Динитрозильные комплексы железа, s-нитрозотиолы и коэнзим q как антиоксиданты в системах, моделирующих окислительный стресс
На правах рукописи
Губкин Андрей Александрович Динитрозильные комплексы железа, S-нитрозотиолы и коэнзим Q как антиоксиданты в системах, моделирующих окислительный стресс Специальность 03.00.02 биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва 2006
Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова и в НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росздрава.
Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич Научный консультант: кандидат химических наук Шумаев Константин Борисович
Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Петрусевич Юрий Михайлович доктор биологических наук Реутов Валентин Палладиевич
Ведущая организация: Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
Защита диссертации состоится 21 ноября 2006 г. в « » часов на заседании диссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адрессу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Физический факультет, аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан « » октября 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета К 501.001. кандидат физико-математических наук Хомутов Г.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования.
В настоящее время одной из актуальных задач в медицинской биофизике, физиологии и медицинской химии является изучение короткоживущих активных соединений, выполняющих функцию регуляторов на различных уровнях организации живых организмов. К таким молекулам, в первую очередь, относятся оксид азота (NO) и активные формы кислорода. В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов. Наряду с сигнальной ролью NO, важной областью исследований является взаимодействие оксида азота с активными формами кислорода.
Возникающие в этих реакциях активные метаболиты азота – пероксинитрит, диоксид азота, NO2Cl и. др. являются важным компонентами иммунного ответа в организме человека и животных. С другой стороны, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом, в том числе атеросклероза, ишемической болезни сердца, нейродегенеративных заболеваний, катаракты, рака, диабета. В тоже время, процессы взаимодействия активных форм кислорода с такими производными NO как S-нитрозотиолы (RSNO) и динитрозильные комплексы железа остаются мало изученным. Существенно, что сам оксид азота и S-нитрозотиолы в некоторых модельных системах проявляют антиоксидантные свойства. Предполагается, что одним из механизмов антиоксидантного действия NO является связывание свободных ионов железа в составе нитрозильных комплексов. При этом ингибируются реакции свободно-радикального окисления, катализируемые редокс-активными ионами железа. Перекисное окисление липидов ингибируется также благодаря взаимодействию NO с алкилпероксильными и алкоксильными радикалами. Оксид азота может защищать другие биологические молекулы от окислительной модификации, нитрозилируя гем и восстанавливая оксоферрилформы гемопротеидов.
Во многих работах в качестве возможных белков-переносчиков NO в кровотоке рассматриваются гемоглобин и альбумин. Цистеиновые остатки этих белков могут нитрозилироваться, в случае гемоглобина NO также связывается с железом гема. Показано, что при взаимодействии низкомолекулярных ДНКЖ с гемоглобином и альбумином образуются ассоциированные с этими белками динитрозильные комплексы железа. Они, так же как и низкомолекулярные ДНКЖ могут играть важную роль в условиях окислительного стресса.
Известно, что супероксид влияет на образование S-нитрозогемоглобина и стимулирует высвобождение NO из S-нитрозоальбумина. Редокс-реакции с участием гемоглобина играют важную роль в ходе окислительного стресса.
Установлено, что гемоглобин может стимулировать перекисное окисление белок-липидных комплексов. В ряде статей высказано предположение, что динитрозильные комплексы железа с белками могут участвовать в защите клеток от цитотоксического действия активных форм кислорода. Так как белковые динитрозильные комплексы ответственны за многие физиологические функции NO в организме человека, большое значение имеет изменение их концентрации под действием активных форм кислорода.
В условиях окислительного стресса происходит истощение большинства эндогенных антиоксидантов. В связи с этим, несомненно, актуальным является выяснение влияния производных оксида азота на концентрацию важнейшего липофильного антиоксиданта убихинона (коэнзима Q). Высокая эффективность коэнзима Q связана с тем, что он может регенерировать витамин Е (токоферол) и сам восстанавливается ферментами дыхательной цепи митохондрий или аскорбатом. Однако убихинон может также способствовать генерации супероксидного радикала.
Следовательно, взаимодействие убихинона с производными оксида азота может иметь неоднозначный характер.
