Энантиоселективные сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотками

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ МИХАИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ СОРБЕНТЫ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИМИ ГЛИКОПЕПТИДНЫМИ АНТИБИОТКАМИ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2008

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, Староверов С.М.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков И.А.

доктор химических наук, Курганов А.А.

Ведущая организация:

Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Москва 2008 года в 1600 часов на заседании

Защита состоится « 27 » мая диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан 11 апреля 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из фундаментальных особенностей живой материи является оптическая молекулярная асимметрия главнейших компонентов организмов – белков и нуклеиновых кислот. Определяя пространственную структуру этих основных биологических полимеров, она играет важную роль в специфичности действия ферментов и, таким образом, в основных реакциях живых систем.

Бурное развитие биохимических исследований, возросшие требования Всемирной организации здравоохранения к оптической чистоте лекарственных препаратов и широкие возможности современной органической химии требуют разработки методов получения оптически чистых соединений.

Высокоэффективная жидкостная хроматография является мощнейшим инструментом решения задач аналитического контроля энантиомерного состава хиральных соединений и препаративного получения индивидуальных энантиомеров различных классов соединений. Хроматографическое разделение энантиомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, способный различать пространственную конфигурацию оптических антиподов. В связи с этим интерес к получению новых хиральных селекторов огромен.

Отсутствие универсальных хиральных фаз для разделения оптических изомеров стимулирует разработку новых сорбентов. Иммобилизованные макроциклические гликопептидные антибиотики, к которым относятся ванкомицин, тейкопланин, ристоцетин A, авопарцин и др., успешно зарекомендовали себя в качестве хиральных фаз для ВЭЖХ большого круга оптических изомеров лекарственных препаратов. Высокая энантиоселективность этого класса сорбентов связана с наличием в их структуре различных по строению фрагментов, способных к многоточечным взаимодействиям с разделяемыми соединениями, как в полярных, так и неполярных растворителях. Дополнительные возможности по изменению энантиоселективности этого класса сорбентов могут быть достигнуты путем иммобилизации новых антибиотиков, химическим изменением их структуры или оптимизацией методов иммобилизации.

Актуальна проблема разделения аминокислот и их производных, так как они входят в состав белков в организме человека и играют большую роль в процессах питания. Определение и разделение оптических изомеров фармацевтических препаратов профенов и -блокаторов необходимо вследствие их различного фармакологического действия в биологических системах.

Цель работы заключалась в разработке группы новых хиральных селекторов на основе нового отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина, способа их иммобилизации на силикагеле, изучении хроматографических и энантиоселективных свойств полученных сорбентов. Для достижения этой цели были решены следующие задачи:

- разработаны методики препаративного выделения новых хиральных селекторов на основе нового отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина;

- разработан метод иммобилизации макроциклических антибиотиков и селекторов, полученных на их основе, на силикагеле для получения хиральных ВЭЖХ сорбентов;

- разработан метод получения гибридного сорбента с иммобилизованным комплексом макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина, полученного в присутствии фермента – лакказы;

- комплексом физико-химических методов изучена структура иммобилизованных на силикагеле хиральных селекторов:

- проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных сорбентов при разделении энантиомеров - и -аминокислот и их производных, профенов и -блокаторов;

- изучены изотермы адсорбции L- и D-метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и продемонстрированы возможности применения данного сорбента для препаративного разделения энантиомеров метионина методом «симулированного движения стационарной фазы» (SMB – simulated moving bed).

Научная новизна. Разработаны новые хиральные селекторы на основе гликопептидного антибиотика эремомицина. Разработан и оптимизирован метод иммобилизации хиральных селекторов гликопептидной природы на силикагеле. Получены новые хиральные ВЭЖХ сорбенты с иммобилизованным эремомицином, его производными, а также комплекса эремомицина с хиральным полианилином.

Проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных ВЭЖХ сорбентов в разделении энантиомеров - и -аминокислот, профенов и -блокаторов. Изучены зависимости удерживания и энантиоселективности разделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры.

По изотермам адсорбции индивидуальных энантиомеров метионина оценены вклады в удерживание энантиоселективных и неселективных сайтов молекулы эремомицина, что позволило рассчитать и экспериментально подтвердить возможность использования данного сорбента в препаративных разделениях рацемических смесей методом SMB.

Практическая значимость. Предложен простой метод иммобилизации селекторов гликопептидной природы на силикагеле, отличающийся проведением прививки из водно-органических смесей, при комнатной температуре. Найдены условия разделения большого числа энантиомеров различных классов соединений, в том числе и лекарственных препаратов, в условиях обращено-фазового и полярно-ионного режима ВЭЖХ.

Хроматографические колонки, заполненные разработанными сорбентами, внедрены в производство и выпускаются предприятием ЗАО «БиоХимМак СТ».

На защиту выносятся следующие положения:

1. Метод иммобилизации хиральных селекторов на основе макроциклических гликопептидных антибиотиков на силикагеле.

2. Методики получения и препаративного выделения дезэремозаминил эремомицина, эремозаминилагликона эремомицина и полного агликона эремомицина.

3. Метод получения гибридного сорбента на основе макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина.

4. Закономерности удерживания и энантиоразделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры, а также структуры хирального селектора.

5. Данные по разделению энантиомеров профенов и -блокаторов и зависимости энантиоразделения от структуры хирального селектора.

6. Данные по расчету изотерм адсорбции оптических изомеров метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и препаративному разделению энантиомеров метионина методом SMB.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» Москва. 2004. 15 – 19 марта;

Международная конференция «Физико-химические основы новейших технологий XXI века» Москва. 2005. 30 мая – 4 июня;

Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» Самара. 2005. 3 – 8 июля;

1st South East European Congress of Chemical Engineering. Belgrade. Serbia. 2005.

September 25 – 28;

II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов.

Санкт-Петербург. 2005. 6 – 8 июня;

X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва. 2006. 24 – 28 апреля;

Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». Москва. 2007. 23 – 27 апреля.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и тезисов докладов, получено 3 патента на изобретения.

