Светозависимые окислительно-восстановительные реакции с участием зелёных флуоресцентных белков

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

на правах рукописи

Богданов Алексей Михайлович СВЕТОЗАВИСИМЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ ЗЕЛЁНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ специальность – 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории биофотоники Института биоорганической химии им.

академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук Константин Анатольевич Лукьянов

Официальные оппоненты:

Алексей Валерьевич Феофанов, доктор биологических наук, доцент, заведующий лабораторией оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Александр Сергеевич Соболев, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Института биологии гена РАН.

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита состоится «12» мая 2010 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «12» апреля 2010 г.

Учный секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В. А. Олейников ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Зелный флуоресцентный белок GFP стал основой для разработки целого набора весьма востребованных современных технологий для молекулярной и клеточной биологии и биомедицинских исследований. Потенциал открытия GFP и его внедрения в повседневную экспериментальную практику был оценен Нобелевской премией по химии 2008 года. Вместе с тем, именно огромная прикладная значимость флуоресцентных белков обусловила заметное смещение центра тяжести их исследований в технологическую область, оставив существенные «белые пятна» в фундаментальных представлениях об этом интересном объекте.

Действительно, при наличии тысяч мутантных вариантов GFP-подобных белков, десятков молекулярных сенсоров на их основе, сотен методов количественного и качественного анализа, немыслимых без данного типа белков, все еще остаются без исчерпывающих ответов такие вопросы, как биологические функции GFP-подобных белков, детали механизмов созревания и видоизменения их хромофоров и др.

Особый интерес, в частности, представляют различные типы фотоконверсий (т.е.

изменений спектральных свойств под действием света), обнаруженные для некоторых природных и мутантных флуоресцентных белков. В последние годы фотоконверсия флуоресцентных белков применяется в передовых методах флуоресцентной микроскопии для слежения за перемещениями биологических объектов (клеток, клеточных органелл или индивидуальных белков), а также для получения изображений со сверхвысоким разрешением. До недавнего времени этот феномен считался достаточно «экзотическим», присущим лишь небольшому числу известных GFP подобных белков. Настоящая работа посвящена открытию и изучению нового типа фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков. Полученные данные позволяют пересмотреть наши представления о фотоконверсии GFP-подобных белков и предположить, что она свойственна большинству представителей семейства. Детальное изучение фотоконверсии флуоресцентных белков вызывает большой интерес как в фундаментальном, так и в прикладном смысле.

Цели и задачи работы. Целью данной работы было всестороннее описание обнаруженного нами явления фотоконверсии зелных флуоресцентных белков в красную флуоресцентную форму в присутствии акцепторов электрона. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи: 1) Охарактеризовать условия in vitro, необходимые для прохождения окислительной фотоконверсии зелных флуоресцентных белков и описать основные физико химические особенности данного явления;

2) Проверить возможность прохождения окислительной фотоконверсии зелных флуоресцентных белков in vivo. 3) Предложить способы практического применения обнаруженного феномена.

Научная новизна и практическая ценность работы. Описан совершенно новый тип фотоконверсии зелных флуоресцентных белков различного происхождения. Показано, что в процессе формирования красной флуоресцентной формы GFP происходит окислительно-восстановительная реакция, в которой сам белок выступает в роли донора электронов. Выяснено, что в качестве электронных акцепторов в указанной фотореакции могут выступать вещества самой различной структуры: от простых неорганических окислителей до целых белков. Экспериментально подтверждено, что окислительная фотоконверсия GFP может протекать внутри эукариотических клеток, причм последние существенно отличаются друг от друга по способности индуцировать реакцию. Сделано предположение о возможности применения флуоресцентных белков в качестве индикаторов окислительно-восстановительного статуса клеток или их компартментов. Проведены эксперименты, подтверждающие возможность осуществления фотоконверсии эндогенных GFP in vivo, в клетках коралловых полипов.

Выдвинута гипотеза о связи способности флуоресцентных белков к переносу электронов с их биологической функцией. Выявлена корреляция между окислительной фотоконверсией и фотообесцвечиванием зелной формы флуоресцентных белков при визуализации в живых клетках. Предложены и протестированы новые методы повышения фотостабильности зеленых флуоресцентных белков, основанные на модификации состава культивационных сред.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 92 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 206 ссылок.

Диссертация содержит 26 рисунков и 9 таблиц.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на V съезде российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), Международной Конференции в честь 75-летия со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), а также на международной конференции по микроскопии в Кракове (2009) и на 2-й конференции по флуоресцентным белкам и биологическим сенсорам (США, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Новый тип фотоконверсии зелных флуоресцентных белков В 1997 году две независимые группы исследователей обнаружили, что белок GFP Aeqorea victoria и некоторые его мутантные варианты в анаэробных условиях способны к фотоконверсии в красную флуоресцентную форму с максимумами возбуждения и эмиссии при 525 и 600 нм, соответственно. Недавние публикации свидетельствуют о широком распространении такой анаэробной фотоконверсии среди зеленых флуоресцентных белков различного происхождния. Механизм этого явления до сих пор остатся непонятным, хотя по аналогии с классическими примерами фотоконверсии хлорофиллов и флавопротеидов в анаэробных условиях можно предполагать, что в его основе лежит фотовосстановление GFP.

В данной работе мы обнаружили новый тип фотоконверсии зелных флуоресцентных белков (ФБ). Для этой реакции характерно светоиндуцируемое превращение зеленого флуоресцентного белка в форму с флуоресценцией в красной области видимого спектра в присутствии окислителей (как в аэробных, так и в анаэробных условиях). Подробное описание данной окислительной фотоконверсии приведено ниже.

