Биологическая активность новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках hep g2 и mcf-7
На правах рукописи
Мехтиев Ариф Раминович БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ОКСИГЕНИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ СТИГМАСТАНА И ЭРГОСТАНА В КЛЕТКАХ HEP G2 И MCF-7 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2008
Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук
Научный консультант: доктор биологических наук Мишарин Александр Юрьевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Соколов Николай Николаевич доктор биологических наук Торховская Татьяна Ивановна
Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Росмедтехнологий
Защита диссертации состоится «» _ 2008 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при Государственном учреждении Научно исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук по адресу 119121, г. Москва, ул. Погодинская,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно исследовательского института биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук
Автореферат разослан «» _ 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Карпова Е. А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Изучение физиологически активных природных соединений и их синтетических производных является важнейшим направлением современной биомедицинской химии. Препараты, созданные на основе природных соединений, широко применяются в лечении и профилактике онкологических, инфекционных, сердечно-сосудистых, аутоиммунных заболеваний и нарушений метаболизма.
Высоким фармакологическим потенциалом обладают природные изопреноиды, в частности стерины растительного и микробного происхождения, а также продукты их химической трансформации. Наибольшее значение имеют оксигенированные производные растительных и микробных стеринов, которые являются близкими структурными аналогами оксистеринов - важнейших регуляторных молекул в организме млекопитающих. При физиологических концентрациях оксистерины регулируют биосинтез, метаболизм и транспорт изопреноидов, липидов, желчных кислот, углеводов, играют важную роль в процессах клеточной дифференцировки и апоптоза. Однако неоднократные попытки использования природных оксистеринов в качестве фармакологических регуляторов липидного обмена потерпели неудачу из-за их быстрого метаболизма в клетках печени, а также вследствие многочисленных побочных эффектов, обусловленных наличием множества потенциальных мишеней для соединений стеринового ряда.
В лаборатории Синтеза физиологически активных соединений ГУ НИИ БМХ РАМН был осуществлен синтез новой серии оксигенированных производных стигмастана и эргостана. Основу проекта составляет гипотеза, что направленная химическая трансформация доступных молекул эргостерина и стигмастерина представляет собой перспективный путь получения новых оксистеринов, обладающих регуляторной активностью в клетках млекопитающих и проявляющих пролонгированный эффект по сравнению с аналогичными производными ряда холестана. Данная диссертация является частью этого проекта.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение биологической активности и оценка фармакологического потенциала новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках гепатобластомы человека линии Hep G2 и карциномы молочной железы человека линии MCF-7.
Выбор вышеуказанных клеточных культур был обусловлен тем, что клетки MCF-7 и Hep G2 являются стандартными моделями для первичного тестирования потенциальных противоопухолевых препаратов и регуляторов липидного обмена, соответственно. Кроме того, исследование биологической активности оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках Hep G2 особенно интересно, поскольку в клетках печени регуляторно активные производные холестана быстро деградируют, теряя активность.
Задачи работы:
1) Оценка влияния новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана на жизнеспособность и пролиферацию клеток MCF-7 и Hep G2;
исследование цитотоксичности наиболее активных соединений.
2) Изучение влияния оксигенированных производных стигмастана и эргостана на биосинтез холестерина в клетках Hep G2;
исследование (22E)-5-эргоста-8(14),22 диен-15-он-3-ола, (22S,23S)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола и (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола в качестве регуляторов биосинтеза и метаболизма холестерина в клетках печени.
3) Исследование влияния (22S,23S)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола и (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола на биосинтез холестериловых эфиров и активность ацилкофермент-А:холестерин ацилтрансферазы (АСАТ) в клетках Hep G2.
4) Исследование влияния (22S,23S)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола и (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола на метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2.
Научная новизна работы. В работе проведено исследование биологической активности 22 новых синтетических производных стигмастана и эргостана в клетках MCF-7 и Hep G2. Впервые показано, что новые производные стигмастана, содержащие (22R,23R)-22,23-диольную функцию, подавляют жизнеспособность клеток млекопитающих, причем токсический эффект определяется жесткой конформацией боковой цепи. В результате работы найдены три новых производных эргостана, эффективно подавляющих биосинтез и регулирующих метаболизм холестерина в клетках Hep G2. Регуляторная активность этих соединений определялась стереохимической конфигурацией атомов С22 и С23.
Теоретическое и практическое значение работы. Работа убедительно доказала справедливость гипотезы, согласно которой направленная модификация боковой цепи природных стеринов является перспективным подходом к созданию новых биологически активных соединений с высоким фармакологическим потенциалом.
Проведенные исследования показали перспективу использования новых производных стигмастана и эргостана, содержащих оксигенированную боковую цепь, в качестве потенциальных цитотоксиков, цитостатиков, регуляторов клеточного сигналинга и липидного метаболизма, а также позволили провести прогноз биологической активности и оценки фармакологического потенциала некоторых стеринов растительного происхождения и их синтетических производных.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1) В результате проведенных исследований установлено, что производные (22R,23R) 22,23-дигидроксистигмастана токсичны в клетках MCF-7 и Hep G2.
2) В результате проведенных исследований установлена высокая цитотоксичность (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола в клетках MCF-7.
8(14)-15 3) В результате проведенных исследований установлено, что кетопроизводными эргостана подавляют биосинтез и регулируют метаболизм холестерина в клетках Hep G2, причем различия в биологической активности определяются структурой боковой цепи и стереохимической конфигурацией атомов С22 и С23.
4) В результате проведенных исследований установлено, что изомерные (22S,23S) 22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол и (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост 8(14)-ен-15-он-3-ол оказывают различное влияние на биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Hep G2.
5) В результате проведенных исследований установлено, что изомерные (22S,23S) 22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол и (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост 8(14)-ен-15-он-3-ол активируют метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на международных конференциях “ Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового покoления (март 2006, ЦВТ ХИМРАР, г. Химки)”, “Новые технологии создания инновационных лекарств (декабрь 2006, ЦВТ ХИМРАР, г.
