Структура и функционирование 5'-регуляторной области гена nanog восточно-европейской полёвки
На правах рукописи
Сорокин Михаил Алексеевич СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ 5'-РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА NANOG ВОСТОЧНО-ЕВРОПЕЙСКОЙ ПОЛЁВКИ 03.02.07 — генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук в лаборатории эпигенетики развития, г. Новосибирск.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Закиян Сурен Минасович
Официальные оппоненты: Маркель Аркадий Львович доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией эволюционной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Таранин Александр Владимирович доктор биологических наук, заведующий лабораторией иммуногенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва
Защита диссертации состоится « 23 » октября 2013 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:
пр. академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс:
(383) 363-49-06 (1321);
факс: (383) 333-12-78;
e-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.
Автореферат разослан « 6 » сентября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова ВВЕДЕНИЕ Актуальность. В раннем развитии у млекопитающих формируются три эмбриональных закладки: трофобласт, гипобласт и эпибласт. Вместе они составляют бластоцисту — зародыш, готовый к имплантации и дальнейшему развитию (Zernicka-Goetz et al., 2009). Клетки эпибласта мыши обладают свойством плюрипотентности — они способны как in vivo, так и in vitro дифференцироваться в производные всех трёх зародышевых листков, а также образовывать функциональные гаметы (Nichols, Smith, 2009).
На молекулярном уровне плюрипотентность представляет собой состояние, в котором подавлены гены, отвечающие за дифференцировку, и активны гены, отвечающие за самообновление клеток (Young, 2011).
Поддержание контрастного статуса экспрессии двух типов генов обеспечивается совместно действующими транскрипционными факторами NANOG, OCT4, SOX2, KLF4, ESRRB, SALL4 и некоторыми другими. Они кооперативно связываются с ДНК, привлекают активирующие, либо репрессирующие белковые комплексы и в результате поддерживают состояние самообновления клеток (Young, 2011). Гены факторов плюрипотентности регулируют также транскрипцию друг друга, формируя автономную сеть.
NANOG является одним из центральных транскрипционных факторов плюрипотентности. Ген Nanog необходим для развития плюрипотентных клеток и клеток половой линии у млекопитающих in vivo и in vitro, а также повышает эффективность самообновления плюрипотентных стволовых клеток в культуре (Theunissen, Silva, 2011). Формирование плюрипотентности в раннем развитии строго в нужное время и в ограниченном компартменте зародыша зависит от уровня белка NANOG в клетках (Miyanari, Torres Padilla, 2012), поэтому экспрессия гена Nanog должна очень точно контролироваться. Регуляция транскрипции Nanog изучена, главным образом, у мыши и в меньшей степени — у человека. В регуляторной области гена Nanog мыши выявлены два основных регуляторных района: проксимальный промотор и дистальный энхансер. В этих районах локализованы сайты связывания ряда транскрипционных факторов (SP1/SP3, KLF, ZIC3, OCT4 SOX2, T, STAT3, ZFP281). В то же время значительное количество сайтов, выявленных у мыши, имеют лишь минорное влияние на экспрессию Nanog, а некоторые из них к тому же локализованы в неконсервативных зонах повторов (сайты ZFP143, FOXD3, REST, p53, TCF/LEF, GCNF) и, кроме того, полностью отсутствуют у крысы. Таким образом, актуальной задачей является детальное исследование регуляторной области гена Nanog различных видов млекопитающих для определения наиболее консервативных регуляторов транскрипции Nanog.
Полёвки рода Microtus являются важным объектом изучения раннего развития, инактивации Х-хромосомы, индуцированной плюрипотентности (Shevchenko et al., 2009;
Сорокин et al., 2010;
Manoli et al., 2012). Кроме того, полёвки удачно подходят для сравнения с мышью и крысой: все три вида входят в один подотряд мышеобразных грызунов (Myomorpha), но при этом полёвки (семейство хомяковые Cricetidae) достаточно эволюционно отделены от мыши и крысы (семейство мышиные Muridae). Сравнительный подход позволяет различить у грызунов основные и вспомогательные регуляторные взаимодействия генов плюрипотентности и создать модель, удобную для экспериментального изучения сложной транскрипционной сети факторов плюрипотентности.
Изучение системы плюрипотентности у полёвки требует комплексного подхода, включающего секвенирование 5'-регуляторной области гена Nanog, идентификацию у полёвки генов Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb, Myc — важнейших регуляторов Nanog, функциональный анализ 5'-регуляторной области гена Nanog.
Цель и задачи исследования.
Цель: исследовать структуру и функционирование 5'-регуляторной области гена Nanog восточно-европейской полёвки Microtus levis.
Задачи:
1. Определить нуклеотидную последовательность 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки и сравнить её с ортологичными последовательностями других видов млекопитающих. Определить в 5' области гена Nanog полёвки потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов.
2. Определить регуляторную активность участков 5'-области гена Nanog полёвки в составе репортёрных конструкций.