I.1. Физико-химическая характеристика окислительной фотоконверсии зелных флуоресцентных белков Используя лазерную конфокальную и флуоресцентную широкопольную микроскопию в качестве основных методов детекции, мы изучили влияние различных химических веществ на спектральное поведение белка EGFP, иммобилизованного с помощью гексагистидиновой последовательности на сферических частицах металлоаффинной смолы. Данная модельная система позволяет осуществлять высокоточный контроль интенсивности и продолжительности облучения и добавлять необходимые реагенты в среду. Нами было обнаружено, что в присутствии различных электронных акцепторов (окислителей), наблюдается эффективная фотоконверсия EGFP, детектируемая как появление формы этого белка, флуоресцирующей в красной области спектра (рис. 1).

Указанная окислительная фотоконверсия наблюдалась, в частности, в присутствии феррицианида калия (красной кровяной соли, K3[Fe(CN)6]), бензохинона и бромида 3-[4,5 диметилтиазол-2-ил]-2,5 дифенил тетразолия (МТТ).

Облучение иммобилизованного EGFP синим лазером (488 нм) конфокального микроскопа после добавления в суспензию любого из перечисленных акцепторов электрона приводило к многократному возрастанию (относительно уровня в буфере PBS) скорости фотообесцвечивания зелной формы и появлению красного флуоресцентного сигнала (рис. 1). В отличие от анаэробной фотоконверсии, упомянутой выше, не была выявлена какая-либо зависимость фотоактивации от наличия кислорода. В случае проведения эксперимента в присутствии МТТ на облучаемых участках наблюдалось образование характерного синего осадка восстановленного формазана (что говорит о прохождении окислительно-восстановительной реакции).

Интересно, что зависимости скоростей фотообесцвечивания зелной и нарастания красной флуоресценции от концентрации окислителя, носят совершенно разный характер (рис. 2а, табл. 2). Для всех протестированных электронных акцепторов величина EC50 (полумаксимальная эффективная концентрация) для фотообесцвечивания была существенно ниже (иногда на порядок), чем для появления красной флуоресценции. Эта особенность указывает на двухстадийность наблюдаемой фотоконверсии EGFP. Мы предложили следующую гипотетическую схему процесса (рис. 2б): на первом этапе хромофор зеленого флуоресцентного белка, находящийся в возбужднном состоянии, отдает один электрон молекуле окислителя;

в результате этой реакции образуется некий короткоживущий нефлуоресцентный интермедиат (вероятно, катион-радикал хромофора);

если этот интермедиат успевает вступить в реакцию со второй молекулой окислителя, то он отдает еще один электрон и образуется наблюдаемая красная флуоресцентная форма, если нет, происходит самопроизвольный распад интермедиата с необратимым переходом в нефлуоресцентную форму.

Для определения спектральных характеристик красной флуоресцентной формы EGFP мы провели фотоконверсию белка в водном растворе в присутствии красной кровяной соли, облучая кювету с раствором с помощью специально сконструированного источника излучения высокой интенсивности, построенного на основе светодиодов.

После 5-8 минут облучения спектрофлуориметр детектировал красную флуоресценцию, характеризующуюся максимумом возбуждения в 575 нм и максимумом эмиссии в нм (рис. 3а). Квантовый выход флуоресценции составлял около 0,05.

Измерения эффективности окислительной фотоконверсии при разных интенсивностях облучения демонстрируют линейную зависимость (рис. 3б). Таким образом, мы, по всей вероятности, имеем дело с однофотонным процессом, причм фотон поглощается на первой стадии описанной выше схемы. Образующаяся в результате фотоконверсии красная форма оказалась достаточно стабильной. Так, при низких концентрациях окислителя (например, 1 мкМ бензохинона) красный сигнал не уменьшался в течение по меньшей мере часа, а при высоких (около 1 мМ) интенсивность красной флуоресценции постепенно падала (время полужизни около 40 минут).

Добавление -меркаптоэтанола способствовало быстрому распаду красной флуоресцентной формы, однако, другие восстановители (аскорбиновая кислота, восстановленный глутатион) не приводили к такому эффекту.

Поскольку при распаде красного сигнала остаточный зелный сигнал не возрастал, мы пришли к выводу, что данный тип фотоконверсии необратим.

I.2. Фотоконверсия и биологические окислители Мы проверили способность некоторых внутриклеточных окислителей к индукции фотоконверсии EGFP. Оказалось, что процесс эффективно проходит в присутствии цитохрома с (cyt c) – гем-содержащего растворимого белка, одноэлектронного акцептора, вовлечнного в электрон-транспортную дыхательную цепь практически всех организмов. Сравнение спектров поглощения растворов EGFP + cyt c, измеренных до и после облучения светодиодным источником света, чтко демонстрирует сопряжнное с фотоконверсией EGFP превращение окисленной формы цитохрома (широкий пик поглощения с максимумом при 530 нм) в восстановленную (узкие пики с максимумами при 520 и 550 нм) (рис. 4). Контрольный образец цитохрома, облучнный в растворе, не содержащем EGFP, остался спектрально неизменным. Учитывая степени уменьшения пика поглощения EGFP на 488 нм, увеличения пика поглощения cyt c на 550 нм и молярные коэффициенты экстинкции обоих белков (55000 и 19000 М-1см-1, соответственно), мы рассчитали квантовый выход данной окислительно восстановительной реакции. Он равен примерно 1,7;

величина, бльшая единицы, свидетельствует о том, что окисление EGFP – двухэлектронный процесс, в результате которого может образовываться до 2-х молекул восстановленного цитохрома на одну молекулу EGFP.