Химки)”, “Перспективы разработки противоопухолевых лекарств с новыми механизмами действия (декабрь 2007, ЦВТ ХИМРАР, г. Химки)”, конференции научных работ ГУ НИИ БМХ РАМН (май 2007, Москва). Материалы диссертационной работы отражены в 9 публикациях: 6 статей и 3 публикации в сборниках докладов научных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: “Bведение”, “Обзор литературы (Биологическая активность фитостеринов и их производных)”, “Материалы и методы”, “Результаты и их обсуждение”, “Заключение”, “Выводы”. Диссертация изложена на 92 страницах, иллюстрирована 33 рисунками, список литературы включает 230 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Химические реактивы, растворители и хроматографические материалы получены от фирм “Sigma”, “Merck”, “Aldrich”, “Woelm” и “МедХимЛаб”;
культуральный пластик, среды и сыворотка - от фирм “Greiner”, “Costar”, “Corning”, “Gibco BRL” и “HyClone”;
радиоактивные изотопы от фирмы “Amersham” и “ВО Изотоп”;
синтетические олигонуклеотиды – от АOO “Cинтол”. 5-Холест-8(14)-ен-15 он-3-ол (15-кетостерин) и оксигенированные производные стигмастана и эргостана ( – 22) cинтезированы в лаборатории Синтеза физиологически активных соединений ГУ НИИ БМХ РАМН. Структурные формулы соединений 1 – 22 приведены на рис.1.
Культуры клеток. Клетки гепатомы человека линии Hep G2 (ECACC) и клетки карциномы молочной железы человека линии MCF-7 (АТCC), выращивали в 96 луночных, 24-луночных, 6-луночных планшетах, чашках диаметром 35 мм или флаконах площадью 25 см2. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, в атмосфере 5% СО2 при 37оС. Перед экспериментом клетки выдерживали ч в среде, содержащей 10% FCS, или в бессывороточной среде. Исследуемые соединения добавляли к культуральной среде в этанольном растворе.
Y1, (22S,23S) X1, O H HO Y H3C X2, H HO Y2, CH3 O (22R,23R) H H3C O X3, H HO HOOH Y3, (22R,23R) HO OH H3C CH X4, HO H3C O HH X5, HO OH X6, HO OH X St X7, O X8, O O Y1, (22S,23S) O H Y H3C CH H H3C Y2, O (22R,23R) H H H3C Y3, (22R,23R) HO OH CH H3C HH H O Y4, (22E) HO St H H Рис. 1. Оксигенированные производные стигмастана и эргостана: 1 (St1,X1,Y1) – (22S,23S)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-3-ол;
2 (St1,X1,Y2) - (22R,23R)-22,23 оксидостигмаст-5-ен-3-ол;
3 (St1,X1,Y3) - (22R,23R)-стигмаст-5-ен-3,22,23-триол;
(St1,X7,Y1) - (22S,23S)-22,23-оксидостигмаст-4-ен-3-он;
5 (St1,X7,Y2) - (22R,23R)-22,23 оксидостигмаст-4-ен-3-он;
6 (St1,X7,Y3) - (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмаст-4-ен-3 он;
7 (St1,X8,Y1) - (22S,23S)-22,23-оксидостигмаст-4-ен-3,6-дион;
8 (St1,X8,Y2) (22R,23R)-22,23-оксидостигмаст-4-ен-3,6-дион;
9 (St1,X8,Y3) - (22R,23R)-22,23 дигидроксистигмаст-4-ен-3,6-дион;
10 (St1,X2,Y3) - (22R,23R)-5,6 оксидостигмастан-3,22,23-триол;
11 (St1,X3,Y3) - (22R,23R)-стигмастан-3,5,6 22,23-пентаол;
12 (St1,X4,Y1) - (22S,23S)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-7-он-3-ол;
(St1,X4,Y2) - (22R,23R)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-7-он-3-ол;
14 (St1,X4,Y3) (22R,23R)-стигмаст-5-ен-7-он-3,22,23-триол;
15 (St1,X5,Y1) - (22S,23S)-22,23 оксидостигмаст-5-ен-3,7-диол;
16 (St1,X6,Y1) - (22R,23R)-22,23-оксидостигмаст-5-ен 3,7-диол;
17 (St1,X5,Y2) - (22S,23S)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-3,7-диол;
(St1,X6,Y2) - (22R,23R)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-3,7-диол;
19 (St2,Y4)– (22E)-5 эргоста-8(14)-диен-15-он-3-ол;
20 (St2,Y1)- (22S,23S)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен 15-он-3-ол;
21 (St2,Y2)- (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол;
(St2,Y3) - (22R,23R)-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3,22,23-триол.
Методы. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре “Thermospectronic Helios.” Измерение радиоактивности липидных экстрактов проводили в толуольном сцинтилляторе;
измерение радиоактивности водных растворов и клеточных экстрактов - в сцинтилляторах ЖС-8 и “Unisolv” на счетчике Tri-Carb 2800 TR (Perkin Elmer).
Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [Маrkwell et al., 1978], или реакцией с бицинхониновой кислотой [Smith et al., 1985], концентрацию холестерина - модифицированным методом Либермана-Бурхардта [Huang et al., 1961] или ферментативным методом при помощи стандартного набора “Оксохром Холестерин“ фирмы “Lachema“ по протоколу фирмы-изготовителя. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках “Kieselgel UV 254”, “HPTLC Kieselgel UV 254” и “PSC Kieselgel UV 254”. Расчет низкоэнергетических конформаций боковой цепи оксистеринов полуэмпирическим методом АМ1 проводился с использованием программы “HyperChem 7.0” на компьютерном кластере лаборатории Динамики белков ИМБ РАН;
построение трехмерных моделей комплекса соединения 3 с димиристоилфосфатидилхолином проводилось в компьютерном центре Университета штата Минессота (США). Все расчеты проведены м.н.с. ИМБ РАН Я.В. Ткачевым.