3. Идентифицировать у полёвки ортологи генов-регуляторов гена Nanog:
Sox2, Klf4, Sall4 и Myc. Определить степень консервативности их нуклеотидной последовательности и паттерна экспрессии.
4. Определить функциональность сайтов связывания транскрипционных факторов OCT4, SOX2 и KLF4 в 5'-области гена Nanog полёвки.
5. Изучить роль метилирования ДНК в регуляции активности гена Nanog полёвки.
Научная новизна исследования. В работе впервые у полёвки проведён системный анализ основных генов, регулирующих плюрипотентность. У полёвки обнаружены ортологи генов Sox2, Klf4, Myc, Sall4, которые являются ключевыми в процессе регуляции транскрипции гена Nanog. Определена нуклеотидная последовательность 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки. Посредством молекулярно-генетического анализа идентифицированы участки 5'-регуляторной области Nanog полёвки, оказывающие позитивное и негативное влияние на транскрипцию гена, а также определены транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими участками. В начале первого интрона Nanog обнаружен дифференциально метилируемый район, который, вероятно, участвует в репрессии этого гена в экстраэмбриональных тканях полёвки.
Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов регуляции транскрипции гена Nanog и поддержания состояния плюрипотентности клеток у грызунов.
Основные положения работы, выносимые на защиту.
1. Центральная часть 5'-регуляторной области гена Nanog является у млекопитающих наиболее изменчивой. Сайты связывания транскрипционных факторов ZFP143, FOXD3, REST, p53, TCF и GCNF, расположенные в этой области у мыши, являются факультативными регуляторными элементами гена Nanog и имеются не у всех грызунов.
2. Проксимальный блок SINE-повторов, расположенный в 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки, активирует экспрессию этого гена в плюрипотентных клетках, а протяжённый дистальный блок SINE повторов не оказывает влияния на экспрессию Nanog.
3. В стволовых клетках экстраэмбриональных тканей полёвки наблюдается гиперметилирование CpG-обогащённого участка в начале первого интрона гена Nanog.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты данной работы расширяют знания о молекулярно-генетических механизмах поддержания плюрипотентности у млекопитающих и могут быть использованы при планировании и проведении экспериментов по получению индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, 13-18 апреля 2009 г.), на Международной конференции BGRS/SB'2012 (Новосибирск, 25-29 июня 2012 г.), на Международной конференции «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2-7 сентября 2012 г.), а также на семинарах Института цитологии и генетики СО РАН.
По материалам диссертации опубликованы две статьи в рецензируемых отечественных журналах из списка ВАК, одна глава в коллективной монографии.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно.
Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана диссертация.
Биоинформатический анализ проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы (220 ссылок). Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 15 рисунками, содержит 11 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Работа с РНК, ОТ-ПЦР, 3’- и 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) эксперименты.
РНК из клеточных культур, предымплантационных эмбрионов и органов взрослых полёвок (передних долей головного мозга, сердца, легкого, желудка, печени, кишечника, почки, яичников и семенника) выделяли с помощью TRI-Reagent RT (Molecular Research Center). Для очистки образцов РНК от контаминаций ДНК использовали набор реактивов DNA-free (Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы M-MLV (Promega) и случайных праймеров Random-Decamer (Ambion). Участки полученной кДНК амплифицировали с помощью ПЦР.
Для проведения RACE использовали BD SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). Выделяли РНК из 9-дневных эмбрионов, головного мозга, печени, почки, толстого кишечника, яичников и семенника полёвок. Синтезировали кДНК с олиго-dT-содержащих праймеров. 5' и 3' концы кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с универсальных и генспецифичных праймеров.
Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу Сэнгера с использованием BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems).
2. Амплификация 5'-фланкирующей области гена Nanog полёвки методом инверс-ПЦР.
В известной 5'-области Nanog полёвки картировали сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции (6-нуклеотидные, невырожденные, дающие липкие концы, расположенные не чаще, чем 1 сайт на 1 т.п.н.). Провели гидролиз гДНК полёвки. Продукты гидролиза очистили и лигировали «на себя».
Лигазные смеси использовали как матрицу для ПЦР с вложенных праймеров (2 праймера «реверс» на известный 5'-конец и 2 праймера «форвард» под каждый сайт). Полученные ПЦР-продукты клонировали и секвенировали.
3. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК.
Поиск гомологичных последовательностей проводили при помощи программы BLASTN (Altschul et al., 1990) в базах данных секвенированных и аннотированных геномов (http://genome.ucsc.edu/, http://www.ensembl.org, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Повторы идентифицировали с помощью программ CENSOR (http://www.girinst.org/censor/index.php) (Jurka et al., 1996) и RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org). Выравнивание двух и более нуклеотидных последовательностей проводили при помощи программ mVista (http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml) (Frazer et al., 2004), PipMaker (http://pipmaker.bx.psu.edu/pipmaker/) (Schwartz et al., 2000), FASTA (Pearson, Lipman, 1988). Поиск потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов осуществляли при помощи программы MatInspector (http://www.genomatix.de) (Cartharius et al., 2005).
