На правах рукописи

Оккельман Ирина Александровна 03.01.03 – Молекулярная биология НОВЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Группе кросс-сшивающих ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Научный консультант:

кандидат химических наук Пестов Николай Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бабаков Алексей Владимирович кандидат химических наук Пахомов Алексей Александрович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «» октября 2013 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автореферат разослан «» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ.-мат. наук Олейников В.А.

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Взаимодействия белков лежат в основе выполняемых ими функций. Совокупность всех биологически значимых белковых взаимодействий в рамках целого протеома носит название интерактом. На сегодняшний день все больше внимания уделяется исследованиям как глобальных интерактомов различных организмов, так и интерактомов отдельных белков. Составление карт взаимодействий между биомолекулами (например, белками) позволяет систематизировать и расставить отдельные фрагменты гигантской «интерактомной мозаики» на свои места и прогнозировать возможные пути функционирования и регуляции биологических процессов. Использование подобного подхода имеет ценность не только для фундаментальных биологических исследований, но и важно для разработки новых подходов в медицине. В наши дни для решения этой задачи используют высокопоточные методы анализа взаимодействий биомолекул в клетках и организмах. Однако, именно в силу гигантского объема информации, получаемой с помощью высокопоточных поисковых методов, их применение порождает массу «ошибок» и «пробелов» в составляемых интерактомных схемах. Поэтому интерактомные исследования, осуществляемые небольшими коллективами, обычно посвященные отдельному объекту, часто дают более достоверные результаты о молекулярных взаимодействиях и их роли в функционировании организмов.

Наиболее ярким примером приложения интерактомного подхода являются исследования этиологии онкологических заболеваний. В настоящее время считается, что канцерогенез - это сложный, многоэтапный процесс, одним из движущих факторов которого является взаимодействие опухоли и ее окружения, а также изменение характеристик клеточных интерактомов. Особый интерес в этом плане представляют собой белки, непосредственно вовлеченные в процессы метастазирования и прогрессии опухоли, в частности, семейство лизилоксидаз (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4). Все представители семейства лизилоксидаз характеризуются высокой консервативностью аминокислотной последовательности каталитического домена и проявляют схожую субстратную специфичность. Эти белки секретируются различными типами клеток во внеклеточное пространство, где они участвуют в посттрансляционной модификации коллагена и эластина, формируя тем самым структуру внеклеточного матрикса. В то же время ряд представителей семейства лизилоксидаз (LOX и LOXL2) найдены в ядрах клеток, где они участвуют в регуляции экспрессии генов, например, гена кадгерина Е, репрессия которого приводит к изменению клетками фенотипа с эпителиального на мезенхимальный, характеризующийся большей миграционной активностью. Несмотря на успешность функциональных исследований, остаются непонятыми молекулярные механизмы этих процессов и конкретная роль лизилоксидаз в них. Поэтому составление интерактомной карты белковых взаимодействий с участием лизилоксидаз позволило бы проанализировать возможные механизмы работы этих белков, а также установить роль внеклеточной и внутриклеточной функциональной активности лизилоксидаз в прогрессии опухолей.

Так как лизилоксидазы непосредственно участвуют в метастатической прогрессии опухолей и являются потенциальной мишенью для терапии онкологических заболеваний, остро встает вопрос о возможности специфического воздействия на ферментативную активность этих ферментов in vivo. Необходимо отметить, что до сих пор не созданы лекарственные препараты, ингибирующие активность этих ферментов, пригодные для применения в медицинской практике. Известные на сегодняшний день ингибиторы лизилоксидаз обладают высокой токсичностью и неспецифичностью действия по отношению к лизилоксидазам и не пригодны для медицинских целей. В то же время полное ингибирование лизилоксидазной активности нежелательно, так как эти белки крайне необходимы для нормального функционирования тканей. Поэтому наиболее перспективным направлением исследований является поиск возможных альтернативных путей регулирования / моделирования активности лизилоксидаз.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе с использованием различных поисковых методов (например, «молекулярный фишинг», двугибридный дрожжевой скрининг) определен ряд новых, до этого момента неизвестных белков-партнеров лизилоксидазы человека. Хотя подобные работы уже проводились рядом авторов [Fogelgren et al, 2005;

Polgar et al, 2007], до сих пор круг известных белков-партнеров лизилоксидаз очень узок и ограничен, в основном, данными о внеклеточных интеракторах этого белка.

Данное исследование не только выявило ряд новых потенциальных внутриядерных интеракторов лизилоксидазы человека, но и позволило выдвинуть гипотезу, объясняющую механизм регуляции лизилоксидаза-зависимой репрессии гена кадгерина Е. По результатам работы также была составлена карта фрагмента глобального интерактома с участием лизилоксидаз.

В данной работе был осуществлен не только поиск новых интеракторов лизилоксидазы, позволяющий предположить новые пути регуляции ее функциональной активности в организме, но также предложен уникальный метод модуляции каталитической активности лизилоксидазы, основанный на применении изотопного эффекта. Этот метод может быть использован как новый инструмент для исследований функциональной активности лизилоксидаз.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлся поиск новых путей регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека с помощью различных подходов и методов. В связи с этим предполагалось решить следующие задачи:

Получить продуценты рекомбинантной лизилоксидазы на основе различных систем 1.

экспрессии белков и, по возможности, выделить каталитически активную лизилоксидазу.

Охарактеризовать локализацию каталитического домена лизилоксидазы в различных 2.

тканях, а также в культурах различных клеточных линий, в том числе в первичной культуре.

С помощью дрожжевой двугибридной системы произвести поиск белок-белковых 3.

взаимодействий каталитического домена лизилоксидазы в организме человека.

Подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой двугибридной 4.

системе, с помощью альтернативных методов – связывания in vitro, колокализации в клетке и других.

Произвести поиск новых интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного 5.

фишинга» с последующей идентификацией белков при помощи масс-спектрометрии.

Подтвердить детектированные взаимодействия независимыми методами.

Измерить изотопный эффект сайт-специфичного дейтерирования нативных 6.

субстратов лизилоксидазы и протестировать возможность регуляции лизилоксидазной активности при помощи данного подхода.

Исследовать особенности внутриклеточной локализации предполагаемого 7.

онкосупрессора TTC4.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных конференциях “Cancer Proteomics, 2009” (Дублин, Ирландия), “The 25th Anniversary Symposium of the Protein Society” (Бостон, США, 2011) и ”15th Amine Oxidase Congress, AOC 2012” (Тулуза, Франция), а также на “X-ых чтениях, посвященных памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова”, (Москва-Пущино, Россия, 2011), «Белки и пептиды» (Казань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ – 2 статьи в реферируемых научных журналах и 7 в сборниках тезисов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав основной части (литературный обзор, результаты и обсуждение, экспериментальная часть), выводов, приложения и списка литературы, включающего 265 источников. Работа содержит 43 рисунка и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изотопный эффект сайт-специфического дейтерирования лизина 1.

на каталитическую активность лизилоксидазы Разработка новых методов ингибирования и регуляции активности лизилоксидазы in vivo является очень важной для выяснения роли лизилоксидазы в различных физиологических процессах и, возможно, средством для коррекции таких патологических процессов как фиброз и метастатическая прогрессия опухолей. На сегодняшний день для ингибирования ферментативной активности LOX применяют агенты, способные связывать медь, антитела и низкомолекулярные ингибиторы, такие как и его производные. Все из BAPN вышеперечисленных ингибиторов имеют серьезные недостатки. В то же время полное ингибирование лизилоксидазной активности может быть нежелательным, так как помимо участия лизилоксидазы в образовании преметастатической ниши – «среды обитания» для вновь формирующихся метастазов, LOX необходима для поддержания правильной структуры сосудов, кожи, костей, хрящевой ткани, а в молодом организме необходима для правильного роста и закладки тканей. Поэтому наилучшим способом корректировки нежелательной активности лизилоксидазы является не ингибирование, а модуляция работы.

Такую возможность может дать применение кинетического изотопного эффекта (КИЭ).

Известно, что в некоторых случаях дейтерирование лекарственных препаратов может улучшить их фармакодинамические свойства. Исходя из этих соображений, было решено измерить кинетический изотопный эффект на активность лизилоксидазы с использованием дейтерированных субстратов LOX.

В качестве дейтерированного субстрата LOX мы использовали 6,6-D2-лизин и его пептидные производные, любезно синтезированные Шманаем В.В. и А.Л. Хурским (Институт Физической Органической Химии Национальной академии наук Республики Беларусь). Использование производных лизина с заменой атомов водорода на дейтерий только при шестом атоме углерода было неслучайным, так как замена атомов водорода в других положениях может привести к нежелательным последствиям. Например, водородные атомы при пятом атоме углерода вовлечены в процесс образования гидроксилизина в составе коллагена в реакции, катализируемой лизилгидроксилазой. В то же время, отщепление одного из атомов водорода в шестом положении является неотъемлемой стадией в реакции окислительного дезаминирования.

Лизилоксидаза, использованная для этих исследований, была получена из аорты барана путем экстракции растворами мочевины, с последующей ионообменной хроматографией, высаливанием сульфатом аммония и гель-фильтрацией. Так как для определения активности лизилоксидаз необходимо проводить измерения с контрольными образцами в присутствии специфического ингибитора LOX BAPN, крайне важным было получить препарат лизилоксидазы без загрязнения другими аминоксидазами (особенно SSAO, для которой BAPN является одновременно слабым субстратом и конкурентным ингибитором). Поэтому полученный препарат лизилоксидазы перед использованием в эксперименте тестировали на присутствие активности в беренил-чувствительной реакции окисления SSAO специфического субстрата SSAO - метиламина. Так как LOX не чувствительна к действию беренила, специфического ингибитора SSAO, такой метод мониторинга на присутствие SSAO в препарате можно использовать на каждой из стадий выделения лизилоксидазы.

Таким образом, нам удалось получить препарат, обладающий лизилоксидазной активностью и свободный от примесей SSAO. Присутствие в препарате лизилоксидазы было проверено методом иммуноблотинга (рис. 1) с использованием моноклональных мышиных антител к каталитическому домену лизилоксидазы (любезно предоставлены A.J. Giaccia).

Рис. 1. Иммуноблотинг рекомбинантной мышиной mLOX, полученной в E.coli (A) и LOX, выделенной из аорты барана (B). Рекомбинантная mLOX выделена из клеток E. coli (штамм SG13009) и подвергнута рефолдингу для получения растворимого белка. Белки препаратов LOX были разделены электрофорезом в ПААГ, перенесены на PVDF мембрану с последующим инкубированием с мышиными моноклональными антителами к LOX и визуализацией при помощи хемилюминесцентного субстрата пероксидазы хрена.

Электрофоретическая подвижность ниже теоретической в случае рекомбинантной мышиной лизилоксидазы объясняется присутствием N-концевого пептида MRGSHHHHHHGS.

Для мониторинга окислительной реакции, катализируемой лизилоксидазой, мы использовали флуорометрический анализ, основанный на измерении стехиометрического образования H2O2 в реакции окислительного дезаминирования субстратов LOX. Для характеристики КИЭ необходимо и достаточно измерить эффект дейтерирования на D D максимальную скорость (Vmax) – V, а также на отношение Vmax/Km – VK (последнее соответствует отношению скоростей окисления нормального и дейтерированного субстратов при бесконечно малой концентрации субстрата). Оказалось, что DVK для 6D2 лизина равен 4.35±0.22 (n=4) при 37С. Интересно, что гораздо меньшее влияние оказывается на DV, для лизина это значение близко к 1 (1.34±0.3) (рис. 2A). Это означает, что при очень больших концентрациях субстрата действие изотопного эффекта нивелируется. Такие результаты можно объяснить следующими соображениями относительно механизма ферментативной реакции: реакционный цикл LOX и других медь-зависимых аминоксидаз подчиняется механизму типа «пинг-понг» и включает в себя стадию удаления атома водорода, как одну из скорость-лимитирующих стадий. Вместе с этим существует другая скорость-лимитирующая стадия - окисление хинонимина молекулярным кислородом.

Поэтому низкие показатели DV свидетельствуют о сильном влиянии стадии окислительной полуреакции на суммарную скорость реакции. Это также подтверждает тот факт, что при постановке LOX-катализируемой реакции в условиях гипоксии (данные не приведены) показатели DVK тоже приближаются к единице. При этом даже при низких концентрациях субстрата фактором, определяющим скорость реакции, будет концентрация кислорода, и изотопный эффект будет мал.

КИЭ может быть использован для уменьшения активности лизилоксидазы без полного ее блокирования. Однако, чтобы действительно оценить практическое значение изотопного эффекта, оказываемого на отношение величин Vmax/Km необходимо проводить эксперименты, приближенные к условиям in vivo. Это может быть достигнуто использованием сайт специфически дейтерированных белков и пептидов. В случае высокомолекулярных субстратов образование и диссоциация фермент-субстратного комплекса может в значительной степени лимитировать реакцию и маскировать изотопный эффект. По этой причине, очень важно измерить КИЭ на полипептидных субстратах. Уровень аутокаталитического окисления у лизилоксидазы невысок, так как этот фермент содержит низкий уровень аминокислотных остатков лизина в своей последовательности proLOX (так всего 6 остатков Lys приходится на 417 аминокислотных остатков последовательности proLOX человека). Учитывая эти факторы, мы получили типичный пептидный фрагмент последовательности коллагена, содержащий один дейтерированный остаток лизина.

Скорость его окисления была измерена в диапазоне концентраций от 0.1 до 0.8 мМ и показано, что DVK для этого 6,6-D2-Lys-содержащего пептида равен 3.1 при 37С (рис. 2B).

А В Рис. 2. А. Изотопный эффект дейтерирования субстрата на окисление свободного лизина лизилоксидазой.

В. Изотопный эффект дейтерирования субстрата на окисление Lys-содержащего пептида Ac RGGGGEKGGGGG-NH2 лизилоксидазой из аорты барана. Квадратами обозначен немеченый лизин, треугольниками – дейтерированный лизин (6,6-D2-Lys) (значения трех повторных измерений). DVK определяли по соотношению наклонов прямых зависимости, а DV – по соотношению пересечений с осью y. В случае экспериментов с использованием лизинового субстрата четыре независимых препарата LOX из аорты барана дали следующие значения DVK=4.35±0.22 и DV=1.34±0.3 (среднее ± стандартное отклонение). Для Lys содержащего пептида DVK=3.1.

Таким образом, разработан новый способ регуляции лизилоксидазной активности, который может оказаться полезным для исследований роли окисления белковых субстратов лизилоксидазой в экспериментах на животных и клеточных моделях. В то же время перспективы применения его для медицинских целей сомнительны в виду чрезвычайно высокой стоимости дейтерированного лизина.

Исследование локализации эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных 2.

линиях, тканях и первичной культуре фибробластов Аминокислотная последовательность полноразмерной лизилоксидазы (ppLOX) представляет собой совокупность трех структурно-функциональных регионов: сигнального пептида, пропептидного домена (LOPP), и каталитического домена (mLOX), отделенного от последовательности LOPP последовательностью сайта протеолитической деградации (DDR).

Обычно новосинтезированный белок секретируется во внеклеточное пространство и локализуется на соединительнотканных волокнах, однако некоторые исследования свидетельствуют о ядерной локализации этого белка в некоторых типах клеток, например, в гладкомышечных клетках и фибробластах. Мы решили изучить, насколько широко распространена ядерная локализация LOX. Для этого мы проанализировали локализацию лизилоксидазы в имеющихся в нашем распоряжении клеточных линиях и сравнили ее с локализацией LOX в некоторых доступных для нас тканевых образцах. Мы наблюдали преимущественно ядерную локализацию и в меньшей степени цитоплазматическую локализацию эндогенной лизилоксидазы во всех исследованных нами препаратах различных клеточных линий (рис. 3). При этом эндогенный белок был локализован в ядрах в виде точечных структур, вне области расположения ядрышек.

Так как современные клеточные культуры являются иммортализованными клеточными линиями, претерпевшими многократное культивирование, и по многим своим характеристикам часто отличаются от нормальных (неиммортализованных) клеток и первичных клеточных культур, мы решили также проанализировать локализацию эндогенной лизилоксидазы в клетках первичной культуры и в некоторых доступных тканевых препаратах человека. Для исследования поведения LOX в первичной культуре мы использовали фибробласты, полученные из эмбриона курицы (рис. 4). Клетки культивировали в течение нескольких недель и подвергали иммуноцитохимическому анализу с использованием антител к лизилоксидазе. Для первичной клеточной культуры фибробластов также была характерна ядерная локализация LOX в клетке в точечных структурах. В то же время в этих клетках мы наблюдали более интенсивное, чем в случае иммортализованной культуры фибробластов мыши, окрашивание цитозоля, напоминающее структуры секреторных везикул и, вероятно, связанное с повышенной продукцией и секрецией Однако, в целом локализация лизилоксидазы в первичной и LOX.

иммортализованных клеточных линиях была аналогичной, что позволяет использовать иммортализованные клеточные культуры для исследования ядерной LOX.

Рис. 3. Анализ клеточной локализации лизилоксидазы в различных линиях клеток: мышиных фибробластов NIH3T3, HeLa (аденокарцинома человека, эпителиальная морфология), А549 (клеточная линия немелкоклеточной карциномы легкого человека), MCF-7 (клеточная линия рака молочной железы человека, эпителиальная морфология). Зеленая и красная флуоресценция соответствует лизилоксидазе, меченной антителами к эпитопу каталитического домена LOX, синяя флуоресценция соответствует окраске ядер клеток DAPI. Масштаб 10 мкм.

Рис. 4. Анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках первичной культуры эмбриона курицы.

Зеленая флуоресценция соответствует лизилоксидазе, меченной антителами к эпитопу каталитического домена LOX, синяя флуоресценция соответствует окраске клеточных ядер DAPI. Масштаб 10 мкм.

Однако мы не наблюдали ядерной локализации лизилоксидазы при анализе тканевых образцов, даже в случае клеток с выраженной фибробластоподобной морфологией (как в образцах соскоба эндометрия матки, взятого у пациентки с дисплазией эндометрия (рис. 5), в сравнении с эндометрием здорового пациента (рис. 6). В тканях с хорошо выраженным внеклеточным матриксом, как, например, в случае трахеи эмбриона курицы, мы наблюдали исключительно внеклеточную локализацию лизилоксидазы вдоль соединительнотканных волокон (рис. 7). Таким образом, в клеточной культуре in vitro мы наблюдали нехарактерную для тканевых препаратов ядерную локализацию лизилоксидазы. Возможно, что ту или иную локализацию LOX определяет не только природа клеток, но и структура внеклеточного матрикса. Однако не исключено, что существуют и другие объяснения этого явления.

Рис. 5. Анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках эндометрия матки при дисплазии эндометрия. Для окрашивания парафинового среза ткани использовали антитела к каталитическому домену LOX. На препарате видны клетки с характерной для фибробластов морфологией, в которых локализация эпитопов лизилоксидазы соответствует цитоплазматическому компартменту клетки, а не ядерному.

Рис. 6. Анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках эндометрия матки (норма). Два увеличения. В препарате видны отдельные клетки округлой формы с сегментированным ядром, в которых локализация эндогенной лизилоксидазы соответствует цитоплазматическому компартменту. Масштаб мкм.

Рис. 7. Иммунофлуоресцентный гистохимический анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в образцах трахеи эмбриона курицы. Красная флуоресценция соответствует распределению лизилоксидазы вдоль волокон внеклеточного матрикса. Синяя флуоресценция – окраска DAPI ядер клеток.

Мы также исследовали локализацию клеточной лизилоксидазы в препарате крови человека. Мазки крови, фиксированные в холодном метаноле (-20С), окрашивали по стандартной методике антителами к каталитическому домену лизилоксидазы (чтобы убедиться в специфичности антител, этот эксперимент был воспроизведен с несколькими различными антителами: как с коммерческими, так и с полученными в нашей лаборатории).

Результат представлен на рис. 8. Положительное окрашивание антителами к LOX наблюдали только у тромбоцитов (В) и сегментоядерных лейкоцитов (А).

Рис. 8. Локализация лизилоксидазы в клетках крови человека. А – сегментоядерные лейкоциты, В – тромбоциты. Зеленая флуоресценция соответствует локализации LOX, синяя флуоресценция – окраска DAPI ядер клеток. Масштаб 10 мкм.

Отметим, что присутствие LOX в тромбоцитах нами показано впервые, в то же время функция лизилоксидазы в тромбоцитах остается неясной.

3. Исследование интерактома лизилоксидазы Для интерактомных исследований лизилоксидазы человека был применен спектр методологических подходов, позволивший представить наиболее полную картину взаимодействий лизилоксидазы. Мы не ограничились применением только одного способа поиска белковых взаимодействий и подтвердили у некоторых интеракторов способность взаимодействовать с каталитическим доменом лизилоксидазы с помощью альтернативных методов.

3.1. Поиск белков интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга».

Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа – новая субстратная мишень лизилоксидазы В качестве материала для получения белковых экстрактов использовали следующие ткани: печень, головной мозг, почки и семенники крыс породы WISTAR в возрасте от 0,5 до 1 года. Органы гомогенизировали с добавлением ингибиторов протеаз, гомогенат подвергали процедуре центрифугирования и фильтрации для разделения водорастворимой и нерастворимой фракции. Водонерастворимую фракцию препарата подвергали последовательно дополнительной экстракции растворами неионных детергентов и мочевины. Полученные тканевые экстракты последовательно пропускали через три тандемные колонки с иммобилизованными рекомбинантными белками: m-субъединицей X,K-АТФазы (контрольный белок), пропептидным доменом лизилоксидазы (LOPP) и ее каталитическим доменом (mLOX). После инкубации с тканевыми экстрактами систему последовательно промывали от неспецифически связанных белков, чередуя растворы на основе PBS, содержащие 1 М мочевину, с растворами, содержащими неионный детергент Triton X100. После промывания проводили элюцию прочно связанных белков. Элюцию осуществляли с каждой отдельной колонки последовательно буферными растворами, содержащими как мочевину, так и мочевину с имидазолом. Полученные элюаты концентрировали ультрафильтрацией и анализировали методом электрофореза в 13.5% ПААГ. Специфические связанные белки анализировали при помощи масс-спектрометрии. В препарате, элюированном 4M мочевиной, нам удалось детектировать глицеральдегидфосфатдегидрогеназу (GAPDH) (полоса, соответствующая 36-37 кДа на рис.

9) в качестве возможного интерактора каталитического домена LOX.

Получение белковых экстрактов из тканей и инкубация их с рекомбинантными белками наживками, иммобилизованными на смоле.

Идентификация образца методом масс-спектрометрии как GAPDH Дополнительные исследования взаимодействия LOX/GAPDH Рис. 9. Схема эксперимента по «молекулярному фишингу» белков-партнеров лизилоксидазы из тканей крысы. На рисунке также представлен результат электрофоретического разделения белков одной из фракций полученных элюцией раствором состава 4 M мочевина/PBS pH 7.4. LOPP – пропептид лизилоксидазы, m – контрольный белок.

Так как нам не удалось подтвердить взаимодействие GAPDH/mLOX in vitro методом пулл-даун, мы предположили, что это взаимодействие слабое или требует особых условий.

Такое взаимодействие может подразумевать и то, что GAPDH служит субстратом в реакции, катализируемой лизилоксидазой. Аминокислотная последовательность GAPDH богата аминокислотными остатками лизина, например, входящими в состав сигнала ядерной локализации GAPDH. Модификации этих лизинов важны для регуляции транспорта белка между цитоплазмой и ядром клетки, что влияет на процессы транскрипции, репликации, транспорта РНК и апоптоза, осуществляемые при участии GAPDH. Для тестирования этой гипотезы мы разработали новый метод определения лизилоксидазной активности, который можно успешно применять для исследования субстратных характеристик крупных белковых молекул, основанный на поляризации флуоресценции зонда с активной карбонильной группой (рис. 10).

60, 50, 40, no BAPN 30, BAPN 20, no GAPDH 10, 0, 0 1 4 Рис. 10. Зависимость поляризации флуоресценции от количества препарата LOX, используемого в реакции. Перед измерением поляризации флуоресценции препарат LOX инкубировали в течение 30 мин с GAPDH. Для определения вклада лизилоксидазной активности во включение флуоресцентной метки в молекулы GAPDH ту же процедуру проводили в присутствии ингибитора BAPN. В качестве контроля использовали препарат LOX, инкубированный без GAPDH.

3.2. Поиск новых белковых партнеров зрелой формы лизилоксидазы человека в системе дрожжевого двугибридного срининга.

Другим подходом, использованным для поиска новых интеракторов mLOX, был метод двугибридного дрожжевого скрининга. В качестве «наживки» использовали каталитический домен человека, как наиболее консервативный структурный элемент всех LOX изоферментов семейства лизилоксидаз. Скрининг проводили с использованием нормализованной универсальной библиотеки кДНК человека (Clontech). Было идентифицировано около 300 клонов, у которых наблюдался положительный рост на селективной среде, дефицитной по аденину и гистидину. Наиболее перспективные интеракторы были подвергнуты дополнительной проверке на способность активировать промотор -галактозидазы в штамме АН109. После отсева всех ложноположительных клонов был составлен список наиболее интересных интеракторов лизилоксидазы (Таб.1). Анализ литературы и известных интерактомных баз данных (PIPs, BioGrid, String) позволил составить фрагмент карты взаимодействий лизилоксидазы (рис. 11). Некоторые из новых интеракторов являются ядерными резидентами (например MDC1, p66, 2G4). Исследование функционального значения этих взаимодействий может прояснить роль внутриядерной лизилоксидазы. В то же время не меньший интерес представляет собой взаимодействие LOX с белком SOS2, являющимся одним из важных компонентов Ras-опосредованных сигнальных путей. Как известно, LOX является онкосупрессором Ras-трансформированных опухолей, т.е. роль LOX в канцерогенезе становится противоречивой и поэтому особенно интересной. Наши дальнейшие исследования мы сосредоточили на изучении взаимодействия mLOX/p66 и его функций в клетке.

Функциональный домен Кол-во Аминокислотные Интерактор Номер Gene Bank белка вовлеченный во Функция интерактора Роль в онкогенезе клонов координаты взаимодействие с LOX Богатый пролином регион Катализирует реакцию Изменения в продукции белка не оказывают влияния на SOS2 (Son of (содержит SH3-связывающий обмена ГДФ на ГТФ в нормальное развитие у мышей;

неизвестная роль в AAI43368.1 1 1169- sevenless 2) домен) ГТФазе RAS прогрессии рака.

Компонент нуклеосом CR2-домен, содержащий ремоделирующего последовательность цинковых Не известно p66 NP_065750.1 1 334- комплекса Mi2/NuRD;

пальцев репрессия транскрипции Повышение экспрессии белка наблюдается при раке шейки MDC1 (mediator of Часть тандема tBRCT Ранний ответ на матки, понижение экспрессии приводит к остановке роста DNA damage AAI52557.1 3 1974- доменов повреждение ДНК опухоли in vivo и in vitro;

потенциальный терапевтический checkpoint 1) агент при лечении рака пищевода.

Передача ростовых регуляторных сигналов;

p EBP1 (ErbB3-binding protein1) p48 и p42 подавляет апоптоз;

p42 Онкоген: p48 способствует росту клеток и инвазии в HDAC2 –связывающий NP_006182. изоформы (продукты ингибирует клеточную случаях глиобластомы человека, повышенная продукция 2 238-373 / 184- регион AAD00646. альтернативного пролиферацию и белка при раке молочной железы;

Онкосупрессор: p сплайсинга) способствует дифференцировке клеток Неизвестная доменная структура, некоторые медиатор ErbB2- Онкоген: повышена экспрессия при инвазивном раке MEMO1 изоформы аминокислотные остатки опосредованной молочной железы и высоко инвазивной аденокарциноме NP_057039.1 1 13- вовлечены во взаимодействие 1/ подвижности клеток поджелудочной железы с фосфорилированным по Tyr1227 ErbB angiotensin II receptor-associated protein (AGTRAP) NP_001035285. 10-111 (для Неизвестная доменная изоформы c,d,e Неизвестная функция Не известно NP_001035286.1 изоформы c) структура (продукты NP_001035287. альтернатиного сплайсинга) Complement 1511-1570 a.a. - часть A Компонент component C4A макроглобулинового CAQ10919. классического пути Не известно (Rodgers blood group) 3 1511- рецепторного региона;

1588 CAI41869. системы комплемента and C4B (Chido blood 1742 a.a. - NTR/C345C домен group) Таб. 1. Белки-интеракторы каталитического домена лизилоксидазы, выявленные в дрожжевом двугибридном скрининге.

Рис. 11. Фрагмент интерактома лизилоксидазы человека, реконструированный с использованием баз данных по взаимодействию белков и результатам проведенных нами экспериментов. Обозначения: стрелками показана ферментативная активность по отношению к субстрату, линиями показаны взаимодействия белков (красный – результаты двугибридного скрининга, синий – результаты коиммунопреципитации, розовый – результат «молекулярного фишинга», совмещенного с масс-спектрометрией, черный – взаимодействие подтверждено несколькими независимыми методами, зеленый – данные известные только для LOXL2 изоформы);

голубым цветом отмечены белки, детектированные в результате проведенных экспериментов, розовым – компоненты комплекса Mi2/NuRD.

3.3. Картирование доменов репрессора транскрипции p66, вовлеченных во взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы Для подтверждения возможности белка р66 взаимодействовать с mLOX in vitro мы использовали пулл-даун. В качестве «белка-наживки» использовали рекомбинантную mLOX, иммобилизованную на Ni-NTA. На первом этапе эксперимента мы подобрали оптимальные условия получения клеточных экстрактов с использованием различных лизирующих буферных систем, таких как RIPA, основанную на использовании смеси анионных детергентов додецилсульфата и дезоксихолата с неионным нонидетом-40;

и CATZ, основанную на использовании цвитерионного детергента CHAPS и катионного детергента бромида гексадецилтриметиламмония. В обоих случаях мы наблюдали одинаковую эффективность экстракции GFPp66 (соответствует полосе с подвижностью 92 кДа, в отличие от GFP – 27 кДа), оверэкспрессированного в клетках НЕК293Т (рис. 12A). Однако при постановке пулл-дауна с экстрактами, полученными с использованием CATZ и RIPA, мы наблюдали значительную разницу в эффективности формирования комплекса GFPp66/mLOX in vitro (рис. 12B). Поэтому при постановке пул-дауна с различными фрагментами последовательности p66 мы целенаправленно использовали систему лизирующего раствора CATZ для получения клеточных экстрактов.

Выравнивание аминокислотных последовательностей р66 различных организмов выявляет в первичной структуре белка два высококонсервативных участка (домены CR1 и CR2), обладающих различной функциональной активностью. При этом в составе CR2 домена присутствует аминокислотный мотив цинковых пальцев GATA-типа, вероятно, вовлеченных в белок-белковые взаимодействия [Brackertz et al, 2006]. Чтобы определить роль структурно функциональных доменов p66 в формировании белкового комплекса p66/mLOX, мы воспроизвели эксперимент по пулл-дауну с использованием клеточных экстрактов, содержащих GFP-меченные домены p66: GFPCR1 (1-338 а.о.) и GFPCR2 (339-593 а.о), продуцированные в клетках HEK293T (рис. 12C). В результате проведенного эксперимента оказалось, что CR2-домен р66, также как и полноразмерный р66 способен формировать комплекс с рекомбинантной mLOX, иммобилизованной на Ni-NTA. В то же время CR1 домен р66 такой активностью не обладает (рис. 12D). Таким образом, мы впервые продемонстрировали новую способность функционального домена р66 – CR взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы. Предположительно, способность р66 формировать комплекс с LOX важна для инкорпорации лизилоксидазы в состав нуклеосом-ремоделируюшего комплекса Mi2/NuRD и в регуляции взаимодействия LOX с гистонами.

Рис. 12. Подтверждение взаимодействия LOX и p66. А. Оценка эффективности экстракции экзогенных GFP и GFPp66 из клеток линии НЕК293Т с использованием лизисных растворов CATZ и RIPA. B.

Полноразмерный р66 способен связываться с каталитическим доменом лизилоксидазы in vitro. Наибольшая эффективность взаимодействия наблюдается в присутствии буферного раствора CATZ. C.

Иммунохимический анализ лизатов HEK293T, экспрессирующих различные конструкции белка р66. Детекцию экзогенных белковых продуктов осуществляли с помощью антител к GFP (в разведение 1:5000). D.

Полноразмерный р66, а также его CR2-домен содержащий фрагмент способны образовывать белковые комплексы с рекомбинантной лизилоксидазой in vitro. Детекцию белков осуществляли антителами к GFP (1:5000).

3.4. Анализ локализации эндогенных р66 и LOX в клетках млекопитающих.

Исследование локализации LOX и p66 в клетках при совместной экспрессии Для характеристики взаимодействия р66/LOX мы провели исследование их локализации в культивируемых клетках. Для этой цели был проведен иммуноцитохимический анализ локализации этих белков в клетках линии MCF7 (рис. 13). Как видно на рисунке и р66, и LOX колокализуются в ядре в похожих точечных образованиях, избегая области расположения ядрышек (на фотографии соответствуют пустотам). В то же время оба белка одинаково локализуются и в делящихся клетках в несвязанном с хромосомами состоянии.

Подобное поведение белков также может служить дополнительным свидетельством в пользу существования их взаимодействия внутри клетки.

Рис. 13. Исследование локализации эндогенных LOX (B, F) и р66- (C, G) в клетках линии MCF7. Клетки были фиксированы формальдегидом;

детекцию эндогенных белков проводили с использованием специфических антител к LOX (B, F) и к р66 (C, G). A, E – окраска DAPI. D, H – наложение изображений B и C, F и G. В нижней части рисунка (E-H) представлены изображения двух делящихся клеток. Масштаб 10 мкм.

В то же время способность локализоваться в точечных структурах в ядрах клеток сохраняется и у оверпродуцированного GFPр66 (рис.14). Вероятно, что в ядрах клеток существуют некие локусы, способствующие скоплению GFPр66 и формированию им телец.

Возможно, что в них могут формироваться функционально активные белковые комплексы, отвечающие за нуклеосомный ремоделинг и репрессию генов, например, нуклеосом ремоделирующий комплекс Mi2/NuRD, компонентом которого является белок р66.

Рис. 14. Исследование локализации GFPp66 (вверху) и GFP (внизу) при их оверпродукции в клетках мышиных фибробластов NIH3Т3. Живые клетки фотографировали через 18 часов после трансфекции.

Масштаб 10 мкм.

Экзогенный домен mLOX (в отличие от эндогенной лизилоксидазы) не может транспортироваться в ядро и накапливается в цитозоле клетки, что вполне объяснимо, так как у него отсутствует свой собственный сигнал ядерной локализации. Чтобы объяснить способность каталитического домена лизилоксидазы проникать в ядро, мы решили проверить, как присутствие оверпродуцированного р66 влияет на локализацию оверпродуцированной mLOX in vivo.

Рис. 15. Исследование локализации GFPp66 и RFPLOX при их совместной продукции в клетках линии HeLa. Клетки линии HeLa котрансфецировали плазмидами, кодирующими GFPp66 и RFPLOX (A – C) или GFP и RFPLOX (отрицательный контроль, D – F). Локализацию флуоресцентных белков анализировали через часов после трансфекции. В присутствии оверэкспрессированного p66, LOX переносится в ядра, где локализуется в точечных структурах вместе с p66. Масштаб 10 мкм.

Для этой цели клетки линии HeLa трансфецировали плазмидами, кодирующими RFPLOX и GFPp66, и анализировали локализацию обоих белков in vivo через 8 часов после трансфекции. Как видно на рис. 15, в отсутствие GFPp66 RFPLOX локализуется внеядерно в цитоплазматической фракции. В то же время совместная экспрессия GFPp66 и RFPLOX приводит к появлению ядерной лизилоксидазы, сосредоточенной в тельцах неизвестной природы, совпадающих по локализации с тельцами GFPp66. Подобная локализация экзогенного белка напоминает поведение эндогенной лизилоксидазы, которая также имеет точечный характер ядерной локализации.

Неспособность оверэкспрессированной лизилоксидазы накапливаться в ядре можно объяснить как отсутствием у нее своего собственного сигнала ядерной локализации, так и недостатком свободных сайтов связывания экзогенной лизилоксидазы. Вероятно, экзогенный p66, как ядерный интерактор лизилоксидазы, создает дополнительные сайты связывания LOX и способствует ее локализации в ядре. Более того, возможно, p напрямую вовлечен в транслокацию лизилоксидазы из цитозоля в ядро клетки.

Необычную картину наблюдали при коэкспрессии GFP р66 c ppLOX (полноразмерная молекула лизилоксидазы, содержащая сигнальный пептид для внеклеточной секреции, пропептидный домен и каталитический домен). В этом случае происходила аномальная локализация р66 в цитоплазматическом компартменте (рис. 16), причем в строгой колокализации с лизилоксидазой. Такое поведение строго ядерного белка, вероятно, объясняется его заякореванием на внутриклеточных мембранах за счет взаимодействия с оверэкспрессированной, содержащей сигнальный пептид лизилоксидазой (так как из-за большого количества экзогенной лизилоксидазы собственные протеолитические системы клетки не справляются с отщеплением сигнального пептида).

Рис. 16. Исследование локализации GFPp66 и ррLOX при их совместной оверэкспрессии в клетках линии HeLa. GFPp66 колокализуется с препроферментом лизилоксидазы (ppLOX) в цитозоле. Такая локализация белка сильно отличается от характерной для него ядерной локализации. В отличие от GFPp66 белок GFP не меняет характерного для него равномерного распределения внутри клетки при его совместной продукции с ppLOX. Масштаб 10 мкм.

