Рекомбинантные фрагменты альфа фетопротеина человека для создания лекарств адресной доставки
На правах рукописи
Шарапова Ольга Андреевна РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФРАГМЕНТЫ АЛЬФА ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ Специальность 03.01.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2012 г.
Работа выполнена в лаборатории биохимии Курчатовского центра нано-, бионаук, информа ционных и конвергентных технологий с источниками синхротронного излучения и нейтро нов и социогуманитарных наук Национального Исследовательского Центра Курчатовский Институт Научные руководители: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Северин Евгений Сергеевич доктор биологических наук Федоров Алексей Николаевич
Официальные оппоненты: Долгих Дмитрий Александрович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, руководитель подразделения Лунин Владимир Глебович доктор биологических наук, Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалея Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов
Защита состоится «14» июня 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук;
119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН;
119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.
Автореферат разослан « » _ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский Александр Федорович
Общая характеристика работы
Широко применяемым методом в противоопухолевой терапии является химиотера пия. Эффективность химиопрепаратов обеспечивается тем, что все они, в силу природы сво его действия, особенно эффективно убивают активно делящиеся и метаболизирующие клет ки. К сожалению, помимо опухолевых клеток, такими же характеристиками в норме облада ют клетки костного мозга, желудочно-кишечного тракта и волосяных фолликул (Альбертс Б.
и др., 1993). Как следствие, весь спектр побочных эффектов от химиотерапии связан с воз действием препарата на нормальные активно делящиеся клетки организма.
Одним из перспективных способов повышения эффективности химиопрепаратов яв ляется их адресная доставка к опухолевым клеткам. Суть метода состоит в том, что химиоп репарат пришивается к векторной молекуле, которая обеспечивает доставку лекарства к оп ределенному виду клеток. Адресность доставки обеспечивается за счет специфических, ха рактерных только для клеток мишеней молекул на их поверхности. В связи с этим в качестве векторной молекулы могут быть использованы моноклональные антитела (МоАТ), получен ные к какой-либо молекуле на поверхности клетки мишени, либо белки, рецепторы которых должны присутствовать на поверхности клеток мишеней.
Одним из перспективных кандидатов, способных обеспечить адресность доставки ле карства является альфа-фетопротеин человека (АФП). АФП является белком, характерным для эмбрионального периода развития человека (Bergstrand C.G., Czar B., 1956). В постэм бриональный период развития этот белок начинает синтезироваться только в процессе кан церогенеза (Abelev G.I., 1971, Gillespie J.R., Uversky V.N., 2000). АФП проникает в клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза (Villacampa M.J. et al., 1984). Рецептор АФП (РАФП) так же является онкофетальным белком, т.е. в постэмбриональный период раз вития экспрессируется только на поверхности опухолевых клеток (Geuskens M. et al., 1991, Ницветов М.Б. и др., 2005). Этот факт позволяет использовать АФП как векторную молекулу для адресной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам. Показано, что конъюгаты природного АФП с цитостатиками ингибировали рост опухолевых клеток in vitro и in vivo (Ницветов М.Б., 2001, Severin S.E. et al., 1997, Северин С.Е. и др., 1999).
Использование природного АФП ограничено техническими и этическими причинами, так как его единственным источником является абортивный материал. По этой причине не обходимо использовать его рекомбинантные формы. Известно, что участок связывания с ре цептором находится в С-концевом домене, поэтому для целей адресной доставки является оптимальным использование рекомбинантных белковых фрагментов на основе С-концевого домена АФП (Mizejewski G.J., 2001).
Одной из главных проблем при использовании рекомбинантных белков является их получение в функциональной форме. В большинстве случаев, при продукции белков в боль ших количествах в бактериальной системе, они формируют в клетках так называемые тельца включения (ТВ), которые состоят из белка в агрегированном состоянии (Bowden G.A. et al., 2006, Ventura S., Villaverde A., 2006). Для получения функционально активного белка необ ходимо проводить процедуру его ренатурации. К сожалению, не существует универсальных и эффективных методик ренатурации. Это ограничивает круг рекомбинантных белков, ис пользуемых в производстве и научных исследованиях. Для гидрофобных белков с большим количеством дисульфидных связей эта проблема является особенно сложной. Именно таки ми характеристиками обладает С-концевой домен АФП. Разработка эффективной методики его ренатурации является основной трудностью при получении его в функциональной фор ме. Решение этой проблемы носит не только частный характер. Разработка, на примере АФП, общей методики ренатурации, подходящей для схожих по свойствам белков, позволит суще ственно расширить круг белков, получаемых с помощью рекомбинантных технологий в бак териальных системах экспрессии. В отношении АФП это позволит получать функциональ ный белок в достаточных количествах для создания его конъюгатов с цитостатиками, что са мо по себе также является сложной задачей.
Цель и задачи работы. Целью данной работы был отбор оптимальных фрагментов АФП для адресной доставки цитостатиков в опухолевые клетки, их эффективное получение и создание на их основе конъюгатов с модельными цитостатиками. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Отбор фрагментов АФП для адресной доставки цитостатиков в опухолевые клет ки. Клонирование фрагментов и экспрессия с высокой эффективностью в бактериальной сис теме экспрессии.
2. Создание высокоэффективной методики выделения и получения функционально активного рекомбинантного фрагмента АФП.
3. Сравнительный физико-химический и функциональный анализ фрагментов АФП.