Свободные флавины – ФАД (флавин-аденин динуклеотид) и ФМН (флавин мононуклеотид) – двухэлектронные акцепторы и одни из важнейших и наиболее распространнных в клетке ферментативных кофакторов, также оказались отличными индукторами окислительной фотоконверсии EGFP: величина ЕС50 для них равна примерно 150 мкМ (табл. 1). Более того, способность поддерживать фотоконверсию EGFP белка продемонстрировала и глюкозооксидаза (ФАД-содержащий фермент, относящийся к тому же структурному классу, что и ферменты поддержания клеточного RedOx-гомеостаза, глутатион- и тиоредоксин-редуктазы).

Реакция детектировалась уже при микромолярных концентрациях фермента.

Примечательно, что в случае флавин-содержащих окислителей не наблюдалось сильных различий в величинах ЕС50, рассчитанных для фотообесцвечивания зелной и появления красной флуоресцентных форм EGFP (табл. 1). Очевидно, подобные окислители способны принимать два электрона подряд, обеспечивая псевдоодностадийный переход EGFP в красную форму.

Иммобилизованный на частицах смолы EGFP в присутствии 5 мМ НАД+ показал довольно слабую способность к фотоконверсии. Восстановление до НАДН характерным образом меняет спектр поглощения (появляется пик с максимумом при 340 нм) этого вещества. Мы воспользовались данным свойством для проведения эксперимента по совместному облучению EGFP и НАД+ в водном растворе (аналогично ранее приведнному опыту с цитохромом с). В результате облучения кюветы с соответствующим раствором мы действительно наблюдали появление пика поглощения НАДH при 340 нм, сопряжнное с уменьшением (вследствие фотоконверсии) поглощения EGFP при 488 нм (рис. 5). Расчтный квантовый выход этой окислительно восстановительной реакции составил около 0,5 моль образовавшегося НАДН (его коэффициент экстинкции на 340 нм равен 6000 М-1см-1) на моль EGFP.

Наши эксперименты позволяют говорить о том, что в EGFP способен восстанавливать вещества, имеющие стандартный RedOx потенциал (Е0) до -0,32 В (см. табл. 1).

Интересно, что такое важное с точки зрения поддержания клеточного RedOx-гомеостаза вещество как глутатион, на фотоконверсию никак не влияет.

Табл. 1. Некоторые вещества, способные индуцировать фотоконверсию EGFP.

Е01, В n2 ЕС503 для ЕС Вещество для Относительная уменьшения увеличения эффективность фотоконверсии4, % зелёной красной флуоресценции, флуоресценции, мкМ мкМ K3[Fe(CN)6] 0,42 1 60 500 Бензохинон 0,29 2 70 2000 Цитохром с 0,22 1 400 1500 МТТ -0,11 2 1200 4000 Глюкозо-оксидаза -0,22 2 10 15 ФМН -0,22 2 100 150 + НАД -0,32 2 нет данных нет данных 0, Е0 – стандартный окислительно-восстановительный потенциал (рН 7, 25 °С).

n – максимальное количество принимаемых электронов.

ЕС50 – полумаксимальная эффективная концентрация Относительная яркость красной флуоресценции EGFP, образовавшейся при фотоконверсии, прошедшей в одинаковых условиях облучения (продолжительности и интенсивности освещения) в присутствии оптимальной концентрации соответствующего окислителя.

I.3. Окислительная фотоконверсия других флуоресцентных белков Для того чтобы понять, насколько широко распространена окислительная фотоконверсия, мы отобрали ряд GFP-подобных белков различного происхождения, таких как AcGFP1, TagGFP, zFP506, amFP486 и ppluGFP2, и протестировали их на предмет образования красной формы (табл. 2). Эксперименты проводились так же, как ранее с EGFP: белки, иммобилизованные на аффинной смоле, облучали активирующим светом в присутствии электронных акцепторов (бензохинона или феррицианида калия).

Все протестированные ФБ оказались способными к фотоконверсии. Хотя красная флуоресцентная форма у всех этих белков оказалась заметно менее яркой, чем у EGFP, в целом поведение при облучении в присутствии окислителей было совершенно аналогичным. Более того, белки amFP486 и ppluGFP2 восстанавливали цитохром с при совместном облучении в растворе аналогично тому, как это делал EGFP в ранее описанном эксперименте. Таким образом, все рассмотренные нами зелные флуоресцентные белки оказались способными участвовать в светозависимых окислительно-восстановительных реакциях. Вероятно, что это общее свойство множества (если не всех) GFP.

В то же время, некоторые мутанты GFP, флуоресцирующие в голубой (ECFP) и синей (EBFP) областях спектра, не продемонстрировали характерных признаков окислительной фотоконверсии: их фотообесцвечивание не усиливалось в присутствии акцепторов электронов, и они не образовывали новых спектральных форм с красной (или смещнной в красную область) флуоресценцией (табл. 2). Будучи в общем весьма похожими на EGFP по аминокислотной последовательности, эти белки несут модифицированный хромофор, содержащий триптофан (ECFP) или гистидин (EBFP) вместо тирозина в 66-м положении. Отсюда можно сделать вывод о том, что структура хромофора имеет определяющее значение для способности к фотоконверсии. Вероятно, именно тирозин способен формировать радикальный интермедиат (скорее всего, семихиноидной природы), необходимый для протекания реакции.

Табл. 2. Флуоресцентные белки, проверенные на способность к окислительной фотоконверсии.