Цитотоксичность соединений 1 – 22. Оценку токсичности соединений 1 – 22 в клетках МСF-7 и Hep G2 проводили с использованием цветной реакции тетразолиевого красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (MTT) с живыми клетками по методу [Mosmann, 1983], а также по включению [14C]тимидина в ДНК.
Проточная цитофлуориметрия. Цитофлуориметрический анализ клеток MCF-7, инкубированных с соединениями 3 и 21, проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSAria в режиме FL1.
Микрофотографии клеток. Микрофотографии клеток MCF-7, инкубированных с соединениями 3 и 21 (в режиме фазового контраста и после окрашивания гидрохлоридом 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI)), получали на приборе Axiovert 200M (Zeiss).
Уровень биосинтеза холестерина, жирных кислот, триглицеридов и холестериловых эфиров в клетках Hep G2, инкубированных с исследуемыми соединениями в различных условиях, оценивали по скорости включения биосинтетических предшественников - [14С]ацетата и [14С]олеата в соответствующие продукты по методу [Goldstein et al., 1983].
Влияние соединений 20 и 21 на активность АCАТ в бесклеточной системе.
Получение клеточного лизата;
приготовление модельных субстратов, содержащих холестерин, 25-гидроксихолестерин, кетостерины 20 и 21;
инкубацию модельных субстратов с клеточным лизатом и [1-14С]олеоил-KoA проводили по методу [Сheng et al., 1995].
Включение [3H]холестерина;
влияние соединений 20 и 21 на метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2. Инкубацию клеток с [3H]холестерином и исследуемыми соединениями проводили в присутствии 10% FCS в течение 24 ч, затем клетки инкубировали 24 ч в отсутствии радиоактивности, образовавшиеся радиоактивные продукты анализировали ТСХ в экстрактах из клеток и культуральной среды.
Влияние соединений 19 - 21 на уровень мРНК HMG-CoA-редуктазы, СYP27A1 и СYP3A4 в клетках Hep G2. Тотальную РНК выделяли из клеток Hep G2, инкубированных с исследуемыми соединениями, гуанидинизотиоцианатным методом [Chomczynski, Sacchi, 1987]. K-ДНК получали по протоколу фирмы “Promega”, ПЦР проводили по методу [Маниатис и соавт., 1984];
продукты амплификации разделяли электрофорезом в агарозном геле;
зоны, окрашенные бромфеноловым синим, анализировали на приборе WAT-137LH и с помощью программы “ImageJ 1.36”.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ 22,23-ОКСИГЕНИРОВАНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ СТИГМАСТАНА (1 – 18) Первой задачей работы было исследование влияния новых оксигенированных производных стигмастана 1 - 18 на жизнеспособность и пролиферацию клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде (рис. 2 - 5).
На основании результатов оценки цитотоксичности все исследованные соединения 1 – 18 были разделены на 4 группы: группа 1 (токсичные соединения):
оксистерины 3, 11, 14, 17;
группа 2 (избирательно токсичные соединения):
оксистерины 6, 9 и 10 проявляли токсичность только в клетках MCF-7, а соединение 15, проявляя умеренную токсичность в клетках Hep G2, не оказывало токсического эффекта в клетках MCF-7;
группа 3 (нетоксичные и слаботоксичные соединения) :
оксистерины 1, 2, 8, 13, 16, 18;
группа 4 (соединения, показывающие сложную зависимость МТТ-теста от концентрации): оксистерины 4, 5, 7 и 12 в низких концентрациях достоверно увеличивали значения МТТ-теста выше контрольного в клетках MCF-7.
MCF-7 Жизнеспособность клеток Hep G 14 (% от контроля ) 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Концентрация, мкМ Рис. 2. Влияние цитотоксичных производных стигмастана 3, 11, 14 и 17 (группа 1) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде 6 Жизнеспособность клеток Hep G MCF- 9 120 (% от контроля ) 10 100 15 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 Концентрация, мкМ Рис. 3. Влияние избирательно токсичных производных стигмастана 6, 9, 10 и (группа 2) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде Жизнеспособность клеток MCF-7 Hep G 140 (% от контроля ) 8 13 16 18 20 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 Концентрация, мкМ Рис. 4. Влияние нетоксичных и слабо токсичных производных стигмастана 1, 2, 8, 13, 16 и 18 (группа 3) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде Жизнеспособность клеток 4 MCF- Hep G 5 (% от контроля ) 7 12 40 20 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 Концентрация, мкМ Рис. 5. Влияние производных стигмастана, стимулирующих пролиферацию клеток MCF-7 4, 5, 7 и 12 (группа 4) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде Наибольшую токсичность проявляли (22R,23R)-3,22,23-тригидроксистигмаст 5-ен 3 и (22R,23R)-3,22,23-тригидроксистигмаст-5-ен-7-он 14;
(22R,23R)-22,23 дигидроксистигмаст-4-ен-3,6-дион 9 был избирательно токсичен в клетках MCF-7;
токсичность производных (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмастана значительно превосходила таковую для производных (22S,23S)-22,23-оксидостигмастана;
среди исследованных производных (22R,23R)-22,23-оксидостигмастана цитотоксичных соединений не выявлено. Соединения, входящие в группу 4 в низких концентрациях увеличивали значения МТТ-теста выше контрольного, что указывает на высокую активность митохондриальных гидрогеназ и стимулировании пролиферации. Можно отметить, что таких эффектов никогда ранее не наблюдалось для оксигенированных производных холестана и стигмастана [Maguire et al, 2003;
Ryan et al., 2005;
Adcox et al., 2001;
Lizard et al., 1999;
Lemair-Ewing et al., 2005;
O’Callahan et al., 1999;
Hall, 2006].