4. Получение конъюгата фрагмента АФП с отобранным цитостатиком. Проверка функциональной активности полученного конъюгата.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Два фрагмента АФП с 404 по 595 (rAFP3D595) и с 404 по 609 (rAFP3D 609) а.о.
полноразмерного белка были клонированы и экспрессированы в виде телец включения в клетках E.coli с высокой эффективностью.
2. Отработана эффективная методика выделения и очистки белков и их ренатурация методом разбавления. Проведен сравнительный анализ эффективности процедур выделения и ренатурации разных фрагментов АФП.
3. Показано сходство исследованных физико-химических свойств ренатурированных рекомбинантных фрагментов и природного АФП.
4. На примере фрагмента АФП показана возможность эффективного способа ренату рации иммобилизованного на смоле гидрофобного, содержащего большое количество S-S связей белка.
5. Флуоресцентно меченный рекомбинантный фрагмент АФП in vitro проникал в опухолевые клетки, так же как и природный полноразмерный АФП. При этом в нормальные клетки он не проникал.
6. Получен конъюгат рекомбинантного фрагмента АФП с ципрофлоксацином, кото рый подавлял рост опухолевых клеток in vitro в концентрациях по ципрофлоксацину значи тельно меньших, чем свободный цитостатик.
Научная новизна и практическая ценность работы. На основании анализа первич ной структуры АФП и его модели пространственной структуры был отобран С-концевой до мен белка, соответствующий третьему домену. Были клонированы и экспрессированы два варианта С-концевого фрагмента АФП в клетках E. coli: с 404 по 595 а.о. (аминокислотных остатка) (rAFP3D595) и с 404 по 609 а.о. (rAFP3D 609) полноразмерного белка. Белки экс прессировались в виде ТВ, т.е. в денатурированной форме.
Была отработана методика ренатурации с помощью быстрого разбавления в большом избытке ренатурирующего буфера. Выход белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%.
В качестве альтернативного метода ренатурации была выбрана ренатурация иммоби лизованного на смоле белка. Для ренатурации рекомбинантных фрагментов АФП была ис пользована металло-аффинная Ni-смола. Было показано, что выход ренатурированного белка сильно зависел от химической природы основы смолы: при переходе от агарозных основа ний к оксиду кремния выход ренатурированного белка возрастал значительно. Выход рена турированного белка составил порядка 100% с чистотой не менее 98%.
При разработке методик ренатурации фрагментов особое внимание уделялось не только эффективности процедуры, но и ее продуктивности, т.е. потраченным времени и ма териалам на единицу ренатурированного белка. При сравнении этих характеристик ренату рация на смоле была значительно более продуктивна, чем ренатурация разбавлением.
Созданная методика ренатурации иммобилизованного белка на смоле на основе окси да кремния впервые обеспечила высокоэффективную ренатурацию сложного для сворачива ния белка. Разработанный подход позволит расширить спектр рекомбинантных белков, ис пользуемых в научных исследованиях и в промышленном производстве.
Было показано, что фрагменты rAFP3D595 и rAFP3D609 in vitro проникали в клетки, несущие РАФП, также как и природный АФП. При этом в нормальные клетки организма они не проникали.
Была разработана методика получения конъюгата фрагмента АФП с ципрофлоксаци ном, который in vitro подавлял рост опухолевых клеток в концентрациях на порядок меньше чем для свободного ципрофлоксацина и не влиял на рост нормальных клеток.
Полученные данные свидетельствуют о том, что С-концевой фрагмент АФП может быть использован в качестве векторной молекулы для адресной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам. Создание лекарств на его основе будет способствовать значительному повышению эффективности применяемых химиопрепаратов и позволит начать использовать новые не применявшиеся ранее.
Апробация работы Результаты работы были доложены на заседании ученого совета МНИИМЭ;
на засе дании ученого совета НБИКС-центра;
на 12-ой Международной Пущинской Школе Конференции Молодых Ученых в 2008 г.;
на 16-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» в 2008 г. (Москва);
на 3-ей Научно практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» в 2009 г. (Моск ва);
на 9-ой Курчатовской молодежной научной школе в 2011 г. (Москва).
Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 4 статьи, 4 тезиса со общений и 3 российских патента.
Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материа лов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка ци тируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах печатного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 4 таблицами. Список цитированной литературы содержит 218 наименований.
Содержание работы Обзор литературы В обзоре литературы приведены данные о структуре и свойствах альфа-фетопротеина человека (АФП) как одного из центральных онкофетальных белков человека. Изложена про блема ренатурации рекомбинантных белков, как одна из лимитирующих стадий при получе нии их в функциональной форме. Кратко изложены проблемы терапии злокачественных но вообразований и современные способы их лечения.
Материалы и методы Создание плазмиды для синтеза вариантов С-концевого домена АФП в E. coli Последовательность, кодирующая С-концевой домен АФП, с помощью точечного му тагенеза была оптимизирован для синтеза в бактериальной системе. На 3' конце нуклеотид ной последовательности были внесены нуклеотиды, кодирующие последовательность из Гис. Два варианта С-концевого домена белка: с 404 по 595 а.о. (rAFP3D595), либо с 404 по 609 а.о. (rAFP3D609) полноразмерного белка – были клонированы в модифицированную плазмиду pET11c.
Синтез фрагментов АФП Полученной плазмидой, содержащей один из двух вариантов С-концевого домена АФП, трансформировали клетки E. coli штамма BL21 (DE3). Синтез белка проводили двумя методами: 1. индуцировали добавлением ИПТГ;
2. синтез методом автоиндукции. В обоих случаях белок синтезировался в виде телец включения.
