очищенных белков со 100 мл культуры E.coli составлял 2,2, 2,6 и 1,8 мг для Р17, Р18 и Р32, соответственно.

Определение антигенной активности рекомбинантных белков Специфическую антигенную активность полученных рекомбинантных антигенов оценивали по их взаимодействию с положительной и отрицательной контрольными сыворотками в непрямом варианте ИФА. В качестве положительной использовали сыворотку от экспериментально зараженной ВОО овцы, в качестве отрицательной – сыворотку от здоровой не вакцинированной против оспы овцы.

Результаты проверки антигенной активности рекомбинантных белков отражены на рисунке 8. Предельное разведение для белков Р17, Р18 и Р32, при котором оптическая плотность положительного контроля в 2 раза превышала оптическую плотность отрицательного контроля, составило 1:10000, 1:640 и 1, что соответствовало концентрации рекомбинантных белков 0,16, 1,9 и 8,7 мкг/мл соответственно.

1, контрольных сывороток оптическая плотность 1, Р 0, Р Р 0, К 0, 0, 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 разведение антигена Рис. 8. Антигенная активность рекомбинантных белков Р17, Р18 и Р в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками По данным литературы, белок Р32 является одним из наиболее иммуногенным у каприпоксвирусов (Chand, 1992). В наших исследованиях он оказался значительно менее активным по сравнению с рекомбинантными белками Р17 и Р18. Причиной этого обстоятельства могут быть изменения во вторичной структуре белка, появившиеся в результате делетирования его гидрофобной С-концевой части, или нарушение конформации белка после выделения в денатурирующих условиях. Из-за низкой антигенной активности рекомбинантный белок Р32 был исключен из дальнейшей работы, а непрямой вариант ИФА для выявления антител против ВОО и ВОК разрабатывался на основе рекомбинантных антигенов Р17 и Р18.

Разработка непрямого варианта ИФА При разработке непрямого варианта ИФА были решены следующие задачи:

определено рабочее разведение антигена и конъюгата, отработаны условия сенсибилизации лунок микропанелей (состав буферов для сенсибилизации и блокирования планшетов), установлены позитивно-негативный порог реакции и показатель воспроизводимости реакции (коэффициент вариации).

Критерии реакции, установленные в результате проведенных исследований, представлены в таблице 1.

Таблица Установленные показатели Р17-ИФА и Р18-ИФА для обнаружения антител к каприпоксвирусам методом последовательных разведений сывороток Показатели Р17-ИФА Р18-ИФА Рабочее разведение антигена 1:640 1: (2,5мкг/мл) (15мкг/мл) Условия сенсибилизации антигена 16-18ч 4С в КББ Условия блокирования свободных центров 1 ч 37С в 10% р-ре молока связывания на планшете в буфере TBS-T Позитивно-негативный порог 1: Коэффициент вариации 4,9% 5,5% Для оценки специфичности и чувствительности ИФА на основе рекомбинантных антигенов Р18 (Р18-ИФА) и Р17 (Р17-ИФА) были исследованы 155 заведомо отрицательных и 5 заведомо положительных сывороток крови мелких жвачных. В качестве отрицательных использовали сыворотки крови от здоровых не вакцинированных овец и коз, полученные из хозяйств Тверской и Новосибирской областей РФ. Данные области являются благополучными по оспе мелких жвачных, что дает основания рассматривать сыворотки крови овец и коз из этих областей как заведомо отрицательные. При их исследовании на наличие антител к каприпоксвирусам в Р18-ИФА отрицательный результат был получен для всех сывороток. При использовании Р17-ИФА две сыворотки крови показали ложноположительный результат. Таким образом, диагностическая специфичность Р17-ИФА составила 98,7%, специфичность Р18-ИФА равнялась 100%.

Для оценки чувствительности разработанных тест-систем в нашем распоряжении были пять заведомо положительных (по результатам исследования в реакции нейтрализации) сывороток крови от овец и коз, экспериментально инфицированных ВОО и ВОК, соответственно. Все сыворотки были положительными как в Р17-ИФА, так и в Р18-ИФА.

Сравнительная оценка показала, что при использовании Р17-ИФА положительные сыворотки показывают больший титр, чем при использовании Р18 ИФА, т.е. непрямой вариант ИФА на основе рекомбинантного антигена Р17 обладает более высокой аналитической чувствительностью по сравнению с Р18-ИФА (рис. 9).