Полученные результаты позволяют заключить, что токсичность производных стигмастана 3, 6, 9, 10, 11, 13, 15 и 17 значительно отличается от токсичности основных оксигенированных производных ряда холестана (оксистеринов):
1) среди производных (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмастана найдены соединения в 10-20 раз более токсичные, чем 7-кетохолестерин и 7-гидроксихолестерин в клетках Hep G2 и MCF-7;
2) 7-гидроксихолестерин, как известно, является наиболее токсичным среди основных оксистеринов, однако среди исследованных производных стигмастана только соединение 17, обладающее 7-гидроксильной группой, показало умеренный токсический эффект;
3) введение в кольцо В производных холестана кислородсодержащих заместителей приводит к цитотоксичным соединениям (таким как 5,6-эпоксихолестан-3-ол или холестан-3,5,6-триол), но в ряду (22R,23R)-дигидроксистигмастана токсичность (22R,23R)-3,22,23-тригидрокси-5,6-оксидостигмастана 10 и (22R,23R) 3,5,6,22,23-пентагидроксистигмастана 11 была значительно ниже, чем токсичность (22R,23R)-3,22,23-тригидроксистигмаст-5-ена 3.
Вероятно, токсичность 22,23-оксигенированных производных стигмастана определяется структурными особенностями боковой цепи. Расчет низкоэнергетических конформаций соединений 1 - 18 показал, что производные (22S,23S)-22,23 оксидостигмастана и (22R,23R)-22,23-оксидостигмастана существуют в виде пары развернутых, близких по энергии конформеров, с различной ориентацией боковой цепи, в то время как для производных (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмастана реализуется одна низкоэнергетическая конформация, характеризующаяся жесткой скрученной боковой цепью и низким значением двугранного угла С22-С23 (рис. 6).
Рис. 6. Рассчитанная низкоэнергетическая конформации боковой цепи соединения 3.
Все наиболее токсичные производные стигмастана (3, 9 и 14) содержали (22R,23R)-22,23-диольную группировку. Можно полагать, что в отличие от большинства стеринов и оксистеринов, при встраивании в липидную бислойную мембрану для производных (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмастана наиболее вероятна сольватация гидроксильных групп боковой цепи, а не заместителя в положении 3.
Рис. 7. Молекулярная модель (22R,23R)-стигмаст-5-ен-3,22,23-триола 3, встроенного в бислойную мембрану димиристоилфосфатидилхолина.
Трехмерная модель бислоя димиристоилфосфатидилхолина со встроенным (22R,23R)-стигмаст-5-ен-3,22,23-триолом 3 (рис. 7) позволяет сделать следующие заключения:
Ориентация главной оси стероидного цикла (С3-С17) практически параллельна ориентации жирнокислотных остатков. В области полярных “головок” фосфолипида расположен фрагмент С22-С29, при этом наблюдаются нарушения регулярности поверхностного слоя. Связывание стерина вызывает нарушение в упаковке жирнокислотных остатков (по крайней мере два слоя липидов, окружающих молекулу стерина, испытывают возмущение). Толщина бислоя в месте связывания стерина меньше, чем толщина бислоя индивидуального димиристоилфосфатидилхолина.
Поэтому мы считаем, что высокую цитотоксичность производных (22R,23R)-22,23 дигидроксистигмастана можно объяснить структурными изменениями внутренних мембран клетки.
2. ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ 8(14)-15-КЕТОПРОИЗВОДНЫХ 5-ЭРГОСТАНА 19 - Среди регуляторов метаболизма холестерина, представляющих интерес в качестве потенциальных фармакологических агентов, важное место занимают 8(14) 15-оксигенированные стерины. Синтетический ингибитор биосинтеза холестерина 3 гидрокси-5-холест-8(14)-ен-15-он (15-кетостерин) проявлял гипохолестеринемическую активность и эффективно регулировал метаболизм холестерина in vivo и в культуре клеток [Schroepfer et al., 1977a;
1977b;
1980;
1982;
1984;
1988a;
1988b;
2000;
Miller et al., 1980;
Swaminathan et al., 1995;
Schmidt et al., 2006].
Особое место занимает проблема создания 15-кетостеринов с С17-боковой цепью, отличной от боковой цепи холестана, поскольку быстрая метаболическая деградация в клетках печени ведет к потере биологической активности 15-кетостерина [Schroepfer et al., 1988;
St. Pyrek et al., 1989;
Пийр и соавт., 2003]. Поскольку наличие С24-алкильного заместителя блокирует расщепление боковой цепи стерина в клетках печени [Boberg et al., 1990;
1991;
Bjorkhem, 1992], исследование новых 15-кетостеринов ряда 5-эргостана в культуре клеток печени, несомненно, представляет интерес.
Влияние четырех новых 8(14)-15-кетостеринов ряда 5-эргостана 19 – 22 на жизнеспособность клеток Hep G2 и MCF-7 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде представлено на рис. 8. 15-Кетопроизводное эргостадиена 19 не проявляло токсического эффекта в обоих культурах. Наибольшей токсичностью в клетках MCF- обладал (22R,23R)-эпоксид 21, рассчитанное значение TC50 составляло 0.4 ± 0.1 мкМ, что на порядок превосходило значение TC50 для известных оксистеринов и было сравнимо с соответствующими значениями для природных соединений стероидного ряда, используемых в качестве цитотоксических и цитостатических противоопухолевых лекарственных препаратов [D’Auria et al., 1993;
Izzo et al., 1998;
Rogers et al., 1998]. Изомерный (22S,23S)-эпоксид 20 умеренно подавлял жизнеспособность клеток MCF-7 и не проявлял токсичности в клетках Hep G2. Триол 22, эффективно подавлял жизнеспособность клеток Hep G2, но в клетках MCF- проявлял слабую токсичность.