Максимумы Степень Амино Происхож Способность к Флуоресцентный возбуждения/ гомологии кислоты белок эмиссии -дение фотоконверсии с EGFP, % хромофора флуоресценции Aequorea victoria 100 488/509 Thr-Tyr-Gly EGFP (Hydrozoa, + Cnidaria) Aequorea coerulescence 86 485/505 Ser-Tyr-Gly AcGFP1 (Hydrozoa, + Cnidaria) Aequorea macrodactyla 79 482/505 Cys-Tyr-Gly TagGFP (Hydrozoa, + Cnidaria) Zoanthus sp + 22 496/506 Asn-Tyr-Gly (Anthozoa, zFP Cnidaria) Anemonia majano 28 458/486 Lys-Tyr-Gly amFP486 (Anthozoa, + Cnidaria) Pontellina plumata 24 482/502 Gly-Tyr-Gly ppluGFP2 (Crustacea, + Arthropoda) Aequorea victoria 98 434/475 Thr-Trp-Gly ECFP (Hydrozoa, Cnidaria) Aequorea victoria 98 377/446 Thr-His-Gly EBFP (Hydrozoa, Cnidaria) I.4. Окислительная фотоконверсия EGFP в живых клетках Следующим этапом экспериментов стала проверка возможности протекания окислительной фотоконверсии белка EGFP в живых эукариотических клетках. Мы хотели определить, смогут ли внутриклеточные электронные акцепторы индуцировать описанный выше процесс. Отправной точкой в этом отношении стала клеточная линия Phoenix Eco (производная от популярной линии HEK293, трансформированных человеческих эмбриональных почечных клеток). Данные клетки были выбраны из соображений удобства визуализации относительно слабого флуоресцентного сигнала красной формы EGFP, поскольку они характеризуются высочайшим уровнем экспрессии трансгенов. Phoenix Eco, транзиентно трасфецированные экспрессионным плазмидным вектором EGFP-N1, наблюдались с помощью флуоресцентного микроскопа в нормальных аэробных условиях. Фотоконверсию индуцировали интенсивным синим облучением (формируемым светом ртутной лампы микроскопа, прошедшим через набор фильтров для GFP). Ход фотоконверсии (появление красного сигнала) и фотообесцвечивания (уменьшение зелного сигнала) контролировали каждые 5 секунд в соответствующих каналах регистрации.

Действительно, в клетках наблюдалась достаточно эффективная фотоконверсия.

Активирующее синее облучение приводило к постепенному появлению красной флуоресценции и пропорциональному уменьшению зелной (рис. 6а). Необычным фактом, выявленным в процессе наблюдений, стала чрезвычайная вариабельность отдельных клеток (в том числе в одном поле зрения) в отношении эффективности фотоконверсии;

т.е. красная флуоресцентная форма EGFP в некоторых клетках накапливалась гораздо быстрее (или медленнее), чем большинстве других (рис. 6а,б).

Нами не было обнаружено чтких корреляций между морфологией клеток (а также предполагаемой стадией клеточного цикла) или уровнем экспрессии EGFP и эффективностью фотоконверсии, проходящей в них. Длительные (около 12 часов) наблюдения за одним полем зрения, содержащим исходно около 20 клеток, позволяют говорить о том, что фотоконверсия EGFP в дочерних клетках, образованных в результате деления одной клетки-предшественницы, имеет примерно равную эффективность.

В дальнейших экспериментах мы сравнили эффективность окислительной фотоконверсии EGFP в трх клеточных линиях: HEK293, HeLa и 3Т3. Были детектированы существенные различия в интенсивности процесса как между линиями в целом, так и между индивидуальными клетками-представителями каждой линии (рис.

6в).

Хорошо известно, что митохондрии представляют собой наиболее RedOx-активный компартмент эукариотической клетки, а общий окислительно-восстановительный баланс в них благодаря анаболическим процессам смещн (по сравнению с другими компартментами) в сторону восстановления. Используя конструкции, содержащие сигнал митохондриальной локализации, мы направили белок EGFP в матрикс митохондрий клеток линий Phoenix Eco, HEK293 и HeLa с целью визуализации окислительной фотоконверсии в данном компартменте. Оказалось, что процесс идт достаточно эффективно только в клетках HEK293, в то время как остальные две линии продемонстрировали крайне низкую способность к индукции фотоконверсии в митохондриях (рис. 6г). Интересно, что гетерогенность клеток одной линии в отношении эффективности фотоконверсии при митохондриальной локализации EGFP была существенно ниже (рис. 6г). Кроме того, были обнаружены заметные отличия в кинетике нарастания сигнала красной флуоресценции в сравнении с таковой для цитоплазматической локализации белка. Так, в одинаковых условиях фотоактивации EGFP митохондриальной локализации (продукт экспрессии конструкции EGFP-mito) приобретал максимальную красную флуоресценцию существенно быстрее EGFP, локализованного в цитоплазме (продукта экспрессии конструкции EGFP-N1), причм даже в сравнении с трансфецированными EGFP-N1 клетками, демонстрирующими высокую эффективность фотоконверсии (рис. 6д). Таким образом, внутриклеточная локализация EGFP оказывает непосредственное влияние на эффективность его фотоконверсии, вероятно, ввиду существенной разницы в окислительно восстановительных статусах (иными словами, в суммарном RedOx-потенциале, количестве и составе RedOx-активных молекул) разных клеточных компартментов.