4. Конструирование репортерных векторов. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы.
Для получения репортёрных конструкций части 5'-области гена Nanog полёвки амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции KpnI и XhoI, гидролизовали соответствующими эндонуклеазами и клонировали в вектор pGL4.10[luc2] (Promega) по липким концам. Препаративные количества пДНК репортёрных конструкций очищали с помощью набора реактивов PureLink TM HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit (Invitrogen). Для трансфекции клеток использовали LipofectamineTM2000 (Invitrogen). Люциферазную активность детектировали при помощи Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). Измерения проводили на счётчике Wallac 1420 (PerkinElmer).
5. Бисульфитное секвенирование.
Для бисульфитной обработки геномной ДНК использовали набор реактивов EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Участки гДНК, модифицированной бисульфитом, амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймеров: «промотор» (Nanog_CpG_F2 5'-ttttgtattataatgtttttggtgaattt-3', Nanog_CpG_R1 5'-aacaacaaaactaaaactctaaaactcaa-3'), «1 экзон — 1 интрон» (Nanog_CpG_F5* 5'-ttgagttttagagttttagttttgttgtt-3', Nanog_CpG_R3 5' aaatttacttacaaaaaatatcgtcccc-3'). Продукты амплификации клонировали и секвенировали. Последовательности отдельных клонов анализировали программой QUMA (http://quma.cdb.riken.jp/).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Структура кодирующих областей генов Oct4 и Nanog, а также регуляция гена Oct4 восточно-европейской полёвки Microtus levis ранее были подробно изучены (Medvedev et al., 2008;
Медведев et al., 2009). В то же время у полёвки не изучена регуляция ключевого гена плюрипотентности — Nanog и не охарактеризованы остальные гены плюрипотентности. В данной работе было продолжено исследование генетической системы поддержания плюрипотентности клеток полёвки.
Структура и экспрессия генов Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb и Myc полёвки Построили множественные выравнивания нуклеотидных последовательностей ортологов генов Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb и Myc млекопитающих (мышь, крыса, хомяк, суслик, морская свинка, человек, собака, корова, лошадь). В выравнивание включили также наиболее сходные по последовательности паралогичные гены. Для каждого гена определили области, консервативные в ортологичных генах и отсутствующие, либо измененные в паралогичных генах, и подобрали к ним праймеры для ПЦР.
Учитывали также расположение повторяющихся последовательностей ДНК и экзон-интронную структуру генов. Продукты амплификации с гДНК или кДНК полёвки секвенировали и подтвердили их принадлежность к изучаемым генам.
Полные последовательности транскриптов генов Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb и Myc полёвки установили при помощи RACE амплификации концов кДНК.
Полученные RACE ПЦР-продукты клонировали и секвенировали.
Последовательность кДНК каждого гена получали, объединяя все сиквенсы на основе перекрывания.
У всех пяти генов нашли потенциальные рамки считывания и определили вероятные последовательности полипептидов.
Последовательности кодирующих областей генов Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb, Myc, Oct4, Nanog, а также последовательности соответствующих полипептидов сравнили с ортологами мыши и крысы. В кодирующих частях генов изменчивость во всех случаях представлена только однонуклеотидными заменами, мелкими делециями/инсерциями без сдвига рамки считывания, что согласуется с белок-кодирующей функцией этих последовательностей. Уровень сходства кодирующих областей генов Sox2, Klf4, Esrrb и Myc в парных сравнениях составляет 93-98%, а полипептидных последовательностей — 93-100% (табл. 1). Ген Sall4 выделяется существенно меньшим уровнем межвидового сходства в районе 80-90% как в ДНК, так и в белке (табл. 1). По этому параметру Sall4 сходен с генами Oct4 и Nanog, функция которых ограничена системой плюрипотентности. Наиболее тесно ассоциированный с формированием плюрипотентности ген Nanog наименее консервативен у млекопитающих (табл. 1).
Таблица 1. Уровень сходства последовательностей кДНК генов полёвки и предсказанных полипептидных продуктов с ортологами мыши и крысы.
Уровень гомологии кодирующей Уровень гомологии Ген области кДНК (полной кДНК), % предсказанного полипептида, % полёвка/мышь полёвка/ крыса полёвка/ мышь полёвка/ крыса Sox2 98 (96) 97 (96) 98 Klf4 95 (95) 95 (95) 96 Myc 93 (91) 94 (91) 95 Sall4 84 (83) 88 (88) 81 Esrrb 93 (93) 93 (93) 93 Oct4 88 (82) 88 (84) 85 Nanog 70 (66) 72 (62) 58 Большинство консервативных доменов в полипептидных последовательностях SOX2, KLF4, SALL4, ESRRB и MYC полёвки сохраняют 90-100% сходство последовательности с ортологичными доменами мыши и крысы (табл. 2), что также подтверждает функциональность соответствующих белков у полёвки.
