Периодизация и регуляция морфогенеза боковых корней linum usitatissimum l.

На правах рукописи

ПЛОЩИНСКАЯ Мария Евгеньевна ПЕРИОДИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА БОКОВЫХ КОРНЕЙ LINUM USITATISSIMUM L.

03.02.01 – ботаника

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена на кафедре высших растений биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Виктор Борисович Иванов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Владимир Викторович Чуб доктор биологических наук, в.н.с. Наталья Владимировна Обручева

Ведущая организация: Ботанический институт имени В.Л. Комарова Российской Академии Наук (Санкт-Петербург)

Защита состоится 27 апреля 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы 1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1;

тел./факс (495) 939 18-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан « 20 » марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Корневая система растений формируется в результате ветвления главного и придаточных корней, поэтому для понимания процессов формирования корневых систем и управления ими необходимо понимание базовых процессов, лежащих в основе инициации и развития боковых корней. В отличие от побегов, боковые корни высших растений не имеют строго фиксированного положения на материнском корне, число их нестабильно, однако развитие корневых систем подчинено скрытым закономерностям. Выявление этих закономерностей особенно важно для понимания архитектуры корневых систем и их моделирования.

В настоящее время накоплен огромный фактический материал, охватывающий многие аспекты морфогенеза боковых корней (Демченко и др., 2001;

Lloret, Casero, 2002;

Dubrovsky et al., 2006;

Benkov, Bielach, 2010;

De Smet et al., 2012), его генетическую и гормональную регуляцию (Boerjan et al., 1995;

De Smet et al., 2007, 2010, 2011), влияние окружающей среды.

Предложены модели, объясняющие порядок появления и расположения боковых корней на главном корне (Celenza et al., 1995;

Ruegger et al., 1997;

Dupuy et al., 2010). Однако знания о механизмах гормональной регуляции инициации и развития боковых корней еще неполны и иногда противоречивы.

Не вполне ясны особенности регуляции недавно выделенных стадий развития бокового корня (Laskowski et al., 1995;

Malamy, Benfey, 1997). В настоящее время очень подробно изучается роль ауксина в инициации примордиев, но регуляция более поздних стадий развития боковых корней, как и влияние цитокининов на эти процессы, изучено недостаточно.

Особый интерес для изучения представляют те растения, характер ветвления корней которых проявляет какие-либо отличия от такового у традиционно изучаемых видов. Ветвление корней проростков льна Linum usitatissimum L. почти не изучено, однако, по имеющимся данным, его растущие боковые корни способны при воздействии экзогенного ауксина стимулировать заложение новых примордиев в непосредственной близости от себя (Goldacre, 1959), тогда как типичным считают ингибирование заложения новых примордиев в непосредственной близости от уже имеющихся. Для сравнения были выбраны проростки кукурузы Zea mays L., развитие и гормональная регуляция ветвления корней которых изучены очень подробно и не проявляют отличий от других изученных видов (Дубровский, Иванов, 1984;

Bell, McCully, 1970;

Barlow, 1974;

McCully, 1975;

Hurren et al., 1988;

MacLeod, 1990).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в установлении закономерностей ранних стадий формирования корневой системы проростков льна и особенностей ее гормональной регуляции. Для ее достижения поставлены следующие задачи:

Изучить особенности инициации и развития боковых корней у 1.

проростков льна и сравнить их с таковыми у проростков кукурузы.

Проверить соответствие особенностей ветвления корней льна 2.

гипотезе двухстадийного развития бокового корня.

Выявить особенности гормональной регуляции развития боковых 3.

корней льна от их инициации до выхода из главного корня посредством добавления экзогенного ауксина, экзогенного цитокинина и удаления апикальной меристемы главного корня как источника эндогенного цитокинина.

Установить степень пластичности ветвления корней льна.

4.

Выявить зависимые и независимые от гормонального влияния 5.

процессы ветвления корней проростков льна.

Научная новизна. Впервые подробно изучен характер роста и ветвления корней у проростков льна Linum usitatissimum в естественном состоянии и при искусственно измененном гормональном балансе. Выявлено существование в корнях льна покоящихся неопределенно долгое время примордиев, остановка в развитии которых происходит в период между двумя стадиями развития.

Показано, что нарушение акропетального порядка появления боковых корней на поверхности главного корня обусловлено паузами в развитии части примордиев. Установлено, что ауксины и цитокинины различным образом влияют на разные стадии развития бокового корня льна. Стимуляция корнеобразования развитыми примордиями в корнях льна не подтверждена. На примере двух изученных видов описаны две стратегии развития корневой системы покрытосеменных растений. Корневая система льна более лабильна и способна быстрее реагировать на изменяющиеся условия окружающей среды, чем корневые системы, сходные по способу развития с таковой у кукурузы.

