Днк-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса а

На правах рукописи

УЛЯШОВА Мария Морисовна ДНК-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БЕТА-ЛАКТАМАЗ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛАССА А 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2011

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научные руководители:

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Егоров Алексей Михайлович кандидат химических наук, доцент Рубцова Майя Юрьевна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибович доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Ведущая организация:

Институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится « » марта 2011 года в часов на заседании дис сертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском го сударственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Моск ва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзи мологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факуль тета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » февраля 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001. кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема возникновения и распространения ус тойчивости к бета-лактамным антибиотикам у клинически значимых видов микроорганизмов имеет чрезвычайно важное значение, поскольку бета лактамы являются наиболее часто используемыми препаратами для лечения бактериальных инфекций (Rolinson, 1998). У грамотрицательных микроорга низмов известно несколько механизмов резистентности к бета-лактамным ан тибиотикам, однако основным из них является продукция бета-лактамаз – фер ментов, катализирующих реакцию гидролиза бета-лактамного кольца, в резуль тате чего антибиотик теряет свою антибактериальную активность (Livermore, 1995).

В настоящее время внимание исследователей привлечено к изучению трех основных групп бета-лактамаз, относящихся к молекулярному классу А – TEM, SHV и СТХ-М (Bradford, 2001;

Pitout, 2008). Благодаря плазмидной локализации генов распространение этих групп ферментов среди возбудителей инфекционных заболеваний человека приняло угрожающий характер.

Ферменты групп ТЕМ и SHV являются производными классических пенициллиназ ТЕМ-1 и SHV-1 и отличаются от них наличием от одной до нескольких единичных аминокислотных мутаций, что является результатом однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) кодирующих их генов (Woodford, 2007). Известно, что некоторые мутации могут изменять субстратную специфичность или приводить к возникновению устойчивости к ингибиторам.

Большинство субтипов TEM и SHV бета-лактамаз являются бета-лактамазами расширенного спектра (БЛРС), способными расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и антибиотики, принадлежащие к цефалоспоринам III и IV поколений. Характерную для БЛРС активность проявляют также все ферменты СТХ-М типа. В отличие от TEM и SHV бета-лактамаз они имеют низкую степень гомологии внутри группы, поэтому их дополнительно разделяют на 4 подгруппы, внутри которых ферменты отличаются наличием точечных аминокислотных мутаций (Bonnet, 1999;

Bonnet, 2004).

Многообразие бета-лактамаз молекулярного класса А, а также их широ кое распространение диктуют необходимость разработки методов точной и бы строй идентификации ферментов данного класса. Рутинная оценка чувстви тельности к антибиотикам, проводимая в бактериологических лабораториях, не является достаточно эффективной для обнаружения БЛРС вследствие вариа бельности их фенотипического проявления. Кроме того, существующие методы исследования бета-лактамаз, основанные на определении их физико химических свойств и субстратного спектра, не обладают достаточной разре шающей способностью для дифференциации многочисленных ферментов этой группы. В связи с этим актуальной задачей является разработка молекулярно генетических методов типирования бета-лактамаз. Полимеразная цепная реак ция (ПЦР) является сейчас наиболее распространенной для выявления генов БЛРС, однако положительный результат ПЦР-амплификации генов, как прави ло, не является достаточным для определения субтипа фермента и предполагает дальнейшее исследование генов с целью выявления возможных мутаций, опре деляющих расширенный спектр активности (Эйдельштейн, 2001).

Перспективным методом определения множества мутаций как с точки зрения времени получения результата анализа, так и его информативности является метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах (Grimm, 2004;

Ensor, 2007;

Cohen Stuart, 2010). ДНК-микрочип представляет собой небольшую по площади поверхность носителя с размещенными на ней в виде матрицы ячейками, в каждой из которых иммобилизованы олигонуклеотидные зонды. В настоящее время наиболее распространенными являются ДНК-микрочипы на стеклянных пластинах с флуоресцентной детекцией (Sassolas, 2008). Их основными преимуществами являются высокая чувствительность и простота проведения анализа. Однако данная технология имеет существенные ограничения при мультипараметрическом определении ОНП генов, так как не всегда удается достичь высокой специфичности идентификации однонуклеотидных замен, в том числе, из-за влияния флуоресцентной метки на образование совершенных ДНК-дуплексов. С этой точки зрения использование в качестве метки молекул небольшого размера, например биотина, является перспективным для одновременного определения множества точечных мутаций в генах. Для выявления биотина в дуплексах ДНК возможно использование конъюгата стрептавидин-фермент с последующей колориметрической детекцией фермента. Колориметрические микрочипы могут быть достойной альтернативой флуоресцентным микрочипам, так как регистрация аналитических сигналов в этом случае может проводиться на недорогих оптических сканерах или даже визуально.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования бета-лактамаз мо лекулярного класса А на основе определения однонуклеотидного полиморфиз ма кодирующих их генов. Для достижения поставленной цели требовалось ре шить следующие задачи:

оптимизировать метод гибридизационного анализа биотинилированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией;

изучить специфичность выявления ОНП генов на ДНК-микрочипах с коло риметрической детекцией;

разработать методы амплификации полноразмерных генов TEM, SHV и CTX-M бета-лактамаз с одновременным включением биотина в качестве метки;

разработать колориметрические ДНК-микрочипы для генотипирования ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз на основе выявления однонуклеотидно го полиморфизма кодирующих их генов;

разработать интегрированный ДНК-микрочип для одновременной диагно стики бета-лактамаз расширенного спектра и ингибитор-резистентных бета лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов.

Научная новизна. В ходе данной работы разработан метод колоримет рической детекции на основе пероксидазы хрена для ДНК-микрочипов высокой плотности на стекле и мембранных носителях, сравнимый по чувствительности с флуоресцентной детекцией на основе красителя Су3.

Показано, что специфичность выявления ОНП генов методом гибридиза ционного анализа на ДНК-микрочипах с использованием биотина в качестве метки выше, чем для метода гибридизационного анализа с использованием флуоресцентной метки Су3.

Разработана методика совместной амплификации полноразмерных генов бета-лактамаз TEM, SHV и CTX-M типов в процессе мультиплексной ПЦР с одновременным включением метки. Показана более высокая эффективность включения биотина в качестве метки в амплифицируемый ген в сравнении с флуоресцентным красителем Сy3.