Выделение и очистка фрагментов АФП Процедура очистки белка заключалась в отмывке телец включения от не белковых примесей и дальнейшее максимальное растворение белка из телец включения в денатури рующих условиях (0.05 M Na3BO3 pH 8.6, 8 M мочевина, 12 мМ –меркаптоэтанол). Не рас творившийся материал отделяли с помощью центрифугирования. Растворенный белок в де натурирующих условиях очищали с помощью металло-аффинной хроматографии на Ni смоле.
Ренатурация фрагментов АФП разбавлением Ренатурацию очищенных фрагментов АФП (в конечной концентрации 0.01-0. мг/мл) проводили быстрым разбавлением в 100-кратном избытке ренатурирующего буфера, обладающего окислительно-восстановительным потенциалом за счет содержания окисленно го и восстановленного глутатионов (ФСБ pH 8.0, 5 мМ глутатион восстановленный, 1 мМ глутатион окисленный). При необходимости белок после ренатурации концентрировали на Ni-смоле, либо в концентрационной ячейке.
Ренатурация иммобилизованных фрагментов АФП При ренатурации на смоле фрагменты rAFP3D595 и rAFP3D609, выделенные из телец включения, наносили на металло-аффинную Ni-смолу на разной основе (агароза либо сили кагель) в денатурирующих условиях. Смолу с иммобилизованным белком смешивали с рена турирующим буфером, обладающим окислительно-восстановительным потенциалом и рена турировали в течение 4 часов на холоду. Ренатурированный белок элюировали и при необ ходимости диализовали для удаления имидазола.
Определение сульфгидрильных групп в ренатурированных фрагментах АФП Свободные сульфгидрильные группы в ренатурированном белке определяли по мето ду Эллмана (Ellman G.L., 1956).
Аналитическая хроматография Аналитическую хроматографию проводили на приборе Breeze (Waters). Анализ гомо генности препарата ренатурированного белка проводили с помощью гель-фильтрации на ко лонке Superose12 10/300 GL и хроматографии в обращенных фазах на колонке Symme try300 C4 5 µm 3.9x150 mm.
Круговой дихроизм (КД) Исследование вторичной структуры ренатурированного белка проводилось с исполь зованием спектроскопии КД на спектрополяриметре J-600 (Jasco) в диапазонах длин волн от 200 нм до 250 нм. Измерения проводились в 0.1 мм кювете при концентрации белка 0.41 мг/мл либо в 1 мм кювете при концентрации белка 0.03 мг/мл в ФСБ pH 7.4.
Конъюгирование фрагментов АФП с флуоресцентной меткой В качестве флуоресцентной метки использовали ФИТЦ. Реакцию проводили по инст рукции фирмы производителя. В обоих полученных конъюгатах rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ молярное соотношение ФИТЦ/белок составило ~2.1 к 1.
Клеточные линии В качестве клеток, несущих РАФП, использовали линию клеток карциномы яичника человека SKOV3. В качестве отрицательного контроля использовали лимфоциты перифери ческой крови здоровых добровольцев, выделенные с помощью центрифугирования крови че рез раствор фиколл-пак по методу Byum (Byum A., 1968).
Анализ связывания и эндоцитоза rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ в опухоле вых клетках и лимфоцитах Для анализа связывания конъюгаты белка в диапазоне концентраций 0-4000 нM до бавляли к суспензии клеток на холоду и инкубировали при +4оС в течение 1 ч. При исследо вании эндоцитоза инкубацию проводили при 37оС. После окончания инкубации клетки от мывали и фиксировали 2% параформальдегидом. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитометре EPICS-XL (Beckman Coulter). Флуоресценция возбуждалась аргоно вым лазером (длина волны возбуждения 488 нм, полоса пропускания 515-520 нм). В каждом образце (105 клеток) определяли среднее значение интенсивности флуоресценции.
Конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином Конъюгирование rAFP3D609 (концентрация ~ 1мг/мл) с ципрофлоксацином проводи ли с помощью карбодиимида EDC по методике производителя. Молярное соотношение rAFP3D609 к ципрофлоксацину в конъюгате составляло в среднем 1:1.
Анализ цитотоксической активности конъюгата rAFP3D с цитостатиком в опухо левых клетках и лимфоцитах Клетки линии SKOV3 и свежевыделенные лимфоциты за 1 сутки до эксперимента рассевали в плотности 5000-7000 клеток в лунку. Раствор ципрофлоксацина либо конъюгата добавляли к клеткам в диапазоне концентраций по ципрофлоксацину от 0 до 1000 мкМ. Ин кубировали клетки в стандартных условиях 72 ч, после чего определяли их выживаемость.
Для количественной оценки выживаемости клеток при инкубации в сере, содержащей цито токсический агент, использовали МТТ-тест (Mosmann T., 1983).
Статистическую достоверность полученных данных определяли, используя t критерий Стьюдента с помощью программного обеспечения Origin (OriginLab Corporation).
Как статистически значимый рассматривали уровень p0.05.
Основные результаты и их обсуждение Клонирование и синтез вариантов С-концевого домена АФП Идентичность первичных структур АФП и ЧСА составляет около 40%. На основании данных о пространственной структуре ЧСА построены теоретические модели пространст венной структуры АФП. Согласно этому моделированию, для работы были отобраны два варианта С-концевого домена АФП. Первый, соответствующий на пространственной модели структурному С-концевому домену - с 404 по 595 а.о. (rAFP3D595) и второй, дополнительно содержащий не структурированный С-конец белка, - с 404 по 609 а.о. (rAFP3D609) полно размерного белка.