Показано, что время развития примордиев боковых корней, акропетальный порядок их инициации, зависимость способности клеток перицикла к восприятию индуцирующего сигнала от их положения относительно проводящей системы корня не могут быть изменены экспериментальными воздействиями. Подтверждена необходимость использования более широкого круга объектов для изучения морфогенеза боковых корней и учета особенностей естественного морфогенеза растения при интерпретации результатов экспериментальных исследований.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа имеет теоретический характер и направлена на выявление неизвестных аспектов корнеобразования у высших растений. Полученные результаты расширяют представления о разнообразии ветвления корней проростков и его зависимости от экспериментального изменения гормонального баланса. В перспективе они позволят разработать более общие модели ветвления корня семенного растения. Установленная особая стратегия развития корневой системы проростков Linum usitatissimum может пригодиться для разработки новых эффективных приемов агротехники льна – важной сельскохозяйственной культуры. Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах морфологии, анатомии и физиологии растений и в учебных пособиях по этим дисциплинам.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), на Международном Симпозиуме «Биоразнообразие и эволюционная биология» Германского Ботанического Общества (Йена, 1999), на междисциплинарной конференции «Нецентрализованная регуляция биологических процессов» (Москва, 2000), на научных семинарах лаборатории физиологии корня Института физиологии растений им. К.А Тимирязева РАН (1999 – 2000), на VIII Международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти И.Г. и Т.И. Серебряковых (Москва, 2009), на заседаниях кафедры высших растений биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 – статьи в рецензируемых журналах, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации — 209 страниц (основной текст изложен на 142 страницах, проиллюстрирован 18 таблицами и 53 рисунками). Список литературы включает 165 работ, в т.ч. 138 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава 1. Обзор литературы В обзоре литературы описаны особенности инициации, роста и регуляции боковых корней у разных растений. Проанализированы данные о последовательности заложения примордиев и расположении боковых корней на главном корне (Barlow, Adam, 1988;

Charlton, 1996;

Lloret, Casero, 2002;

Dubrovsky et al., 2006 и др.), порядке инициации и развития примордиев боковых корней (McCully, 1975;

Malamy, Benfey, 1997;

Демченко, 1999, 2001;

Dubrovsky et al., 2000, 2001;

Jansen et al., 2010 и др.), времени развития боковых корней (Дубровский, Иванов, 1984;

Thompson, Macleod, 1981;

Ivanov, 1994;

Dubrovsky, 2001, 2006). Рассмотрена гипотеза о том, что развитие бокового корня представляет собой двухстадийный процесс (Laskowski et al., 1995).

Проанализированы принципы выбора критериев для разграничения этих стадий (Pecket, 1957а;

Thompson, Macleod, 1981;

MacIsaac et al., 1989;

Laskowski et al., 1995), поскольку стадия формирования примордия в виде меристематического бугорка и стадия развития примордия в боковой корень не имеют выраженной анатомо-морфологической границы и переходят одна в другую без периода покоя.

Рассмотрены современные данные о влиянии фитогормонов на ветвление корней (Torrey, 1986;

Hurren et al., 1988;

Zhang, Hasenstein, 1999;

Laskowski et al., 2006;

De Smet et al., 2010, 2011 и др.), таких как характер транспорта и распределения ауксинов и цитокининов по корню (Atzmon et al., 1996, 1997;

Werner et al., 2001;

Aloni et al., 2005, 2006 и др.), декапитация главного корня проростка (Bttger, 1974, 1978;

Lloret et al., 1985, 1988;

Atzmon et al., 1994, и др.), баланс концентраций ауксинов и цитокининов в корне (Bollmark et al., 1988;

Reed et al., 1998). В настоящее время детально изучена роль ауксина в инициации первых делений примордия бокового корня. Влияние ауксина на последующий ход развития бокового корня, а также влияние цитокинина на этот процесс изучены еще недостаточно. Очень мало изучены особенности гормональной регуляции двух стадий развития примордиев боковых корней. В заключительной части главы представлен обзор данных о развитии корней и корневых систем кукурузы Zea mays и льна Linum usitatissimum и их регуляции (Crooks, 1933;

Goldacre, 1959;

Bell, McCully, 1970;

MacLeod, 1990;

Kutschera et al., 2009 и др.). В то время как морфогенез боковых корней кукурузы изучен достаточно подробно, данные об особенностях развития корней льна практически отсутствуют.

Глава 2. Материал и методы Эксперименты по изучению ветвления корней проводили на 10–14 дневных проростках кукурузы и льна, корни которых имеют первичное анатомическое строение. Для изучения влияния экзогенных гормонов на ветвление корней использовали синтетические аналоги природных ауксинов — -нафтилуксусную кислоту (НУК) и цитокининов — бензиламинопурин (БАП).

Использовали концентрации гормонов от 110-5 М до 110-7 М. Влияние эндогенного цитокинина изучали методом декапитации (удаление апикальной меристемы главного корня). Ежедневно измеряли длину главного корня проростка, длину участка, несущего боковые корни, подсчитывали общее число боковых корней и число боковых корней и примордиев на каждом отрезке длиной 1 см.

Семена льна сорта Белинка проращивали в чашках Петри на смоченной водопроводной водой фильтровальной бумаге. Трехдневные проростки, имевшие длину главного корня 25–30 мм, пересаживали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой (контроль) и растворами НУК или БАП в дистиллированной воде. Часть корней декапитировали. Растения выращивали в темноте при температуре 20–22 С в течение 10 дней.