Hep G Жизнеспособность клеток 19 MCF-7 20 (% от контроля ) 21 22 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 Концентрация, мкМ Рис. 8. Влияние 8(14)-15-кетопроизводных эргостана 19 – 22 на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде Рис. 9. Зависимость токсического эффекта (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен 15-он-3-ола 21 в клетках MCF-7 от времени инкубации в среде, содержащей 10% FCS (по данным MTT).
3. ТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ СОЕДИНЕНИЙ 3 И 19 В КЛЕТКАХ MCF- Инкубация клеток MCF-7 с наиболее токсичными оксистеринами (22R,23R) стигмаст-5-ен-3,22,23-триолом 3 и (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он 3-олом 21 сопровождалась нарушениями конфлуентности монослоя, снижением числа прикрепленных клеток и морфологическими изменениями.
A Б В Рис. 10. Анализ клеток МСF-7 методом проточной цитофлуориметрии. Клетки MCF-7 в отсутствии оксистеринов (контроль) - А;
в присутствии (22R,23R)-3,22,23 тригидрокси-стигмаст-5-ена 3 – Б;
в присутствии (22R,23R)-3-гидрокси-22,23-оксидо 5-эргост-8(14)-ен-15-она 21 – В.
Данные цитофлуориметрического анализа клеток MCF-7, инкубированных с соединениями 3 и 21, приведены на рисунке 10;
микрофотографии клеток (в режиме фазового контраста и флуоресцентные микрофотографии, полученные после инкубации клеток с красителем DAPI, специфично сорбирующимся на ДНК) – на рис. 11.
А Б В Рис. 11. Микрофотографии клеток МСF-7. А - клетки MCF-7 в отсутствии оксистеринов (контроль);
Б - в присутствии (22R,23R)-стигмаст-5-ен-3,22,23-триола 3;
В - в присутствии (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ола 21. Слева представлены поля фазового контраста, справа – поля фазового контраста, совмещенные с полем флуоресценции DAPI (А, Б), и только поле флуоресценции DAPI (В).
В контрольных клетках MCF-7 отсутствовали апоптотические клетки;
в клетках, инкубированных с соединением 3, популяция апоптотических клеток не превышала 5%;
в клетках, инкубированных с соединением 19, популяция апоптотических клеток составляла 19%. В контрольных клетках и клетках, инкубированных с (22R,23R) стигмаст-5-ен-3,22,23-триолом 3, не замечено фрагментации ядер, а в клетках, инкубированных с (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-олом 21, были видны клетки с фрагментированными ядрами (показано стрелкой).
4. ИНГИБИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ HEP G2 СОЕДИНЕНИЯМИ 1 – На первом этапе исследовалось влияние соединений 1 – 22 на уровень биосинтеза холестерина из радиоактивного предшественника – [14С]ацетата в условиях краткосрочной (3 ч) инкубации в бессывороточной среде. Среди 22,23 оксигенированных производных стигмастана только 7-кетосодержащие соединения (22S,23S)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-7-он-3-ол 12 и (22R,23R)-стигмаст-5-ен-7-он 3,22,23-триол 14 ингибировали биосинтез холестерина (значения IC составляли: ± 2 мкМ и 5 ± 2 мкМ, соответственно). Кетостерин 12 избирательно подавлял биосинтез холестерина в концентрации до 20 мкМ, а в концентрации 30 мкМ ингибировал биосинтез холестерина, жирных кислот и триглицеридов.
Рис. 12. Ингибироваие биосинтеза холестерина в клетках HepG2 соединениями 19– 22.
На рисунке 12 представлен уровень биосинтеза холестерина из [14C]ацетата при 3ч инкубации с соединениями 19 – 22. Эпоксисодержащие кетостерины 20 и эффективно подавляли биосинтез холестерина пропорционально их концентрации в среде (рассчитанные значения IC50 для соединений 20 и 21 составляли 1.9 ± 0.2 мкМ и 0.6 ± 0.2 мкМ, соответственно). Ингибиторная активность (22E)-3-гидрокси-5 эргоста-8(14),22-диен-15-она 19 была ниже (рассчитанное значение IC50 3.1 ± 0.4 мкМ).
Можно отметить, что в тех же условиях значение IC50 для 15-кетостерина составляло 4.0 ± 0.4 мкМ. Триол 22 подавлял биосинтез холестерина в этих условиях слабее, чем 15-кетостерин и кетостерины 19 – 21.
Для того чтобы выяснить влияние 8(14)-15-кетопроизводных ряда эргостана на экспрессию гена HMG CoA редуктазы в клетках Hep G2, были проведены эксперименты по количественной оценке уровня мРНК HMG CoA редуктазы в клетках, инкубированных 24 ч с соединениями 19 – 21.
Рис. 13. Влияние соединений 19 – 21 в концентрации 5 мкМ на уровень мРНК HMG CoA редуктазы в клетках Hep G2 при 24 ч инкубации в бессывороточной среде.
Известно, что в клетках Hep G2 15-кетостерин слабо снижает уровень мРНК HMG CoA редуктазы [Киселева и соавт., 1999;
Kisseleva et al., 1999]. Оказалось, что 15 кетопроизводные эргостана 19, 20 и 21 существенно снижали уровень мРНК HMG CoA редуктазы в клетках Нер G2 в концентрации 5 мкМ (рис. 13), причем эффект зависел от структуры стерина.
Тем не менее, очевидно, что влияние соединений 19 – 21 на уровень экспрессии гена HMG CoA редуктазы не является причиной ингибирования биосинтеза холестерина в клетках Hep G2 этими соединениями. Кетостерин 21 являлся самым мощным ингибитором биосинтеза холестерина, но снижал уровень мРНК HMG CoA редуктазы слабее, чем менее эффективные ингибиторы биосинтеза холестерина 19 и (cр. рис. 12 и 13).