Патент на сорбент с иммобилизованным эремомицином получил золотую медаль на 59-й международной выставке «Идеи – изобретения – инновации», Нюрнберг, Германия, 2007.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 6 глав обсуждения результатов, общих выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 131 странице машинописного текста, содержит 51 рисунок и таблиц, в списке цитируемой литературы 122 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Анализ литературных данных по исследованию энантиоселективности достаточно широкого круга сорбентов с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками показывает существенное различие их хроматографических свойств. Среди наиболее селективных, необходимо отметить сорбенты с привитыми тейкопланином и его агликоном, ристомицином и ванкомицином*. Значительное влияние на энантиоселективность способен оказывать способ и условия иммобилизации, а также длина и природа «спейсера», связывающего селектор с носителем.

В связи с этими в работе была поставлена задача сравнить, разрабатываемый нами способ иммобилизации, с известными на примере изученных селекторов, в качестве которых, мы выбрали ванкомицин и ристомицин А.

Даже незначительное изменение структуры хирального селектора может приводить к значительному изменению энантиоселективных свойств хиральной неподвижной фазы. Это определило интерес изучить не только характеристики нового хирального селектора на основе отечественного гликопептидного антибиотика эремомицина, но и исследовать возможность создания на его основе группы селекторов, отличающихся по энантиоселективности.

Существенно, что структура эремомицина наиболее близка к структуре ванкомицина, а уже первые исследования показали, что в отличие от ванкомицина, эремомицин проявляет высокую селективность к энантиомерам аминокислот.

OH CH OH CH HO HO CH3 HO H2N CH3 HO H2N O O OH OH O O O O OH O Cl CH3 O Cl O O H2N CH3 O O O HO OH O OH Cl O O O O O O O H H O H H H H N N N NH N N N NH HO N N N HO N N N H H H O O O H H H O O O O O HO HO NH2 NH OH HO OH HO Рис. 1. Структуры ванкомицина (слева) и эремомицина Сопоставление структур ванкомицина и эремомицина (рис. 1) показывает, что основные структурные отличия сосредоточены в левом * Эти сорбенты разрабатываются группой Д.В. Армстронга, начиная с 1994 г.

макроцикле и его углеводном окружении. Поэтому задача получения гликозидов и агликона эремомицина представлялась особенно существенной.

Получение и очистка гликозидов и агликона эремомицина*. В связи с изложенным выше, была поставлена задача разработать удобный метод селективного отщепления моносахаридов от молекулы эремомицина и разработать препаративный хроматографический метод выделения и очистки гликозидов и агликона эремомицина в соответствии со схемой, представленной на рисунке 2.

OH CH HO HO CH3 HO H2N HO O OH OH HO O O O OH OH CH CH3 O Cl O Cl H 2N CH3 O O H2N CH3 O O O O O OH O OH O O O O O O H H O O H H H H N N N NH N N N NH HO N N N HO N N N H H H O O O H H H O O O O O HO HO NH NH OH HO OH HO Дезэремозаминилэремомицин Эремомицин OH CH3 OH Cl OH Cl O O H 2N CH3 O O O HO OH O OH O O O O O H H H O O O H H H N N N NH N N N NH HO N N N HO N N N H H H O O O H H H O O O O O HO HO NH NH OH HO OH HO Эремозаминилагликон эремомицина Агликон эремомицина Рис. 2. Схема модификации эремомицинового селектора Нами оптимизирован метод, основанный на гидролизе эремомицина соляной кислотой. Снижение температуры обработки и увеличение времени гидролиза (0.2 н соляная кислота, 70°С, 40 мин.) позволяют получить дезэремозаминилэремомицин с высоким выходом, практически свободный от побочных продуктов. Для получения эремозаминилагликона и полного агликона эремомицина оптимальным является выдерживание эремомицина в концентрированной HCl на холоду при 4°С (4 ч). Очистку полученных продуктов проводили методом ВЭЖХ на колонке Диасорб-130-С16Т, 10 мкм, 24*250 мм (ЗАО «БиоХимМак СТ»). По данным ВЭЖХ, полученные гликозиды и агликон эремомицина имели чистоту 92 – 95%. Структура всех выделенных продуктов доказана методом масс-спектроскопии.

* Антибиотик эремомицин предоставлен проф. Г.С. Катрухой (НИИ по изысканию новых антибиотков им. Г.Ф. Гаузе РАМН).

Иммобилизация хиральных селекторов на силикагеле. В настоящей части работы была поставлена задача разработки общего, простого и эффективного метода иммобилизации антибиотиков гликопептидной природы, обеспечивающего высокую плотность прививки селекторов. Из ряда изученных нами методов был выбран и оптимизирован способ с использованием эпокси активированного силикагеля (рис.3), с проведением иммобилизации в водно органических средах при комнатной температуре (рН 8.5, 150 ч), что обеспечивает сохранение структуры антибиотика, исходя из известных его химических свойств.

OSi (CH2)3 O CH2 CH CH2 NHR A + O OSi (CH2)3 O CH2 CH CH2 NR A OH Рис. 3. Схема иммобилизации гликопептидных антибиотиков. (R = H или CH3) Максимальная плотность прививки соответствует 0.3 мкмоль эремомицина на 1 м2 поверхности силикагеля с диаметром пор 10 нм.

Увеличение диаметра пор носителя приводит к увеличению плотности прививки, достигая 0.78 мкмоль/м2 для носителя с диаметром пор 30 нм.

Эти данные свидетельствуют о том, что в порах диаметром менее 30 нм молекулы эремомицина испытывают стерические затруднения при иммобилизации. Это может влиять на конформацию закрепленного селектора, а, следовательно, и на энантиоселективность.

Получение гибридного сорбента с иммобилизованным эремомицином, модифицированным хиральным полианилином *.

В настоящей части работы была поставлена цель совместить в гибридном хиральном селекторе наиболее перспективные к настоящему времени классы селекторов – хиральный полимер и гликопептидный антибиотик, что существенно может расширить возможности нового сорбента.