Семена кукурузы сорта KOC 58 95 проращивали в водопроводной воде на влажной фильтровальной бумаге. У трехдневных проростков, имевших длину главного корня 50–70 мм, удаляли придаточные корни. Проростки пересаживали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой (контроль) и растворами НУК или БАП в дистиллированной воде. Часть корней декапитировали. Растения выращивали в темноте при температуре 27 С в течение 7–10 дней.

Все корни фиксировали целиком по Кларку в течение 12 ч. Для приготовления тотальных препаратов корни обрабатывали 5% хромовой кислотой, окрашивали ацетокармином в течение 20 мин (Hackett, Steward, 1969), просветляли в ксилоле в течение 5–7 дней и заключали в канадский бальзам (Pags, Serra, 1994). У корней кукурузы отделяли первичную кору, оставляя центральный цилиндр с окрашенными бугорками примордиев на нем.

Для анатомических исследований срезы делали бритвой от руки или готовили серийные микротомные срезы толщиной 10–15 µm. Приготовление и окраску препаратов проводили по стандартной методике (Паушева, 1980;

Барыкина и др., 2004).

Статистическую обработку результатов и построение графиков проводили с помощью программ Microsoft Excel и STATISTICA. Препараты изучали с помощью стереомикроскопа Stemi 2000-C и светового микроскопа Axioplan 2 imaging (Carl Zeiss). Срезы фотографировали видеокамерой AxioCam MRc с помощью программы AxioVision 3.1.

Глава 3. Результаты 3.1. Ветвление корней проростков льна 3.1.1. Рост главного корня и развитие корневой системы интактных проростков льна. Двухнедельные проростки льна имеют весьма тонкие корни, отличающиеся слабым ростом и незначительным ветвлением. Боковые корни короткие, слабые;

как правило, их в среднем 4–6, редко больше 10. Часто главный корень не ветвится вовсе или образует 1-2 боковых корня.

Соответственно плотность ветвления также очень невелика и для интактных проростков составляет в среднем 0,2. Примордии боковых корней у проростков льна в большинстве случаев закладываются напротив лучей диархной ксилемы, вследствие чего боковые корни расположены по двум неявно выраженным ортостихам. Нередко встречаются случаи заложения примордиев с незначительным смещением относительно геометрического центра ксилемного полюса, так что примордий оказывается между ксилемой и флоэмой, вследствие чего могут появляться группы из трех боковых корней.

Последовательность появления боковых корней на главном имеет выраженную тенденцию к акропетальности, но не строго акропетальный порядок. Из растений отмечено только 8 случаев строго акропетального ветвления, а также 1 случай базипетального ветвления, в остальных случаях боковые корни появлялись на главном в произвольной, лишь приблизительно акропетальной последовательности. Боковые корни, возникающие в разные сутки роста, располагаются на главном корне в почти произвольном порядке;

весьма часто в базальной части главного корня расположена группа позже всего возникших боковых корней (рис. 1, А). Сближенные в группы боковые корни часто А. Интактные корни Б. Декапитированные корни Рис. 1. Последовательность появления боковых корней на главном корне у проростков льна.

На схеме в масштабе отражены длина главного корня и расстояние между боковыми корнями.

кш – корневая шейка;

бк – боковые корни;

стрелкой показано направление роста корня.

развиваются с разницей в сутки и более.

Табл. 1. Соотношение примордиев и развитых боковых корней в 10–дневных проростках льна при различных воздействиях.

Общее число Число бк Процент бк от примордиев* общего числа примордиев Интактные корни b 7% 24,5 1,9 1,8 0, Корни, обработанные c 15% 34,3 2,3 5,3 1, НУК (110-7М) Корни, обработанные a 29% 55,6 3,8 16,1 1, НУК (110-6М) Декапитированные b a 75% 20,0 0,8 14,9 0, корни Декапитированные c a 28,3 ±1,4 17,5 ±1,1 61% корни + НУК (110-7М) Декапитированные a 39,3 ±2,5 17,0 ±1,4 44% корни + НУК (110-6М) Примечание. Среднее число примордиев и боковых корней рассчитано на один корень. Приведены средние арифметические значения и их стандартные ошибки. Данные, обозначенные одинаковыми буквенными индексами, различаются статистически недостоверно (P 0,05).

* - включая боковые корни бк – боковые корни В корнях льна, даже в неветвящихся, закладывается в среднем по 20- примордиев боковых корней, но только 7% примордиев без паузы развивается в боковые корни (табл. 1). Развитие остальных примордиев останавливается на стадии меристематических бугорков. Никаких закономерностей в расположении покоящихся примордиев и боковых корней выявить не удалось.

Меристематические бугорки могут быть расположены между развитыми боковыми корнями во всех частях главного корня (рис. 2, 3), часто некрупные примордии расположены в базальной части корня. На стадии формирования меристематического бугорка все примордии имеют одинаковое строение и не Рис. 2. Схема расположения примордиев и боковых корней на главном корне у проростков льна, выращенных на дистиллированной воде (контроль) и обработанных НУК в концентрации 110-7 М и 110-6 М.

На схеме в масштабе отражены длина главного корня и расстояние между боковыми корнями и примордиями. Стрелкой показано направление роста корня.

Рис. 3. Схема расположения примордиев и боковых корней на главном декапитированном корне у проростков льна, выращенных на дистиллированной воде (контроль) и обработанных НУК в концентрации 110-7 М и 110-6 М.