15-Кетостерин и (22Е)-3-гидрокси-5-эргоста-8(14),22-диен-15-он 19 в концентрации 5 мкМ в присутствии 10% FCS не влияли на уровень биосинтеза холестерина в клетках Hep G2. Однако оказалось, что кетостерины 20 и 21, содержащие 22,23-эпоксигруппу, способны снижать уровень биосинтеза холестерина в клетках Hep G2, культивированных в присутствии сыворотки.
На рисунке 14 представлены уровни биосинтеза радиоактивных липидов (холестерина, жирных кислот и триглицеридов) из [14C]ацетата в клетках Hep G2 в присутствии соединений 20 и 21. Уровень биосинтеза холестерина был значительно снижен (52 ± 6 % и 57 ± 6 % от контроля, соответственно);
cодержание радиоактивных свободных жирных кислот составляло 76 ± 9 % и 79 ± 10 %, а триглицеридов - 125 ± % и 131 ± 9 %, соответственно. По-видимому, присутствие соединений 20 и 21 не оказывало существенного влияния на биосинтез жирных кислот, но стимулировало их включение в триглицериды.
Рис. 14. Влияние соединений 20 и 21 в концентрации 5 мкМ на уровень биосинтеза холестерина, жирных кислот и триглицеридов в клетках Hep G2 при 24 ч инкубации в среде с 10% FCS. Контрольные значения (100 %) составляли: для холестерина - 40 100;
для жирных кислот - 49 900;
для триглицеридов - 106 (имп./мин на 1 мг клеточного белка за 6 ч).
Результаты, представленные в этом разделе, свидетельствуют, что 8(14)-15 кетопроизводые эргостана 19 – 21 эффективно подавляют биосинтез холестерина в клетках Hep G2, причем эффекты этих соединений существенно отличаются от эффектов 15-кетостерина. Среди новых 8(14)-15-кетопроизводых эргостана найдено соединение (21), ингибирующее биосинтез холестерина в 7 раз эффективнее, чем 15 кетостерин. В данной работе впервые показано, что 8(14)-15-кетопроизводные эргостана подавляют экспрессию гена HMG CoA редуктазы в клетках Hep G2. Кроме того, соединения 20 и 21 способны снижать уровень биосинтеза холестерина в клетках Hep G2 в присутствии сывороточных липидов, то есть проявляли активность при культивировании клеток печени в условиях, близких к физиологическим.
5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ 20 И 21 НА БИОСИНТЕЗ ХОЛЕСТЕРИЛОВЫХ ЭФИРОВ И АКТИВНОСТЬ АСАТ В КЛЕТКАХ HEP G Соединения 20 и 21 оказывали различное влияние на биосинтез холестериловых эфиров (ХЭ) в клетках Hep G2, что было показано в экспериментах по оценке скорости биосинтеза ХЭ из радиоактивных предшественников - [14C]ацетата и [14C]олеата (рис.
15 и 16).
Рис. 15. Влияние соединений 20 и 21 на уровень биосинтеза ХЭ из [14С]ацетата в клетках Hep G2, прединкубированных 24 ч в среде, содержащей 10% FCS и исследуемые соединения в концентрации 5 мкМ. К - Контрольное значение (100 %, 5500 имп./мин / 1 мг клеточного белка за 6 ч). 1 - Образование [14С]ХЭ в клетках, обработанных соединением 20;
2 - образование [14С]ХЭ в клетках, обработанных соединением 21 (опыт 1 проводился в отсутствие кетостеринов в среде). 3 Образование [14С]ХЭ в клетках, обработанных соединением 20;
4 - образование [14С]ХЭ в клетках, обработанных соединением 21 (опыт 2 проводился в присутствии мкМ кетостеринов в среде).
Очевидно, что включение радиоактивности во фракцию ХЭ зависит от скоростей биосинтеза холестерина и жирной кислоты, а также от скорости АСАТ зависимого ацилирования холестерина. В опыте 1 (рис. 15) эффекты соединений 20 и 21 достоверно не различались, а включение радиоактивности во фракцию ХЭ было ниже, чем в контроле (65% и 69%, соответственно). Поскольку кетостерины подавляли включение [14C]ацетата в холестерин (рис. 14), можно полагать, что прединкубация клеток с соединениями 20 и 21 не оказывает заметного влияния на биосинтез ХЭ. В опыте 2 (рис. 15) уровень биосинтеза ХЭ был выше, чем в опыте 1 - в присутствии соединения 20 включение радиоактивности во фракцию ХЭ составляло 84 ± 8 % от контрольного, а в присутствии соединения 21 - 180% ± 15% от контрольного.
Очевидно, что присутствие кетостеринов 20 и 21 во время инкубации клеток с радиоактивным предшественником, оказывает стимулирующее влияние на ацилирование холестерина (аналогично 25-гидроксихолестерину и некоторым другим оксистеринам [Miller, Melnykovich, 1984;
Morin, Peng, 1992;
Kisseleva et al, 1999].
На рис. 16 представлено влияние соединений 20 и 21 на уровень биосинтеза ХЭ в клетках Hep G2 из [14C]олеата. Кетостерин 20 стимулировал включение [14C]олеата во фракцию ХЭ пропорционально концентрации;
кетостерин 21 эффективно увеличивал включение радиоактивности во фракцию ХЭ в низких концентрациях (0 – мкМ), но при более высоких концентрациях (3 – 6 мкМ) стимулирующий эффект пропадал. Низкий уровень биосинтеза холестериловых эфиров при 18 мкМ соединения 21 можно объяснить тем, что в этих условиях проявляется общий цитотоксический эффект соединения, приводящий к ингибированию всех путей ацетатного биосинтеза.
Рис. 16. Влияние соединений 20 и 21 на уровень биосинтеза ХЭ из [14С]олеата в клетках Hep G2 в среде, содержащей 10% FCS. Контрольное значение (уровень биосинтеза ХЭ в отсутствии исследуемых соединений), принятое за 100 %, составляло 1200 имп./мин / 1 мг клеточного белка за 6 ч.