Нами реализован подход и разработан метод синтеза полианилина непосредственно на поверхности сорбента в процессе протекания ферментативной полимеризации мономера. В реакционную смесь, содержащую анилин и кислоту, добавляли сорбент с S-сульфокамфорную иммобилизованным эремомицином и лакказу для инициации процесса полимеризации. Увеличение содержания углерода в привитом слое сорбента соответствует прививке двух элементарных звеньев хирального полианилина ( молекулы анилина) на одну иммобилизованную молекулу эремомицина.

* Эта часть работы проведена совместно с проф. А.И. Ярополовым (Институт биохимии им.

А.Н. Баха РАН) в рамках государственного проекта № 02.467/11/3004.

Характеристики синтезированных в работе сорбентов приведены в таблице 1.

Из таблицы видно, что метод показывает высокую воспроизводимость (сорбенты №№ 1-4, табл.1). Молекула эремомицина имеет три аминогруппы, способные участвовать в процессе иммобилизации. Представляло интерес получить информацию об основном направлении реакции прививки, так как место закрепления молекулы хирального селектора может существенно влиять на стерическую доступность различных хиральных сайтов эремомицина для разделяемых энантиомеров.

Табл. 1. Характеристики синтезированных в работе сорбентов.

Плотность № Матрица Селектор иммобилизации ммоль/г мкмоль/м Kromasil, 11 нм, 5 мкм Эремомицин 0,069 0, Kromasil, 11 нм, 5 мкм Эремомицин 0,072 0, Kromasil, 11 нм, 7 мкм Эремомицин 0,074 0, Eurospher, 11 нм, 15 мкм Эремомицин 0,072 0, Kromasil, 6 нм, 5 мкм Эремомицин 0,088 0, Kromasil, 20 нм, 5 мкм Эремомицин 0,077 0, Kromasil, 30 нм, 5 мкм Эремомицин 0,069 0, Kromasil, 11 нм, 5 мкм Дезэремозаминилэремомицин 0,015 0, Эремозаминилагликон Kromasil, 11 нм, 5 мкм 0,05 0, эремомицина Kromasil, 11 нм, 5 мкм Агликон эремомицина 0,043 0, КСК-Г, 130, 6 мкм Ванкомицин 0,039 0, Kromasil, 11 нм, 5 мкм Ристомицин А 0,054 0, Kromasil, 11 нм, 5 мкм Ванкомицин 0,049 0, Kromasil, 11 нм, 5 мкм Эремомицин/Полианилин* 0,07/0,28 0,3/1, * в расчете на элементарное звено анилина Физико-химические исследования полученных хиральных неподвижных фаз. Традиционные физико-химические методы исследования, как правило, малоинформативны в случае изучения соединений закрепленных на силикагеле, вследствие значительного фонового влияния матрицы. Только совокупность ряда методов может дать представление об особенностях закрепления привитых молекул.

Спектроскопия диффузного отражения комплексов с тетрацианохинодиметаном.

Одним из немногих методов, позволяющих определить присутствие на поверхности первичных, вторичных или третичных аминогрупп является метод, основанный на изучении спектров диффузного отражения комплексов аминогрупп с тетрацианохинодиметаном.

Полученные нами спектры (рис. 4) имеют значительные уширения, что не позволяет точно определить каким образом эремомицин прививается к поверхности. Однако, все три сорбента имеют максимумы в области, отвечающей за взаимодействие третичной аминогруппы с ТЦХДМ, что свидетельствует о том, что иммобилизация идет через вторичную аминогруппу эремомицина.

Рис. 4. Спектры диффузного отражения сорбентов с иммобилизованными эремомицином (сплошная линия), эремозаминилагликоном эремомицина (пунктирная линия) и полным агликоном эремомицина (прерывистая линия) Электронная спектроскопия для химического анализа (ЭСХА).

Метод рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) основан на явлении фотоэффекта и на том факте, что каждый атом имеет практически не совпадающие с другими атомами энергетические уровни. Сдвиги в спектре атомов отражают изменение состояния атомов.

На рис. 5 приведены спектры азота исследованных образцов*. Из рисунка видно, что правая ветвь спектра азота, отвечающая за состояние вторичной аминогруппы, для иммобилизованных селекторов одинакова и сдвинута вправо, относительно правой ветви спектра азота свободного эремомицина. Это свидетельствует о том, что вторичная аминогруппа переходит в третичную и, следовательно, иммобилизация идет через взаимодействие вторичной аминогруппы селектора с эпокси-группой активированного силикагеля. В левой части спектра картина более сложная. Однозначно можно сказать о том, что обе первичные аминогруппы эремомицина не затрагиваются при прививке, так как левая ветвь спектра азота (отвечает за состояние первичных аминогрупп) исходного и иммобилизованного эремомицина абсолютно одинаковы. Для полного агликона левая ветвь сильно сдвинута вправо, так как обе первичные * Спектры получены А.В. Наумкиным (Институт элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова РАН).

аминогруппы отсутствуют. На спектре азота силикагеля с иммобилизованным эремозаминилагликоном эремомицина также виден сдвиг вправо левой ветви, который обязан был наблюдаться, так как у этого селектора на одну первичную аминогруппу меньше, чем у эремомицина. Поэтому, однозначно сказать нельзя происходит ли взаимодействие первичной аминогруппы селектора с эпокси группами при иммобилизации.

SiO2-Ere-Ag Интенсивность, отн единицы SiO2-Ere-Ag Ere SiO2-Ere 405 400 Энергия связи, эВ Рис. 5. Сравниение спектров азота для эремомицина (черные точки) и иммобилизованных на силикагеле эремомицина (светлые точки), эремозаминилаагликона эремомицина (пуктирная линия) и полного агликона эремомицина (сплошная линия) Таким образом, на основе проведенных физико-химических экспериментов можно с большой долей уверенности утверждать, что основной группой, участвующей в иммобилизации эремомицина, является вторичная аминогруппа.

Изучение полученных сорбентов в разделении оптических изомеров.