На основе выявленных в работе закономерностей поведения олигонукле отидов различной структуры в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах сформулированы рекомендации по молекулярному дизайну зондов для опреде ления ОНП генов. Использование разработанного подхода позволило улучшить дифференциацию между совершенными и несовершенными ДНК-дуплексами, образованными молекулами исследуемой ДНК и олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе работы результа ты позволили разработать следующие типы колориметрических ДНК микрочипов:

ДНК-микрочипы высокой плотности, изготовленные на поверхности микроскопных стекол, для генотипирования ТЕМ, SHV и CТХ-М бета лактамаз на основе определения всех позиций ОНП генов, приводящих к известным аминокислотным заменам;

интегрированный ДНК-микрочип средней плотности, изготовленный на поверхности мембранных носителей, для одновременной диагностики БЛРС и ингибитор-резистентных бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М ти пов на основе идентификации типа генов и ключевых мутаций в них.

Применение метода гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах с ко лориметрической детекцией позволяет повысить специфичность определения ОНП генов, а также значительно снизить себестоимость анализа. Эти преиму щества открывают новые возможности для применения тест-систем на основе ДНК-микрочипов в клинической диагностике и для проведения широкомас штабных эпидемиологических исследований.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Меж дународных конференциях «Биокатализ. Фундаментальные основы и примене ние» (Санкт-Петербург, 2007;

Архангельск, 2009);

IV и V Московских между народных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007;

Москва, 2009);

X и XII международных конгрессах по антимик робной терапии МАКМАХ/ESCMID (Москва, 2008;

Москва, 2009);

Всероссий ской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобио технология: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008);

8th International Meet ing on Microbial Epidemiological Markers (Закопане, Польша, 2008);

21st IUBMB and the 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biol ogy (Шанхай, Китай, 2009);

II и III международных форумах «Руснанофорум 2009» и «Руснанофорум 2010» (Москва, 2009;

Москва, 2010);

III научно практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2009);

20th Anniversary World Congress on Biosensors (Глазго, Велико британия, 2010);

Всероссийской научно-практической конференции «Молеку лярная диагностика-2010» (Москва, 2010);

Первой международной научно практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабо раторной и клинической медицине» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано работ, в том числе 4 статьи в международных и отечественных журналах, 10 те зисов докладов международных и российских конференций.

Объм и структура работы. Диссертационная работа состоит из введе ния, обзора литературы (главы 1-4), экспериментальной части (глава 5), описы вающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (гла вы 6-10), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изло жена на 188 страницах, содержит 19 таблиц и 59 рисунков. Список литературы включает 212 ссылок.

Используемые сокращения. БЛРС – бета-лактамазы расширенного спектра, ДС - декстран сульфат натрия, ИРТ - ингибитор-резистентный тип, ОНП – однонуклеотидный полиморфизм, ПХ – пероксидаза хрена, ПЦР – по лимеразная цепная реакция, ТМБ - 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин, ЩФ – щелоч ная фосфатаза.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Метод гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах с колориметри ческой детекцией Принцип гибридизационного анализа ДНК на микрочипах основан на выделении бактериальной ДНК из исследуемого образца, амплификации нуж ного ее фрагмента в процессе ПЦР с одновременным введением метки, и по следующей гибридизации меченой ДНК со специфическими зондами. Детекция результатов гибридизации проводится по активности метки. В данной работе в качестве метки ДНК использовался биотин, который выявляли конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена (ПХ). На первом этапе работы была про ведена оптимизация методов иммобилизации олигонуклеотидов и условий ко лориметрической детекции пероксидазы хрена в составе ДНК-дуплексов на поверхности носителей различной природы.

При выборе типа носителя и способа иммобилизации олигонуклеотидов проводили оценку эффективности иммобилизации, размера и морфологии по лучаемых ячеек микрочипа, величины фонового сигнала, воспроизводимости результатов, полученных в разных экспериментах. Для микрочипов «высокой плотности» в качестве носителя были выбраны микроскопные стекла с поверх ностью, модифицированной эпокси-группами. Микрочипы «средней плотно сти» изготавливали на поверхности мембранных носителей, в качестве опти мального был выбран отрицательно заряженный найлон, обработанный карбо диимидом. Из всех описанных вариантов ковалентной иммобилизации олиго нуклеотидов на электрофильных поверхностях использовали способ иммобили зации олигонуклеотидных зондов через концевую нуклеофильную амино группу, связанную с кодирующей частью зонда через линкер из 13 остатков тимидина. Преимущество данного метода заключается в том, что кодирующая часть олигонуклеотида остается максимально доступной для последующей гибридизации с ДНК-мишенью. Для изготовления микрочипов использовали роботы с контактным принципом печати иглами (пинами) с внутренней щелью определенного диаметра. Микрочипы высокой плотности изготавливали на по верхности стеклянных носителей с использованием игл с диаметром щели мкм, они содержали 1000 - 1200 ячеек на 1 см2, диаметр ячеек при этом состав лял 130 – 140 мкм, расстояние между ячейками – 150–200 мкм. Микрочипы средней плотности изготавливали на отрицательно заряженном найлоне иглами с щелью большего диаметра (300 мкм), они содержали 200–350 ячеек на 1 см2, диаметр ячеек составлял 450 мкм.

Одним из важных параметров, определяющих чувствительность гибриди зационного анализа на ДНК микрочипе, является чувствительность детекти рующей системы. В данной работе мы изучили перспективность использования детектирующих систем на основе ферментативных меток для ДНК микрочипов, изготовленных на стекле или мембранных носителях. Оптимиза цию системы детекции проводили на модельной системе, максимально при ближенной к условиям проведения гибридизационного анализа на ДНК микрочипе. На поверхности носителя иммобилизовали контрольный олигонук леотид, который затем в процессе гибридизации образовывал ДНК-комплекс с полностью комплементарным ему олигонуклеотидом, меченым биотином на 5’ конце. Образующиеся на поверхности микрочипа биотинилированные ДНК комплексы выявляли с использованием конъюгата стрептавидин–ПХ с после дующей колориметрической детекцией фермента (рис. 1). Для детекции ПХ были исследованы различные субстратные системы, которые в результате фер ментативного превращения образуют стабильные окрашенные нерастворимые продукты, способные хорошо адсорбироваться на поверхности носителя. Для сравнения эффективности выявления биотина в дуплексах ДНК использовали коммерчески доступные наборы на основе конъюгата стрептавидина с щелоч ной фосфатазой (ЩФ).

Рис. 1. Структурный элемент ДНК микрочипа с колориметрической де текцией.

В таблице 1 представлены значения предела обнаружения биотинилиро ванного олигонуклеотида с использованием различных субстратных систем.

Сравнение результатов, полученных для мембранных микрочипов, показывает, что наименьший предел обнаружения биотинилированного олигонуклеотида в гибридизационной смеси (0,04 нМ) наблюдается при использовании конъюгата стрептавидин-ПХ с колориметрической детекцией на основе 3,3’,5,5’ тетраметилбензидина (ТМБ) в присутствии декстран сульфата (ДС). Он срав ним с пределом обнаружения, полученным с использованием конъюгата стреп тавидин-ЩФ с последующей колориметрической детекцией на основе 5-бромо 4-хлоро-3-индолил фосфата в присутствии нитро-голубого тетразолия. В обоих случаях в ячейках микрочипа осуществлялось накопление темно-синего про дукта ферментативного превращения субстратов в течение 5-10 мин.

При колориметрической детекции биотинилированной ДНК на поверхно сти стекла наиболее низкий предел обнаружения меченого олигонуклеотида (0,025±0,005 нМ) наблюдался при использовании ПХ в качестве ферментатив ной метки и субстратной системы на основе ТМБ/ДС, а также при совместном пероксидазном окислении производных бензидина (3,3’-диаминобензидина, о дианизидина) с 4-хлор-1нафтолом. Он был существенно ниже, чем предел об наружения при использовании ферментативной детекции на основе ЩФ.

Предел обнаружения биотинилированной ДНК на микрочипах с исполь зованием колориметрической детекции на основе ПХ и ТМБ/ДС был сравним с пределом обнаружения олигонуклеотида, меченного флуоресцентным красите лем Су3 (0,020±0,005 нМ). Динамический диапазон определяемых концентра ций меченого олигонуклеотида составлял более двух порядков: 0,02 – 10 нМ для микрочипов с колориметрической детекцией и 0,02 – 5 нМ для микрочипов с флуоресцентной детекцией. Данный факт имеет значение как для количест венного гибридизационного анализа на микрочипах, так и для одновременного определения точечных мутаций в генах.

Таблица 1.

Сравнение различных детектирующих систем в методах гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах Предел обнаружения меченого олигонуклеотида, нМ Субстратная система на мембранах на стекле Метка-биотин+конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена 3,3’-диаминобензидин (ДАБ) 0,35 ± 0,07 0,95 ± 0, 4-хлоро-1-нафтол (ХН) 1,50 ± 0,20 0,80 ± 0, о-дианизидин (ОД) 0,08 ± 0,03 1,50 ± 0, 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ) 0,04 ± 0,01 0,025 ± 0, в присутствии декстран сульфата (ДС) ДАБ+ ХН 0,12 ± 0,03 0,08 ± 0, ОД + ХН 0,10 ± 0,03 0,035 ± 0, Метка-биотин+конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в присут 0,80 ± 0, 0,04 ± 0, ствии нитро-голубого тетразолия Метка-флуоресцентный краситель Сy 0,020 ± 0, Таким образом, для проведения гибридизационного анализа с колоримет рической детекцией на поверхности мембранных микрочипов и микрочипов на основе стекла была выбрана универсальная детектирующая система на основе ПХ с последующим определением ферментативной активности по накоплению продукта окислению ТМБ в присутствии ДС. Помимо высокой чувствительно сти и широкого динамического диапазона дополнительным ее преимуществом является то, что в отличие от других производных бензидина ТМБ не является канцерогенным субстратом.

2. Амплификация генов ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз с одновремен ным включением метки В методе ДНК-микрочипов анализируется меченая ДНК, полученная из образца, как правило, методом ПЦР. Для генотипирования бета-лактамаз класса А было необходимо амплифицировать полноразмерные гены ферментов с од новременным введением биотина в качестве метки с использованием мини мального количества стадий. Был выполнен дизайн праймеров и проведена оп тимизация условий проведения ПЦР. В результате было показано, что ампли фикация всех типов генов изучаемых бета-лактамаз может быть проведена в формате одной мультиплексной ПЦР с 6 парами праймеров. В результате ам плификации наблюдается синтез ПЦР-продуктов длиной 850-870 п.н., соответ ствующих полноразмерным генам ТЕМ, SHV и СТХ-М бета-лактамаз. Выход продуктов, достаточный для последующего гибридизационного анализа, дости гается за 20 циклов ПЦР при амплификации отдельных генов бета-лактамаз и за 25 циклов при одновременной амплификации нескольких типов генов. При этом общее время амплификации не превышает 1 ч. Для включения биотина в качестве метки в реакционную смесь добавляли биотинилированный дезоксиу рацилтрифосфат. Его концентрация была оптимизирована таким образом, что бы на каждые 100 нуклеотидов амплифицируемого гена встраивалось 5 – 7 мо лекул метки. Чувствительность данного метода составляла 50 – 100 копий гена на одну ПЦР.

3. ДНК-микрочипы с колориметрической детекцией для генотипирования TEM и SHV бета-лактамаз Целью следующего этапа работы была разработка колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования ТЕМ и SHV бета-лактамаз. Генотипи рование заключалось в определении всех однонуклеотидных замен в генах данных типов бета-лактамаз, приводящих к аминокислотным мутациям в бел ковых последовательностях ферментов.

Для определения ОНП генов бета-лактамаз использовался принцип ал лель-специфической гибридизации на ДНК-микрочипе. Для определения одной однонуклеотидной замены в генах использовался набор из 4-х олигонуклеотид ных зондов с уникальной последовательностью оснований, соответствующих структуре гена TEM или SHV бета-лактамаз в данном участке и отличающихся друг от друга только нуклеотидом в позиции мутации, в качестве которого ис пользовали один из четырех нуклеотидов A, G, C или Т (рис.2а). Набор из 4-х олигонуклеотидных зондов для определения каждой мутации иммобилизовал ся на поверхности микрочипа в виде блока из 12 точек – каждый в трех повто рах с целью повышения воспроизводимости анализа.

Определение ОНП проводили методом гибридизации меченого ПЦР продукта, амплифицированного из контрольного или клинического штамма продуцента бета-лактамазы, с наборами олигонуклеотидных зондов, иммобили зованных на микрочипе. При этом предполагалось, что наиболее стабильный ДНК-дуплекс образуется при гибридизации меченого фрагмента с полностью комплементарным зондом и, соответственно, в этом случае детектируется более высокий аналитический сигнал (Perfect Match – PM). При образовании ДНК дуплексов при гибридизации с остальными тремя зондами наблюдаемый сигнал (Mismatch – MM) свидетельствует об уровне неспецифической гибридизации.

Для исследования специфичности определения нуклеотида в позиции ОНП генов значения абсолютных интенсивностей сигналов переводились в от носительные (рис. 2б). Для этого значения абсолютных интенсивностей для ка ждого набора зондов нормировались на величину максимального сигнала, ко торому соответствовало положение РМ. Таким образом получали гибридизаци онные сигналы в относительных единицах: сигнал комплементарной гибриди Рис. 2. а. Принцип определения ОНП генов бета-лактамаз методом аллель специфической гибридизации на ДНК-микрочипе. б. Изображение фрагмента микрочипа для определения одной позиции ОНП и принцип количественной обработки результатов.

зации становился равным 1, а три остальных сигнала некомплементарной гиб ридизации выражались в долях от него:

RIPM = IPM/IPM = 1, RIMM = IMM/IPM, где IPM – интенсивность сигнала гибридизации с полностью комплементарным олигонуклеотидным зондом, IMM – интенсивность сигнала гибридизации с ос тальными тремя олигонуклеотидами, RIРM – доля комплементарной гибридиза ции, RIMM – доля некомплементарной (неспецифической) гибридизации. Опре деление нуклеотида в позиции ОНП считалось специфичным в том случае, если значения всех RIMM для данного набора не превышали 0.6.

ДНК микрочип для генотипирования ТЕМ бета-лактамаз содержал олигонуклеотидных зонда для определения 41 позиции ОНП генов, кодирую щих данный тип ферментов;

ДНК микрочип для генотипирования SHV бета лактамаз содержал 150 олигонуклеотидных зондов для определения 35 позиции ОНП генов. Нуклеотидные последовательности данных зондов были разрабо таны в Институте технической биохимии, Штутгарт, Германия для микрочипов с флуоресцентной детекцией (Grimm, 2004;

Grimm, 2006). Расположение набо ров олигонуклеотидных зондов на соответствующих ДНК-микрочипах приве дено на рис. 3. Каждый набор зондов нумеровался по номеру аминокислотной мутации, которая является результатом определяемой однонуклеотидной заме ны в генах. Для некоторых аминокислотных мутаций кодирующие триплеты а. б.

Рис. 3. Расположение наборов олигонуклеотидных зондов на ДНК-микрочипе для генотипирования TEM (а) и SHV (б) бета-лактамаз.

содержали по две однонуклеотидные замены, в этом случае для их определения использовалось по два набора зондов. Для позиций аминокислот 238/240 SHV бета-лактамаз, расположенных рядом и имеющих по несколько замен в каждой, использовался набор из 9 зондов, названных по аминокислотам в данных пози циях и последнему нуклеотиду в кодоне аминокислоты 240. Помимо специфи ческих олигонуклеотидных зондов каждый микрочип содержал 4 типа кон трольных зонда: контроль иммобилизации (олигонуклеотид, меченный биоти ном), положительный контроль гибридизации (олигонуклеотид, нуклеотидная последовательность которого комплементарна меченному биотином олигонук леотиду, добавляемому к гибридизационной смеси), отрицательный контроль гибридизации (олигонуклеотид со случайной последовательностью оснований), а также контроль всего процесса анализа, в качестве которого использовались олигонуклеотиды, комплементарные консервативным участкам генов TEM и SHV бета-лактамаз.

Для выполнения достоверного и специфичного определения всех позиций ОНП генов ТЕМ и SHV бета-лактамаз проводили оптимизацию температуры и времени гибридизации, состава гибридизационного буфера, количества и раз мера фрагментов меченой ДНК. На рис. 4 приводятся значения относительных интенсивностей гибридизационных сигналов, полученных при гибридизации 200 нг меченной биотином ДНК, амплифицированной из контрольного штам ма-продуцента бета-лактамазы ТЕМ-1, со всеми наборами олигонуклеотидных зондов на ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией в оптимизирован ных условиях (температура гибридизации 45С, гибридизационный буфер со держал 0,3 М NaCl и 0,2% SDS, время гибридизации - 2 ч при интенсивном пе ремешивании). В данных условиях во всех позициях ОНП нуклеотид опреде лялся правильно и специфично.

Для сравнения специфичности выявления однонуклеотидных замен в ДНК, меченой биотином и флуорецентной меткой Су3, исследовали распреде ление значений RIMM для всех наборов зондов (таблица 2). Обобщая данные по генотипированию ТЕМ и SHV бета-лактамаз на колориметрических микрочи пах, было установлено, что более 60% ММ-зондов характеризовались значе ниями RIMM, не превышающих 0,1, значения RIMM для остальных зондов варьи ровали от 0,1 до 0,6. В случае флуоресцентной детекции специфичность выяв ления ОНП была ниже: для большинства ММ-зондов значения RIMM находи лись в диапазоне 0,1 – 0,6. И для 2-х наборов зондов для ТЕМ- и 1 набора для SHV бета-лактамаз RIMM превышали 0,6, что делало невозможным достоверное определение типа нуклеотида в данных позициях ОНП. Таким образом, была продемонстрирована более высокая специфичность определения ОНП методом гибридизационного анализа с использованием биотина в качестве метки ДНК и последующей колориметрической детекцией по сравнению с гибридизацион ным анализом с использованием флуоресцентного красителя Су3.

1, 1, 0, Интенсивность, отн. ед.

A G 0, C T 0, 0, 0, 67. 67. 163. 194. 235. 162. 162. 163. 194. 235. 236. 241. 241. Рис. 4. Профили относительных интенсивностей гибридизационных сигналов, полученные при гибридизации 200 нг меченой биотином ДНК, амплифицированной из контрольного штамма-продуцента бета-лактамазы ТЕМ-1, на ДНК-микрочипах с ко лориметрической детекцией.

Таблица 2.

Специфичность выявления ОНП генов ТЕМ и SHV бета-лактамаз на ДНК-микрочипах с колориметрической и флуоресцентной детекцией Доля ММ зондов с заданным значением RIMM (%) Колориметрическая детекция Флуоресцентная детекция RIMM ТЕМ ТЕМ SHV SHV 63,2 71,5 28,7 49, 0, 0,1 – 0,6 36,8 28,5 67,8 50, 0,0 0,0 2,6 0, 0, 4. ДНК-микрочип для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз Целью следующего этапа работы была разработка ДНК-микрочипа для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз, включающая проведение молекуляр ного дизайна олигонуклеотидных зондов.

Сложность молекулярного дизайна зондов для мультипараметрического анализа генов состоит в необходимости подбора олигонуклеотидов, которые будут эффективно и специфично гибридизоваться с меченой ДНК-мишенью в одинаковых гибридизационных условиях. В литературе описаны основные пра вила дизайна олигонуклеотидных зондов для определения ОНП генов (Bodrossy, 2003). Основным правилом является расположение мутации в цен тральной части зонда, так как именно эта позиция обеспечивает максимальную дискриминацию между различными аллелями. Также оптимальным является выполнение следующих условий: длина олигонуклеотида должна составлять 17-24 оснований;

различия в температурах плавления зондов (Tm) для разных групп олигонуклеотидов не должны превышать 50С;

GC-состав должен нахо диться в диапазоне 35 –70 %;

вероятность образования вторичных структур должна быть минимальной.

Основываясь на данных правилах, был проведен молекулярный дизайн зондов для определения 19 позиций ОНП генов бета-лактамаз подгруппы СТХ М-1. Полученные значения абсолютных интенсивностей для РМ-зондов варьи ровали от 10000 до 60000 и для всех наборов зондов превышали интенсивность фона более чем в 3 раза. Однако специфичность выявления правильного нук леотида в позиции ОНП для большинства наборов была крайне низкой: для из 19 позиций ОНП относительные интенсивности хотя бы одного ММ-зонда внутри каждого набора превышали 0,6. Поэтому проведение генотипирования СТХ-М бета-лактамаз с данным набором зондов было невозможно. Таким обра зом, необходимо было разработать подходы к повышению специфичности оп ределения однонуклеотидных замен в генах.

Было установлено, что наиболее частой причиной неспецифического оп ределения мутаций в генах СТХ-М бета-лактамаз являлось наличие в структуре зондов от 1 до 3 GC-повторов длиной 4 и более нуклеотидов. В этом случае для повышения специфичности было предложено вводить в зонды дополнительные искусственные замены. Замены вводили непосредственно в GC-повторы, в большинстве случаев гуанин заменяли на аденин. Максимальная дестабилиза ция ДНК-дуплексов наблюдалась при введении замены в центральную часть зонда на расстоянии 3-4 основания от позиции истинной мутации. Количество введенных замен, в основном, соответствовало количеству GC-повторов (от до 3). При этом при каждой искусственной замене нуклеотида необходимо бы ло дополнительно удлинять зонд на 1 – 3 нуклеотида для сохранения значений Tm,PM в заданном диапазоне.

В качестве примера на рис. 5 приводятся профили относительных интен сивностей сигналов, полученных при гибридизации гена бета-лактамазы СТХ М-3 с исходными (Дизайн 1) и модифицированными (Дизайн 2) вариантами зондов. Для всех наборов зондов, содержащих GC-повторы, данным способом удалось значительно повысить дискриминирующую способность наборов зон дов и значения RIMM всех ММ-зондов в результате не превышали 0,2.

Для наборов зондов, в последовательностях которых отсутствовали GC повторы, но наблюдалась низкая специфичность выявления однонуклеотидных замен дизайн зондов был проведен по прямой и обратной цепям гена. Было ус тановлено, что разница температур плавления совершенных и несовершенных ДНК-дуплексов различается при дизайне зондов по прямой и обратной цепи.

Так при дизайне зондов для позиции ОНП 167 по прямой цепи Tm составляла 3,1С, при дизайне по обратной цепи – 8,2С (рис. 6). При гибридизации с геном бета-лактамазы СТХ-М-3 новый набор олигонуклеотидных зондов показал лучшую дискриминирующую способность - максимальные значения RIMM в на борах зондах не превышали 0,1. Таким образом, при молекулярном дизайне олигонуклеотидных зондов для определения ОНП генов необходимо рассчиты вать Tm для зондов как по кодирующей, так и некодирующей цепи гена, и ис пользовать в анализе те зонды, для которых значение Tm больше.

Отдельно был проведен дизайн олигонуклеотидных зондов, предназна ченных для определения позиций ОНП, расположенных на концах гена. Если определяемая мутация в позиции ОНП располагается на 3’-конце гена и попа дает в область отжига обратного праймера, все синтезируемые в ПЦР обратные цепи гена не будут содержать данную мутацию. Нуклеотидная замена будет со держаться только в амплифицируемых прямых цепях гена и для ее правильного выявления молекулярный дизайн зондов должен быть сделан по обратной (не кодирующей) цепи. Для определения позиций ОНП, расположенных в начале гена и попадающих в область отжига прямого праймера, наблюдается обратная ситуация, и дизайн олигонуклеотидных зондов необходимо проводить по пря мой (кодирующей) ДНК цепи.

а. ОНП С1_ б. ОНП С1_ в. ОНП С1_ Рис. 5. Результаты гибридизации меченого гена бета-лактамазы СТХ-М-3 с на борами олигонуклеотидных зондов для определения ОНП в позициях: а. С1_35;

б. б. С1_23;

в. С1_77 (до и после введения искусственных замен в последова тельности зондов).

Основываясь на выявленных закономерностях, был выполнен дизайн на боров олигонуклеотидных зондов для определения 67 позиций ОНП генов всех подгрупп бета-лактамаз СТХ-М типа. Данные наборы зондов использовали для создания ДНК-микрочипа для генотипирования бета-лактамаз данного типа.

Расположение специфических олигонуклеотдных зондов на поверхности мик рочипа представлено на рис. 7. Олигонуклеотидный микрочип для генотипиро вания СТХ-М бета-лактамаз содержал 4 набора олигонуклеотидных зондов для идентификации подгруппы СТХ-М бета-лактамаз, 19 наборов зондов для опре деления позиций ОНП генов бета-лактамаз подгруппы СТХ-М-1, 15 наборов Рис. 6. Результаты гибридизации меченого гена бета-лактамазы СТХ-М-3 с на бором олигонуклеотидных зондов для определения ОНП в позиции С1_167 (ди зайн наборов олигонуклеотидных зондов проведен по прямой и обратной цепи).

зондов – для подгруппы СТХ-М-2, 9 наборов зондов – для подгруппы СТХ-М- и 20 наборов зондов – для подгруппы СТХ-М-9. Всего на микрочипе были им мобилизованы 264 специфических олигонуклеотидных зонда (1056 точек), при этом площадь микрочипа составляла около 1 см2. Проверку эффективности и специфичности работы олигонуклеотидных зондов проводили при гибридиза ции микрочипов с 8 контрольными штаммами энтеробактерий, продуцирую щих следующие бета-лактамазы: СТХ-М-3, СТХ-М-15 и СТХ-М-42 из под группы СТХ-М-1, СТХ-М-2 и СТХ-М-5 из подгруппы СТХ-М-2, СТХ-М 9 и СТХ-М-14 из подгруппы СТХ-М-9, а также СТХ-М-8. В качестве условий для гибридизации были выбраны условия, оптимизированные ранее для проведения генотипирования ТЕМ и SHV бета-лактамаз на ДНК-микрочипах с колоримет рической детекцией. Изображение колориметрического микрочипа и профили относительных интенсивностей сигналов после гибридизации с амплифициро ванным геном бета-лактамазы СТХ-М-3 представлены на рис. 7б и рис. 8 соот ветственно. Нуклеотиды во всех исследуемых позициях ОНП определялись правильно и однозначно, так как максимальные значения RIMM для всех наборов зондов не превышали 0,6.

Рис. 7. а. Расположение олигонуклеотидных зондов на поверхности ДНК микрочипа для генотипирования СТХ-М бета-лактамаз. б. Изображение микро чипа после гибридизации с меченой ДНК, амплифицированной из контрольно го штамма-продуцента бета-лактамазы СТХ-М-3.

Оценку дискриминирующей способности олигонуклеотидных зондов проводили по значениям относительных интенсивностей гибридизационных сигналов. В таблице 3 представлено распределение полученных значений отно сительных интенсивностей RIMM, полученных при гибридизации микрочипов с меченой ДНК, амплифицированной из контрольных штаммов микроорганиз мов, продуцирующих бета-лактамазы СТХ-М-3, СТХ-М-2, СТХ-М-8 и СТХ-М 9. Большинство MM-зондов для каждой подгруппы ферментов показывали зна чения RIMM меньше 0,1, что соответствует высокой дискриминирующей спо собности. Для остальных ММ-зондов значения RIMM варьировали в диапазоне от 0,1 до 0,6, что также удовлетворяет введенному критерию правильного опре деления нуклеотида в позиции ОНП.

1, A G 1, C Интенсивность, отн. ед.

T 0, 0, 0, 0, 0, С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ С1_ Позиция ОНП Рис. 8. Профили относительных интенсивностей гибридизационных сигналов, полученных при гибридизации меченой ДНК, амплифицированной из кон трольного штамма-продуцента бета-лактамазы СТХ-М-3.

Таблица 3.

Специфичность выявления однонуклеотидного полиморфизма генов СТХ-М бета-лактамаз на ДНК-микрочипе Доля ММ зондов с заданным значением RIMM (%) RIMM СТХ-М-1 СТХ-М-2 СТХ-М-8 СТХ-М- 0,1 73,7 68,9 63,0 66, 0,1 – 0,6 26,3 31,1 37,0 33, 0,6 0,0 0,0 0,0 0, Разработанный ДНК-микрочип был апробирован с использованием клинических штаммах энтеробактерий из различных регионов России, проду цирующих СТХ-М бета-лактамазы. У 84% штаммов выявлено наличие генов ферментов, принадлежащих к подгруппе CTX-M-1. Также были выявлены гены ферментов, принадлежащих к подгруппе CTX-M-2 (4%) и CTX-M-9 (12%). Ре зультаты генотипирования СТХ-М бета-лактамаз на ДНК-микрочипе были подтверждены стандартным методом ДНК-секвенирования, при этом наблюда лось соответствие для 94 из 97 протестированных образцов (96,9%).

5. Интегрированный ДНК-микрочип для диагностики бета-лактамаз рас ширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз Информация о точном генотипе продуцируемой микроорганизмом бета лактамазы, которую получают на генотипирующих микрочипах, необходима для проведения масштабных эпидемиологических исследований, однако она часто избыточна для диагностики антибиотикорезистентности в клинических лабораториях. Целью подобной диагностики в первую очередь является выбор лекарственного препарата для эффективной антибиотикотерапии. В этом слу чае важно знать не генотип продуцируемой микроорганизмом бета-лактамазы, а субстратную специфичность фермента.

Данный раздел посвящен разработке интегрированного олигонуклеотид ного микрочипа для одновременной диагностики бета-лактамаз TEM, SHV и СТХ-М типов, проявляющих расширенный спектр субстратной специфичности и/или являющихся устойчивыми к действию ингибиторов сериновых бета лактамаз.

Согласно литературным данным [], внутри каждого типа ферментов име ется ограниченное число аминокислотных мутаций, влияющих на спектр их субстратной специфичности. Для бета-лактамаз ТЕМ типа установлено, что му тации E104K, R164S/H/C, G238S/D, E240K значительно расширяют спектр субстратной специфичности в отношении цефалоспоринов II – IV поколений, особенно цефтазидима, а мутации M69I/L/V, S130G, R244C/T/S/H/L/G, R275L/Q/A, N276D приводят к возникновению устойчивости ферментов к ин гибиторам сериновых бета-лактамаз. Для бета-лактамаз SHV-типа мутации D179A/N/G, G238S/A, E240K расширяют спектр субстратной специфичности, а M69I, S130G, K234R вызывают устойчивость ферментов к ингибиторам. Все СТХ-М бета-лактамазы являются БЛРС и характеризуются тем, что проявляют значительно более высокую активность в отношении цефотаксима и цефтриак сона по сравнению с цефтазидимом. Однако в последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что продуценты СТХ-М бета лактамаз могут проявлять высокую устойчивость к цефтазидиму в результате аминокислотных мутации P167T/S и D240G внутри всех подгрупп данных фер ментов. Таким образом, определение типов генов и вышеперечисленных ами нокислотных замен позволяет диагностировать продукцию микроорганизмами 95,6% типов известных БЛРС класса А, 97,8% ИРТ бета-лактамаз и 100% бета лактамаз смешанного типа (проявляют как расширенный спектр активности, так и устойчивость к ингибиторам).

Для изготовления микрочипа для диагностики продукции микроорганиз мами БЛРС и ИРТ бета-лактамаз молекулярного класса А использовались два типа олигонуклеотидных зондов: групп(подгрупп)-специфические олигонукле отидные зонды для идентификации типа гена бета-лактамазы, а также олиго нуклеотидные зонды для определения ключевых мутаций внутри каждой груп пы бета-лактамаз. Дизайн групп(подгрупп)-специфических зондов осуществ лялся на основе консервативных участков генов всех ферментов, принадлежа щих к каждой группе. Для детекции нуклеотидных замен в генах, приводящих к определяемым аминокислотным мутациям, создавались наборы зондов, со держащие от 2 до 7 олигонуклеотидов. Последовательность одного из данных олигонуклеотидов соответствовала нуклеотидной последовательности фермен та «дикого типа» (WT – wild type), являющегося родоначальником каждой группы/подгруппы бета-лактамаз (TEM-1, SHV-1, CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M 8, CTX-M-9). Остальные олигонуклеотиды в наборах (один или несколько) бы ли комплементарны участкам генов, кодирующих мутантные по данной пози ции формы ферментов (MT – mutant type). В связи с близким расположением мутаций в позициях 275, 276 ТЕМ бета-лактамаз, а также 238,240 SHV бета лактамаз, для их определения использовались единые наборы зондов – T_275/276 и S_238/240, соответственно. Для изготовления микрочипа в качест ве носителя использовали отрицательно-заряженный найлон. На микрочипе площадью около 1 см2 в виде трех блоков (для ТЕМ, SHV и СТХ-М) были им мобилизованы 75 олигонуклеотидных зондов: 7 зондов для идентификации групп/подгрупп ферментов и 68 зондов для определения 8 мутаций в ТЕМ, мутаций в SHV, 2 мутаций в СТХ-М-1, 5 мутаций в СТХ-М-2 и 3 мутаций в СТХ-М-9 бета-лактамазах. Каждый олигонуклеотид наносился на микрочип в 3-х повторах. Расположение олигонуклеотидных зондов на поверхности микро чипа представлено на рис. 9.

Рис. 9. Расположение олионуклеотидных зондов на ДНК-микрочипе для диагности ки БЛРС и ИРТ бета-лактамаз молекуляр ного класса А.

К преимуществам интегрированного микрочипа можно отнести успеш ную идентификацию смеси генотипов, принадлежащих не только к разным ти пам генов, но и смеси двух генов, принадлежащих к одному генетическому ти пу. На рис. 10 приведены результаты тестирования 2-х штаммов E. coli, один из которых продуцирует только пенициллиназы ТЕМ-1 и SHV-1, а другой – смесь пенициллиназ ТЕМ-1 и SHV-1 и двух БЛРС (SHV-12 и CTX-M-15). Обе смеси ферментов достоверно определялись на микрочипе. Сравнение профилей гиб а.

WT 1, MT_ Интенсивность, отн. ед.

1,00 MT_ MT_ 0,80 MT_ MT_ 0, MT_ 0, 0, 0, S_238/ C1_ C1_ T_ T_ T_ T_ T_ T_ T_275/ S_ S_ T_ S_ S_ S_ б.

WT 1, MT_ Интенсивность, отн. ед.

1,00 MT_ MT_ 0,80 MT_ MT_ 0, MT_ 0, 0, 0, S_238/ C1_ C1_ T_ T_ T_ T_ T_ T_ T_275/ S_ S_ T_ S_ S_ S_ Рис. 74. Результаты гибридизации микрочипа с 1000 нг ДНК, амплифицированной из 2-х клиничеких штаммов E.coli:

а. продуцент бета-лактамаз ТЕМ-1 и SHV-1, б. продуцент бета-лактамаз ТЕМ-1, SHV-1, SHV-12 и CTX-M-15.

ридизации показывает появление двух сигналов комплементарной гибридиза ции в позиции S_238/240 SHV бета-лактамаз, что свидетельствует о продукции как фермента дикого типа SHV-1, так и бета-лактамазы SHV-12, имеющей му тацию в данной позиции. Наличие гибридизационных сигналов для зондов, идентифицирующих гены ферментов подгруппы СТХ-М-1 и мутации в них, подтвердили продукцию фермента СТХ-М-15 во втором образце.

Разработанный ДНК-микрочип бы апробирован с использованием клинических штаммов микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, выде ленных в различных лечебных учреждениях РФ. Все образцы были предвари тельно охарактеризованы фенотипически с использованием диско диффузионного метода: 10 из них являлись БЛРС(–) и 90 – БЛРС(+). По дан ным гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах среди БЛРС(–) штаммов продукции бета-лактамаз ТЕМ, SHV или СТХ-М типов либо обнаружено не было, либо продуцировались только пенициллиназы TEM-1 и SHV-1 типов. У всех штаммом с фенотипом БЛРС(+) были обнаружены гены БЛРС: 62% штаммов продуцировали бета-лактамазы подгрупп СТХ-М-1, -2 и -9, 13% БЛРС типа SHV и у 24,6% исследуемых штаммов была выявлена одновременная продукция двух БЛРС. Таким образом, апробация интегрированного микрочи па не выявила ни ложноположительных, ни ложноотрицательных результатов в сравнении с данными фенотипических тестов.

ВЫВОДЫ 1. Оптимизированы условия проведения гибридизационного анализа биотини лированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией. Предел обнаружения биотинилированных олигонуклеотидов составил 0,025±0, нМ на микрочипах из стекла и 0,04±0,01 нМ на мембранных микрочипах.

Показано, что специфичность выявления однонуклеотидного полиморфизма генов бета-лактамаз методом гибридизационного анализа ДНК с использо ванием биотина в качестве метки выше, чем специфичность гибридизаци онного анализа с использованием флуоресцентной метки Су3.

2. Разработан метод мультиплексной ПЦР для совместной амплификации полноразмерных генов TEM, SHV и CTX-M бета-лактамаз с одновремен ным введением биотина в качестве метки. Метод позволяет определять 50 – 100 копий гена в одной реакции.

3. Исследовано влияние структурных параметров олигонуклеотидных зондов на специфичность и чувствительность выявления однонуклеотидного поли морфизма генов методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах.

Предложены способы проведения молекулярного дизайна олигонуклеотид ных зондов для анализа однонуклеотидного полиморфизма генов.

4. Разработан ДНК-микрочип для генотипирования бета-лактамаз СТХ-М типа на основе определения 67 позиций ОНП кодирующих их генов. Апробация экспериментальной серии ДНК-микрочипов на 97 клинических штаммах семейства Enterobacteriaceae показала 96% совпадение с результатами ДНК-секвенирования.

5. На основе совместного использования олигонуклеотидных зондов для иден тификации трех типов бета-лактамаз (ТЕМ, SHV, СТХ-М) и зондов для оп ределения ключевых мутаций в каждом из указанных типов генов разрабо тан интегрированный ДНК-микрочип для диагностики бета-лактамаз рас ширенного спектра и ингибитор-резистентных бета-лактамаз. Проведена апробация микрочипа на 100 клинических образцах Enterobacteriaceae, ус тановлена хорошая корреляция полученных результатов с данными феноти пических тестов.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Уляшова М.М., Рубцова М.Ю., Бахманн Т., Егоров А.М. Оптимизация гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах с колориметрической де текцией на основе пероксидазы хрена. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 2008, т. 49, № 2, с. 96–102.

2. Уляшова М.М., Рябова Ю.Ю., Рубцова М.Ю., Егоров А.М. ДНК микрочипы на пористых мембранных носителях с колориметрической де текцией. Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия, 2010, т. 51, № 3, с. 235 – 240.

3. Rubtsova M.Yu., Ulyashova M.M., Edelstein M.V., Egorov A.M. Oligonucleo tide microarrays with horseradish peroxidase-based detection for the identifica tion of extended-spectrum beta-lactamases. Biosens. Bioelectron., 2010, v. 26, 4, p. 1252-1260.

4. Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Бахман Т.T., Шмид Р.Д., Егоров А.М.

Мультипараметрическое определение генов и точечных мутаций в них для идентификации бета-лактамаз. Успехи биологической химии, 2010, т. 50, с.

303 – 348.

5. Рубцова М.Ю., Уляшова М. М., Халилова Ю. И., Егоров А. М. Олигонук леотидные микрочипы для определения генетических детерминант рези стентности микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам. Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с междуна родным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 24-26 нояб ря 2010, т.4, стр. 344-347.

6. Ulyashova M.M., Rubtsova M.Yu., Bachmann T., Egorov A.M. Optimization of hybridization analysis on oligonucleotide-based DNA-microarray with colo rimetric detection. Abstracts of International conference “Biocatalysis-2007:

structure, functions, applications”, Moscow – St. Petersburg, Russia, June 17-22, 2007, p. 134.

7. Rubtsova М., Ulyashova M., Ignatenko O., Edelstein M., Egorov A., Schmid R., Bachmann T. Genotyping of CTX-M extended spectrum beta-lactamases with DNA microarrays. Abstracts of 8th International Meeting on Microbial Epidemiological Markers, Zakopane, Poland, May 14-17, 2008, р. 56.

8. Ulyashova M.M., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. Detection of SNPs in genes of extended-spectrum beta-lactamases with DNA-microarrays. Proceedings of the Fifth International Congress “Biotechnology – State of the Art and Prospects of Development”, Moscow, Russia, March 16-20, 2009, part 1, p. 219-220.

9. Ulyashova M.M., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. DNA microarrays with HRP based detection for identification of extended-spectrum beta-lactamases. Pro ceedings of International conference “Biocatalysis-2009: fundamentals & appli cations”, Arkhangelsk, Russia, June 19-24, 2009, p. 57.

10. Ulyashova M.M., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. The development of DNA microarray technology for diagnostics of resistance against beta-lactam antibio tics among Enterobacteriaceae. Proceedings of the Second International Forum «Rusnanotech 2009», Moscow, Russia, October 6-8 октября, 2009, p. 181-182.

11. Уляшова М.М., Рубцова М.Ю., Халилова Ю.И., Эйдельштейн М.В., Алек сандрова И.А., Егоров А.М. ДНК-микрочип для диагностика устойчивости грамотрицательных бактерий к бета-лактамным антибиоткам, вызванной продукцией наиболее распространенных бета-лактамаз. Сборник тезисов XII международного конгресса по антимикробной терапии МАК МАХ/ESCMID, Москва, Россия, 18-20 мая, 2010, с. 51.

12. Rubtsova M.Yu., Ulyashova M.M., Egorov A.M. Oligonucleotide microarrays with horseradish peroxidase based detection for the identification of extended spectrum beta-lactamases. Abstracts of 20th Anniversary World Congress on Biosensors, Glasgow, UK, May 26-28, 2010, р. 3.1.049.

13. Ulyashova M.M., Halilova Yu., Rubtsova M.Yu., Egorov A.M. Membrane DNA microarrays for the rapid diagnostics of clinically significant beta lactamases. Proceedings of the Third International Forum «Rusnanotech 2010», Moscow, Russia, October 6-8.

14. Рубцова М.Ю., Уляшова М. М., Халилова Ю. И., Егоров А. М. ДНК микрочипы с колориметрической детекцией для диагностики устойчивости микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам. Материалы первой ме ждународной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17 19 ноября 2010 г., стр.71.