Таким образом, реакции активных форм кислорода с содержащими ион нитрозония производными оксида азота (RSNO и динитрозильными комплексами железа) могут играть чрезвычайно важную роль как в нормальных условиях существования живого организма, так и в ходе патологических процессов возникающих в результате окислительного стресса. Исследование механизмов взаимодействия производных оксида азота и активных форм кислорода особо актуально, так как они могут определять баланс антиоксидантных и прооксидантных реакций в клетке, а также влиять на концентрацию оксида азота, который является универсальным регулятором многих метаболических путей и физиологических эффектов.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось изучение физиологических роли взаимодействия активных форм кислорода с производными оксида азота, содержащими ион нитрозония, и влияния на эти процессы коэнзима Q (убихинона).
Исходя из поставленной в диссертационной работе цели, решались следующие задачи:
1. Изучить взаимодействие низкомолекулярных динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и органическими гидропероксидами.
2. Исследовать особенности реакций ассоциированных с гемоглобином и альбумином динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и пероксинитритом.
3. В системах, моделирующих окислительный стресс, исследовать влияние динитрозильных комплексов железа и S-нитрозоглутатиона на характеристики индуцированного железосодержащими белками перекисного окисления препаратов миокарда.
4. Изучить действие S-нитрозоглутатиона на окислительную деструкцию липофильных антиоксидантов: коэнзима Q и -каротина, а также взаимодействие в этих условиях коэнзима Q и S нитрозоглутатиона.
Научная новизна диссертации.
1. Методом спектроскопии ЭПР изучены процессы взаимодействия низкомолекулярных и белковых динитрозильных комплексов с активными формами кислорода.
2. Впервые установлено, что различия кинетик деструкций ассоциированных с альбумином и гемоглобином динитрозильных комплексов под действием пероксида водорода, гидропероксида трет-бутила и пероксинитрита обусловлены гемовой группой.
3. При изучении взаимодействия различных типов динитрозильных комплексов с пероксидом водорода впервые показано, что входящее в состав этих комплексов железо не участвует в реакции Фентона.
4. Продемонстрировано антиоксидантное действие динитрозильных комплексов и S-нитрозоглутатиона при перекисном окислении митохондрий кардиомиоцитов, индуцированное миоглобином и ферритином в сочетании с гидропероксидом трет-бутила.
5. Впервые обнаружено защитное действие S-нитрозогутатиона в отношении убихинонов миокарда крысы в условиях моделирующих окислительный стресс.
6. Показано, что S-нитрозоглутатион и динитрозильные комплексы железа ингибируют окислительную деструкцию липофильного антиоксиданта -каротина под действием свободных радикалов трет-бутила.
Научно-практическая значимость исследования.
Представленные в диссертации экспериментальные данные проясняют механизмы взаимодействия динитрозильных комплексов железа с активными формами кислорода и могут быть использованы для лучшего понимания роли оксида азота и его производных в биологических системах. Процессы, изученные в данной работе, имеют большое значение для понимания механизмов действия фармакологических доноров оксида азота.
Апробация результатов исследования и публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах.
Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на XI и XII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам “Ломоносов-2004” и “Ломоносов-2005”, “Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии.” (Москва, 2005), IV международная научно-практическая конференция с международным участием “Активные формы кислорода, оксид азота антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленск. 2005), III съезде биофизиков России (Воронеж 2004), XIV международной конференции и дискуссионном научном клубе “Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармокологии и экологии” (Ялта-Гурзуф, 2006).
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), методической части (глава 2), описания собственных результатов и их обсуждения (главы 3 – 7), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 111 страниц, включая 28 рисунков и графиков, 2 таблици и список литературы из 148 наименований.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, обоснована актуальность темы, сформулированны цели и задачи исследования, кратко изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.
Первая глава содержит литературный обзор, посвященный активным формам кислорода, оксиду азота и его производным. Кратко изложены основные физико-химические свойства активных форм кислорода и азота.
Описаны их источники в биологических системах. Дана классификация NO синтаз и представление о их функционировании, способах регуляции ферментативной активности. Кратко изложена работа дыхательной цепи митохондрий с упором на образование ею активных форм кислорода, прежде всего супероксида. Описана ксантиноксидоредуктаза, даны ее основные функции и регуляция. В разделе 1.3 кратко описано современное представление о взаимодействии активных форм кислорода и азота в клетке, рассказано о роли динитрозильных комплексов в этом взаимодействии.
Отдельный раздел посвящен пероксинитриту, как одному из наиболее важных продуктов взаимодействия активных форм кислорода и азота, описаны его цитотаксические свойства. Заканчивает главу раздел 1.4 о прооксидантных и антиоксидантных свойствах активных форм кислорода и азота, обобщаются данные о роли динитрозильных комплексов и S нитрозоглутатиона. Целью обзора литературы было не только показать современное представление о разделе биофизики посвященном свободным радикалам кислорода и азота, но и показать место данной работы в этом разделе, обосновать актуальность поставленных в ней задач.