На схеме в масштабе отражены длина главного корня и расстояние между боковыми корнями и примордиями. Стрелкой показано направление к апексу корней.

имеют анатомических признаков, позволяющих различать, какие примордии будут развиваться в боковые корни, а какие останутся покоящимися. По нашим данным, останавливаться в развитии могут только недифференцированные примордии. Первые признаки формирования апикальной меристемы и корневого чехлика появляются у примордиев, имеющих размер 6-8 слоев клеток. Все примордии, имеющие более крупные размеры, развиваются в боковые корни. Примордии, имеющие меньшие размеры, могут как сформировать боковые корни, так и останавливаться в развитии.

Инициация примордиев боковых корней у льна происходит в строго акропетальной последовательности, так же, как у большинства проростков других растений. Нарушения акропетального порядка проявляются только на стадии выхода из тканей материнского корня полностью сформированных боковых корней.

3.1.2. Рост и ветвление корней проростков льна при воздействии экзогенного ауксина. Воздействие НУК ингибирует рост главного корня тем сильнее, чем выше концентрация. Вследствие уменьшения скорости роста главного корня боковые корни и примордии приближаются к апексу. Число боковых корней и плотность ветвления остаются невысокими, хотя сильно возрастают по сравнению с интактными проростками. Для проростков, обработанных НУК в концентрации 110-7 М, число боковых корней составляет в среднем 5,1 против 1,9 для интактных проростков;

плотность ветвления возрастает до 0,7 по сравнению с 0,2 у интактных корней, т.е. более чем в раза. Увеличение концентрации НУК до 110-6 М вызывает резкое увеличение числа боковых корней до 12,8;

плотность ветвления возрастает до 3,2.

Воздействие НУК вызывает увеличение в 1,5–2 раза числа заложенных примордиев боковых корней. Однако, как и в интактных корнях, далеко не все примордии развиваются в боковые корни;

значительная их часть останавливается на стадии меристематических бугорков (рис. 2). При воздействии НУК возрастает не только число боковых корней, но и их доля от общего числа заложившихся примордиев (табл.1). Если в корнях интактных проростков в боковые корни развивается в среднем 7% примордиев, то при обработке НУК в концентрации 110-7 М боковые корни развиваются уже из 15% примордиев, а при концентрации 110-6 М – из 29%. Но дальнейшего увеличения доли боковых корней от общего числа примордиев при обработке экзогенным ауксином не происходит.

Увеличение плотности ветвления главного корня при воздействии НУК обусловлено не только увеличением числа заложенных примордиев, но также индуцированным этим воздействием изменением формы и размеров клеток корня. Клетки коры в корнях, обработанных НУК, в области инициации примордиев боковых корней достоверно короче и шире клеток коры интактных корней. В базальных отрезках корней, где клетки коры дифференцированы до начала экспериментального воздействия, у интактных и обработанных НУК проростков они почти не различаются как по длине, так и по ширине.

При обработке проростков льна НУК не было отмечено изменения времени заложения примордиев и скорости их развития в боковые корни, а также значительных изменений последовательности появления боковых корней на главном корне. Так как в норме последовательность появления боковых корней у льна нестабильна, сравнение контрольных и экспериментальных проростков затруднено. Однако для корней проростков льна, обработанных НУК, характерна такая же нестрогая акропетальность ветвления, как и для корней интактных проростков.

3.1.3. Рост и ветвление корней проростков льна при воздействии экзогенного цитокинина. Обработка проростков льна растворами БАП ингибирует рост главного корня и полностью останавливает заложение примордиев боковых корней. Единичные примордии, заложенные до начала воздействия БАП, чаще всего 3–5, но не более 10, можно наблюдать на ближайшем к корневой шейке отрезке длиной 20 мм. В остальных частях корней примордии отсутствуют. Однако доля боковых корней от общего числа примордиев значительно возрастает и составляет в среднем 60%. Воздействие БАП может приводить к 100% развитию примордиев в боковые корни, тогда как у других контрольных и экспериментальных проростках отсутствуют корни без покоящихся примордиев.

3.1.4. Особенности ветвления декапитированных корней проростков льна. Удаление апикальной меристемы главного корня (декапитация) приводит к увеличению числа боковых корней в среднем от 2 у интактных проростков до 15 у декапитированных, в отдельных случаях до 22. Таким образом, число боковых корней у декапитированных проростков возрастает как минимум вдвое, но чаще в 7-8 раз (рис. 1, Б;

табл. 1). Боковые корни развиваются равномерно на всем протяжении главного корня. Однако заложения дополнительных примордиев в декапитированных корнях не происходит. Их число составляет в среднем 20–25, как и в интактных корнях;

различия статистически недостоверны (табл. 1). Часть примордиев останавливается в развитии на стадии меристематических бугорков. Однако соотношение боковых корней и покоящихся примордиев в корнях интактных и декапитированных проростков существенно различается (табл. 1). В декапитированных корнях число примордиев, развившихся в боковые корни, увеличивается до 75% в отличие от 7% в интактных корнях. Примордии в декапитированных корнях закладываются в акропетальной последовательности, боковые корни появляются на поверхности главного корня в произвольном порядке с присущей льну тенденцией к акропетальности.