Разделение энантиомеров аминокислот. Основным классом объектов, изученных в разделении энантиомеров, стали -аминокислоты. Первоначально разделение их энантиомеров было изучено в 9 подвижных фазах обращенно фазового состава на сорбенте с иммобилизованным эремомицином. Найдены условия разделения оптических изомеров практически для всех исследованных аминокислот (табл.2). Проведено систематическое изучение разделения энантиомеров аминокислот на разработанных сорбентах, изучены зависимости энантиоселективности разделения в зависимости от структуры аминокислот, температуры, pH и состава подвижной фазы. Показано, что метанол содержащие элюенты обеспечивают более высокую энантиоселективность в сравнении с элюентами на основе ацетонитрила.

Рис.6. Хроматограммы разделения энантиомеров DL-ДОФА (слева) и DL-метионина Селективность разделения энантиомеров аминокислот падает в ряду:

циклические аминокислоты – гидрофобные Табл. 2. Значения энантиоселективности () ароматические и аминокислоты – аминокислоты с разделения энантиомеров -аминокислот на основными сорбенте с иммобилизованным эремомицином.

кислыми и Элюенты:

функциональными группами в 20% CH3OH – 80% NaH2PO4 (0.1M);

боковой цепи. Примеры 160%CH3OH – 40% CH3COOH/w (pH 3,8);

разделения 2CH3OH – Н2O (1:1);

340% CH3OH – 60% H2O.

хроматограмм энантиомеров DL-ДОФА и DL- Соединение метионина приведены на рис. 6. 2. DL-триптофан 5. элюента DL-тирозин Значение рН 3. DL-м-фтортирозин определяет ионное состояние 4. DL-фенилаланин аминокислот и молекулы привитого DL-ДОФА3 2. антибиотика. Присутствие DL-фенилглицин2 3. диссоциированных карбоксильных DL-(2-тиенил)-аланин 2. групп положительно сказывается на 2. DL-метионин 2. и, DL-аланин селективности разделения, 3. DL-валин наоборот, появление 3. DL-норвалин депротонированных аминогрупп DL-норлейцин 2. подавляет распознавание DL-цитрулин1 1. энантиомеров. Увеличение DL-серин 1. концентрации метанола в DL-треонин 1. 3. к DL--аминомасляная кислота подвижной фазе приводит DL-цистеин2 2. увеличению удерживания обоих 1. DL-лизин энантиомеров (рис. 7А), что DL-пролин2 7. указывает в данном случае на DL-пипеколиновая кислота2 11. реализацию HILIC-IEC механизма за счет гидрофильных и ионных взаимодействий. При снижении температуры хроматографического эксперимента, происходит усиление взаимодействий сорбатов с привитым слоем, а различные конформации селектора становятся более жесткими, что проявляется в увеличении энантиоселективности разделения (рис. 7Б).

Б А 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 о Содерж ание метанола, об.% Температура, С Рис. 7. Зависимость удерживания оптических изомеров метионина kL (), kD (), энантиоселективности разделения () и разрешения и RS () на сорбенте с иммобилизованным эремомицином от значения концентрации метанола в элюенте (А) и от температуры колонки (Б). Элюенты: А – 0.1 M NaH2PO4 с переменным содержанием метанола, Б – 20% CH3OH – 80% 0.1M NaH2PO Разработанный нами способ иммобилизации макроциклических гликопептидных антбиотиков существенно отличается от описанных в литературе. Сравнение энантиоселективности сорбента, полученного нашим методом иммобилизацией известного селектора ристомицина А, с аналогичным, выпускаемым под маркой Chirobiotic R, показало, существенное увеличение значений селективности (табл.3). Это свидетельствует о том, что разработанный нами метод иммобилизации гликопептидных антибиотиков не уступает, а во многих случаях превосходит способ, описанный в литературе.

Табл.3. Влияние способа иммобилизации на характеристики сорбентов. 1 – сорбент, полученный по разработанному методу;

2 – коммерческий сорбент Chirobiotic R.

Ристомицин А1 Ристомицин А Соединение Rs Rs 2.50 5.11 1.33 1. ДОФА 2.66 4.50 1.30 1. тирозин 2.03 4.65 1.23 1. триптофан 3.78 8.25 1.23 1. фенилглицин 1.53 2.35 1.17 1. аспарагин 2.13 4.22 1.15 1. метионин 1.30 1.42 1.26 1. -аминомасляная кислота 1.34 1.54 1.18 1. цистеин 5.88 8.30 1.15 1. лейцин 3.48 5.58 1.23 1. валин 3.08 4.80 1.25 1. норвалин 2.56 3.15 1.14 1. аланин На рис. 8. приведено сравнение разрешающей способности колонки с эремомицином в сравнении с промышленно выпускаемыми аналогами, демонстрирующее преимущества разработанного сорбента.

Рис. 8. Сравнение разрешающей способности в разделении энантиомеров аминокислот сорбента с иммобилизованным эремомицином (1) и промышленно выпускаемыми аналогами: Chirobiotic TAG (2), Chirobiotic R (3), Chirobiotic T (4) Известно, что незначительное изменение структуры хирального селектора зачастую значительно изменяют энантиоселективность получаемого сорбента. Полученные результаты по разделению энантиомеров аминокислот на сорбентах, содержащих дезэремозаминилэремомицин, а также эремозаминил- и полный агликоны эремомицина показали, что сахарные остатки играют очень важную роль в хиральном распознавании энантиомеров аминокислот. Однако, для различных аминокислот это влияние различно.

Табл. 4. Значения факторов удерживания (kL, kD), энантиоселективности () и разрешающей способности (RS) на сорбентах с иммобилизованными эремомицином и его эремозаминилагликоном. Элюент метанол – вода (1:1).