Во второй главе представлены материалы и методы исследования.
Раздел 2.1 посвящен регистрации спектров ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре E-109Е фирмы Varian (США), при комнатной температуре (~25°C). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл для TIRON и СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,4 мТл для ДНКЖ. Спектры феноксильного радикала пробукола регистрировали при СВЧ мощности 50 мВт. В экспериментах с генерацией О2•-, для постоянства газового состава образцы помещали в тонкостенный (толщина стенок 0,00254 мм) тефлоновый капилляр фирмы Norell, Inc. (США), а запись спектров проводили при непрерывной продувке воздухом. В остальных случаях образцы помешались в стеклянные капилляры. Для определения скорости генерации свободных радикалов кислорода митохондриями использовали спиновую ловушку TIRON. В остальных случаях для определения скорости генерации радикалов кислорода использовали спиновую ловушку DEPMPO. Регистрацию спектров спин-аддуктов DEPMPO проводили при тех же условиях что и для ДНКЖ: СВЧ мощность мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 мТл. В разделе 2. описывается получение препаратов и работа с ними. В работе использовали восстановленный глутатион (Calbiochem, США), цистеин, гидропероксид трет-бутила (Merk, Германия), пероксид водорода, ДТПА, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), DEPMPO (5-диэтоксифосфорил-5 метил-1-пирролин N-оксид) (OXIS, США), TIRON (4,5 - диоксибензол - 1,3 дисульфат натрия), супероксиддисмутазу, ксантиноксидазу, гемоглобин, метмиоглобин, гемин, пероксинитрит, диоксид калия (KO2), убихинон, ферритин и 2-тиобарбитуровую кислоту (Sigma, США) и некоторые другие.
S-нитрозоглутатион (GSNO) и динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с глутатионом в диамагнитной димерной форме получали, смешивая 300 мМ NaNO2 и 200 мМ восстановленного глутатиона в кислой среде или растворы FeSO4 и глутатиона в молярном соотношении 1:2 сосуде Тунберга в атмосфере NO, соответственно. Препараты GSNO, ONOO- и ДНКЖ хранили при –20С. Концентрацию ДНКЖ определяли методом спектроскопии ЭПР.
Для генерации супероксида в разных экспериментах использовали систему ксантин-ксантиноксидаза или супероксид калия (КО2). При работе с ксантиноксидазай образец помещали в тонкостенный (толщина стенок 0,00254 мм) тефлоновый капилляр, как и при работе с митохондриями, а запись спектров проводили при непрерывной продувке воздухом.
Пероксинитрит получали, смешивая охлажденные растворы 1 М NaNO2 и М Н2О2 в 0,3 М H2SO4, после чего быстро добавляли равный объём 1,4 М NaOН. Разделы 2.3 и 2.4 посвящены описанию получения изолированных митохондрий и определению их функциональной активности. Митохондрии выделяли из сердец крыс. Методика выделения митохондрий была стандартной. Животных усыпляли, используя 20% раствор уретана (1,8 мг/кг массы животного), который вводился в брюшную полость. Затем быстро извлекали сердце и помещали в охлажденную (4С) среду выделения. Cостав среды выделения: 300 мM сахароза, 10 мM HEPES (N-2 гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота), 0,5 мM EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота);
рН 7.4. Измельченную ткань переносили в гомогенизатор (стекло-тефлон), добавляли 25-30 мл среды выделения в соответствии с соотношением 1:8 и гомогенизировали 2- минуты до превращения суспензии в гомогенную. Осаждение митохондрий производили в два этапа на центрифуге К-24 (ГДР). Полученный осадок митохондрий суспендировали в 150 мл БСА. Далее помещали в маленькую пробирку и хранили во льду или замораживая при –20°С. Концентрация белка в митохондриальной суспензии, определенная по биуретовому методу, составляла 30-35 мг/мл. Раздел 2.5 посвящен описанию инициирования перекисного окисления митохондрий и методу определения МДА.