Рис. 6. Окислительная фотоконверсия EGFP в эукариотических клетках. А. Флуоресцентная микрофотография клеток линии Phoenix Eco, трансфецированных экспрессионным вектором EGFP-N1, в зелёном (верхний ряд) и красном (средний ряд) каналах. Нижний ряд представляет собой наложение двух предыдущих. Сверху обозначено время облучения активирующим фотоконверсию синим светом. В ряду снимков, полученных после 30 секунд облучения, хорошо видна высокая гетерогенность клеток в отношении эффективности фотоконверсии. Б. Кинетика изменения флуоресценции, рассчитанная для двух индивидуальных клеток, отмеченных на (А). В, Г. Эффективность фотоконверсии, нормализованная на исходный сигнал зелёной флуоресценции, рассчитанная для клеточных линий, продуцирующих EGFP цитоплазматической (В) и митохондриальной (Г) локализаций. Для каждой линии приведены максимальное (красный столбец), среднее (жёлтый столбец) и минимальное (зелёный столбец) значения эффективности. Д. Сравнение фотоконверсии EGFP, происходящей в цитоплазме и митохондриях клеток HEK293. Графики отражают изменения флуоресценции в процессе фотоактивации в двух каналах для двух разных клеток. Кривые нормализованы на максимальное значение сигнала.

I.5. Фотоконверсия EGFP в тканях трансгенных животных Далее мы протестировали более сложные живые модельные системы, продуцирующие EGFP. В таком качестве были выбраны трансгенные рыбы и мыши. Визуализация тканей этих животных была призвана ответить на два вопроса: 1) возможна ли окислительная фотоконверсия в контексте клеток здоровой целостной ткани (т.е. не является ли она артефактом модели на основе раковых клеток) и 2) наблюдается ли в указанном контексте вариабельность в отношении эффективности прохождения фотоконверсии EGFP и существуют ли корреляции между этой эффективностью и очевидными параметрами наблюдаемого образца (например, типом клеток и пр.).

Первое модельное животное – эмбрион пресноводной рыбы Danio rerio, несущий на хромосоме ген EGFP под контролем инсулинового промотора (линия рыб была предоставлена проф. Д. Онищук, Германия). Экспрессия данного гена тканеспецифична и происходит в -клетках поджелудочной железы. Небольшие размеры и слабая пигментация позволили визуализовать интактное животное (рис. 7а). Попытка провести раунд фотоконверсии в панкреатических клетках оказалась успешной (рис. 7б).

Эффективность фотоконверсии в разных клетках была практически одинакова, что показывает, что нормальные клетки одного типа не обладают существенной гетерогенностью по данному параметру. Таким образом, мы доказали, что окислительная фотоконверсия может осуществляться в здоровых EGFP эукариотических клетках в составе трансгенных животных.

Второе модельное животное – трансгенная мышь, несущая ген EGFP под контролем актинового промотора (животное было предоставлено проф. А. Терских, США). В этом случае, флуоресцентный белок продуцируется практически во всех клетках организма, хотя и с существенными количественными вариациями. Некоторые органы мыши пригодны для приготовления живых срезов (fresh tissue slices) с помощью вибротома.

Нам удалось получить образцы поперечнополосатой мускулатуры и головного мозга в диапазоне толщин 80-200 мкм. Фотоконверсия была выявлена в обоих типах срезов. При этом на фронтальных срезах мозга в районе полосатого тела (corpus striatum) детектируется существенная разница в эффективности фотоконверсии между клетками кровеносных сосудов (предположительно, эндотелиальной тканью) и соединительнотканными элементами (рис. 7в).

Несмотря на то, что доказательно интерпретировать полученные результаты представляется затруднительной задачей, мы получили ответы на оба экспериментальных вопроса, стоявших в основе рассмотрения трансгенных организмов как модельной системы. Для будущих экспериментов, целью которых является понимание закономерностей, определяющих эффективность фотоконверсии EGFP в каждом конкретном случае, разумно избрать трансгенных «зелных» мышей в качестве основного объекта.

Рис. 7. Фотоконверсия EGFP в клетках трансгенных животных. А. Эмбрион Danio rerio. На микрофотографии (объектив 5х) отчётливо видны флуоресцирующие за счёт продукции EGFP клетки поджелудочной железы Б. Фотоконверсия в бета-клетках поджелудочной железы (объектив 40х).

Представлены наложения зелёного и красного каналов, на каждом кадре указано время облучения активирующим синим светом. Масштабная метка – 30 микрон. В. Фотоконверсия EGFP на срезе полосатого тела мозга мыши (объектив 40х). Верхний ряд – до облучения активирующим светом, нижний около 20 с активирующего облучения. Слева – зелёный канал, в центре – красный канал, справа – наложение каналов. Заметно существенно более эффективное течение процесса в эндотелии сосудов. Масштабная метка – 30 микрон.

I.6. Фотоконверсия эндогенного зелного флуоресцентного белка in vivo Многие представители коралловых полипов Anthozoa имеют яркую зелную окраску благодаря наличию в их тканях GFP-подобных белков. Чтобы проверить, способны ли эти эндогенные белки к фотоконверсии, мы выбрали пуговичный полип Zoanthus sp., коммерчески доступный в магазинах для аквариумистов и хорошо охарактеризованный с точки зрения продуцируемых им флуоресцентных белков. Известно, что представители рода Zoanthus продуцируют зелный флуоресцентный белок zFP506, жлтый zFP538 и красный zFP574 (zoan2RFP), однако в составе этих организмов не было найдено фотоактивируемых белков. Экземпляр, имеющий ярко-зелные щупальца (рис. 8а), был исследован с помощью лазерной конфокальной микроскопии. Было обнаружено, что клетки, содержащие зелный флуоресцентный белок, приобретают красную флуоресценцию в ответ на короткое интенсивное облучение лазером с длиной волны 488 нм (рис. 8б).