Уровень синтеза С-концевого фрагмента АФП в клетках E. coli штамма BL21 (DE3) был очень низким ( 100 мкг/л культуры). Известно, что в первую очередь на уровень про дукции человеческих белков в бактериальных клетках влияет наличие редких кодонов, т.к.
наборы предпочтительных кодонов у человека и бактерий сильно различаются. Анализ нук леотидной последовательности, кодирующей С-концевой домен АФП, показал наличие не скольких кодонов, редких для E. coli, в частности, тандем редких кодонов аргинина AGG (Арг508 и Арг509). Для проверки того, зависел ли уровень синтеза белка от наличия в его последовательности редких кодонов, была проведена экспрессия в присутствии вспомога тельной плазмиды pLacIRARE, несущей набор тРНК к редким кодонам E. coli. Результаты эксперимента показали, что в данном случае уровень синтеза целевого белка резко возрос.
Таким образом, для эффективной продукции С-концевого домена АФП требуется либо вспо могательная плазмида, либо замена редких кодонов в гене.
Ранее было показано, что замена тандемов аргинина обеспечивает значитель ное увеличение уровня синтеза белков в бактериальной системе (Ivanov I. et al., 1992). С помощью точечного мутагенеза, указанный тандем AGG AGG был заменен на кодоны аргинина CGT CGC, оптималь ные для E. coli, клонирован и синтезирован в клетках E. coli. Уровень продукции при этом для обоих фрагментов составил не ме нее 150 мг белка с литра культуры (рис. 1).
Была проверена возможность продук Рис.1. Электрофоретический анализ (ДСН ПААГ электрофорез) экспрессии rAFP3D595 ции белка в системе с автоиндукцией. Суть в клетках E. coli BL21 (DE3). 1 – маркеры подхода состоит в использовании сред роста, молекулярной массы (Fermentas);
2 – индук ция экспрессии исходного rAFP3D595;
3 – позволяющих достичь достаточно высоких индукция экспрессии исходного rAFP3D595 в присутствии pLacIRARE;
4 – индукция экс- плотностей культуры клеток при наращива прессии rAFP3D595 с замененным тандемом нии (Studier F.W., 2006). Кроме этого, среды кодонов аргинина;
5 – клетки до индукции.
Индукцию проводили в течение 3 часов при роста подбираются таким образом, что при 37С с использованием 0.4 мМ ИПТГ. Стрел ками отмечены полосы, соответствующие начальном наращивании до высоких плотно фрагменту rAFP3D595. На дорожку нанесен стей lac-промотор, индуцирующий синтез Т эквивалент 17 мкл культуры клеток полимеразы (а значит и синтез целевого бел ка), находится в репрессированном состоянии. На поздних же стадиях роста lac-промотор индуцируется под воздействием лактозы, входящей в состав сред. Таким образом, данная система позволяет исключить добавление дорогостоящего индуктора синтеза (ИПТГ), кроме этого, процесс автоиндукции не требует контроля за ростом культуры с целью определения времени добавления индуктора синтеза. В процессе работы были проверены различные ус ловия автоиндукции. Наилучший результат был получен при выращивании в среде TB при 37С. Индукция белка начиналась после 4.5 часов роста при оптической плотность 6.5 о.е.
Рост останавливали через 27 часов роста при оптической плотности около 12 о.е. Выход це левого белка для обоих фрагментов составил не менее 200-250 мг с литра культуры.
Ренатурация рекомбинантных фрагментов АФП разбавлением Так как оба фрагмента АФП синтезировались в виде телец включения, то для полу чения функционального белка необходимо было восстановить их третичную структуру.
Сложность задачи по подбору условий ренатурации заключалась в том, что в С-концевом домене АФП содержится 12 цистеинов, которые при переводе белка в неденатурирующие условия могут образовывать межмолекулярные дисульфидные связи. Это, в свою очередь, способствует формированию сначала растворимых, а затем и нерастворимых агрегатов и, как следствие, значительно снижает выход мономерного ренатурированного белка на этой стадии.
Основной задачей при ренатурации является сведение к минимуму межмолекулярных контактов белковых молекул в ходе сворачивания. В связи с этим ренатурацию чаще всего проводят при очень низких концентрациях белка, не более 0.05 мг/мл (Jaenicke R., Rudolph R., 1989). Одним из широко применяемых способов ренатурации белков является их быстрое разведение в большом избытке ренатурирующего буфера и последующей длительной инку бацией. С помощью этого метода удалось ренатурировать оба фрагмента АФП с выходом ренатурированного белка не менее 80% с чистотой порядка 90%. В дальнейшем белок кон центрировали на Ni-смоле, что повышало его чистоту, но, к сожалению, уменьшало итого вый выход белка, который составил не менее 52% с чистотой 95%. Для сравнения эффектив ности отработанной нами методики можно привести результаты по ренатурации полнораз мерного АФП, так как подобные работы для С-концевого фрагмента никем ранее не прово дились. В работе Boismenu et al при выделении и ренатурации рекомбинантного полнораз мерного АФП выход составил 14% с чистотой белка 91% (Boismenu R., 1997).