При этом титры положительных сывороток в ИФА с обоими рекомбинантными антигенами были не ниже, чем в ИФА, основанном на использовании в качестве антигена нативного вируса (Д.К.Басова и др., 2000).

Результаты проведенных исследований позволяют сделать заключение о том, что рекомбинантные белки Р17 и Р18 являются антигенно активными и специфичными и могут использоваться в качестве антигенов в ИФА, предназначенном для исследования сывороток крови овец и коз на наличие антител к каприпоксвирусам.

2. 2. оптическая плотность 1. 1. Р18-ИФА 1. 1.2 Р17-ИФА 1 К 0. 0. 0. 0. 20 40 80 160 320 640 1280 разведения сыворотки Рис. 9. Зависимость оптической плотности от разведения контрольных сывороток при исследовании в Р17-ИФА и Р18-ИФА Одновременное использование Р17-ИФА и Р18-ИФА позволяет взаимно подтверждать получаемые результаты и, тем самым, повышает достоверность информации о серологическом статусе исследуемых сывороток крови.

«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р17 вируса оспы овец» и «Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р18 вируса оспы овец» прошли комиссионные испытания, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

3. ВЫВОДЫ 1. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полноразмерного генома вируса оспы овец, вируса оспы коз и вируса бугорчатки. Выявлены участки генома, позволяющие определять видовую принадлежность каприпоксвирусов, а также дифференцировать вакцинные штаммы вируса оспы овец от эпизоотических изолятов.

2. Разработан метод обнаружения и дифференциации каприпоксвирусов, основанный на мультиплексной ПЦР с видоспецифичными праймерами. Метод отличается высокой специфичностью, чувствительностью и технической простотой.

3. Разработан метод, основанный на амплификации и рестрикционном анализе гена ankyrin-repeat белка, позволяющий дифференцировать вакцинные штаммы «НИСХИ», «ВНИИЗЖ» и «Б5/96» вируса оспы овец от эпизоотических изолятов и, одновременно, различать вирусы оспы овец и коз.

4. Разработан метод обнаружения вируса контагиозной эктимы с помощью ПЦР, позволяющий проводить дифференциальную диагностику оспы овец и коз и контагиозной эктимы.

5. Получены рекомбинантные белки Р17, Р18 и Р32 вируса оспы овец экспрессией в E.coli. Показана антигенная активность рекомбинантных белков Р17 и Р18.

6. На основе рекомбинантных антигенов Р17 и Р18 вируса оспы овец разработан непрямой вариант ИФА для обнаружения антител к каприпоксвирусам в сыворотках крови овец и коз.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Для практического использования предлагаются:

«Методика обнаружения и видовой дифференциации каприпоксвирусов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

«Методика дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец с использованием рестрикционного анализа продуктов ПЦР» (2005 г.);

«Методика обнаружения вируса контагиозной эктимы с использованием полимеразной цепной реакции» (2005 г.);

«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р17 вируса оспы овец» (2006 г.).

«Методика обнаружения антител к каприпоксвирусам в непрямом иммуноферментном анализе с использованием рекомбинантного антигена Р18 вируса оспы овец» (2006 г.).

Методики комиссионно испытаны, одобрены учёным советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Орлова, Е.С. Дифференциация вирусов оспы овец и оспы коз методом полимеразной цепной реакции / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков, В.М. Захаров // Пробл. мониторинга и генодиагност. инфекцион. бол. ж-ных: матер. Междунар.

науч. конф. – Владимир, 2004. – С.79-82.

2. Дифференциация вакцинных и эпизоотических штаммов вируса оспы овец / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков, В.И. Диев, В.М. Захаров // Тр. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. – Владимир, 2005. – Т. 3. – С. 160-170.

3. Орлова, Е.С. Видовая дифференциация каприпоксвирусов методом мультиплексной ПЦР / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков // Тр. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. – Владимир, 2005. – Т. 3. – С. 151-159.

4. Видовая и штаммовая дифференциация каприпоксвирусов методом полимеразной цепной реакции / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков, В.И. Диев, В.М.

Захаров // Молек. биология. – 2006. – Т. 40, № 1. – С. 158-164.

5. Рекомбинантные белки Р17, Р18 и Р32 как потенциальные антигены для иммуноферментного анализа / Е.С. Орлова, А.В. Щербаков, А.С. Яковлева, А.В. Каньшина, Д.К. Басова, В.И. Диев // Тр. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. – Владимир, 2006. – Т. 4. – С.51-61.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», тираж 90 экз., апрель 2007г.