Свободнорадикальное окисление митохондрий индуцировали добавлением 400 мкМ гидропероксида трет-бутила и 100 мкМ метмиоглобина. В ряде экспериментов вместо метмиоглобина или совместно с ним добавляли ферритин (2,5 мг/мл). Образцы объемом в 1 мл инкубировались в течение часов при 37°С после чего в них определялось содержание малонового диальдегида (МДА). Для этого к 0,5 мл инкубационной смеси, содержащей препарат митохондрий, добавляли 1,5 мл 1%-ной фосфорной кислоты, 10- М ЭДТА, 10-5 М ВНТ и 1 мл 0,5%-ного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК), после чего инкубировали 45 мин при 100°С. После охлаждения смеси, комплекс МДА с ТБК экстрагировали н-бутанолом. В бутанольной фазе регистрировали спектр поглощения в области 515-550 нм. Концентрацию МДА рассчитывали по оптической плотности комплексов МДА-ТБК при 532 нм ( 105 М-1 см-1) [92]. Все оптические измерения проводили на.
532= 1, спектрофотометрах Hitachi 557 (Япония) и Beckman Coulter 650 (США). При исследовании взаимодействия ДНКЖ с супероксидным радикалом (О2•–), последний генерировали добавлением к реакционной смеси свежеприготовленного раствора супероксида калия (КО2) в диметилсульфоксиде или использовали систему ксантин-ксантиноксидаза для ферментативной генерации О2•–.
В третьей и последующих главах представлены непосредственно результаты исследований. Третья глава посвящена взаимодействию низкомолекулярных динитрозильных комплексов с активными формами кислорода и гидропероксидами. В данной работе факт генерации супероксидных радикалов митохондриями устанавливали при помощи спиновой ловушки TIRON. При инкубации митохондрий в присутствии субстратов дыхательной цепи не происходит существенного образования супероксида. При добавлении антимицина появляется сигнал аддукта спиновой ловушки с супероксидным радикалом. На рис.1 показана деструкция ДНКЖ при их инкубации с митохондриями из сердечной мышцы крыс в присутствии сукцината в качестве субстрата и антимицина А.
Рис.1. Деструкция динитрозильных комплексов с глутатионовыми лигандами при генерации супероксида Сигнал ЭПР, отн. ед.
митохондриями из сердца крысы. 1 – инкубационная среда + 0,2 мМ ДНКЖ + 1 мкг/мл антимицина А + мМ сукцината;
2 то же что и (1) + СОД ( ед/мл) + каталаза (400 ед/мл).
0 4 8 12 В рем я, м ин В случае добавления в систему супероксиддисмутазы и каталазы, не происходило столь значительного падения сигнала, т.е. деструкцию динитрозильных комплексов вызывает именно супероксид, генерируемый дыхательной цепью митохондрий.
Значительное падение сигнала динитрозильных комплексов говорит о высокой скорости реакции между ними и супероксидным радикалом.
Антиоксидантное действие ДНКЖ оценивали по ингибированию образования в системе гемин/H2O2 феноксильного радикала пробукола. Последний является синтетическим антиоксидантом близким по структуре и механизму действия к токоферолу. Из рис.2 видно, что ДНКЖ как с глутатионовыми так и с цистеиновыми лигандами (спектры 2 и 3), в молярных соотношениях, сравнимых с H2O2 и гемином, более чем на 70% ингибируют образование радикала пробукола. Динитрозильные комплексы с фосфатными лигандами были несколько менее эффективны (~50% ингибирования) (рис.2, спектр 4).
Рис.2. Влияние динитрозильных g=2, комплексов с различными лигандами на образование радикала пробукола. Реакционная смесь содержала:
изопропанол/K,Na-фосфатный буфер, 1,5 мМ пробукола и 0, мМ гемина.
1 cпектр ЭПР феноксильного радикала пробукола образовавшегося после добавления в реакционную среду 2 мМ Н2О2;
2 то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ, содержащих цистеин;
3 то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ, содержащих глутатион;
4 то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ с фосфат-анионом в 324 325 326 327 328 М агнитное поле, мТл качестве лиганда.
Таким образом, можно предположить, что тиольные лиганды наряду с другими компонентами динитрозильных комплексов, такими как NO+ и ионы железа, вносят свой вклад в снижение концентрации радикала пробукола.
Образование феноксильного радикала может происходить при одноэлектронном окислении пробукола оксоферрилформой гемина или гидроксильным радикалом (рис.2). Представляется вероятным, что эти активные окислители, образуются при взаимодействии гемина с H2O2.
Четвертая глава посвящена ферритину и миоглобину, их участию в развитии окислительного стресса. В литературе появляется все больше данных о связи метаболизма ферритина, активных форм кислорода и NO. Так, ферритин может участвовать в образовании нитрозильных комплексов железа.