Таблица 2. Консервативные домены предсказанных полипептидных продуктов генов Sox2, Klf4, Myc, Sall4, Esrrb, Oct4 и Nanog полёвки.
Размер у Уровень гомологии полипептидной Ген Домен полёвки, а.к. последовательности домена, % мышь/крыса полёвка/мышь полёвка/крыса Sox2 SOX-TCF_HMG-box 72 100 100 zf-H2С2_2 26 100 100 Klf zf-H2С2_2 18 100 100 MYC_N 202 99 96 MYC_N 77 99 94 Myc HLH 60 98 98 Myc-LZ 32 97 91 Sall4 zf-H2С2_2 26 96 100 Esrrb NR_DBD_ERR 82 99 100 Pou 75 100 96 Oct homeodomain 59 90 85 Nanog homeodomain 59 93 86 Методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ ПЦР) изучили транскрипцию генов Oct4, Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb, Myc полёвки в культивируемых клеточных линиях, 7- и 9-дневных эмбрионах и органах взрослых полёвок. Обнаруженный у полёвки паттерн транскрипции в целом совпадает с характерным для ортологичных генов мыши. В 7-9-суточных эмбрионах полёвки выявлена транскрипция всех изучаемых генов (рис. 1), что согласуется с их функционированием в развитии. Подтверждена характерная для генов органо-специфичная транскрипция (Sox2 — в мозге и желудке, Sall4 — в гонадах) (рис. 1). Гены Klf4 и Myc показывают почти конститутивную транскрипцию в большинстве исследованных клеток и органов (рис. 1), что можно объяснить их ролью в регуляции клеточного цикла (Amati et al., 1998;
Rowland et al., 2005).
ёвк бр.
р.
.) ик, ик, фф мыш. фиб ик о.
о.
. фи к эм б и и ечн д.п.
удо ечн це енн д.п.
ень ник (ди кое и ка д эм б г XEN киш жел киш сем сер моз пол печ яич поч лёг 7, 9, TS TS + Sox + Klf + Myc + Sall + Esrrb + Actb Рисунок 1. Экспрессия генов Sox2, Klf4, Myc, Sall4 и Esrrb в клеточных линиях, эмбрионах и органах взрослых полёвок.
мы и вк ши ле по.
ф, р.
р.
ши ф к, ик ик иб иб ди ни к мы чн до нн це мо.
c.
нь ик ф ф е c не еч а p.
p.
гко 1.
ше ме лу рд че чн зг чк б.
б.
N К ш d.
d.
, ЭС ТС XE же эм эм ле по яи пе се се ки ки RT+ Oct RT RT+ Actb RT К.
ДН ф и ф ш ик ая ди мы нн c.
мн ик не а p.
2.
ме чн чк но К d.
, ЭС ТС по яи се ге 3’Oct Hprt Рисунок 2. Экспрессия гена Oct4 полёвки в клеточных линиях, эмбрионах и органах взрослых особей. 1 – данные ОТ ПЦР. 2 – данные 3’RACE.
Транскрипты Oct4 обнаружили при помощи ОТ ПЦР в ЭСК мыши, 7- и 9-дневных эмбрионах, яичниках, семенниках, а также в TC клетках полёвки (рис. 2). Однако 3'RACE подтверждает наличие полиаденилированных транскриптов только в ЭСК мыши и яичниках полёвки (7-дневный эмбрион полёвки не был проанализирован). Экспрессия Oct4 отсутствует в XEN и TC клетках полёвки (рис. 2). По-видимому, у полёвки, как и у мыши, ген Oct является маркерным для производных эпибласта (Medvedev et al., 2008), тогда как у человека, коровы и козы экспрессия Oct4 наблюдается также в производных трофобласта (Cauffman et al., 2005).
Сравнительный анализ последовательностей 5'-регуляторной области гена Nanog млекопитающих Фрагменты 5'-области гена Nanog полёвки амплифицировали при помощи инверс-ПЦР. Всего получили и секвенировали 6 продуктов инверс ПЦР размером от 1,2 до 2,3 т.п.н. В результате установили последовательность размером 4,7 т.п.н. от точки старта транскрипции Nanog (GenBank EU908043.2). Полученную последовательность 5'-области Nanog полёвки сравнили с ортологичными последовательностями хомяка, мыши, крысы, человека, собаки, коровы и лошади (рис. 3).
Рисунок 3. Консервативность регуляторной области Nanog млекопитающих. По оси абсцисс отложены позиции нуклеотидов полёвки, а по оси ординат – процент идентичности последовательностей указанных видов с последовательностью полёвки в пределах от 50 до 100%. CR1-CR3 – консервативные районы, треугольники – SINE, прямоугольники – простые повторы.