В декапитированных корнях, дополнительно обработанных НУК, нет различий в порядке заложения примордиев и в последовательности появления боковых корней на главном корне. Общее число примордиев боковых корней возрастает, так же как в обработанных НУК корнях, имеющих апикальную меристему (табл. 1), часть примордиев остается покоящимися (рис. 3). Так же как в корнях проростков, выращенных без добавления ауксина, декапитация приводит к увеличению числа примордиев, развивающихся в боковые корни, но лишь до определенного предела (табл. 1). В декапитированных контрольных корнях доля боковых корней от общего числа примордиев составляет 75%, в декапитированных корнях, обработанных НУК в концентрации 110-7 М их доля составляет 61%, а при использовании концентрации 110-6 М – 44%. Число примордиев возрастает с 20 в декапитированных контрольных корнях до 28,3 и 39,3 в декапитированных корнях, обработанных НУК в концентрации 110-7 М и 110-6 М соответственно. Однако, несмотря на увеличение числа примордиев, число боковых корней остается постоянным и составляет 15–17 при всех экспериментальных воздействиях (табл. 1). Вероятно, для корней проростков льна существует некоторый предел числа боковых корней, остальные примордии остаются покоящимися.

В декапитированных корнях, обработанных БАП, заложение примордиев боковых корней прекращалось, так же как в корнях, имеющих апикальную меристему. Из примордиев, заложенных до начала экспериментального воздействия, примерно 70% развивалось в боковые корни.

3.2. Ветвление корней проростков кукурузы 3.2.1. Рост главного корня и развитие корневой системы интактных проростков кукурузы. Главные корни проростков кукурузы появляются примерно через сутки после намачивания семян. В течение первых 5-6 суток скорость роста главного корня быстро увеличивается, затем начинает медленно уменьшаться. Первые примордии боковых корней на стадии меристематических бугорков появляются на 2-3 сутки после намачивания семян на расстоянии 14-15 мм от апекса при средней длине главного корня мм. Боковые корни появляются на 4-5 сутки роста при длине главного корня 130–150 мм. Примордии боковых корней закладываются возле полюсов ксилемы, но вследствие неравномерного деления клеток примордия, середина растущего бокового корня смещается к полюсу флоэмы. Тогда ксилема бокового корня связывается с двумя соседними тяжами протоксилемы материнского корня, ограничивающими флоэму. Так как в корне 13–17 тяжей протоксилемы и они расположены близко друг к другу, корни кукурузы образуют большое число боковых корней, часто расположенных группами по 3 4 на одном уровне. Из-за такого их расположения ортостихи часто не выражены. В норме средняя плотность ветвления (число боковых корней на отрезке главного корня длиной 10 мм) главного корня проростка кукурузы составляет 15,1 (табл. 2).

Развитие всех примордиев боковых корней от первых делений до выхода из материнского корня у кукурузы проходит без периода покоя. Примордии закладываются в строго акропетальной последовательности, и в такой же последовательности появляются боковые корни. Появления новых примордиев между развитыми боковыми корнями не происходит. Попытка стимулировать дополнительное корнеобразование удалением всех развитых боковых корней у недельных проростков кукурузы не привела к заложению дополнительных примордиев в базальных частях главного корня. Ветвление продолжалось только в апикальной части корня, где происходит заложение новых примордиев.

Табл. 2. Параметры роста и ветвления корней интактных, декапитированных и обработанных НУК проростков кукурузы.

Весь корень Участок 30 мм Lгл.к. Lзбк Число Плотность Число Плотность бк ветвления бк ветвления b 131,9 48, a c К 15,1 ±2,2 17,4 ±1, 224,9 120, ±7,6 ±3, b 51, a c К дек 72,1 ±4,1 19,6 ±1,7 21,3 ±1, 34,4 34, ±4, НУК b 56, a c 56,3 ±5,6 20,3 ±1,5 20,3 ±1, 84,0 29, 110-5 ±5, НУК b 57, a c 22,2 ±3,5 22,2 ±3, 60,9 ±2, 27,9 27, 110-5дек ±2, НУК b 57, a c 74,9 ±4,6 18,9 ±1,4 19,9 ±1, 156,6 60, 110-6 ±4, НУК b 51, a c 62,2 ±3,9 21,1 ±2,2 21,1 ±2, 30,2 30, 110-6дек ±3, Примечание. Плотность ветвления рассчитана как число боковых корней на отрезке главного корня длиной 10 мм. Приведены средние значения и их стандартные ошибки. Данные, обозначенные одинаковыми буквенными индексами, различаются статистически недостоверно (P0,01).