Эремозаминилагликон Селекторы Эремомицин эремомицина kL kD RS kL kD RS Аминокислота 0.26 0.62 2.37 2.94 0.14 0.39 2.78 2. Аланин 0.20 0.67 3.35 4.09 0.09 0.53 5.89 4. Валин 0.22 0.56 2.54 3.64 0.27 0.99 3.48 5. Лейцин 0.26 0.69 2.65 3.76 0.22 0.99 4.50 6. Норвалин 0.47 3.73 7.94 7.75 0.27 1.52 5.63 4. Пролин 0.28 0.62 2.21 4.60 0.14 0.62 4.43 6. Метионин 2.47 4.28 1.73 4.86 2.31 2.61 1.13 0. Триптофан 0.71 3.36 4.73 10.97 0.90 0.96 1.07 0. Тирозин 0.84 2.61 3.11 6.87 0.83 0.88 1.06 0. м-Фтортирозин 1.02 4.26 4.17 10.67 0.89 1.20 1.35 2. ДОФА 0.55 2.38 4.33 6.64 0.57 0.80 1.40 1. Фенилаланин Так, удаление дисахаридной ветви эремомицина приводит к улучшению разделения энантиомеров аминокислот с неароматическим боковым радикалом и к ухудшению разделения ароматических аминокислот (табл. 4) вплоть до полного исчезновения энантиоселективности в разделении энантиомеров фенилаланина на сорбенте с полным агликоном эремомицина (табл. 5).

Табл. 5. Значения факторов удерживания (kL, kD), энантиоселективности () и разрешающей способности (RS) на сорбентах с иммобилизованными селекторами:

дезэремозаминилэремомицином и полным агликоном эремомицина. Элюент метанол – вода (1:1).

Селекторы Дезэремозаминилремомицин Агликон эремомицина kL kD RS kL kD RS Аминокислота 0.20 0.26 1.30 0.56 0.09 0.17 1.88 1. Метионин 0.92 1.17 1.27 1.43 0.93 1.10 1.18 1. Триптофан 0.36 0.73 2.03 2.76 0.26 0.30 1.15 0. Тирозин 0.38 0.56 1.47 1.40 0.28 0.32 1.14 0. м-Фтортирозин 0.43 0.81 1.88 2.33 0.26 0.30 1.15 0. ДОФА 0.36 0.61 1.69 1.83 0.33 0.33 1 Фенилаланин Этот эксперимент позволил сделать предположение о возможном механизме хирального распознавания ароматических аминокислот. В программе HyperChem 5.0 оптимизирована по минимуму потенциальной эненргии структура эремомицина, рассчитаны расстояния между гидроксильной и аминогруппой эремозаминовых остатков, которое совпало с расстоянием между карбоксильной и аминогруппой аминокислоты. Первичное электростатическое взаимодействие, по-видимому, происходит между аминогруппой эремозамина и карбоксильной группой аминокислоты, затем образуется водородная связь между аминогруппой аминокислоты и гидроксильной группой эремозамина. В результате такого взаимодействия ароматический боковой радикал направлен либо внутрь молекулы и образует -связи с ароматическими кольцами, либо наружу и таких связей не образует – это зависит от пространственной конфигурации энантиомера. Хиральное распознавание является суперпозицией таких взаимодействий.

Для большинства исследованных аминокислот в результате дополнительной модификации эремомицина хиральным полианилином энантиоселективность увеличилась. По-видимому, это привело к образованию новых сайтов или модифицированию существующих, обеспечивающих повышение энантиоселективности в отношении энантиомеров аминокислот.

Оптически активные -аминокислоты являются в последнее время перспективным классов интермедиатов для промышленного синтеза антибиотиков и других лекарственных препаратов.

Табл. 6. Результаты разделения энантиомеров -фенилалнина и его производных на сорбентах с иммобилизованным эремомицином и его эремозаминилагликоном. Элюент: 20% - метанол- 80% NaH2PO4 0.1M, 0.7 мл/мин.

Эремозаминилагликон Селекторы Эремомицин эремомицина k1 k2 RS k1 k2 RS Аминокислота 0.63 1.04 1.65 2.47 0.54 0.58 1.07 0. -фенилаланин 0.42 0.67 1.59 1.80 0.48 0.64 1.33 1. 4F--фенилаланин 0.60 0.73 1.22 0.97 0.47 0.62 1.32 1. 3F--фенилаланин 0.53 0.62 1.30 1.21 0.48 0.66 1.37 1. 2F--фенилаланин 1.76 2.28 1.29 1.81 1.55 2.25 1.45 3. 3,4Cl--фенилаланин 0.91 1.13 1.24 1.28 0.81 1.11 1.37 2. 3Cl--фенилаланин 1.21 1.50 1.24 1.46 0.83 1.31 1.58 3. 2Cl--фенилаланин 1.19 1.45 1.22 1.19 1.03 1.42 1.37 2. 3Br--фенилаланин 1.10 1.51 1.37 1.98 0.94 1.32 1.40 2. 3NO2--фенилаланин 0.72 0.72 1.00 0.00 0.68 1.04 1.53 2. 4CF3--фенилаланин 4CF3O--фенилаланин 0.66 0.66 1.00 0.00 0.67 0.95 1.42 2. Проведенные эксперименты по разделению энантиомеров производных -фенилаланина* показали, что удаление дисахаридной ветви эремомицина приводит к более высоким значениям энантиоселективности разделения (табл.

6) Разделение энантиомеров -блокаторов. -Блокаторы – большая группа препаратов, основным свойством которых является способность обратимо блокировать -адренергические рецепторы. Они широко используются в лечении сердечно-сосудистых заболеваний и круг их непрерывно расширяется.

Сорбент с иммобилизованным полным агликоном эремомицина единственный из изученных разделяет до базовой линии энантиомеры почти всех блокаторов (табл. 7).

Это позволяет сделать предположение о существенном вкладе освободившейся гидроксильной группы (в агликоне) в процессе хирального распознавания аминоспиртов и сделать предположение о возможном механизме хирального их распознавания Для -блокаторов главным распознающим сайтом селекторов выступает карбоксильная группа. Она взаимодействует с аминогруппой -блокатора и затем происходит ориентация молекулы сорбата внутрь кармана с образованием --связи между ароматическими кольцами. В результате такой ориентации гидроксильная группа одного энантиомера направлена в сторону освободившейся после удаления эремозамина гидроксильной группы агликона и образует с последней водородную связь. Для другого энантиомера эта группа * Образцы производных -фенилаланина предоставленны проф. В.К. Швядасом (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ направлена в противоположную сторону и водородная связь не образуется, что приводит к хиральному распознаванию энантиомеров -блокаторов.