5'-регуляторная область гена Nanog полёвки состоит из трёх консервативных районов (CR1-CR3), в которых прослеживается межвидовая гомология, и двух блоков SINE-повторов (рис. 3). Районы CR1 и CR3 есть у всех исследованных видов млекопитающих и соответствуют проксимальному промотору и дистальному энхансеру гена Nanog. Район CR2 есть только у грызунов, кроме крысы (рис. 3). В сравнении с другими грызунами 5'-область Nanog полёвки обогащена SINE-повторами, занимающими 37,5% всей последовательности. Проксимальный блок SINE-повторов имеется у всех грызунов, кроме крысы. Дистальный блок SINE-повторов есть только у полёвки и мыши, причём у полёвки его размер существенно больше (рис. 3).
У крысы вся средняя часть 5'-регуляторной области гена Nanog, включая проксимальный и дистальный блоки SINE-повторов, и расположенный между ними район CR2, удалена делецией протяженностью около 2 т.п.н. (рис. 3).
Определение потенциальных регуляторных элементов в 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки Составили список сайтов связывания транскрипционных факторов, экспериментально подтверждённых в 5'-регуляторной области Nanog мыши (табл. 3). Проверили у полёвки гомологию этих сайтов в составе ортологичных участков. В 5'-области Nanog полёвки локализовали участки размером не менее 4 п.н., в которых последовательности полёвки, хомяка, мыши и крысы идентичны, либо содержат минимум замен (т. н.
«филогенетические футпринты»). Наличие у полёвки потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов предсказали программой MatInspector. По сумме полученных сведений в 5'-области Nanog полёвки локализовали 15 потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов (табл. 3, выделены зелёным цветом).
В промоторе гена Nanog полёвки обнаружены потенциальные сайты связывания SP1/SP3, KLF, ZIC3, OCT4-SOX2, а в дистальном энхансере — сайты T, STAT, ZFP281, KLF, SALL4. Ортологи этих сайтов найдены также в 5'-регуляторных областях Nanog мыши, крысы и хомяка и, по-видимому, являются облигатными регуляторными элементами гена Nanog грызунов.
Кроме того, в 5'-области Nanog полёвки обнаружены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов FOXD3, REST и p53. У полёвки не обнаружены ортологи сайтов связывания транскрипционных факторов TCF и GCNF мыши. У крысы сайты FOXD3, REST, p53, TCF и GCNF удалены из 5'-регуляторной области Nanog протяжённой делецией и, по-видимому, являются факультативными регуляторными элементами данного гена у грызунов.
Среди выявленных облигатных регуляторов гена Nanog у грызунов система ZFP281-NANOG является единственной, вызывающей репрессию, тогда как остальные вызывают активацию транскрипции гена. Вероятно, негативная регуляция Nanog у грызунов более изменчива по сравнению с позитивной.
Таблица 3. Потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в 5'-регуляторных областях Nanog мыши и полёвки (сайты, консервативные у полёвки, выделены зелёным цветом).
Mus musculus Транскрипционный гомология MatInsp ФФ*** фактор полёвка/мышь* ector** последовательность ссылка NANOG-SALL4 CATTCC Wu et al., 2006 83.3 + + KLF2/KLF4/KLF5 CCCCACCC Jiang et al., 2008 88.9 + + ZFP281_site1 CCACCCACA Levasseur et al., 2008 100 + + NANOG_site2 CCTCCCTATTCAAA Levasseur et al., 2008 85.7 - + ZFP281_site2 TGGGGGTTG Levasseur et al., 2008 88.9 + + STAT TTCCTAGAA Suzuki et al., 2006 66.7 - + GGGACACACCTAGGGT T Suzuki et al., 2006 60 + + TCCC GCNF AGTTCAAGGCCA Gu et al., 2005 - - TCF_site1 ACTTTG 50 - Kim et al., TCF_site2 CAAAGA Kim et al., 2011 100 + GGGCATGGTGGTAGAC p53_site1 Lin et al., 2005 56.5 - AAGCCT CAGCAAGGTCTGACTC p53_site2 Lin et al., 2005 65.5 + + TTTCATGTCT AGCAAGGTCTGACTCT REST TTCATGTCTGTAGAAAG ChIP-seq, UCSC 66 - + AATGGAAGAG TAAAAGATGAATAAAG FOXD3 Pan et al., 2006 53.3 + + TGAAATGAGGTAAA ZFP143 AAGCCTCTTTTTGGG Chen et al., 2008 53.3 - OCT4-SOX2 TTTTGCATTACAATG Rodda et al., 2005 93.3 + + ZIC3 CCTGCAGG Lim et al., 2010 88.9 - + SP1/SP3 (A) GGGGCGT Wu et al., 2006 100 + + SP1/SP3 (B) GGGGGTGGG Wu et al., 2006 100 + + SP1/SP3 (C) AGGGGGGAGGAGCAG Wu et al., 2006 66.7 - + TBP TTTAAA нет 65.2 + * гомология в границах указанного сайта в составе ортологичного участка. При отсутствии у полёвки ортологичного участка значение гомологии не определено.