Для определения влияния кетостеринов 20 и 21 на активность АСАТ мы использовали метод, основанный на реакции [14C]олеоил-СoA с холестерином, входящим в состав модельного субстрата, в присутствии лизата клеток Hep G2 в качестве источника фермента [Cadigan, Chang, 1988;
Cheng et al., 1995;
Zhang et al., 2003]. В качестве модельного субстрата были использованы фосфолипидные мицеллы, содержащие холестерин, 25-гидроксихолестерин (25HC), соединения 20 и 21.
На рисунке 17А показано образование [14C]ХО в АСАТ-катализируемой реакции в отсутствии (прямая К) и в присутствии 25НС. Рассчитанные из графика скорости ферментативной реакции [9.6 (± 1) пмоль ХО /мин/ 1 мг клеточного белка] и двукратный стимулирующий эффект 25НС на активность АСАТ, соответствовали описанным в работе [Cheng et al., 1995]. На рисунке 17Б показано образование [14C]ХО в АСАТ-катализируемой реакции в отсутствие кетостеринов (прямая К), и в присутствии кетостеринов 20 и 21.
Рис. 17. A. АСАТ-зависимое образование [14C]ХО в реакции [14C]олеоил-КоА и модельного субстрата, содержащего 50 мкг холестерина (К) или 50 мкг холестерина и 150 мкг 25НС (25НС).
Б. АСАТ-зависимое образование [14C]ХО в реакции [14C]олеоил-КоА и модельного субстрата, содержащего 50 мкг холестерина (К);
50 мкг холестерина и 150 мкг кетостерина 20;
50 мкг холестерина и 150 мкг кетостерина 21.
В присутствии соединения 20 начальная скорость АСАТ-зависимого ацилирования холестерина сохраняла линейную зависимость от времени в течение мин и превышала начальную скорость реакции в контрольном эксперименте на 45%.
Cтимулирующий эффект кетостерина 20 на активность АСАТ был ниже, чем эффект 25НС в тех же условиях. В присутствии соединения 21 скорость образования [14C]ХО за первые 5 мин была значительно выше, чем в контроле. Однако при увеличении времени инкубации не наблюдалось дальнейшего увеличения [14C]ХО (рис. 17Б).
Последнее указывает на быструю инактивацию фермента.
Полученные результаты свидетельствуют, что 15-кетопроизводные эргостана и 21, содержащие 22,23-эпоксигруппу, регулируют биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Hep G2, причем эффект зависит от стереохимической конфигурации атомов С22 и С23.
6. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ 20 И 21 НА МЕТАБОЛИЗМ ЭКЗОГЕННОГО ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ HEP G Следующей задачей являлась оценка влияния кетостеринов 20 и 21 на метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2. Схема опыта представлена на рис. 18.
Рис. 18. Клетки Hep G2, прединкубированные 24 ч в среде, содержащей кетостерины 20 и 21 в концентрации 5 мкМ, инкубировали в той же среде в присутствии [3H]холестерина и кетостеринов в течение 24 ч, а затем еще 24 ч без радиоактивности в присутствии кетостеринов.
Присутствие соединений 20 и 21 не оказывало влияния на включение [3H]холестерина в клетки, а также на содержание радиоактивных метаболитов, образовавшихся в клетках за время 24 ч инкубации (рис. 19А). Последующее культивирование клеток, меченных [3H]холестерином, в среде без радиоактивности приводило к накоплению радиоактивных метаболитов в культуральной среде. В присутствии кетостеринов 20 и 21 содержание радиоактивных полярных продуктов (ПП) было повышено (156% и 175% относительно контроля, соответственно), а содержание радиоактивных холестериловых эфиров (ХЭ) не отличалось от контроля (рис. 19Б и 19В).
Результаты этого опыта продемонстрировали, что соединения 20 и 21 не оказывают заметного влияния на включение экзогенного холестерина в клетки Hep G2, а также на скорость обмена холестерина между клеточной мембраной и средой, однако стимулируют образование полярных продуктов из экзогенного [3H]холестерина.
Последнее указывает на активацию окислительных процессов в клетке.
Влияние соединений 20 и 21 на уровень мРНК митохондриальной стерин-27 гидроксилазы (Сyp27А1, ключевого фермента расщепления боковой цепи стеринов, активность которого в клетках печени активируется некоторыми гормонами и метаболитами) и Сyp3A4 (моноокcигеназы, играющей важнейшую роль в катаболизме ксенобиотиков и освобождении клетки от токсичных метаболитов) представлено на рисунке 20.
Рис. 19. A – Cодержание радиоактивности в клетках Hep G2 после 24 ч инкубации в среде, содержащей [3H]холестерин в отсутствии (контроль) и в присутствии соединений 20 и 21. Контрольное значение (100 %) составляло 611 300 (имп./мин на мг клеточного белка).
Б - Содержание радиоактивных полярных продуктов после 24 ч инкубации меченых клеток в отсутствии (контроль) и в присутствии соединений 20 и 21;
значение для контрольной инкубации составляло 101 700 (имп./мин на 1 мг клеточного белка) - ( %).
В - Содержание радиоактивных холестериловых эфиров после 24 ч инкубации меченых клеток в отсутствии (K) и в присутствии соединений 20 и 21;
значение для контрольной инкубации составляло 29 000 (имп./мин на 1 мг клеточного белка) - (5 %).
А Б Рис. 20. Влияние соединений 20 и 21 в концентрации 5 мкМ на уровень мРНК Сyp27A (A) и Сyp3A4 (Б) в клетках Hep G2 при 24 ч инкубации в присутствии 10% FCS.
Кетостерин 20 не вызывал достоверных изменений в уровне мРНК Сyp27A1 и Cyp3A4 в клетках Неp G2, а кетостерин 21, не влияя на уровень мРНК Сyp27A1, значительно (в 3,2 раза) увеличивал уровень мРНК Cyp3A4 (рис. 20). Мы полагаем, что этот эффект можно объяснить активацией ядерного рецептора PXR. В пользу этого предположения свидетельствует заметная цитотоксичность кетостерина 21, а также известные данные [Shenoy et al., 2004] о PXR-зависимой активации экспрессии гена Cyp3A4 токсичными оксистеринами в клетках печени.
Результаты, представленные в этом разделе свидетельствуют, что эпоксисодержащие 8(14)-15-кетопроизводые эргостана 20 и 21 стимулировали превращение экзогенного холестерина в полярные продукты в клетках Hep G2, при этом (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргоста-8(14)-ен-15-он-3-ол 21 увеличивал уровень мРНК Сyp3A4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования показали, что ряд новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана влияют на жизнеспособность и пролиферацию клеток млекопитающих в культуре и регулируют метаболизм липидов в клетках Hep G2. Среди новых оксигенированных производных эргостана и стигмастана найдены соединения с высокой биологической активностью. Производные стигмастана, содержащие (22R,23R)-22,23-диольную функцию, показали выраженный цитотоксический эффект в опухолевых клетках, причем данные, представленные в диссертации, позволяют заключить, что цитотоксичность соединения определяется особенностями конформации боковой цепи.
15-Кетопроизводные эргостана 19, 20 и 21 оказались новыми эффективными регуляторами метаболизма холестерина в клетках Hep G2. Обращает на себя внимание различие в биологической активности изомерных (22S,23S)- и (22R,23R)- эпоксидов и 21. Соединения 20 и 21 существенно различались по способности регулировать уровень мРНК HMG CoA редуктазы и Сyp3A4, ингибировать биосинтез холестерина, влиять на биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Hep G2.
Полученные в диссертации результаты указывают, что биологическая активность новых оксигенированных производных эргостана и стигмастана определяется участием этих соединений в функционировании сложных регуляторных комплексов, интегрированных во внутренние мембраны клетки.
ВЫВОДЫ 1. Среди 22 новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана наибольшую цитотоксичность в клетках MCF-7 и Hep G2 проявляли соединения, содержащие (22R,23R)-диольную функцию;
(22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост 8(14)-ен-15-он-3-ол проявлял высокую токсичность в клетках MCF-7.
2. Новые 8(14)-15-кетопроизводные эргостана: (22E)-5-эргоста-8(14),22-диен-15-он 3-ол, (22S,23S)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол и (22R,23R)-22,23 оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол эффективно подавляли биосинтез холестерина и снижали уровень мРНК HMG CoA редуктазы в клетках Hep G2;
ингибирующий эффект эпоксисодержащих кетостеринов проявлялся в условиях культивирования клеток в присутствии липидов и липопротеинов.
3. (22S,23S)-22,23-Оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол и (22R,23R)-22,23-оксидо 5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол различно регулировали биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Hep G2.
4. (22S,23S)-22,23-Оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол и (22R,23R)-22,23-оксидо 5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-ол стимулировали превращение экзогенного холестерина в полярные продукты в клетках Hep G2;
инкубация клеток с (22R,23R)-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-он-3-олом стимулировала экспрессию Сyp3A4.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Дроздов Ф.В., Мехтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Тимофеев В.П., Мишарин А.Ю.
Цитотоксичные производные (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмастана // Биоорган.
химия. - 2007. - Т. 33. – С. 349-356.
2. Misharin A.Yu., Ivanov V.S., Mehtiev A.R., Morozevich G.E., Tkachev Ya.V., Timofeev V.P. Novel side chain modified 8(14)-15-ketosterols // Steroids. – 2007. – V. 72. – P.
305-312.
3. Meхтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Иванов В.С., Мишарин А.Ю. Влияние (22S,23S)- и (22R,23R)-3-гидрокси-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-онов на биосинтез липидов и метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2 // Биомед. химия.
– 2007. - Т. 53. – С. 221-227.
4. Meхтиев А.Р., Мишарин А.Ю. Биологическая активность фитостеринов и их производных // Биомед. химия. – 2007. - Т. 53. – С. 497-521.
5. Meхтиев А.Р., Козлова Н.И., Скрипник В.В., Мишарин А.Ю. Влияние (22S,23S)- и (22R,23R)-3-гидрокси-22,23-оксидо-5-эргост-8(14)-ен-15-онов на биосинтез холестериловых эфиров и активность ацил-КоА:холестерин-ацилтрансферазы в клетках Hep G2 // Биомед. химия. - 2008. - Т. 54. – С. 341-348.
6. Misharin A.Yu., Mehtiev A.R., Morozevich G.E., Tkachev Ya.V., Timofeev V.P.
Synthesis and cytotoxicity evaluation of 22,23-oxygenated stigmastane derivatives // Bioorgan. Med. Chem. - 2008. - V. 16. – P. 1460-1474.
7. Дроздов Ф.В., Мехтиев А.Р., Пийр Е.А., Мишарин А.Ю. Цитотоксичные производные (22R,23R)-дигидроксистигмастана // Материалы Международной конференции “Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения”. - Химки, 2006. – С. 40-42.
8. Мехтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Дроздов Ф.В., Мишарин А.Ю. Токсичность новых оксигенированных фитостеринов в клетках гепатобластомы Hep G2 и карциномы молочной железы MCF-7 // Материалы 3-ей Международной научно-практической конференции «Новые технологии создания инновационных лекарств. От достижений «постгеномной эры» к национальным фармацевтическим брендам». Химки, 2006. – С. 26.
9. Мехтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Козлова Н.И., Чеглаков И.Б., Федченко В.И., Мишарин А.Ю. 22,23-Оксигенированные производные стигмастана и эргостана вызывают гибель клеток карциномы молочной железы MCF-7 // Материалы 4-ой Международной конференции «Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия». – Химки, 2007. – С.
21.