Табл. 7. Хроматографические результаты по разделению энантиомеров -блокаторов, полученные на сорбентах с иммобилизованными эремозаминилагликоном и полным агликоном эремомицина в элюенте: метанол – 0.1% триэтиламин – 0.1% уксусная кислота.

Эремозаминилагликон Агликон эремомицина -Блокаторы эремомицина k1 k2 RS k1 k2 RS 0.08 0.16 2.00 1.14 0.80 0.91 1.14 1. Салбутамол 0.09 0.16 1.78 1.09 0.84 0.96 1.14 1. Кленбутерол 0.25 0.25 1.00 0.00 0.93 1.03 1.11 1. Окспренолол 0.15 0.19 1.27 0.55 0.95 1.10 1.16 1. Алпренолол 0.17 0.22 1.29 0.57 1.06 1.21 1.14 1. Метопролол 0.25 0.25 1.00 0.00 1.11 1.27 1.14 1. Пронеталол 0.28 0.34 1.21 0.56 1.18 1.33 1.13 1. Пиндолол 0.29 0.34 1.17 0.52 1.27 1.49 1.17 2. Пропранолол 0.31 0.39 1.26 0.88 1.43 1.63 1.14 1. Соталол 0.80 0.80 1.00 0.00 1.86 2.09 1.12 1. Атенолол Разделение энантиомеров профенов. Разделение рацематов профенов изучали в водно-метанольных элюентах (обращенно-фазовый режим) и в полярно-ионном режиме с использованием в качестве элюента 100%-ного метанола с добавками триэтиламина и уксусной кислоты.

мин мин мин мин Рис. 9. Разделение энантиомеров ибупрофена (а, в), индопрофена (б) и фенопрофена (г) на колонках с привитым эремомицином (а-в) и эремозаминилагликоном эремомицина (г).

Элюент: 40%метанол – 60% 0.1М фосфатный буфер, рН 6.5 (а, б) и 100% метанол с добавками 0.1% триэтиламина и 0.2% уксусной кислоты (в, г) Анализ результатов свидетельствует о том, что среди изученных сорбентов оптимальным для разделения профенов является силикагель с привитым эремомицином.

В обращеннно-фазовом режиме достигаются большие значения энантиоселективности и разрешения, однако в полярно-ионном варианте значительно меньше время анализа и лучше форма пиков (рис.9). Остальные сорбенты применимы лишь для разделения одного-двух сорбатов.

Другие возможности разработанных сорбентов в разделении энантиомеров. Помимо энантиомеров - и -аминокислот, профенов и блокаторов проведено изучение возможности разделения рацематов дансил производных аминокислот (табл. 8.) и решена задача аналитического контроля оптической чистоты синтетического мононуклеотида на разработанных хиральных селекторах.

Табл. 8. Результаты раделения дансил-производных -аминокислот на сорбентах с иммобилизованными эремомицином (Э) и его эремозаминил- (ЭА) и полным агликонами (А) в элюентах: 100 %-метанол – 0.1 % триэтиламин – 0.1 % уксусная кислота (1) и 98 %-метанол – 1 % триэтиламин – 1 % уксусная кислота (2), 0.7 мл/мин k1 k2 RS Вещество селектор элюент Э 2 1.55 1.65 1.06 0. Дансил-лейцин ЭА 1 3.2 4.2 1.31 1. А 1 0.84 1.43 1.70 1. Э 2 1.96 2.93 1.49 2. 1 4.41 7.38 1.67 3. ЭА Дансил 2 0.74 1.08 1.46 1. метионин 1 1.41 2.55 1.81 2. А 2 0.62 0.74 1.19 0. Э 2 1.21 1.94 1.60 2. Дансил ЭА 1 2.65 3.51 1.32 1. норлейцин А 1 0.34 0.75 2.20 2. Э 2 2.4 3.15 1.31 1. Дансил ЭА 1 7.79 8.14 1.04 0. фенилаланин А 1 1.47 1.96 1.33 1. Э 2 2.13 2.79 1.31 1. 1 4.24 7.14 1.68 2. ЭА 2 0.83 1.09 1.31 0. Дансил-треонин 1 1.15 2.55 2.22 3. А 2 0.62 0.73 1.18 1. Э 2 2.61 4.26 1.63 2. ЭА 2 0.98 1.99 2.03 2. Дансил-серин 1 0.63 6.96 11.04 4. А 2 0.54 1.74 3.22 3. ЭА 1 2.04 3.18 1.56 2. Дансил-валин А 1 1.21 1.42 1.17 0. Для разделения оптических изомеров этих соединений обращено фазовый режим не подходит из-за сильного удерживания сорбатов на колонке в этих условиях. Поэтому в качестве элюента использовали чистый метанол с добавками по 0.1% триэтиламина и уксусной кислоты.

В более слабом полярно-органическом элюенте наилучшие разделения наблюдаются на сорбенте, содержащем полный агликон эремомицина (исключение дансил-валин). Однако, при увеличении содержания модификаторов элюента до 1% уже сорбент с эремомицином имеет наибольшие значения энантиоселективности, а эремозаминилагликон является предпочтительнее полного агликона для разделения оптических изомеров (исключение дансил-серин).

Одним из примеров использования полученных в работе сорбентов является разработка методики аналитического контроля энантиомерного состава получаемого химическим синтезом модифицированного мононуклеотида (рис. 10), который последующей конденсацией образует декамер пептидно-нуклеиновой кислоты – ДНК-миметика*.