Рис. 8. Фотоконверсия эндогенного GFP коралла А. Фотография кораллового полипа Zoanthus sp., использованного в работе. Б. Конфокальный оптический срез щупальца полипа. Представлены изображения в зелёном (левый столбец), красном (средний столбец) каналах и их наложение (правый столбец). Верхний ряд фотографий снят до фотоактивации, нижний – после (область интенсивного облучения обведена квадратом). Зелёная флуоресценция принадлежит клеткам эктодермы, а клетки эндодермы содержат симбиотические водоросли Zooxantella (представляют собой красные шарики, флуоресцирующие за счёт собственного хлорофилла, к фотоконверсии отношения не имеют).

Фотоконверсия индуцирована 488 нм лазером мощностью 0,15 Вт/см2. Масштабная метка – 50 мкм.

Мы предполагаем, что наблюдаемое появление красного флуоресцентного сигнала есть не что иное, как окислительная фотоконверсия белка zFP506, содержащегося в тканях полипа. Впрочем, нельзя исключить и наличия каких-либо иных не описанных ранее фотоконвертируемых молекул, колокализованных с zFP506.

I.7. Заключение Итак, показана способность различных зелных флуоресцентных белков выступать в определнных условиях (а именно, в присутствии окислителей, в т.ч. и биологических) в роли доноров электрона. Открытая в настоящей работе окислительная фотоконверсия принципиально отличается от похожего на не анаэробного процесса, описанного ранее.

Во-первых, формирование красной формы в данном случае не зависит от присутствия в системе кислорода. Во-вторых, сама образующаяся новая форма не похожа на ранее описанные в спектральном отношении (наиболее заметное отличие - максимум возбуждения флуоресценции при 575 нм против 525 нм для фотоконверсии в бескислородных условиях). Способность к переносу электрона меняет наше традиционное представление о флуоресцентных белках как о химически инертных красителях. Это свойство стоит учитывать как при изучении фундаментальных свойств (в т.ч. биологических функций) флуоресцентных белков, так и при разработке новых методов флуоресцентной визуализации. Можно говорить о целом ряде новых направлений практического применения GFP, использующих этот феномен, например, мониторинг окислительно-восстановительного статуса клеток, клеточных органелл или отдельных молекулярных ансамблей, определение близости электронного акцептора, управление светом RedOx-процессами в живой клетке, микроскопия сверхвысокого разрешения и т.д. Дальнейшие исследования, в частности, рентгеноструктурный анализ, разрешнная во времени спектроскопия, скрининг в тканях трансгенных животных, необходимы для полного понимания молекулярных механизмов и практической значимости обнаруженного явления. Напомним, что биологическая роль GFP-подобных белков остатся малопонятной. Данные, полученные в настоящей работе, позволяют строить новые гипотезы. Возможно, GFP является участником не описанной на сегодняшний день светозависимой электрон-транспортной цепи. Такая цепь могла бы выполнять (при наличии у GFP соответствующих RedOx-активных партнров) самые различные функции внутри клетки: от накопления восстановительных эквивалентов (ФАДH2 или НАДH) до трансдукции светового сигнала. Важно, что окислительная фотоконверсия является общим свойством множества ФБ самого различного происхождения. Вероятно, это вообще наиболее распространнный среди всех GFP подобных белков тип фотоактивации. Филогенетический анализ и изучение предполагаемых предковых флуоресцентных белков свидетельствуют о том, что спектральные свойства EGFP (депротонированный зелный флуорофор с максимумами возбуждения/эмиссии флуоресценции в области 480-500/500-520 нм), скорее всего, соответствуют таковым для общего предка GFP-подобных белков. С этой точки зрения светоиндуцируемый перенос электронов, характерный для разных GFP, может считаться «первичной» функцией предкового ФБ, в то время как «вторичные» функции (например, участие в биолюминесценции и фотопротекции) появились много позже в ходе эволюции и экологической специализации морских организмов.

II. Улучшение фотостабильности зелных флуоресцентных белков при микроскопии живых клеток Яркость и фотостабильность являются ключевыми характеристиками флуоресцентных белков с точки зрения их успешного применения в роли маркров во флуоресцентной микроскопии. Этими параметрами определяется в конечном итоге соотношение сигнал/шум, качество изображения и возможность проведения длительных экспериментов и количественных исследований. Для улучшения фотостабильности флуорофоров было разработано множество специальных реагентов, препятствующих фотообесцвечиванию химических красителей. Однако, они применимы лишь для фиксированных препаратов. Другой способ снизить уровень фотообесцвечивания – удаление кислорода из среды (например, с помощью реагента Oxyrase). Этот метод потенциально применим к визуализации живых клеток, но его использование плохо совместимо с нормальной клеточной физиологией.

Обнаруженная нами окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков позволяет предложить новый способ улучшения их фотостабильности. Как уже было отмечено, нарастание красного флуоресцентного сигнала при фотоконверсии сопряжено с пропорциональным уменьшением зелной флуоресценции. Есть основания полагать, что именно светоиндуцируемый перенос электронов в значительной (если не основной) степени ответственен за нежелательное фотообесцвечивание зелных флуоресцентных белков при наблюдении живых клеток. Теоретически, минимизация возможности осуществления фотоконверсии должна привести к общему улучшению фотостабильности внутриклеточных GFP. Одним из способов ограничить RedOx реакцию представляется удаление из культивационной среды компонентов, способных играть роль электронных акцепторов, свободно проникающих через плазматическую мембрану. Чтобы испытать эффективность такого подхода, мы проверили влияние состава клеточной среды на спектральное поведение флуоресцентных белков.

II.1. Увеличение фотостабильности EGFP Первым объектом стал белок EGFP, продуцируемый клетками линии HEK293T. Его фотостабильность в живых клетках определялась с помощью серийной съмки CCD камерой эпифлуоресцентного микроскопа при большом увеличении (объектив 63х) и высокой интенсивности облучения (около 1 Вт/см2). Популярная среда для культивирования и визуализации клеток DMEM (Dulbecco's Modified Eagle’s Medium) без индикатора (фенолового красного) использовалась в качестве контроля (как стандартное условие). Для исключения из системы всех потенциально RedOx-активных компонентов, мы протестировали в качестве среды для визуализации фосфатный буфер (PBS). Оказалось, что по сравнению с DMEM фотостабильность EGFP в PBS повышается приблизительно в 5 раз (не показано). Однако, фосфатный буфер не подходит для длительного поддержания жизнеспособности клеток. Пытаясь определить оптимальный для клеточной визуализации состав, мы предложили две альтернативные среды: DMEM-Rf (DMEM, не содержащий рибофлавин) и DMEM-V (DMEM, не содержащий все витамины) (табл. 3). Было показано, что отсутствия в растворе рибофлавина достаточно для увеличения фото стабильности EGFP в 5,1 раз (рис. 9, табл. 4). Исключение из среды остальных витаминов производило ещ больший эффект: 9,3 кратное увеличение фотостабильности в сравне нии с DMEM. Интересно, что вариабельность клеток в отношении скорости фото обесцвечивания при удалении перечисленных компонентов также существенно уменьшалась (рис. 9). Дополнительные компоненты сред для культивирования (L глутамин, пенициллин, стрептомицин, зародышвая сыворотка), важные для нормального роста клеток и длительных микроскопических экспериментов, не продемонстрировали сколь-нибудь значимого влияния на фотостабильность EGFP (данные не показаны).

Табл. 3. Составы* культивационных сред, использованных для измерения фотостабильности Содержание в среде, мг/л Компонент DMEM-Rf DMEM-V DMEM L-инозитол 7,2 7,2 D-Ca пантотенат 4 4 Холин хлорид 4 4 Фолиевая кислота 4 4 Никотинамид 4 4 Пиридоксаль HCl 4 4 Тиамин HCl 4 4 Рибофлавин 0,4 0 *приведены только те вещества, по содержанию которых среды отличаются. Неорганические соли, аминокислоты и углеводы, также входящие в состав культивационных сред, здесь не указаны.

II.2. Влияние состава клеточных сред на фотостабильности различных флуоресцентных белков На следующем этапе мы измерили фотостабильности химерных белков, представляющих собой EGFP, связанный с белками цитоскелета, -актином и тубулином. Аналогично EGFP, в средах DMEM-Rf и DMEM-V эти слитные белки показали существенный прирост фотостабильности (рис. 10а, табл. 4). В то же время, фотостабильность EGFP митохондриальной локализации оказалась слабо зависящей от состава раствора для визуализации (рис. 10б).

Заметное улучшение фотостабильностей наблюдалось также для коммерчески доступных флуоресцентных белков AcGFP1 (Clontech) и TagGFP2 (Evrogen) (рис. 10в, г, табл. 4). Кроме того, существенное снижение скорости фотообесцвечивания было показано для двух фотоактивируемых белков: PA-GFP и PS-CFP2 в их зелных флуоресцентных (активированных) формах. Особенно заметный эффект на поведение перечисленных белков оказывала среда DMEM-V (табл. 4).

Рис. 10. Влияние состава клеточной среды на фотостабильность EGFP-тубулина (А), митохондриального EGFP (Б), AcGFP1 (В) и TagGFP2 (Г). Графики представляют собой нормализованные кривые фотообесцвечивания ФБ в живых клетках линии HEK293T, поддерживаемых в средах DMEM (чёрные квадраты), DMEM-Rf (красные круги) или DMEM-V (зелёные треугольники). Показаны стандартные отклонения (n=15-20 клеток).

Табл. 4. Изменения фотостабильности ФБ в клетках линии HEK293T, обусловленные составом клеточной среды Увеличение Флуоресцентный фотостабильности, раз* белок DMEM-Rf DMEM-V 5.1 9. EGFP EGFP-actin 3.5 5. EGFP-tubulin 4.4 6. EGFP-mito 1.4 1. AcGFP1 1.7 2. TagGFP2 2.0 3. PA-GFP 1.3 4. (активированный) PS-CFP 3.0 4. (активированный) * Т.е. увеличение полувремени фотообесцвечивания по сравнению с DMEM. Кривые фотообесцвечивания измерены в одинаковых условиях за исключением состава сред.