** солокализация с потенциальным сайтом предсказанным программой MathInspector *** перекрывание с районом на «филогенетическом футпринтинге» (ФФ) Функциональный анализ 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки Всю 5' область Nanog полёвки условно разделили на 6 участков, которые амплифицировали и встроили в репортёрный вектор pGL4.10 (Dual Luciferase® Reporter Assay System, Promega). Минимальная конструкция (с2) имела встройку только первого участка, а к последующим конструкциям (с3 с7) поочередно добавляли остальные участки, так что максимальная конструкция (с7) содержала ген люциферазы под контролем полной 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки (рис. 4). Репортёрные конструкции трансфицировали в Nanog-отрицательные эмбриональные фибробласты полёвки и Nanog-положительные эмбриональные стволовые клетки мыши.
Проксимальный промотор Nanog полёвки, содержащий предполагаемые сайты SP1/SP3, ZIC3 и OCT4-SOX2, активирует транскрипцию независимо от статуса плюрипотентности клеток (рис. 4, конструкция с2). Более дистально расположенные регуляторные элементы Nanog полёвки специфично усиливают экспрессию репортёрного гена в плюрипотентных клетках и подавляют её в эмбриональных фибробластах. Область промотора, содержащая потенциальные сайты FOXD3 (активатор), REST (репрессор) и p53 (репрессор), имеет активирующее, либо репрессирующее действие в зависимости от статуса плюрипотентности клеток (рис. 4, конструкция с3), что может говорить о функционировании всех трёх сайтов. Проксимальный блок SINE-повторов полёвки содержит неизвестный у мыши позитивный регуляторный элемент, активный в плюрипотентных клетках (рис. 4, конструкция с4). Область CR2 содержит пока неизвестный негативный регуляторный элемент Nanog, не зависящий от статуса плюрипотентности клеток (рис. 4, конструкция с5). Сравнительно протяженный дистальный блок SINE-повторов не влияет на экспрессию репортёрного гена (рис. 4, конструкция с6) и, по-видимому, лишен регуляторных элементов.
Дистальный энхансер Nanog полёвки лишь немного усиливает экспрессию репортёрного гена в плюрипотентных ЭСК мыши, культивируемых при стандартной концентрации LIF (рис. 4, конструкция с7), что характерно и для дистального энхансера Nanog мыши (Suzuki et al., 2006).
Рисунок 4. Трансфекция репортёрных конструкций (с2-с7), содержащих различные участки регуляторной области гена Nanog полёвки, в эмбриональные фибробласты (ЭФ) полёвки и эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши. По оси абсцисс отложена интенсивность репортёрной люминесценции в относительных единицах. CR1-CR3 – консервативные районы, pGL4.10 – контрольный вектор без встройки.
Анализ регуляторной активности сайтов связывания OCT4, SOX2 и KLF4 в промоторе гена Nanog полёвки Cогласно данным литературы, а также анализа, проведённого в данной работе, проксимальный промотор Nanog полёвки содержит сайты связывания транскрипционных факторов OCT4, SOX2, а также возможный сайт KLF4, но не содержит сайта связывания MYC. Для подтверждения функциональной активности этих потенциальных сайтов использовали метод репортёрных люциферазных конструкций в сочетании со сверхэкспрессией отдельных транскрипционных факторов полёвки.
Собрали четыре моноцистронные конструкции, экспрессирующие транскрипционные факторы OCT4, SOX2, KLF4, MYC полёвки, и одну бицистронную конструкцию, экспрессирующую одновременно OCT4 и SOX полёвки. Провели совместную трансфекцию в эмбриональные фибробласты полёвки репортёрной конструкции с2 (ген люциферазы под контролем минимального промотора Nanog полёвки) и различных количеств конструкций, экспрессирующих транскрипционные факторы.
Рисунок 5. Совместная трансфекция репортёрной конструкции с2 и конструкций, экспрессирующих OCT4, SOX2, KLF4 полёвки, а также бицистронной конструкции, экспрессирующей одновременно OCT4 и SOX полёвки, в эмбриональные фибробласты полёвки. Использовали различные количества экспрессирующих конструкций — 20, 100 или 500 нг пДНК на одну трансфекцию.
Индуцированная экспрессия OCT4 дозозависимо усиливает активность промотора Nanog полёвки, тогда как экспрессия SOX2, наоборот, дозозависимо репрессирует промотор (рис. 5). Как и у мыши, у полёвки при совместной экспрессии OCT4 и SOX2 преобладает репрессивное действие SOX2 (рис. 5, (Boer et al., 2007)). В совокупности эти данные подтверждают функциональность у полёвки композитного сайта связывания транскрипционных факторов OCT4-SOX2, являющегося важнейшим регуляторным элементом гена Nanog мыши и человека. Индуцированная экспрессия KLF4 в фибробластах полёвки не влияет на активность проксимального промотора Nanog (рис. 5). Тем не менее, в проксимальном A Б 4. полёвка мышь 3. 3. UM 2. SC S деметилированная пДНК, mE EF 2. метилированная пДНК RT+ 1. Nanog RT 1. RT+ 0. Actb RT 0. SP1/SP3(C) SP1/SP3(A) SP1/SP3(B) pGL c2 20 100 4. Nanog c2 + OCT OCT ZIC 5'UTR cds exon -1 -0,5 0,5 т.п.н. т.п.н. т.п.н. т.п.н.