O CH HN O N O O O N O N OH O H3 C CH H3 C O Рис.10. Структура синтетического мононуклеотида, структурной единицы ДНК миметика. Звездочкой обозначен ассиметрический атом углерода Благодаря своим физико-химическим и биологическим характеристикам ДНК-миметики нашли в настоящее время широкое применение в диагностике в качестве зондов, которые используются в микробиологии, цитогенетике, при создании биосенсоров и микрочипов. В молекулярной биологии пептидно нуклеиновые кислоты находят применение для выделения и очистки нуклеиновых кислот, специфического расщепления нуклеотидных последовательностей, определения генетических мутаций. Таким образом, аналитический контроль оптической чистоты синтетических мономеров такого * Мононуклеотид предоставлен к.х.н. Прохоровым Д.И. (кафедра биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии им. М.В.

Ломоносова).

ДНК-миметика является необходимой ступенью получения чистого продукта с контролируемыми свойствами.

.

Рис. 11. Хроматограммы L-энантиомера (А), D-энантиомера (Б) мононуклеотида и их искусственной смеси (В). Колонка: 4?250 мм, сорбент с иммобилизованным эремомицином.

Элюент: 100 % метанол – 1 % триэтиламин – 1 % уксусная кислота, 0.7 мл/мин В результате разработки методики контроля оптической чистоты мононуклеотида выяснилось, что как и для дансил-производных аминокислот, из-за сильного удерживания обращенно-фазовый вариант хроматографии не подходит для решения этой задачи. Приемлемым является использование полярно-органического режима в элюенте 100 % метанол – 1 % триэтиламин – 1 % уксусная кислота, 0.7 мл/мин, на хиральной неподвижной фазе с иммобилизованным эремомицином.

На рис. 11 приведены хроматограммы L- и D-энантиомеров данного мононуклкотида. Видно что, данные оптические изомеры имеют различные времена удерживания, а целевой образец имеет 10%-ную примесь D-антипода (рис. 11А).

Изучение адсорбции L- и D-Метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином.

Препаративное разделение энантиомеров представляет исключительный интерес для изучения различия биологических свойств антиподов. Наиболее перспективной технологией препаративного aC i q S bC i разделения энантиомеров, является SMB qi 1 bC i 1 bC i процесс, обеспечивающий высокую производительность за счет возможности a1 C a2C qi непрерывной подачи сырья.

1 b1C 1 b2 C Расчет параметров SMB-процесса Уравнения изотермы адсорбции основывается на параметрах уравнения изотермы адсорбции обоих разделяемых энантиомеров.

Нами изучены изотермы L- и D- метионина на сорбенте с привитым эремомицином и рассчитаны параметры (табл. 9) двух уравнений адсорбции ЕСР-методом (расчет по тыловой десорбционной части перегруженного хроматографического пика).

Табл. 9. Параметры уравнения изотермы адсорбции, рассчитанные в работе.

b q s,1 qs, qs b1 b a1 a a Параметры (%) (%) (г/л) (г/л) (г/л) (г/л) (г/л) (г/л) 0.77 0.08 9.79 1.63 0.71 0.06 0.11 1.14 11.4 0.10 0. L-метионин 2.00 0.17 12.0 3.91 1.88 0.14 0.19 1.78 13.3 0.11 0. D-метионин Партия сорбента с иммобилизованным эремомицином (силикагель Eurospher, 15 мкм) упаковали в препартивные колонки 8*60 мм и сопоставили расчетные и экспериментальные данные SMB-процесса Из изотерм адсорбции рассчитаны параметры SMB, которые хорошо совпали с экспериментальными результатами. Показано, что сорбент позволяет получить как в линейных, так и в нелинейных условиях оба энантиомера метионина с высокой чистотой (90- %) и производительностью*.

После трех недель непрерывной работы в SMB-условиях выявлены лишь незначительные изменения факторов удерживания L- и D-метионина на всех колонках, что свидетельствует о высокой стабильности хиральной неподвижной фазы с иммобилизованным эремомицином, превышающей стабильность промышленного сорбента с привитым тейкопланином.

Результат возможности эффективного применения разработанного сорбента в препаративном разделении L- и D-метионина представляет и практический интерес вследствие потребности в D-метионине. В настоящее время идут разработки сопряженного процесса, включающего ферментативную рацемизацию, биотехнологически полученного L-метионина с последующим разделением смеси энантиомеров в SMB-системах с непрерывной подачей сырья и возвращением L-изомера в сопряженный с хроматографической системой ферментер. Нами продемонстрирована возможность эффективной реализации части этой задачи.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что разработанный сорбент с иммобилизованным эремомицином перспективен не только для аналитического контроля, но и для препаративной очистки и получения оптически чистых соединений.

* Экспериментальные исследования SMB-процесса выполнены в лаборатории проф. А.

Зайдель-Моргенштерна (Институт динамики сложных технических систем им. Макса Планка, Магдебург, Германия).

ВЫВОДЫ 1. Передложена новая группа хиральных селекторов для хроматографии энантиомеров: эремомицин, его полный агликон и эремозаминилагликон эремомицина. Разработан способ препаративного получения и очистки полного агликона и эремозаминилагликона эремомицина путем кислотного гидролиза с последующей очисткой препаративной ВЭЖХ.

2. Разработан и оптимизирован общий способ иммобилизации гликопептидных антибиотиков в водно-органических средах при умеренной температуре.

Показано, что способ обеспечивает более высокую энантиоселективность сорбентов в сравнении с известными. Синтезирована группа новых энантиоселективных сорбентов, отличающихся природой хирального селектора и энантиоселективными свойствами.

3. Разработан способ получения нового гибридного хирального сорбента путем ферментативной полимеризации лакказой анилина в присутствии хирального допанта на поверхности пористого силикагеля с иммобилизованным эремомицином. Показано, что энантиоселективность гибридного сорбента, для ряда аминокислот выше в сравнении с иммобилизованным эремомицином.

4. Комплексом физико-химических методов изучена химическая структура привитого слоя синтезированных сорбентов. Установлено основное направление иммобилизации гликопептидных селекторов.

5. Проведено систематическое изучение удерживания и разделения энантиомеров аминокислот на синтезированных сорбентах в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии. Выявлены закономерности хирального распознавания оптических изомеров аминокислот в зависимости от их структуры, температуры, рН и состава подвижной фазы.