Синтез самого ферритина регулируется оксидом азота, а проходящая с участием ферритина, микросомальная продукция активных форм кислорода, ингибируется донорами NO. В то же время, возможное влияние миоглобина и ферритина на окислительную модификацию митохондрий изучено недостаточно. В данной работе было исследовано свободнорадикальное окисление митохондрий, индуцированное сочетанием гидропероксида трет бутила с метмиоглобином или их комбинацией с ферритином. На рис. представлены результаты изучения влияния S-нитрозоглутатиона (GSNO), GSH и ДНКЖ на образование вторичных продуктов перекисного окисления (МДА) в препарате митохондрий из миокарда крысы.
Рис.3. Накопление МДА.
1 - препарат митохондрий (0,5 мг белка/мл), Na,K-фосфатный буфер и 1, 400 мкМ гидропероксида трет-бутила;
2 – то же, что и (1) плюс 100 мкМ метмиоглобина;
1, МДА, мкM 3 - то же, что и (2) плюс 100 мкМ GSNO;
4 - то же, что и (2) плюс 200 мкМ 0, GSH;
5 - то же, что и (2) плюс 100 мкМ GSNO и 200 мкМ GSH;
6 - то же, что и (2) плюс 50 мкМ 0, ДНКЖ.
В серии параллельных экспериментов в среду инкубации добавляли 2,5 0, 1 2 3 4 5 мкг/мл ферритина (заштрихованные столбики).
Образование МДА наиболее эффективно подавлялось под действием ДНКЖ (рис.3 столбец 6), а также при сочетанном действии GSNO и GSH (рис.3 столбец 5). Следует отметить, что в последнем случае возможно формирование ДНКЖ при взаимодействии GSNO, GSH и ионов железа, содержащихся в реакционной среде. Накопление МДА при окислении мембран митохондрий индуцированном гидропероксидом трет-бутила в сочетании с метмиоглобином и ферритином было достоверно выше, чем в присутствии гидропероксида трет-бутила и миоглобина (рис.3 столбец 2).
На рис.4 представлены кинетики деструкции ДНКЖ при ферментативной генерации O2.- в системе ксантин - ксантиноксидаза.
Рис.4. Кинетики деструкции ДНКЖ в условиях ферментативной генерации Сигнал ЭПР, отн. ед.
супероксид-анион радикала.
Реакционная среда содержала:
1 100 мМ Na,K-фосфатного буфера pH 7,4, 0,2 мМ 1 мМ ксантина, 0,2 ед./мл ксантиноксидазы, 120 мкМ ДНКЖ;
2 то что и (1) плюс 100 мкМ метмиоглобина. 200 В присутствии 0 10 20 30 метмиоглобина скорость Время, мин распада ДНКЖ резко возрастает (рис.4 кривая 2), однако, этот эффект почти полностью снимается каталазой. Полученные результаты указывают на то, что снижение ЭПР-детектируемой O2.-, концентрации ДНКЖ происходит как под действием так и гидроксильного радикала, возникающего в условиях эксперимента в реакции между Н2О2 и метмиоглобином.
Высокая антиоксидантная активность ДНКЖ, позволяет заключить, что при взаимодействии этого комплекса NO с O2.-, по-видимому, не происходит образования пероксинитрита.
Пятая глава посвящена взаимодействию белковых динитрозильных комплексов с активными формами кислорода. В разделе 5.1 описано исследование взаимодействия белковых ДНКЖ с супероксидом, ферментативно генерируемым в системе ксантин-ксантиноксидаза. На рис. и 6 представлены кинетики гибели альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ, соответственно, под действием супероксида.
300 Сигнал ЭПР, отн.ед.
Сигнал ЭПР, отн.ед.
200 2 0 4 8 12 0 2 4 6 8 10 Время, м ин.
Время, мин.
Кинетика деструкции альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ в условиях ферментативной генерации супероксида.
Рис.5. Рис.6.
(1) – Na-фосфатный буфер, (1) – Na-фосфатный буфер, альбуминовые ДНКЖ (560µМ), ДТПА гемоглобиновые ДНКЖ (540µМ), (1,6мМ), ксантин (3,5мМ), ДТПА (1,6мМ), ксантин (3,5мМ), ксантиноксидоредуктаза (0,6 ксантиноксидоредуктазу (0,6 ед./мл);
ед./мл);
(2) (1) + СОД (100 ед./мл);
(2) (1) + СОД (25 ед./мл);
(3) (1) + СОД (400 ед./мл);
(3) (1) + СОД (400 ед./мл);
(4) (2) + каталаза (600 ед./мл);
(4) кинетика гибели (5) кинетика спонтанной альбуминовых ДНКЖ в реакционной деструкции гемоглобиновых ДНКЖ в среде без ксантина. Концентрация реакционной среде без ксантина.