II.3. Влияние витамин-дефицитных сред на физиологию клеток Мы провели ряд тестов, чтобы определить влияние витамин-дефицитных сред на жизненные функции клеток HEK293T. Для этого, клетки из одного пассажа параллельно культивировались на трх разных средах, DMEM, DMEM-Rf и DMEM-V (дополненных необходимыми добавками: глутамином, антибиотиками и сывороткой). В процессе культивации все клетки несколько раз пересевались на новые субстраты. Во всех трх случаях в первую неделю подращивания клетки сохраняли нормальную морфологию, способность к делению, прикреплению и трансфекции. Лишь на вторую неделю культивирования клетки, живущие в среде DMEM-V, продемонстрировали сниженную жизнеспособность и патологические изменения в морфологии. Дополнительно проверялось состояние цитоскелета клеток линии HeLa, продуцирующих -актин или тубулин, слитые с флуоресцентным белком. На пятый день культивации на среде DMEM-V элементы цитоскелета этих клеток демонстрировали нормальную структуру (рис. 8a). Кроме того, был проведн стандартный тест на клеточную подвижность (scratch wound healing assay), состоящий в проверке способности клеток заполнять предоставленную свободную поверхность субстрата. Тест проводился на 5-й день культивации крысиных эмбриональных фибробластов (REF52) на среде DMEM-V и показал отсутствие заметных отличий от контроля (рис. 8 б, в). Таким образом, есть все основания полагать, что среды DMEM-V и тем более DMEM-Rf могут успешно применяться для экспериментов, связанных с флуоресцентной визуализацией живых клеток, длительностью до нескольких суток.

Рис. 11. Тесты на жизнеспособность клеток в витамин-дефицитных средах. А. Флуоресцентные микрофотографии белков цитоскелета клеток HeLa после 5 дней культивации в среде DMEM-V.

Представленные клетки были трансфецированы плазмидами с генами TagGFP2--тубулина (слева) и mKate2--актина (справа). Б, В. Тест на способность клеток REF52 к миграции на свободные участки субстрата. Б. Микрофотографии клеток непосредственно после скобления поверхности субстрата (верхний ряд) и через 10 часов культивирования (нижний ряд). Слева клетки, поддерживаемые в DMEM, справа – в DMEM-V. В. Диаграмма, показывающая количественный обсчет миграции клеток REF52 за 10 ч (n=5).

II.4. Заключение Итак, на данном этапе работы продемонстрирована колоссальная зависимость фотостабильности зелных флуоресцентных белков от состава клеточной среды. Надо отметить, что уровень фотообесцвечивания флуоресцентных белков часто измеряется в PBS, что может приводить к завышенным ожиданиям фотостабильности в условиях работы с живыми клетками. Использование дефицитных по витаминам сред при флуоресцентной визуализации клеток представляется простым, но вместе с тем действенным методом улучшения свойств широко используемых флуоресцентных белков. Среды такого состава могут быть полезны во множестве приложений. Высокая фотостабильность чрезвычайно важна для длительных экспериментов по мониторингу клеточной подвижности, а также изучению перемещений органелл и других субклеточных структур (вплоть до отдельных белков). Такие передовые технологии как флуоресцентная корреляционная спектроскопия и микроскопия сверхвысокого разрешения также нуждаются в высокой фотостабильности флуорофоров. В этом смысле особенный интерес представляет показанное нами увеличение фотостабильности фотоактивируемых белков.

ВЫВОДЫ 1. Открыта способность зеленых флуоресцентных белков выступать в роли свето индуцируемых доноров электронов в присутствии акцепторов электронов. Эта реакция сопровождается фотоконверсией зеленых флуоресцентных белков в форму с флуоресценцией в красной области видимого спектра. Акцепторами электронов могут выступать как неорганические, так и органические окислители, в частности, биологические молекулы, например, флавины, никотинамидадениндинуклеотид (НАД+) и цитохром с. Показано, что окислительная фотоконверсия характерна для целого ряда эволюционно далеких зеленых флуоресцентных белков.

2. Обнаружено, что окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков может осуществляться в живых эукариотических клетках без добавления внешних окислителей (т.е. за счет внутриклеточных акцепторов электронов). Это было показано на примере белка EGFP в линиях клеток млекопитающих и в клетках трансгенных позвоночных (рыб Danio rerio и мышей), а также эндогенного зеленого флуоресцентного белка кораллового полипа Zoanthus. При этом наблюдается заметная вариабельность в отношении эффективности протекания данного процесса между клетками различных тканей или клеточными линиями, а также индивидуальными клетками одной линии.

3. Предложены модификации состава сред для флуоресцентной микроскопии живых клеток, позволяющие существенно снизить уровень фотообесцвечивания зеленых флуоресцентных белков за счет снижения эффективности их окислительной фотоконверсии. Доказана пригодность модифицированных клеточных сред для проведения длительных (до нескольких суток) экспериментов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Bogdanov A.M., Mishin A.S., Yampolsky I.V., Belousov V.V., Chudakov D.M., Subach F.V., Verkhusha V.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Green fluorescent proteins are light induced electron donors. Nature Chem. Biol. 2009, 5, 459- 2. Bogdanov A.M., Bogdanova E.A., Chudakov D.M., Gorodnicheva T.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nature Methods.

2009, 6, 859-860.

Тезисы докладов на конференциях 1. Богданов А., Мишин А., Лукьянов К.. Окислительная фотоконверсия зелного флуоресцентного белка. Тезисы докладов на V съезде российского фотобиологического общества (Пущино, 8-13 июня 2008 года) сек. 5.4. с. 2. Лукьянов К.А., Богданов А.М. Зелные флуоресцентные белки – светоиндуцируемые доноры электронов. Тезисы докладов на Международной Конференции по биомолекулярной науке в честь 75-летия со дня рождения профессора Юрия Овчинникова. с. 279- 3. Bogdanov A.M., Chudakov D.M., Verkhusha V.V., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins:

promising novices and unexpected abilities of old friends. Сonference Focus on Microscopy 2009. Jagiellonian University, Krakow, Poland, April 5-8, 4. Bogdanov A.M., Lukyanov K.A. Green fluorescent proteins function as light-induced electron donors. Сonference Fluorescent Proteins and Biological Sensors II, HHMI Janelia Farm, USA, November 1-4,