6. Определены условия разделения энантиомеров лекарственных препаратов группы профенов и -блокаторов в обращено-фазовом и полярно органическом вариантах хроматографии на разработанных сорбентах для всех изученных соединений.

7. Выявлена высокая энантиоселективность синтезированных сорбентов для модифицированных - и -аминокислот и их производных.

8. Выявлены существенные отличия энантиоселективности изученных сорбентов, что позволило предложить модели хирального распознавания для ароматических -аминокислот и -блокаторов.

9. На основании изучения изотерм адсорбции L- и D-метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином, проведены расчеты и получены экспериментальные доказательства эффективности применения синтезированого сорбента в препаративной хроматографии в режиме SMB.

Показана стабильность сорбента в условиях препаративной ВЭЖХ.

10. Разработанные сорбенты внедрены в производство и выпускаются предприятием ЗАО «БиоХимМак СТ».

Список публикаций по теме диссертации:

1. S.M. Staroverov, M.A. Kuznetsov, P.N. Nesterenko, G.G. Vasiarov, G.S.

Katrukha, G.B. Fedorova. New chiral stationary phase with macrocyclic glycopeptide antibiotic eremomycin chemically bonded to silica. // J. Chromatogr.

A. 2006. V. 1108. P. 263 – 267.

2. М.А Кузнецов, П.Н. Нестеренко, Г.Г. Васияров, С.М. Староверов. Сорбенты с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками для разделения оптических изомеров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №. 6. С. 615 – 623.

3. М.А. Кузнецов, Г.Г. Васияров, С.М. Староверов. Иммобилизованные на силикагеле эремомицин и его эремозаминилагликон в разделении оптических изомеров методом ВЭЖХ. // Труды X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва. 2006. 24- 28 апреля. С. 406 – 410.

4. K. Petrusevska, M.A. Kuznetsov, K. Gedicke, V. Meshko, S.M. Staroverov, A.

Seidel-Morgenstern. Chromatographic enantioseparation of amino acids using a new chiral stationary phase based on a macrocyclic glycopeptide antibiotic. // J.

Sep. Sci. 2006. V. 29. P. 1447 – 1457.

5. L. Zhang, K. Gedicke, M.A. Kuznetsov, S.M. Staroverov, A. Seidel-Morgenstern.

Application of an eremomycin-chiral stationary phase for the separation of DL methionine using simulated moving bed technology. // J. Chromatogr. A. 2007. V.

1162. P. 90 – 96.

6. М.А. Кузнецов, П.Н. Нестеренко, Г.Г. Васияров, С.М. Староверов.

Высокоэффективная жидкостная хроматография энантиомеров аминокислот на силикагеле с иммобилизованным эремомицином. // ЖАХ.

2008. Т. 63. №. 1. С. 64 – 72.

7. С.М. Староверов, М.А. Кузнецов, Г.С. Катруха, Г.Б. Федорова, Г.Г.

Васияров, П.Н. Нестеренко, Ю.В. Волгин. Сорбент для разделения оптических изомеров и способ его получения. // Патент РФ № 2255802.

Опубликован 10.07.2005. Бюл. №. 19.

8. А.И. Ярополов, И.С. Синякова, О.В. Морозова, С.В. Шлеев, С.М.

Староверов, И.Ю. Сахаров, М.А. Кузнецов. Способ получения оптически активного полианилина. // Патент РФ № 2301262. Опубликован 20.06.2007.

Бюл. №. 17.

9. С.М. Староверов, М.А. Кузнецов, И.Ю. Сахаров, А.И. Ярополов, О.В.

Морозова, Г.П. Шумакович. Сорбент для хроматографии оптических изомеров и способ его получения. // Положительное решение о выдаче патента РФ по заявке № 2006135760.

10. М.А. Кузнецов, Г.С. Катруха, Г.Г. Васияров, П.Н. Нестеренко, С.М.

Староверов. Хроматографическое разделение аминокислот на сорбенте с иммобилизованным макроциклическим гликопептидным антибиотиком. / Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» Москва. 2004. 15 – 19 марта. С. 219.

11. М.А. Кузнецов, П.Н. Нестеренко, Г.Г. Васияров, Г.С. Катруха, С.М.

Староверов. Закономерности разделения энантиомеров аминокислот на сорбенте с иммобилизованным макроциклическим антибиотиком – эремомицином. / Международная конференция «Физико-химические основы новейших технологий XXI века» Москва. 2005. 30 мая – 4 июня. С. 194.

12. М.А. Кузнецов, Г.Г. Васияров, Ю.В. Волгин, С.М. Староверов. Влияние структуры хирального селектора и способа прививки на энантиоселективность ВЭЖХ сорбентов с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками./ Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» Самара. 2005. 3 – 8 июля. С. 219.

13. K. Petrusevska, M.A. Kuznetsov, K. Gedicke, V. Meshko, S.M. Staroverov, A.

Seidel-Morgenstern. Enantioseparation of racemic mixtures of amino acids using high performance liquid chromatography. / 1st South East European Congress of Chemical Engineering. Belgrade. Serbia. 2005. September 25 – 28. P. 211.

14. С.М. Староверов, М.А. Кузнецов, Г.С. Катруха. Новые хиральные сорбенты на основе гликопептидных антибиотиков для разделения оптических изомеров аминокислот и пептидов. / II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург. 2005. 6 – 8 июня. С. 115.

15. М.А. Кузнецов, П.Н. Нестеренко, Г.Г. Васияров, Ю.В. Волгин, С.М.

Староверов. Сорбенты с иммобилизованными гликопептидными антибиотиками для разделения оптических изомеров профенов методом ВЭЖХ. / X Международная конеренция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва. 2006. 24 – 28 апреля. С.

296.

16. М.А. Кузнецов, Ю.В. Волгин, Г.Г. Васияров, В.С. Карасев, И.В. Назимов, С.М. Староверов. Новые хиральные сорбенты с иммобилизованными гликозидами и агликоном макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина. / Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» Москва. 2007. 23 – 27 апреля.

С. 17.