альбумина 16,5 мг/мл.
Представляется вероятным, что разница в кинетиках гибели альбуминовых и гемоглобиновых динитрозильных комплексах связана с взаимодействием гема с пероксидом водорода, в результате которого возникают активные интермедиаты, способные внести свой вклад в деструкцию гемоглобиновых ДНКЖ. При взаимодействии пероксида водорода с гемом образуется феррилгемоглобин, являющийся сильнейшим окислителем. В данных условиях динитрозильные комплексы оказываются способными эффективно восстанавливать феррилгемоглобин, фактически выступая в роли антиоксидантов. Это может иметь большое значение для тканей с высоким содержанием гемопротеидов, находящихся в условиях окислительного стресса.
В разделе 5.2 описано взаимодействие динитрозильных комплексов с пероксидом водорода и гидропероксидом трет-бутила. В присутствии пероксидов наблюдалось существенное снижение концентрации ДНКЖ.
Было показано, что гидропероксид трет-бутила более эффективно разрушает гемоглобиновые ДНКЖ. Это можно объяснить возникновением активных интермедиаторов при взаимодействии гема с пероксидом водорода и гидропероксидом трет-бутила. Такими интермедиатами являются оксоферрилгемоглобин, протеиновые радикалы гемоглобина и алкилперекисные радикалы.
В разделе 5.3 описано исследование образования димеров субъединиц гемоглобина, образующихся вследствие возникновения дисульфидной связи между цистеинами -93 и димеризации тирозиновых свободных радикалов в результате окислительной модификации. В ходе вызванной пероксидом водорода деструкции гемоглобиновых ДНКЖ можно было бы ожидать окисление цистеиновых -93, входящих в состав динитрозильных комплексов, и образования дисульфидной связи. Однако, связанные с гемоглобином ДНКЖ в концентрациях, эквимолярных пероксиду водорода, почти полностью ингибируют димеризацию субъединиц, т.е. в случае с гемоглобиновыми ДНКЖ не происходит окисления цистеинов молекулы гемоглобина. Причем взаимодействие этих ДНКЖ с пероксидом водорода не приводит к генерации свободных радикалов в реакции Фентоновского типа и возникновению дисульфидных связей, т.е. железо, входящее в состав динитрозильных комплексов, само по себе, не вызывает разложение перосида водорода.
Таким образом, гемоглобиновые ДНКЖ действуют как антиоксиданты, защищая белок, с которым они связаны, от окислительной модификации.
Стоит отметить, что образование белковых ДНКЖ носит обратимый характер и не нарушает функциональной активности белка. Антиоксидантное действие ДНКЖ, показанное в этом эксперименте, не носит специфический характер по отношению к гемоглобину и также может реализовываться в случае других белков. В разделе 5.4 описано исследование взаимодействия альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с пероксинитритом. В результате диффузионно-контролируемой реакции супероксида с оксидом азота образуется один из наиболее мощных биологических окислителей пероксинитрит. Невысокие концентрации оксида азота и супероксида компенсируются высокой константой скорости реакции. Представляется вероятным, что пероксинитрит может вызывать окислительную деструкцию белковых ДНКЖ, как в физиологических условиях, так и в модельных системах.
Рис.7. Деструкция альбуминовых ДНКЖ под действием различных концентраций пероксинитрита в Сигнал ЭПР, отн.ед.
Na-фосфатном буфере (0,2 М, pH 7,4), содержащем ДТПА (1,6 мМ).
Концентрация альбумина 16, мг/мл. Концентрация альбуминовых ДНКЖ (560 µМ).
0,0 0,2 0,4 0,6 0, На рис.7 и 8 представлены [O N O O ], м М кривые зависимости деструкции альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ от концентрации пероксинитрита.
Рис.8. Деструкция гемоглобиновых ДНКЖ под действием различных концентраций пероксинитрита в Na фосфатном буфере (0,2 М, pH 7,4), содержащем ДТПА (1,6 мМ).
Сигнал ЭПР, отн.ед.
Концентрация гемоглобина 16,3 мг/мл (288 µМ). Концентрация гемоглобиновых ДНКЖ (540 µМ).