Lгл.к. – длина главного корня (мм) Lзбк – длина участка главного корня, занятого боковыми корнями (мм) бк – боковые корни 3.2.2. Рост и ветвление корней проростков кукурузы при воздействии экзогенного ауксина. Воздействие экзогенной НУК ингибирует рост главного корня тем сильнее, чем выше использованная концентрация (табл. 2). Главные корни экспериментальных проростков в 2-3 раза короче корней контрольных проростков такого же возраста, и рост их прекращается быстрее. Время развития примордия в боковой корень не меняется, вследствие чего молодые боковые корни и примордии в корнях экспериментальных проростков приближаются почти вплотную к апексу главного корня. Однако значимого увеличения числа боковых корней не происходит. Средняя плотность ветвления корней интактных проростков составляет 15,1;

при обработке НУК этот показатель незначительно повышается и составляет 18,4 для концентрации 110-6М и 19,6 для концентрации 110-5М (табл. 2). Это различие весьма невелико и статистически недостоверно. Вероятно, причиной незначительного возрастания плотности ветвления является формирование в корне более коротких и широких клеток вследствие нарушения процесса их растяжения. В области заложения примордиев средняя длина клеток коры в контрольных корнях составляет 160,2 µm при средней ширине 18,3 µm, тогда как в корнях, обработанных НУК в концентрации 110-6М, средний размер клеток коры составляет 139,5 28,6 µm, а при использовании концентрации 110-5М — 104,4 31,2 µm. Воздействие НУК, независимо от концентрации, не приводит к нарушениям акропетальной последовательности заложения примордиев и появления боковых корней. Не происходит также заложения новых примордиев между развитыми боковыми корнями или остановки развития примордиев.

3.2.3. Рост и ветвление корней проростков кукурузы при воздействии экзогенного цитокинина. Воздействие БАП ингибирует рост главного корня.

Боковые корни развиваются только из примордиев, заложенных до начала воздействия БАП;

ветвление прекращается на 5-6 сутки роста, заложения новых примордиев не происходит. Общее число боковых корней уменьшается примерно в 5 раз по сравнению с корнями интактных проростков. Средняя плотность ветвления корня у проростков, обработанных БАП, уменьшается почти в 2 раза по сравнению с интактными проростками независимо от использованной концентрации. Она составляет 13,5 у интактных корней и 6,7 и 6,3 при использовании БАП в концентрации 110-7 М и 110-6 М соответственно. Воздействие БАП не влияет на последовательность формирования боковых корней у кукурузы. Так же как и в интактных корнях, они появляются на главном корне в акропетальной последовательности.

3.2.4. Особенности ветвления декапитированных корней проростков кукурузы. Удаление апикальной меристемы главного корня не вызывает заложения дополнительных примордиев. Общее число боковых корней у декапитированных проростков и на участках главного корня такой же длины у интактных проростков различается недостоверно и составляет в среднем 51,9 и 48,6 соответственно. Различия плотности ветвления у корней интактных и декапитированных проростков также недостоверны и составляют 15,1 и 19, соответственно (табл. 2). Последовательность заложения примордиев и скорость их развития в боковые корни у декапитированных корней не отличаются от таковых у интактных. Сохраняется также акропетальный порядок появления боковых корней. Дополнительное воздействие на декапитированные корни проростков кукурузы экзогенной НУК не приводит к заметным изменениям в их ветвлении (табл. 2). Средние значения плотности ветвления отличаются от контрольных корней незначительно и статистически недостоверно и составляют 22,2 и 20,3 при концентрации 110-6 М и 21,1 и 18, при концентрации 110-5 М для декапитированных и целых корней соответственно.

Глава 4. Обсуждение результатов 4.1. Сравнение особенностей ветвления корней проростков кукурузы и льна. Проростки льна и, возможно, некоторых других растений имеют особую стратегию развития корневой системы, обусловленную наличием в их корнях покоящихся примордиев. Наличие таких примордиев является причиной различий в изменениях характера ветвления, проявляющихся в корнях кукурузы и льна в ответ на декапитацию или воздействие экзогенных гормонов (табл. 3). При массовом заложении примордиев и развитии их без перерыва в боковые корни, как, например, в корнях кукурузы, возможности корнеобразования быстро исчерпываются, и применение стимуляторов не вызывает заметного эффекта. При наличии в корнях покоящихся примордиев или сохранении возможности их инициации стимуляция может приводить к значительному усилению ветвления. У растений, корни которых ветвятся по типу кукурузы, внешние воздействия не способны быстро изменить ни общее число боковых корней, ни плотность их распределения по длине главного корня. У растений, корни которых имеют резерв примордиев, число боковых корней и их распределение существенно меняются в течение 1-2 суток после экспериментальных воздействий вследствие развития в боковые корни покоящихся примордиев. Корневая система проростков кукурузы и многих других растений стабильна, внешние воздействия не вызывают заметной реакции, так как все заложенные латеральные структуры сразу реализуются.

Корневая система льна более пластична и способна быстро реагировать на изменение условий роста без дополнительных затрат.

4.2. Гормональная регуляция двух стадий развития бокового корня.

Выделенные стадии развития бокового корня (Laskowski et al., 1995) имеют разную гормональную регуляцию. Однако выявление границы между ними представляет собой весьма непростую задачу. У большинства современных модельных растений, в том числе у Arabidopsis thaliana, боковые корни развиваются подобно таковым у кукурузы, очень быстро и без периода покоя между двумя стадиями, что сильно затрудняет экспериментальную оценку Наличие Достоверное увеличение числа Достоверное увеличение числа покоящихся боковых корней при: примордиев при:

Растение примордиев понижении повышении понижении повышении концентрации концентрации концентрации концентрации цитокининов ауксина цитокининов ауксина (декапитации) (декапитации) Кукуруза нет нет нет нет нет Лен есть есть есть нет есть Табл. 3. Изменения в структуре корневой системы кукурузы и льна при разных воздействиях, обусловленные наличием или отсутствием покоящихся примордиев боковых корней.