В 89% TSC CKR134 48% XEN 4S 37% 73% 41% EF SUM1 50% Рисунок 6. Участие CpG-метилирования ДНК в подавлении транскрипции гена Nanog полёвки. А. Совместная трансфекция в эмбриональные фибробласты полёвки метилированной либо деметилированной репортёрной конструкции с2 и конструкции, экспрессирующей OCT4 полёвки (20, 100 или 500 нг на одну трансфекцию).
Б. ОТ ПЦР-анализ транскрипции гена Nanog в клетках полёвки и мыши. B.
Бисульфитное секвенирование области минимального промотора и начала первого интрона гена Nanog в трех линиях Nanog-негативных клеток полёвки.
TS CKR134 – трофобластные стволовые клетки полёвки, XEN 4S – стволовые клетки экстраэмбриональной энтодермы полёвки, EF SUM1 – эмбриональные фибробласты полёвки, MEF – эмбриональные фибробласты мыши, mESC – эмбриональные стволовые клетки мыши.
промоторе гена Nanog полёвки присутствуют три высококонсервативных сайта связывания транскрипционных факторов SP1/SP3, любой из которых может являться также сайтом связывания KLF4. Возможно, взаимодействие KLF4 c промотором Nanog требует наличия белковых партёров, присутствующих только в плюрипотентных клетках. Экспрессия Myc не оказывает эффекта на активность минимального промотора Nanog полёвки в составе репортёрной конструкции (данные не представлены). Этот результат согласуется с данными для мыши, у которой MYC не связывается с регуляторной областью Nanog и не влияет на экспрессию Nanog напрямую.
Изучение роли метилирования ДНК в поддержании неактивного состояния гена Nanog полёвки 5'-область Nanog полёвки не имеет характерных для некоторых генов CpG-островков. Единственная область, обогащённая CpG-динуклеотидами, расположена у полёвки в начале первого интрона Nanog. Метилирование этой области и расположенного по соседству района минимального промотора изучили в трофобластных стволовых клетках (TS CKR134 (Grigor'eva et al., 2009)), стволовых клетках экстраэмбриональной энтодермы (XEN 4S (Шевченко et al., 2008)) и эмбриональных фибробластах (EF SUM1) полёвки.
Экспрессия гена Nanog в этих клетках не детектируется при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (рис. 6). Минимальный промотор Nanog во всех трёх типах клеток метилирован на среднем уровне. Район в начале первого интрона является дифференциально-метилируемым – он гиперметилирован в клетках экстраэмбриональных линий (TS и XEN клетки) и имеет средний уровень метилирования в клетках эмбриональной линии (EF) (рис. 6).
Возможно, эти различия между клетками связаны с хронологией событий раннего развития: у грызунов эмбрион развивается из Nanog-позитивных бластомеров, а экстраэмбриональные ткани – из Nanog-негативных бластомеров ранней бластоцисты (Frankenberg et al., 2011). Полученные данные указывают на потенциальное участие метилирования в подавлении экспрессии Nanog в экстраэмбриональных тканях полёвки в раннем развитии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате работы у восточно-европейской полёвки (Microtus levis) впервые охарактеризовали ортологи генов Sox2, Klf4, Esrrb, Sall4 и Myc.
Последовательности кодирующих областей генов Sox2, Klf4, Esrrb и Myc, а также их предсказанных полипептидных продуктов сохраняют 90-100% сходство с ортологичными последовательностями мыши и крысы. Ген Sall относится к менее консервативным (80-90% сходство у грызунов) как и гены Oct4 и Nanog (80-90% и 60-70% сходство у грызунов, соответственно). В предсказанных полипептидных последовательностях SOX2, KLF4, SALL4, ESRRB и MYC полёвки присутствуют консервативные домены, необходимые для функционирования ортологичных белков мыши и человека. Гены Oct4, Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb, Myс в основаном сохраняют паттерн органо- и тканеспецифичной транскрипции, характерный для мыши. Таким образом, ключевые транскрипционные факторы плюрипотентности консервативны у полёвки как по структуре, так и по экспрессии.
Впервые установлена нуклеотидная последовательность 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки размером 4,7 т.п.н. от точки старта транскрипции. Сравнение с ортологичными последовательностями мыши и ещё шести различных млекопитающих показало наличие у полёвки ортологов промотора и дистального энхансера гена Nanog. Центральная часть 5' регуляторной области Nanog, расположенная между промотором и дистальным энхансером, обогащена мобильными элементами, и её нуклеотидная последовательность сравнительно слабо консервативна у млекопитающих.