Хорошо видно, что альбуминовые ДНКЖ почти на порядок более 0 1 2 3 4 5 [O N O O ], мМ чувствительны к действию пероксинитрита, чем ДНКЖ, ассоциированные с гемоглобином. Этот факт может быть связан как с большей доступностью альбуминовых ДНКЖ, так и с возможным взаимодействием пероксинитрита с гемом этих белковых молекул. Интересно, что перелом в концентрационной зависимости деструкции гемоглобиновых ДНКЖ соответствует молярному соотношению гем/ONOO, равному 2. Это косвенно подтверждает предположение, что именно геммы -субъединиц гемоглобина частично нейтрализуют пероксинитрит.
Шестая глава посвящена описанию взаимодействия оксофферилмиоглобина с динитрозильными комплексами. Известно, что в деструктивных процессах, развивающихся в ходе окислительного стресса, определенную роль играют миоглобин, гемоглобин и другие гемопротеиды.
В реакциях между гемопротеидами и органическими гидропероксидами возникают алкоксильные и алкилпероксильные радикалы, являющиеся интермедиатами свободнорадикального окисления липидов. С другой стороны, при взаимодействии перекиси водорода или органических гидропероксидов с гемопротеидами образуется оксоферрилгем (порфирин FeIV=O), также способный вызывать окислительную модификацию биологически важных молекул. В ряде работ показано, что оксид азота (NO) снижает прооксидантное действие оксоферрилгемопротеидов и восстанавливает их до ферриформы (порфирин-FeШ).
Образование оксоферрилмиоглобина, наблюдалось в системе содержащей метмиоглобин и гидропероксид трет-бутила. Восстановление оксоферрилмиоглобина сопровождалось быстрым снижением концентрации ДНКЖ, которая контролировалась по характерному для динитрозильных комплексов железа сигналу ЭПР (Рис.9).
сигнал ЭПР ДНКЖ, отн. ед.
Рис.9. Кинетика деструкция 0,15 мМ ДНКЖ (по изменению сигнала ЭПР) в процессе инкубации с 0,1 мМ метмиоглобином в присутствии 0,4 мМ гидропероксида трет-бутила.
Перед регистрацией спектров ЭПР к образцам добавляли 4 мМ цистеин. 0 5 10 15 Время, мин Этот факт согласуется с выдвинутым нами предположением о способности ДНКЖ взаимодействовать с органическими свободными радикалами и оксоферрилмиоглобином.
В модельной системе, содержащей гидропероксид трет-бутила и метмиоглобин, весьма сложно было установить вклад в деструкцию ДНКЖ свободных радикалов с одной стороны и оксоферрилформы миоглобина с другой. Для определения этого вклада мы исследовали влияние на ДНКЖ только оксоферрилмиоглобина. Последний получали в реакции метмиоглобина и Н2О2, избыток которой удалялся каталазой. Взаимодействие ДНКЖ с оксоферрилмиоглобином действительно вызывало деструкцию исследуемых комплексов, причем этот процесс сопровождался восстановлением оксоферрилгема до его метформы, однако это снижение было не столь значительно как в системах содержащих гидропероксид трет бутила. Исходя из этого мы полагаем, что одной из важных функций нитрозильных комплексов железа in vivo является детоксикация образующихся при окислительном стрессе оксоферрилформ гемопротеидов.
В седьмой глава описано исследование взаимодействия убихинола и GSNO в условиях моделирующих окислительный стресс. Известно, что в ходе свободнорадикального окисления биологических мембран происходит быстрое снижение концентраций липофильных антиоксидантов. При интенсивной генерации свободных радикалов возможна окислительная деструкция молекул этих антиоксидантов. В связи с этим, наиболее объективным параметром оценки влияния окислительного стресса на белок липидные комплексы является измерение концентрации липофильных антиоксидантов. При изучении свободнорадикального перекисного окисления гомогената миокарда крыс мы оценивали изменение концентрации различных форм убихинона. Перекисное окисление инициировалось гидропероксидом трет-бутила. Было показано, что деструкцию убихинона хорошо ингибирует S-нитрозоглутатион. Защитное действие GSNO в ходе перекисного окисления гомогената согласуется с высокой антиоксидантной эффективностью производных оксида азота, содержащих катион нитрозония, продемонстрированных нами в других модельных системах.
В заключении подведены итоги и сформулированы выводы диссертационной работы.
ВЫВОДЫ 1. В системе содержащей гемопротеиды в сочетании с H2O2 или гидропероксидом трет-бутила, а также в условиях генерации супероксидного анион-радикала происходит быстрый распад низкомолекулярных и белковых динитрозильных комплексов железа.