воздействия гормона на каждой стадии. Покоящиеся примордии в корнях льна не имеют никаких анатомических признаков формирования апикальной меристемы и в то же время при экспериментальных воздействиях способны развиваться в боковые корни. Можно предположить, что примордии боковых корней льна переходят в состояние покоя как раз между двумя стадиями развития.

Разные изменения гормонального баланса по-разному влияют на разные стадии развития примордиев боковых корней проростков льна. Показано, что ауксин является необходимым и достаточным сигналом для перевода клеток перицикла в состояние инициалей боковых корней (Aloni et al., 2006;

Laskowski et al., 2006;

De Smet et al., 2007, 2010;

Dubrovsky et al, 2008). Действительно, воздействие ауксина в высоких концентрациях вызывает в корнях льна инициацию дополнительных примордиев. Однако наши исследования показали, что ауксины не влияют на развитие этих примордиев в боковые корни, а по некоторым данным, ингибируют его (MacIsaac et al., 1989;

Zhang, Hasenstein, 1999).

Увеличение концентрации цитокининов полностью останавливает формирование примордиев на стадии инициации у льна, кукурузы и других растений (MacIsaak et al., 1989;

Atzmon et al., 1996;

Zhang, Hasenstein, 1999;

Werner et al., 2001;

Laplaze et al., 2007). Применение высоких концентраций цитокинина останавливает даже индукцию примордиев ауксинами (MacIsaak, Sawhney, 1990). Но, по нашим результатам, в корнях проростков льна и кукурузы воздействие БАП не препятствует формированию собственной апикальной меристемы у ранее заложенных примордиев и дальнейшему росту боковых корней. На этой стадии развития бокового корня ауксины не имеют ингибирующего или стимулирующего эффекта. Тем не менее, ауксины, вероятно, участвуют в регуляции формирования апикальной меристемы бокового корня, но механизм их участия совершенно иной, нежели на стадии инициации примордия (De Smet et al., 2010;

Dupuy et al., 2010).

Уменьшение концентрации цитокининов в корне (декапитация) у льна не оказывает влияния на инициацию примордиев. Но на стадии образования из примордия апикальной меристемы бокового корня важность цитокининов несомненна. В корнях проростков льна уменьшение концентрации эндогенного цитокинина стимулирует развитие боковых корней из примордиев. В корнях кукурузы такую стимуляцию заметить невозможно, так как все примордии сразу развиваются в боковые корни. Однако нет оснований предполагать существование у льна принципиально иного механизма регуляции ветвления корня, чем у растений, не имеющих покоящихся примордиев.

В регуляции заложения примордиев и развития боковых корней баланс ауксинов и цитокининов, несомненно, играет важную роль. Растения стремятся тем или иным способом восстановить соотношение концентраций эндогенных гормонов, нарушенное при декапитации (Bollmark et al., 1988;

Atzmon et al., 1997;

Kerk et al., 2000;

Lucas et al., 2008). Подтверждением неизменности гормонального состава при декапитации может служить одинаковая реакция на воздействие экзогенного ауксина интактных и декапитированных корней, наблюдаемая нами у проростков кукурузы и льна. Постоянством соотношения ауксины/цитокинины можно объяснить полученные нами данные, что декапитация не оказывает заметного влияния на число заложенных примордиев у кукурузы и льна на апикальном участке главного корня. Случаи, когда декапитация корня вызывает усиление его ветвления, как у проростков льна, не удается объяснить только удалением источника цитокининов. На примере проростков льна нами показано, что высокие концентрации цитокинина не влияют на стадию развития бокового корня из примордия, следовательно, поступающие из апикальной меристемы цитокинины не должны препятствовать ветвлению. Не удается также объяснить усиление ветвления корней при декапитации накоплением ауксина в апикальной части корня, так как показано, что концентрация ауксина в декапитированном корне понижается (Bttger, 1974;

Atzmon et al., 1997). Одной из попыток разрешить это противоречие стало предположение, что цитокинины участвуют в регуляции ветвления корней опосредованно, через участие в регуляции транспорта и распределения ауксина (Atzmon et al., 1996).

4.3. Детерминированность инициальных клеток боковых корней в апикальной меристеме корня. Несмотря на высокую пластичность корневых систем у проростков кукурузы и у льна и отсутствие закономерностей в расположении примордиев и боковых корней, существует ряд устойчивых признаков. Примордии боковых корней в проростках кукурузы и льна закладываются только напротив полюса ксилемы, и в наших экспериментах не отмечено ни одного случая нарушения этой закономерности. Возможно, способность клеток перицикла к пролиферации и инициации примордиев определяется их совместным развитием с тяжами ксилемы. Для некоторых растений показано наличие в перицикле двух популяций клеток, связанных с проводящими тканями и достоверно различающихся по строению и размерам (Lloret et al., 1989;

Parizot et al., 2008). Не выявлено также нарушений акропетального порядка заложения примордиев при каких-либо гормональных воздействиях. В корнях проростка кукурузы никакие экспериментальные воздействия не вызвали заложения дополнительных примордиев между боковыми корнями. Тип морфогенеза боковых корней, характерный для данного растения, также очень устойчив. По нашим данным, клетки перицикла кукурузы теряют способность инициировать боковые корни в ответ на стимуляцию ауксином в течение двух суток. При ветвлении корней по типу льна эта способность сохраняется дольше. Время развития примордия в боковой корень также остается постоянным при всех экспериментальных воздействиях. Таким образом, регуляция процессов, определяющих строение корневой системы растений, не может быть сведена к действию фитогормонов, но также определяется положением, которое каждая клетка занимает в корне.