Таким образом, нам удалось продемонстрировать взаимодействие р66/LOX in vivo и показать, каким образом лизилоксидаза способна проникать в клеточное ядро.

Опираясь на полученные нами результаты, а также на литературные сведения, мы предложили следующую гипотезу о возможной функциональной активности взаимодействия р66/LOX в клетке. Как известно, белок репрессор транскрипции p66 является постоянным компонентом нуклеосом-ремоделирующего комплекса осуществляющего Mi-2/NuRD, репрессию генов, в частности, вовлеченного в репрессию гена белка клеточной адгезии кадгерина-Е. Mi-2/NuRD связывается с хроматином благодаря способности одного из компонентов этого комплекса – белка MBD2 распознавать и связывать метилированные СрG-островки. В то же время p66 за счет своего CR2 функционального домена участвует в связывании гистонов Н3 и Н4. Таким образом, происходит одновременная «фиксация» нуклеосом-ремоделирующего комплекса как на ДНК, так и на гистоновых корах. Так как NuRD не способен связываться с метилированным Н3К4, для сборки репрессорного комплекса необходимо деметилирование этого гистона. В настоящее время показана способность лизилоксидаз (по крайней мере, LOXL2) окислять триметилированный по остатку лизина 4 гистон Н3 [Herranz et al 2012]. Так как мы показали, что p66 за счет своего CR2 функционального домена участвует в формировании комплекса с каталитическим доменом лизилоксидазы и определяет ее ядерный транспорт и локализацию в ядерных структурах, мы предположили, что это взаимодействие вовлечено в лизилоксидаза опосредованное деметилирование H3K4, способствующее сборке Mi2/NuRD репрессорного комплекса на нужных сайтах хроматина.

3.5. Исследование ядерного транспорта белка ТТС4 в клетке В рамках интерактомных исследований часть работы мы посвятили изучению ядерного транспорта белка ТТС4 (tetratricopeptide repeat domain protein 4). Этот белок является потенциальным онкосупрессором, вовлеченным в трансформацию меланоцитов, но в целом изучен слабо. Для нас особый интерес представляет его взаимодействие с хампином, который может быть ассоциирован с фактором RASSF1C и ГТФазой Ras. В свою очередь, взаимодействие Ras, этого важнейшего сигнального белка, - через SOS2 – с LOX (рис. 11) может быть объяснением «парадоксальной» онкосупрессорной активности LOX в ras трансформированных клетках.

Сверхпродуцированный белок ТТС4 локализуется исключительно в цитоплазме клетки, вне клеточных ядер. Однако такая локализация эндогенного белка не характерна для эндогенного ТТС4, обладающего либо строго ядерной локализацией, или локализующегося одновременно в цитоплазме и ядре. Поведение сверхпродуцированного белка можно объяснить либо нехваткой нативных белковых партнеров ТТС4, в норме взаимодействующих с ним и определяющих его транспорт в ядро из цитоплазмы, либо неспособностью системы ядерного транспорта белков «справляться» с обилием сверхпродуцированного ТТС4 в клетке. В асинхронной культуре клеток эндогенный ТТС4, идентифицированный специфическими антителами, имел различный характер локализации:

от строгой локализации в ядрах клеток до диффузного распределения по всей клетке. Мы предположили, что характер локализации эндогенного белка зависит от стадии клеточного цикла. Для подтверждения этой гипотезы нами был поставлен эксперимент по синхронизации клеток с последующим иммуцитонохимическим анализом локализации ТТС (данные не приведены). Клетки в той или иной стадии клеточного цикла фиксировали и подвергали иммуноцитохимии с использованием поликлональных кроличьих антител к ТТС4, полученных ранее в нашей лаборатории. Иммуноцитохимический анализ показал, что в G0 фазе ТТС4 обладает ядерно-цитоплазматической локализацией. При индукции клеточного цикла ТТС4 из цитоплазмы постепенно транслоцируется в ядро и в G1 фазеимеет наиболее выраженный ядерный характер локализации. Позднее, уже в G2 фазе, белок снова начинает появляться в цитоплазме. Таким образом, ТТС4 имеет динамический характер локализации, зависящий от стадии клеточного цикла.

Существует несколько возможных объяснений появлению цитоплазматического ТТС4 в фазе: блокада ядерного транспорта этого белка, взаимодействие его с G цитоплазматическим партнером или деградация ядерного пула ТТС4. Мы предположили, что данный феномен может возникать преимущественно благодаря ядерному экспорту белка ТТС4, так как его динамика в клетке сильно напоминает поведение ядерных белков, имеющих сигнал ядерного экспорта. Ориентируясь на данные анализа присутствия возможных NES в последовательности ТТС4 и учитывая структурные особенности белка, мы создали конструкции, кодирующие четыре перекрывающихся фрагмента последовательности белка ТТС4 мыши находящихся в одной рамке считывания с флуоресцентными белками: два участка, содержащих последовательность TPR-мотива (1 185, 79-386), последовательность TPR-мотива (79-185) и С-концевую последовательность ТТС4 (185-386). Клетки линии HEK293T трансфецировали одной из конструкций, кодирующей фрагмент последовательности ТТС4, и через 18 часов анализировали локализацию флуоресцентного продукта in vivo. Как видно на рис. 17, только фрагмент 1- обладал характерной для полноразмерного ТТС4 цитоплазматической внеядерной локализацией, не зависящей от положения флуоресцентного белка с N- (конструкция GFP1 185) или с С-конца (конструкция 1-185RFP) последовательности. В то же время для всех других фрагментов, в том числе и содержащих TPR-мотив, было характерно равномерное распределение между ядром и цитоплазмой. Такое поведение описано для белков GFP и RFP, не обладающих высокой молекулярной массой и не имеющих сигналов ядерного экспорта, способных свободно проникать через ядерные поры. Так как TPR-мотив (79-185) никак не влиял на ядерное распределение GFP79-185 и GFP79-386 в клетке, мы предположили, что возможный сигнал ядерного экспорта содержит последовательность 1- ТТС4.

Мы предположили, что белок ТТС4 способен транспортироваться в ядро в комплексе с его ядерным белком-партнером хампином (гомолог MSL1 Drosophila melanogaster), ранее идентифицированным в нашей лаборатории [Dmitriev et al., 2007]. Чтобы проверить это предположение, мы трансфецировали клетки фибробластов мыши конструкцией ТТС4RFP совместно с конструкцией, кодирующей хампин, содержащий на С-конце белковой молекулы GFP, и проводили анализ локализации белков в живых клетках (рис. 18). Нами было показано, что при совместной экспрессии ТТС4 с хампином происходит накопление ТТС4 в ядрах клеток и его локализация в точечных структурах. В отличие от хампина, другой ядерный белок - DNMT1 - при совместной с ТТС4 продукцией не влиял на клеточную локализацию последнего.

Рис. 17. Картирование фрагмента белка ТТС4, отвечающего за ядерный экспорт белка. Клетки линии НЕК293Т трансфецировали плазмидными конструкциями, кодирующими различные участки полипептидной цепи ТТС4 в рамке с GFP (GFP1-185, GFP79-185, GFP79-386, GFP185-386) или RFP (RFP1-185). Через часов наблюдали флуоресценцию белков в живых клетках. Характерную для полноразмерного ТТС локализацию проявляют только белки GFP1-185 и 1-185FRP.

Рис. 18. Исследование ядерного транспорта белка TTC4RFP в присутствии оверпродуцированных ядерных белков GFPDNMT1 и GFPhampin. Клетки фибробластов трансфецировали плазмидными конструкциями TTC4RFP и GFPhampin или GFPDNMT1. Через 18 часов после трансфекции анализировали локализацию оверпродуцированного белка ТТС4 in vivo. При совместной продукции ТТС4 и DNMT1 белок ТТС4 не транспортируется в ядро и локализуется строго в цитоплазме клеток. При коэкспрессии ТТС4 и хампина белок ТТС4 транспортируется из цитоплазмы в ядро, где происходит его накопление в точечных структурах.

Масштаб 50 мкм.

ВЫВОДЫ Получены бактериальные и дрожжевые продуценты рекомбинантного 1.

каталитического домена лизилоксидазы. Использование дрожжевого продуцента позволяет получить препарат растворимой лизилоксидазы. Оптимизирован процесс рефолдинга денатурированного очищенного каталитического домена лизилоксидазы, продуцированного в E. coli.

Впервые измерен кинетический изотопный эффект с использованием нативных 2.

субстратов лизилоксидазы: лизина и лизин-содержащего пептида.

Проанализирована локализация эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных 3.

культурах и тканях. Показано, что в культивируемых клетках лизилоксидаза имеет преимущественно ядерную локализацию, в то время как в тканях наблюдается либо внеклеточная, либо цитозольная локализация. Лизилоксидаза впервые детектирована в зрелых тромбоцитах и лимфоцитах.

С использованием различных методологических подходов (дрожжевой двугибридной 4.

системы и «молекулярного фишинга») детектированы неизвестные ранее партнеры лизилоксидазы. Показано, что глицеральдегидфосфатдегидрогеназа – новый субстрат лизилоксидазы. Ядерные резиденты и 2G4 являются возможными MDC1, p внутриядерными интеракторами лизилоксидазы. С использованием полученных результатов и литературных данных составлена интерактомная карта лизилоксидазы.

Независимыми методами показано взаимодействие р66/LOX in vivo и in vitro. Данное 5.

взаимодействие осуществляется CR2-доменом белка р66 и каталитическим доменом лизилоксидазы. Белок р66 определяет локализацию зрелой формы лизилоксидазы в ядре.

Исследована зависимость локализации белка ТТС4 от стадии клеточного цикла.

6.

Фрагмент белка с координатами 1-185 а.о. содержит предполагаемый сигнал ядерного экспорта белка ТТС4. Совместная продукция белка ТТС4 и хампина приводит к транспорту ТТС4 в ядро и его колокализации с белком хампином.

Список сокращений:

LOX – лизилоксидаза mLOX – зрелая форма лизилоксидазы ppLOX – полноразмерная лизилоксидаза, включающая сигнальный пептид и пропептидный домен LOPP – пропептидный домен лизилоксидазы LOXL – лизилоксидаза-подобные белки SSAO –семикарбазид-чувствительная аминоксидаза GAPDH – глицеральдегидфосфатдегидрогеназа TTC4 – tetratricopeptide repeat domain protein RFP – красный флуоресцентный белок GFP – зеленый флуоресцентный белок Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Dmitriev R.I., Okkelman I.A., Shakhparonov M.I., Abdulin R.A., Pestov N.B. (2009) Nuclear transport of protein TTC4 depends on the cell cycle. Cell Tissue Res. 336: 521–527.

2. Pestov N.B., Okkelman I.A., Shmanai V.V., Hurski A.L., Giaccia A.J., Shchepinov M.S.

(2011) Control of lysyl oxidase activity through site-specific deuteration of lysine. Bioorg. Med.

Chem. Lett., 21: 255–258.

Тезисы конференций:

1. Pestov N., Dmitriev R., Okkelman I., Shakhparonov M. (2008) Hampin/MSL1 regulates nuclear transport of putative tumor suppressor TTC4. Mol. Biol. Cell, 19 (suppl), abstract #2779/B493. (The 48th Annual Meeting of The American Society for Cell Biology, Dec 13-17, 2008, San Francisco, USA).

2. Okkelman I.A., Pestov N.B. (2009) Identification of new proteins that interact with lysyl oxidase. (The IInd Cancer Proteomics Conference, June 8-11, 2009, Dublin, Ireland).

3. Okkelman I.A., Pestov N.B., Fedotova A.S. (2010) Differential intracellular localization of lysyl oxidase in vitro and in vivo. FASEB J. 2010, 24: 816.1 (Experimental Biology Annual Meeting, April 24 - 28, 2010, Anaheim/OC, USA).

4. Okkelman I.A., Pestov N.B. (2011) GAPDH is a putative intracellular lysyl oxidase interactor. Protein Sci. 20: Suppl. 1, 166 (The 25th Anniversary Symposium of the Protein Society, July 23-27, 2011, Boston, USA).

Оккельман И.А. (2011) Поиск белков-партнеров лизилоксидазы в системе 5.

двугибридного скрининга. (Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», 14-17 ноября, Москва – Пущино).

6. Okkelman I.A., Pestov N.B. (2012) Transcription repressor p66 is putative intranuclear lysyl oxidase interactor. (15th Congress on Amine oxidases, July 15-18, 2012, Toulouse, France).

Pestov N.B., Okkelman I.A. (2012) Tissue-specificity of -aminopropionitrile oxidase in the 7.

rat. (15th Congress on Amine oxidases, July 15-18, 2012, Toulouse, France).