Ренатурация фрагментов АФП на твердой фазе Сведение к минимуму контактов между белковыми молекулами в процессе ренатура ции может быть достигнуто не только посредством низкой концентрации белка, но и за счет иммобилизации белковых молекул на твердой фазе. Для этого была использована Ni-смола, на которой белок иммобилизовался за счет тага из 7 остатков гистидина на его С-конце. Та кой способ иммобилизации, по нашему мнению, одновременно позволяет белковой молекуле быть отделенной от других молекул, но при этом полипептидная цепь не ограничена в дви жении и может флуктуировать в процессе ренатурации.
Первоначально для ренатурации нами была использована Ni-смола на основе агарозы, которую мы использовали для очистки белка в денатурирующих условиях. К сожалению, по сле ренатурации белок не элюировался со смолы высокими концентрациями имидазола ни в нативных буферах, ни в растворах с добавлением денатурирующих агентов. Исходя из этого, можно заключить, что в процессе ренатурации молекулы белка необратимо связываются с углеводной матрицей смолы – агарозой.
Другим широко используемым носителем в качестве основы для смол может служить силикагель. По сравнению с агарозой, силикагель является химически инертным материа лом. Поэтому была использована Ni-смола на основе силикагеля HisLink и проведена проце дура ренатурации в условиях аналогичных для ренатурации разбавлением.
Белок в концентрации 1 мг/мл ренатурировали на смоле в течение 1 - 24 ч. Наилуч ший выход ренатурированного белка составил 100% после 4 ч инкубации. Чистота ренатури рованного белка составила не менее 98%. По результатам ДДС-ПААГ электрофореза при на несении 1 мг белка весь материал связывался со смолой. В элюции после ренатурации анализ показывал наличие порядка 1 мг белка. Незначительные потери фрагментов АФП происхо дили в результате необратимого связывания со смолой в процессе ренатурации.
Принято считать, что при ренатурации белка на смоле, упакованной в колонку, уве личение количества наносимого белка коррелирует с уменьшением выхода ренатурации из за большей агрегации белковых молекул (Stempfer G. et al., 1996). Причиной этого может быть неравномерное распределение белковых молекул по колонке в процессе нанесения. Ло кальное повышение концентрации белка в какой-либо части колонки может способствовать агрегации при переводе в ренатурирующие условия и тем самым уменьшать выход ренату рированного белка (Chen Y., Leong S.S.J., 2009). При изучении влияния количества нанесен ного rAFP3D609 в диапазоне концентраций 0.5-10.0 мг/мл на выход ренатурации было пока зано, что выход белка не зависел от количества нанесенного белка в указанном диапазоне концентраций. Такой результат можно объяснить тем, что при взаимодействии белка со смолой в пробирке его распределение происходит более равномерно, чем при нанесении на смолу, упакованную в колонку. Как следствие, выход ренатурации не зависел от количества нанесенного белка.
Для сравнения разных способов ренатурации rAFP3D609 был проведен контрольный эксперимент по ренатурации одного и того же количества белка (1 мг) разными способами.
Основные различия разработанных методик ренатурации заключались в необходимом времени ренатурации и количестве ренатурирующего буфера. Поэтому с точки зрения прак тического получения белка более адекватным будет сравнение продуктивности ренатурации, которая определялась по уравнению:
YM P (1) Vt 100 % где P – продуктивность ренатурации (мг мл-1 ч-1), Y – выход ренатурированного белка (%), M – исходное количество белка, взятого для ренатурации (мг), V – объем ренатурирующего бу фера (мл), t – время ренатурации (ч).
Таблица. Сравнение экспериментальных параметров ренатурации на смоле и ренатурации раз бавлением.
Экспериментальный параметр Смола Разбавление Исходное количество белка, мг 1 Объем ренатурирующего буфера, мл 10 Время ренатурации, ч 4 Концентрация белка при ренатурации, мг/мл 0.1 0. Выход ренатурированного белка, %* 100 Чистота ренатурированного белка, %* 98 Продуктивность ренатурации (мг мл-1 ч-1) 2,5х10-2 1х10- * Определяли денситометрией электрофореграмм с помощью программы OnedScan (“Stratagen”, США).
Рассчитанная по данной формуле продуктивность для ренатурации разбавлением со ставила 1х10-4 мг мл-1 ч-1, для ренатурации на твердой фазе – 2.5х10-2 мг мл-1 ч-1. Значитель ное превосходство продуктивности ренатурации на твердой фазе по сравнению с ренатура цией разбавлением связано с меньшим временем инкубации и меньшим объемом ренатури рующего буфера. При этом чистота белка после ренатурации на твердой фазе (98%) была выше, чем при ренатурации разбавлением (80%) (таблица). Одним из недостатков методики ренатурации на Ni-смоле является необходимость удалять имидазол, который используется для элюции, из образца белка. Эта процедура может быть осуществлена с помощью гель фильтрации. Однако, некоторые гидрофобные белки, в частности фрагменты АФП, в ренату рированном состоянии при обессоливании связываются со смолой, что значительно влияет на конечный выход белка. Избежать этого можно за счет того, что белок с Ni-смолы может быть элюирован в достаточно высокой концентрации. При разведении его до рабочих кон центраций сниженная концентрация имидазола уже не влияет на функциональные свойства белка.
При проведении процедур по ренатурации С-концевого фрагмента АФП было отме чено, что ренатурированный фрагмент rAFP3D609 более устойчив в растворе по сравнению с rAFP3D595.
Физико-химический анализ ренатурированных фрагментов АФП Идентичность полученного фрагмента АФП была подтверждена методом масс спектрометрического анализа и N-концевым секвенированием белка.
А Б Рис. 2. Гель-фильтрация ренатурированных rAFP3D595 (А) и rAFP3D609 (Б). Скорость потока 1 мл/мин, оптическую плотность измеряли при 280 нм.
Гель-фильтрация обоих фрагментов выявила один пик. Рассчитанный по времени вы хода молекулярный вес С-концевого фрагмента АФП, используя калибровку со стандартами, составил ~25 кДа, что близко к теоретическому молекулярному весу этого полипептида в форме мономера. Высокомолекулярные формы и агрегаты отсутствовали в детектируемых количествах (рис. 2, А и Б). При проведении хроматографии в обращенных фазах в препара те детектировался только один пик с максимумом выхода около 48% ацетонитрила и отсут ствие других детектируемых белко вых пиков (рис. 3, А и Б). Это под А тверждает гомогенность выделенно го препарата белка.
Как уже упоминалось выше, в аминокислотной последовательности фрагментов АФП присутствует цистеинов, которые участвуют в об Б разовании 6 дисульфидных связей.
Отсутствие в препарате ренатуриро ванных белков свободных сульфгид рильных групп (определяли по мето ду Эллмана) наряду с подавляющим преобладанием мономерной формы Рис. 3. Обратно-фазовая хроматография ренатуриро ванных rAFP3D595 (А) и rAFP3D609 (Б). Оптическую белка (по данным гель-фильтрации) плотность измеряли при 214 (а) и 280 (б) нм. Хромато служило одним из косвенных доказа графию осуществляли в линейном градиенте ацетонит рила (0-100%, 60 мин) с добавлением 0.1% трифторук тельств того, что полученные белки сусной кислоты при скорости потока 0.5 мл/мин.
образовали правильную конформа цию в ходе ренатурации.
Пространственная структура АФП до сих пор не определена. Так как АФП является гомологом ЧСА, принято считать, что их пространственные структуры близки. Исходя из этого предполагается, что АФП является белком с вторичной структурой, состоящей пре имущественно из -спиралей. В литературе описан анализ вторичной структуры нативного АФП методом кругового дихроизма (Leong S.S.J., Middelberg A.P., 2007, Parker M.H. et al., 2004). Профили кругового дихроизма нативного белка и его рекомбинантной формы после процедуры ренатурации схожи и имеют выраженные пики поглощения на 190, 208 и 222 нм, соответствующие, как указывают авторы, преимущественно -спиральной структуре.
В результате исследования вторичной структуры ренатурированных rAFP3D595 и rAFP3D609 с использованием спектроскопии КД и диапазонах длин волн от 200 до 250 нм было выявлено, что оба белка имеют ярко выраженные пики поглощения на 190, 208 и нм (рис. 4, А и Б). Это согласуется с наличием преимущественно -спиральной структуры.
Интенсивности сигналов говорят о том, что белок очень хорошо структурирован. Общий профиль эллиптичности, распределение основных пиков и их интенсивности, представлен ные для полноразмерного АФП в разных работах и полученные в нашей работе (рис. 4, В), соответствуют полученным нами данным для С-концевых фрагментов. Хотя сравнивать дан ные для полноразмерного белка и его части, одного из доменов, следует с осторожностью, можно заключить, что полученный нами целевой белок имеет структуру, близкую к таковой в нативном белке.
По результатам физико-химического анализа оба фрагмент rAFP3D595 и rAFP3D были идентичны.
Рис. 4. Спектры кругового дихроизма рена турированных фрагментов rAFP3D595 (А), rAFP3D609 (Б) и полноразмерного нативно го АФП (В) Анализ функциональных свойств рекомбинантных фрагментов АФП Накопление АФП в клетках происходит в результате рецептор-опосредованного эн доцитоза. Для подтверждения функциональности полученных нами фрагментов АФП мы провели работу по изучению специфического связывания и проникновения в клетки полу ченного белка. В качестве клеток, несущих рецепторы к АФП, использовали клетки карци номы яичника человека линии SKOV3. Контролем служили лимфоциты периферической крови здорового человека, не несущие рецепторов к АФП (Ницветов М.Б. и др., 2001). Для анализа использовали конъюгат фрагментов АФП с флуоресцентной меткой ФИТЦ (rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ).
При температуре +4°С белки связываются с соответствующими рецепторами на по верхности клеток, при их наличии, но не проникают внутрь, так как при такой температуре не происходит эндоцитоза. При физиологической температуре +37°С белки, связавшиеся с рецепторами, подвергаются эндоцитозу, т.е. проникают в клетки. Результаты эксперимента показаны на рисунке. Видно, что оба фрагмента эффективно связывались при +4°С с клет ками линии SKOV3, но не с лимфоцитами (рис. 5, А и Б, +4°С). Данный результат говорит о специфическом связывании rAFP3D595-ФИТЦ и rAFP3D609-ФИТЦ с рецепторами к АФП на поверхности клеток SKOV3. При +37°С (рис. 5, А и Б, +37°С) наблюдается высокий уро вень эндоцитоза конъюгатов в клетки SKOV3, в сравнении с этим эндоцитоз в лимфоциты шел на очень низком уровне.
А Рис.5. Связывание при +4°С и эндоци тоз при +37°С ФИТЦ-меченных rAFP3D595 (А) и rAFP3D609 (Б) с клетками карциномы яичника человека SKOV3 и лимфоци тами перифериче ской крови человека.
Б При инкубации клеток линии SKOV3 с конъюгатами в присутствии 30-кратного мо лярного избытка природного АФП, связывание обоих фрагментов значительно ингибирова лось природным АФП. Это свидетельствует о том, что полученные рекомбинантные ренату рированные фрагменты на основе С-концевого домена АФП на клетках связываются с теми же молекулами, что и природный АФП.
Химическое конъюгирование с ципрофлоксацином Ципрофлоксацин – синтетический антибиотик из группы фторхинолов II поколения.
Он подавляет рост бактерий за счет ингибирования ферментов, в частности топоизомераз, обеспечивающих расплетание ДНК для репликации и транскрипции. Из-за способности фторхинолов ингибировать топоизомеразу не только прокариотическую, но и эукариотиче скую, они рассматриваются как перспективные противоопухолевые химиопрепараты.
Для получения конъюгатов был отобран фрагмент rAFP3D609, так как он в ренатури рованном состоянии был более устойчив в растворе.
Конъюгирование rAFP3D609 и ципрофлоксацина осуществляли с помощью карбо диимида EDC. EDC активировал карбоксильную группу ципрофлоксацина, образовавшийся реакционно-способный интермедиат взаимодействовал с первичной аминогруппой на белке с образованием конъюгата rAFP3D609 с ципрофлоксацином – rAFP3D609-Cipro. Молярное соотношение rAFP3D609 к ципрофлоксацину в конъюгате составляло в среднем 1:1. Реакци онную смесь диализовали для удаления не прореагировавших продуктов реакции.
Цитотоксическая активность конъюгата rAFP3D609-Cipro Цитотоксическую активность препа рата выражали в единицах IC50 – молярная концентрация препарата, вызывающая ги бель 50% клеток. IC50 свободного ципроф локсацина для лимфоцитов составляла мкМ, для клеток SKOV3 – более 1000 мкМ.
IC50 конъюгата rAFP3D-Cipro (концентра цию измеряли по ципрофлоксацину) для клеток SKOV3 составляла 50 мкМ, на лим фоциты полученный конъюгат не оказывал цитотоксического действия в диапазоне ис Рис. 6. Выживаемость клеток линии SKOV3 и лимфоцитов периферической крови человека следуемых концентраций ципрофлоксацина после 3 ч инкубации с конъюгатом rAFP3D609 с ципрофлоксацином. (0-1000 мкМ) (рис. 6). Из результатов экс перимента видно, что в отношении опухо левых клеток ципрофлоксацин в форме конъюгата с фрагментом АФП оказывал свое цито статическое действие в концентрации в 20 раз ниже по сравнению со свободным цитостати ком. Таким образом, фрагмент АФП в конъюгате обеспечил более эффективную доставку ципрофлоксацина в опухолевые клетки, и конъюгирование не повлияло на биологические свойства ни белковой части, ни цитостатика.
Многообещающим результатом является то, что ципрофлоксацин в форме конъюгата с фрагментом АФП оказывал цитостатический эффект на опухолевые клетки в концентраци ях на порядок меньше по сравнению со свободным ципрофлоксацином и не оказывал цито статического эффекта на лимфоциты. Таким образом, отобранный рекомбинантный фраг мент АФП в форме конъюгата обеспечивал специфическую доставку цитостатика к опухоле вым клеткам in vitro.
Заключение Нуклеотидная последовательность, кодирующая третий домен АФП, была оптимизи рована для экспрессии в бактериальной системе. Были созданы две плазмиды для экспрессии двух фрагментов АФП на основе третьего домена. Уровень индукции белка составил от до 250 мг с литра культуры при разных способах индукции. Была разработана эффективная методика ренатурации белка методом разбавления, с итоговым выходом мономерной формы не менее 50% с чистотой 95%. Была разработана высокоэффективная методика ренатурации иммобилизованного на металло-хелатной смоле фрагмента АФП. Данный способ ренатура ции впервые применен с высокой эффективностью для гидрофобного белка с большим коли чеством дисульфидных связей. Использование смолы на основе силикагеля, вместо традици онно используемых агарозных смол, позволило значительно улучшить эффективность рена турации (от практически 0 до практически 100%). Выход ренатурированного белка составил не порядка 100% с чистотой 98%. Ренатурация белка на твердой фазе по продуктивности на два порядка превосходила ренатурацию методом разбавления. В экспериментах на клеточ ных культурах in vitro было показано, что по своим функциональным свойствам, т.е. способ ности связываться с рецептором на поверхности клеток и проникать внутрь, ренатурирован ные обоими способами фрагменты не уступали нативному полноразмерному АФП.
Была разработана методика конъюгирования фрагмента rAFP3D609 с ципрофлокса цином. IC50 ципрофлоксацина в форме конъюгата (50 мкМ) была в 20 раз меньше, чем для свободного цитостатика (1000 мкМ) по отношению к опухолевым клеткам. Таким образом, отобранный фрагмент АФП в форме конъюгата обеспечивал специфическую доставку цито статика к опухолевым клеткам. Процедура конъюгирования не повлияла на биологические свойства ни белкового фрагмента, ни цитостатика.
Подытожив вышесказанное, можно заключить, что отобранные в данной работе фрагменты АФП являются перспективными носителями для адресной доставки цитостатиков к опухолевым клеткам. Конъюгат фрагмента АФП с цитостатиком ципрофлоксацином как модельного объекта продемонстрировал перспективность дальнейшей разработки и исследо вания лекарств адресного действия на основе фрагментов АФП.