Полученные нами результаты позволяют подтвердить гипотезу детерминации инициальных клеток примордиев боковых корней только в отношении коррелированного развития перицикла и проводящих тканей. Положение каждого примордия, с одной стороны, детерминировано вследствие способности к делению лишь части клеток перицикла, с другой стороны, определяется многими внешними и внутренними факторами, которые могут меняться в процессе роста растения.

ВЫВОДЫ 1. Выявлен особый тип морфогенеза боковых корней у проростков льна (Linum usitatissimum L.), имеющих перерыв в развитии части примордиев в течение времени, в несколько раз превышающего время полного развития бокового корня. Для кукурузы (Zea mays L.) характерно непрерывное развитие примордиев боковых корней.

2. Примордии боковых корней льна закладываются в акропетальной последовательности, тогда как порядок развития боковых корней отклоняется от акропетального. Причиной является наличие покоящихся примордиев, возобновляющих свое развитие в разные сроки.

3. Морфогенез бокового корня льна представляет собой двухстадийный процесс, включающий (1) инициацию и развитие примордия до стадии меристематического бугорка и (2) формирование собственной апикальной меристемы бокового корня. Остановка в развитии примордия происходит на границе двух стадий.

4. Разные стадии развития бокового корня имеют разную гормональную регуляцию. Инициация и ранние стадии образования примордия бокового корня регулируются ауксинами. На регуляцию формирования апикальной меристемы бокового корня ауксин не оказывает непосредственного воздействия.

5. Степень участия цитокинина в регуляции стадий развития бокового корня зависит от его концентрации. Низкие концентрации цитокинина не влияют на процесс образования примордия, но оказывают стимулирующее воздействие на формирование апикальной меристемы бокового корня. Высокие концентрации полностью останавливают инициацию примордиев в перицикле и не оказывают воздействия на формирование апикальной меристемы уже заложенных примордиев.

6. Клетки перицикла кукурузы способны становиться инициалями боковых корней только в ограниченный по времени период органогенеза, поэтому заложение новых примордиев возможно лишь на очень коротком отрезке главного корня. Клетки перицикла льна способны к инициации боковых корней в течение длительного времени, что делает возможной индукцию примордиев на значительном участке главного корня.

7. Инициация примордиев боковых корней в определенном положении относительно проводящих тканей главного корня, акропетальная последовательность заложения примордиев, время развития примордия от инициации до выхода из главного корня (без учета периода покоя у льна) как у кукурузы, так и у льна не изменяются при всех видах проведенного экспериментального воздействия и, по-видимому, не зависит от ауксина и цитокинина.

8. Проростки изученных растений проявляют две разные стратегии формирования корневой системы. Корневая система льна обладает высокой степенью пластичности и быстро меняется при изменении внешних условий.

Корневая система кукурузы, напротив, весьма стабильна, изменение ее структуры при изменении внешних условий требует большего времени.

Список публикаций по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах 1. Площинская М.Е. Влияние декапитации главного корня проростков льна на его ветвление // Физиология растений. 2001. Т. 48, № 4. С. 511–513.

2. Площинская М.Е., Иванов В.Б., Салмин С.А., Быстрова Е.И. Анализ возможных механизмов регуляции ветвления корня // Журнал общей биологии.

2002. Т. 63, № 1. С. 68–74.

3. Площинская М.Е. Различные способы формирования корневых систем растений на примере проростков кукурузы и льна // Онтогенез. 2003. Т. 34, № 5.

С. 358–364.

4. Ivanov V.B., Bystrova E.I., Dubrovsky J.G., Ploshinskaya M.E. Duration of lateral root formation in maize seedlings as affected by diverse factors // Root demographics and their efficiencies in sustainable agriculture, grasslands, and forest ecosystems. Eds. J.E. Box, Jr. Dordrecht: Kluwer, 1998. P. 777–787.

Тезисы докладов и публикации в материалах конференций 5. Площинская М.Е. Влияние декапитации на формирование боковых корней проростков льна (Linum usitatissimum L.) // Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений России «Физиология растений – наука III тысячелетия». М.: ИФР РАН. 1999. С. 664.

6. Ploshinskaya M.E. Development of lateral root primordia in flax (Linum usitatissimum L.) seedlings // 14. Symposium Biodiversitt und Evolutionsbiologie.

Jena, 1999. P. 149.

7. Площинская М.Е. О количественной оценке интенсивности ветвления корня при экспериментальном воздействии // Труды VIII Международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти И.Г. и Т.И.

Серебряковых. М.: МПГУ. 2009. Т. 2. С. 135–139.