2. Обнаружено, что ассоциированные с гемоглобином динитрозильные комплексы железа могут защищать этот гемопротеид от окислительной модификации под действием перекиси водорода.
3. Установлено, что S-нитрозоглутатион и содержащие глутатион динитрозильные комплексы железа эффективно защищают митохондриальные мембраны от индуцированного миоглобином и ферритином свободнорадикального перекисного окисления.
Показано также, что S-нитрозоглутатион предотвращает деструкцию убихинона в ходе перекисного окисления гомогената миокарда крысы.
4. Показано, что S-нитрозоглутатион и динитрозильные комплексы железа ингибируют окислительную деструкцию липофильного антиоксиданта -каротина под действием пероксинитрита. В то же время это антиоксидантное действие S-нитрозоглутатиона снижается в присутствии восстановленного убихинона.
5. Показано что, комплексы NO+ могут играть роль антиоксидантов защищающих биологические молекулы от активных форм кислорода и азота, причем их взаимодействие с кислородными радикалами и пероксинитритом может регулировать уровень оксида азота в биологических системах.
Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
1. Шумаев К.Б., Губкин А.А., Губкина С.А., Гудков Л.Л., Свиряева И.В., Тимошин А.А., Топунов А.Ф., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Взаимодействие динитрозильных комплексов железа с интермедиатами окислительного стресса // Биофизика, 2006, т. 51, №3, 472-477.
2. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин А.А., Петрова Н.Е., Рууге Э.К. Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторов перекисного окисления липидов, роль активных форм кислорода и азота // Биофизика. 2004. Т. 49. С. 659-665.
3. Тимошин А.А., Лакомки В.Л., Губкин А.А., Руге Э.К. Влияние коэнзима Q10 на свободнорадикальные центры ткани изолированного миокарда крысы // Биофизика. 2003. Т. 48. вып. 4. С. 717-721.
4. Шумаев К.Б., Губкина С.А., Губкин А.А., Гудков Л.Л., Ланкин В.З., Ванин А.Ф. Антиоксидантные и прооксидантные свойства метаболитов оксида азота // XIV Международная конференция и дискуссионный научный клуб.
“Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармокологии и экологии.” Ялта-Гурзуф. 31 мая - 9 июня. 2006. Т. 8. С. 416-417.
5. Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Топунов А.Ф., Губкина С.А., Губкин А.А., Гудков Л.Л., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Ланкин В.З., Рууге Э.К.
Взаимодействие с активными формами кислорода как механизм антиоксидантного действия динитрозильных комплексов железа и S нитрозоглутатиона. // IV международная научно-практическая конференция с международным участием “Активные формы кислорода, оксид азота антиоксиданты и здоровье человека”. Смоленск. 26-30 сентября. 2005.
Сборник трудов. С. 114-115.
6. Шумаев К.Б., Губкин А.А., Губкина С.А., Гудков Л.Л., Каленикова Е.И., Топунов А.Ф., Рууге Э. К. Антиоксидантная роль производных оксида азота содержащих катион нитрозония. // Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии. Медицинская физика. 21-24 июня 2005. С. 375.
7. Гудков Л.Л., Губкин А.А., Шумаев К.Б. Антиоксидантные процессы и активные формы азота в ткани сердечной мышцы // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам “Ломоносов-2005” апрель 2005. Сборник тезисов. Т. 1. С. 201.
8. Тимошин А.А., Орлова Ц.Р., Губкин А.А., Ванин А.Ф., Капелько В.И., Руге Э.К. Применение комплекса N-митил-D-глюкомин дитиокарбомата (MGD) и железа для регистрации уровня радикалов оксида азота в организме // III съезд биофизиков России. Воронеж. 24-29. 2004. Сборник тезисов. С. 385 386.
9. Губкин А.А., Лакомкин В.Л., Тимошин А.А. Влияние потребления коэнзима Q10 сократительную и митохондриальную функции миокарда // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам “Ломоносов-2004” апрель 2004. Сборник тезисов.
Т. 1. С. 214.
10. Timoshin A.A., Lakomkin V.L., Shumaev K.B., Gubkin A.A., Kapelko V.I., Ruuge E.K. Coenzyme Q10 containing water-soluble substance Kudesan as a potential cardiac protector and oxygen radical scavenger // International conference “Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health” Smolensk.
September. 22-25. 2003. Abstracts. P. 69.