Выводы 1. Получены штаммы-продуценты E. coli BL21 (DE3) для получения двух вариантов С-концевого домена АФП: соответствующий структурному С-концевому домену (с 404 по 595 а.о. – rAFP3D595) и дополнительно содержащий не структурированный С-конец белка (с 404 по 609 а.о. – rAFP3D609).
2. Разработана эффективная методика ренатурации рекомбинантных фрагментов rAFP3D595 и rAFP3D609 методом быстрого разбавления. Выход ренатурированного белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%.
3. Впервые показана возможность высокоэффективной ренатурации гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей, иммобилизованного на металло хелатной смоле. Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой не ме нее 98%. Продуктивность ренатурации иммобилизованных фрагментов АФП на два порядка превышала продуктивность ренатурации методом разбавления.
4. Показано соответствие структур рекомбинантных ренатурированных фрагментов АФП и природного белка несколькими независимыми методами. Установлено, что ренату рированные фрагменты АФП представляют собой белки в форме мономеров. Показано, что все остатки цистеинов вовлечены в образование дисульфидных связей, как и в природном белке. Вторичная структура обоих фрагментов состоит преимущественно из -спиралей и соответствует вторичной структуре нативного полноразмерного АФП.
5. Показано, что оба фрагмента АФП связывались и подвергались рецептор опосредованному эндоцитозу линией опухолевых клеток, несущих РАФП, и не проникали в нормальные клетки, не несущие РАФП (лимфоциты периферической крови человека). По способности проникать в клетки они были близки к природному АФП.
6. В экспериментах на клеточных культурах показано, что конъюгат фрагмента АФП с ципрофлоксацином подавлял рост раковых клеток в концентрации на порядок меньше, чем свободный ципрофлоксацин (IC50 50 мкМ для конъюгата и 1000 мкМ для свободного ци профлоксацина). Конъюгат оказывал специфический цитотоксический эффект именно на ра ковые клетки и, в отличие от свободного ципрофлоксацина, не влиял на рост нормальных клеток.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах Шарапова О.А., Позднякова Н.В., Лауринавичюте Д.К., Юркова М.С., Посыпанова Г.А., Андронова С.М., Федоров А.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. (2010) «Выделение и ха рактеристика рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина человека, соответствующего С-концевому структурному домену». Биоорганическая химия, 6(36): 1-9.
Шарапова О.А., Юркова М.С., Андронова С.М., Федоров А.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. (2011) «Высокоэффективная ренатурация иммобилизованного рекомбинантного С концевого фрагмента альфа-фетопротеина человека». Прикладная биохимия и микробиоло гия, 5(47): 1-6.
Sharapova O.A., Pozdnykova N.V., Laurinavichyute D.K., Yurkova M.S., Posypanova G.A., Fedorov A.N., Severin S.E., Severin E.S. (2010) “High-efficient expression, refolding and pu rification of functional recombinant C-terminal fragment of human alpha-fetoprotein”. Protein Ex pression and Purification, 73(1): 31-35.
Sharapova O.A., Yurkova M.S., Laurinavichyute D.K., Andronova S.M., Fedorov A.N., Severin S.E., Severin E.S. (2011) “Efficient refolding of a hydrophobic protein with multiple S-S bonds by on-resin immobilized metal affinity chromatography”. Journal of Chromatography A, 1218 (31): 5115-5119.
Тезисы докладов Шарапова О.А., Позднякова Н.В., Юркова М.С., Посыпанова Г.А., Федоров А.Н., Се верин Е.С. (2008) «Создание векторов для адресной доставки цитостатиков на основе реком бинантного альфа-фетопротеина человека». Сборник тезисов 12 Международной пущинской школы-конференции молодых ученых, с. 233, Пущино.
Шарапова О.А. (2008) «Рекомбинантный С-концевой фрагмент альфа-фетопротеина человека как основа для адресной доставки цитостатиков». Материалы докладов XVI Меж дународной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», с.
35, Москва.
Шарапова О.А. (2009) «Рекомбинантный альфа-фетопротеин человека как основа для адресной доставки лекарств-цитостатиков». Материалы III Научно-практической конферен ции «Перспективы развития инноваций в биологии», с. 180, Москва.
Северин С.Е., Северин Е.С., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С. (2011) «Вы сокоэффективная ренатурация гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей, иммобилизованного на смоле». Сборник аннотаций работ IX Курчатовской молодеж ной научной школы, с. 140, Москва.
Патенты Патент на изобретение № 2422512 от 27 июня 2011 г. Штамм Escherichia coli BL21 (DE3)/pAFP11D3-продуцент фрагмента с 404 по 609 аминокислоту альфа фетопротеина человека. Северин Е.С., Лауринавичуте Д.К., Позднякова Н.В., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С., Северин С.Е.
Патент на изобретение № 2431639 от 20 октября 2011 г. Способ получения конъюгата фрагмента альфа-фетопротеина человека с ципрофлоксацином.
Северин Е.С., Лауринавичуте Д.К., Позднякова Н.В., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С., Северин С.Е.
Патент на изобретение № 2448116 от 20 апреля 2012 г. Способ получения активного фрагмента альфа-фетопротеина человека. Северин Е.С., Лауринавичуте Д.К., Позднякова Н.В., Федоров А.Н., Шарапова О.А., Юркова М.С., Северин С.Е.
Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаменталь ных исследований по программе офи_м и Фонда содействия развитию малых форма пред приятий в научно-технической сфере по программе УМНИК.
Для заметок