В 5'-области гена Nanog полёвки локализовали 15 потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов: в промоторе обнаружили потенциальные сайты SP1/SP3, KLF, ZIC3, OCT4-SOX2, а в дистальном энхансере — сайты T, STAT, ZFP281, KLF, SALL4. Ортологи этих сайтов присутствуют также у мыши, крысы и хомяка и, предположительно, являются облигатными регуляторными элементами гена Nanog грызунов. Установлено, что у крысы сайты FOXD3, REST, p53, TCF и GCNF удалены из 5' регуляторной области Nanog протяжённой делецией и, по-видимому, являются факультативными регуляторными элементами данного гена у грызунов. Таким образом, у грызунов наблюдается дефицит облигатных негативных регуляторов гена Nanog.
Функциональный анализ 5'-области Nanog полёвки с помощью репортёрных конструкций показал активность проксимального промотора как в плюрипотентных, так и в неплюрипотентных клетках. Проксимальный промотор Nanog полёвки содержит потенциальные сайты связывания SP1/SP3, KLF, ZIC3 и OCT4-SOX2, причём индуцированная экспрессия OCT усиливает активирующее действие промотора, а экспрессия SOX2 — ослабляет. Участок регуляторной области, содержащий сайты FOXD3, REST и p53, активирует, либо репрессирует транскрипцию в зависимости от статуса плюрипотентности клеток, что согласуется с функционированием у полёвки всех трёх сайтов. Проксимальный блок SINE-повторов полёвки содержит неизвестный позитивный регуляторный элемент, активный в плюрипотентных клетках. Дистальный энхансер Nanog полёвки незначительно усиливает экспрессию репортёрного гена в плюрипотентных ЭСК мыши в нормальных условиях культивирования. Полученные данные подтверждают наличие у полёвки функциональных промотора и энхансера гена Nanog.
Единственный участок, обогащённый CpG-динуклеотидами, расположен у полёвки в начале первого интрона Nanog. Эта область гиперметилирована в стволовых клетках экстраэмбриональных тканей, но метилирована на среднем уровне в эмбриональных фибробластах полёвки. Таким образом, данный район является у полёвки дифференциально-метилируемым, что указывает на потенциальное участие метилирования в подавлении экспрессии Nanog в экстраэмбриональных тканях полёвки.
ВЫВОДЫ 1. Потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов SP1/SP3, KLF, ZIC3, OCT4-SOX2 в составе промотора гена Nanog, а также сайты T, STAT, ZFP281, KLF и SALL4 в составе энхансера этого гена являются консервативными регуляторными элементами Nanog грызунов. Сайты FOXD3, REST, p53, TCF и GCNF имеются не у всех грызунов и являются факультативными регуляторными элементами гена Nanog.
2. В 5'-регуляторной области гена Nanog восточно-европейской полёвки Microtus levis присутствуют и функционируют проксимальный промотор и дистальный энхансер.
3. Установлено, что проксимальный промотор гена Nanog полёвки активирует экспрессию независимо от статуса плюрипотентности клетки, а дистальные регуляторные районы специфично усиливают экспрессию гена Nanog в плюрипотентных клетках и подавляют её в эмбриональных фибробластах.
4. Показано, что гены Oct4, Sox2, Klf4, Esrrb, Sall4 и Myc полёвки сходны с соответствующими генами мыши как по нуклеотидной последовательности, так и по паттерну экспрессии в органах взрослых особей.
5. Белок OCT4 полёвки способен активировать, а белок SOX2 — репрессировать минимальный промотор Nanog полёвки in vitro, что подтверждает функциональность соответствующих сайтов связывания.
6. CpG-метилирование ингибирует активность минимального промотора гена Nanog полёвки. В стволовых клетках экстраэмбриональных тканей полёвки наблюдается гиперметилирование CpG-обогащённого участка в начале первого интрона гена Nanog.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Сорокин М.А., Медведев С.П. Шевченко А.И., Слынько Н.М., Закиян С.М. Экспрессия генов раннего развития у полёвки Microtus rossiaemeridionalis // Генетика 2010. Т. 46. № 2. С. 282-286.
2. Сорокин М.А., Елисафенко Е.А., Мазурок Н.А., Закиян С.М.
Структурно-функциональный анализ 5'-регуляторной области гена Nanog полёвки // Доклады Академии Наук. 2013. T. 452. № 1. С. 100-105.
3. Сорокин М.А. Генетические и эпигенетические механизмы предымплантационного развития мыши / Эпигенетика. Под ред. С.М.
Закияна, В.В. Власова, Е.В. Дементьевой. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2012. С. 207-224.
4. Сорокин М.А. Экспрессия генов раннего развития у обыкновенной полёвки Microtus rossiaemeridionalis // Материалы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, 13-18 апреля 2009 г.).
5. Sorokin M.A., Elisaphenko E.A. Investigation of vole Nanog regulatory region // Материалы конференции BGRS/SB'2012 (Новосибирск, 25-29 июня 2012 г.).
6. Сорокин М.А., Елисафенко Е.А. Исследование регуляторной области гена Nanog полёвки // Материалы международной конференции «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2-7 сентября 2012 г.).
Подписано к печати 22.07.2013 г.
Формат бумаги 6090 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0, Тираж 110 экз. Заказ № Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева,