Особенности действия дельта - эндотоксинов bacillus thuringiensis на микробиоценоз толстого кишечника животных
На правах рукописи
КУПЦОВА Анна Александровна ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ ДЕЛЬТА - ЭНДОТОКСИНОВ BACILLUS THURINGIENSIS НА МИКРОБИОЦЕНОЗ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ЖИВОТНЫХ 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Каменек Людмила Кирилловна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Маннапова Рамзия Тимергалеевна доктор биологических наук, доцент Юдина Татьяна Георгиевна
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»
Защита диссертации состоится « 28 » декабря 2011 г. в 14 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева.
Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева
Автореферат разослан «16» ноября 2011 г.
и размещён на сайте университета www.timacad.ru Отзывы на автореферат (в 2-х экземплярах заверенных печатью), просим направлять по адресу: 127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49;
тел. факс: 8(499) 976-24-
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О.В. Селицкая
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одними из наиболее эффективных и широко применяемых биопестицидов для борьбы с вредными насекомыми являются препараты на основе споро-кристаллического комплекса и отдельных параспоральных белков (Сry- и Cyt- белков, -эндотоксинов) грамположительной спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis.
Преимуществами биопестицидов на основе B. thuringiensis по сравнению с химическими инсектицидами являются высокая специфичность действия, отсутствие загрязняющих остатков и сравнительно низкая стоимость процедур, требуемых для регистрации их в качестве средств защиты растений (Вершинина, Алимова, 2000). Кроме того, Сry-гены введены в целый ряд растений для их защиты от вредных насекомых (генно-модифицированные Bt растения).
Сведения о действии Bt-растений и биоинсектицидов на основе различных компонентов B. thuringiensis на нецелевые объекты носят противоречивый характер. С одной стороны, литературные данные свидетельствуют об абсолютной экологической безопасности данных препаратов в рекомендуемых дозах, неактивности их компонентов в отношении теплокровных (Кандыбин, 1989;
Головко и соавт., 1993;
Киль, Надыкта, 2002).
С другой стороны, определенные штаммы данного микроорганизма содержат гены, ответственные за образование энтеротоксинов, вызывающих отравление с диарейным синдромом, и гемолизина, гомологичного гемолизину II В. cereus и сходного с ним по свойствам (Hansen et al,. 1998;
Perani et al, 1998;
Gaviria Rivera et al, 2000;
Helgason et al., 2000;
Imre et al., 2005).
Некоторые штаммы B. thuringiensis описаны как антибиотически активные против грибов и бактерий, способные проявлять бактериостатическое или бактерицидное действие (Авторские свидетельства Н.С. Егорова и соавт., № 1367491 и № 1420947, 1987 и 1988 годов;
Юдина и соавт., 1988;
Юдина и Егоров, 1996;
Юдина и Бурцева, 1997;
Кандыбин и Смирнов, 1999;
Смирнов, 2000;
Юдина, 2006;
Marrone et al., 1999).
Известно, что белковые токсины способны оказывать влияние на микроорганизмы, входящие в состав нормального микробиоценоза кишечника:
вызывать появление новых патогенных и условно-патогенных штаммов, изменять биологические свойства отдельных представителей микробиоты, селективно ингибировать или, напротив, усиливать их рост, обусловливать дисбиотические нарушения (Барановский и Кондрашин, 2000;
Лобзин и соавт., 2003;
Костюкевич, 2007).
При токсикологической оценке, гигиеническом нормировании и регламентации производства и применения биопрепаратов изучение бактериоценоза желудочно-кишечного тракта животных представляется весьма важным и актуальным, так как в организм животных и человека Cry-белки могут попадать перорально, вместе с пищей, прежде всего – с продуктами, содержащими генетически модифицированные Bt растения.
Цель исследования. Целью данного исследования явилась оценка влияния дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki, являющихся основным действующим началом ряда биопестицидов, применяющихся в защите растений, на микроорганизмы биотопа прямого отдела толстого кишечника мышей при их пероральном введении in vivo.
Были поставлены следующие задачи:
1. Выявить изменение характера поведения и симптомов проявления дисбактериоза у белых мышей при пероральном введении дельта – эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52.
2. Определить влияние дельта - эндотоксинов на изменение состава и численности микробиоты прямого отдела толстой кишки животных.
3. Изучить особенности микробного пейзажа толстого кишечника мышей при экспериментальном дисбактериозе, обусловленном действием высоких доз дельта-эндотоксинов.
4. Рассмотреть особенности межбактериальных взаимодействий в условиях формирующегося патобиоценоза толстого кишечника под влиянием бактериальных токсинов.
5. Выявить изменение персистирующих и патогенных свойств ряда бактерий, входящих в состав биотопа толстого кишечника мышей при экспериментальном дисбактериозе: антилизоцимную (АЛА), антиинтерфероновую (АИА) активности и адгезивные свойства.
Научная новизна работы. Впервые изучено действие дельта эндотоксинов B. thuringiensis на кишечную микробиоту. Показано, что пероральное введение растворов дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp.
kurstaki Z-52 в дозе от 1 до 50 мг/кг веса животных в течение 28 суток не оказывает существенного влияния на изменение состава и численности микробиоценоза толстого кишечника белых мышей. Высокие дозы дельта эндотоксинов (100 мг/кг веса животных) вызывают развитие дисбиотических изменений в толстом кишечнике белых мышей, изменение характера межмикробных взаимодействий и усиление факторов патогенности и персистирующих свойств условно-патогенных бактерий уже с первой недели применения.
Практическая значимость работы. Полученные результаты, демонстрирующие действие дельта - эндотоксинов B. thuringiensis subsp.
kurstaki в отношении микробиоты желудочно-кишечного тракта теплокровных животных, могут быть использованы при контроле регламента производства и биологической активности промышленно выпускаемых биопестицидов, разработке норм и доз их безопасного применения и при оценке степени токсичности генетически модифицированных Bt-растений в отношении теплокровных животных и человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
Пероральное введение растворов дельта-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе от 1 до 50 мг/кг веса белых мышей в течение 28 суток не оказывает значимого влияния на изменение состава и численности микробиоценоза толстого кишечника.
При применении дельта-эндотоксинов в дозе 100 мг/кг веса уже на первой неделе эксперимента происходит развитие дисбиотических изменений в толстом кишечнике белых мышей: происходит структурная перестройка микробиоценоза, чаще выявляются гемолитические штаммы видов Escherichia coli и Staphylococcus aиreus, проявляющие антагонистическое действие в отношении ряда микроорганизмов, наблюдается увеличение степени патогенности и персистирующих свойств штаммов некоторых видов условно патогенных микроорганизмов.
Работа выполнена на экологическом факультете ФГБОУ ВПО УлГУ при частичной поддержке гранта МО РФ аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» по проекту № 2.1.1/2275 «Разработка теоретических основ экологически безопасного регулирования численности вредных организмов дельта эндотоксинами Bacillus thuringiensis» и гранта ФЦП, гос. контракт № 02.740.11.5230.
Личный вклад автора - участие в практическом решении всех поставленных задач, анализе и обобщении полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на всероссийских и международных научных конференциях и симпозиумах разных уровней: «Проблемы защиты растений в условиях современного сельскохозяйственного производства» (ВИЗР, Санкт-Петербург, 2009);
«Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (Казань, КГУ), «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (МГУ, Москва, 2009);
«Ломоносов -2010» (МГУ, Москва, 2010), «Биологически активные вещества микроорганизмов:
прошлое, настоящее, будущее» (МГУ, Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав: обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, а также выводов, списка используемых литературных источников и приложений. Работа изложена на 163 страницах, содержит 11 таблиц, 11 рисунков и 9 приложений. Список использованных литературных источников включает 308 наименований, в том числе зарубежных.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В данной главе дан подробный обзор отечественной и зарубежной литературы об основных проблемах безопасности применения биопрепаратов на основе различных подвидов B. thuringiensis и генно-модифицированных Bt растений, об основных факторах, влияющих на развитие дисбиотических изменений в кишечнике животных и человека. Также даны характеристика и механизм действия белковых дельта - эндотоксинов как основных факторов токсичности B. thuringiensis, освещены вопросы биологической активности токсинов, в том числе по отношению к прокариотическим организмам.
ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение растворов кристаллов. В работе был использован штамм Z 52 B. thuringiensis subsp. kurstaki, продуцирующий кристаллы дельта эндотоксинов классов CryIА и Cry2, полученный из ФГУП ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Выделяли параспоральные кристаллы дельта-эндотоксинов по известной методике с помощью п-ксилола (Chestukhina et al., 1980), активировали их до активных токсинов и перерастворяли в 0,02М фосфатном буфере (Юдина, 2006);
полученные растворы белков нужной концентрации использовали для перорального (per os) введения подопытным животным. Фракционирование белков кристаллов проводили на электрофоретической системе Paragon фирмы «Beckman» на ацетоцеллюлозных пластинах в гиппуратном буфере (pH 8,6).
Работа с экспериментальными животными. В работе использовали белых беспородных мышей – самок возраста 180 дней со средним весом 26,0 ± 3,0г. В соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755), все животные содержались в виварии в клетках по 10 особей при сходных условиях в отношении температуры, влажности и освещения, а также рациона питания. Все мыши были разделены на 9 групп. 1 я группа – контрольная, животным которой вводили per os буферный раствор;
2-я группа – доза получаемых дельта-эндотоксинов 1мг/кг веса;
3-я группа – 3мг/кг веса;
4-я группа - 5мг/кг веса;
5-я группа –10мг/кг веса;
6-я группа – 15мг/кг веса. 7-я группа (группа А) – доза дельта-эндотоксинов 25мг/кг веса;
8 я группа (группа В) – 50 мг/кг веса;
9-я группа (группа С) — 100 мг/кг веса. В группах с 1 по 6-ю было по 40 мышей, с 7 по 9-ю – по 120.
Каждое животное ежедневно в первой половине дня получало раствор дельта - эндотоксинов внутрижелудочно с помощью зонда в течение 28 суток.
Ежедневно контролировали состояние животных, поедаемость корма, поведение, состояние шерстного покрова, наличие/отсутствие диареи, прирост/снижение массы тела. На определенных сроках проведения эксперимента животных подвергали усыплению эфиром, вскрывали и проводили отбор фекальных масс из содержимого толстого кишечника (прямой отдел) в стерильную одноразовую посуду для исследования микробиоты.
Выделение и идентификация микроорганизмов. Микроорганизмы выделяли и идентифицировали с использованием классических бактериологических методик, используя широкий набор коммерческих селективных и диагностических питательных сред и с помощью коммерческих тест-систем фирмы LACHEMA (Чехия): ENTEROtest (1 и 2), STREPTOtest, NEFERMtest, STAPYtest, а также по морфологическим, биохимическим и культуральным признакам, согласно определителю Берджи (1997).
Количественное содержание бактерий и грибов на 1 г исследуемого материала выражали в десятичных логарифмах (lg КОЕ/г).
Определение индекса встречаемости проводили по числу проб, в которых обнаружены микроорганизмы исследуемого вида, выраженных в процентах к общему числу проанализированных проб. При встречаемости в 50% проб и выше виды считались постоянными (доминирующими), добавочные виды соответствовали значениям от 25 до 50%, случайные – ниже 25%.
Определение индекса доминирования (С) – доли в %, которую составляет обилие исследуемого вида по отношению к суммарному обилию всех сравниваемых между собой видов в изучаемом материале.
Антагонистическую активность гемолитических штаммов эшерихий (E.coli Hly+) определяли методом штрихов c отсроченным антагонизмом при совместном культивировании микроорганизма-продуцента факторов ингибирования роста и индикаторных штаммов (Блинкова, 2003;
Постникова и соавт., 2004).
Изучение антилизоцимной активности (АЛА) проводили по методу О.В. Бухарина и Б.Я. Усвяцова (1982). При этом штаммы считались высокоактивными при нейтрализации лизоцима в концентрации более 5 мкг/мл, среднеактивными – от 3 до 4 мкг/мл, низкоактивными – от 0 до 2 мкг/мл.
Антиинтерфероновую активность (АИА) штаммов культур E.coli и St.
aureus исследовали по методу О.В. Бухарина и В.Ю. Соколова (1989) с учетом антибактериального действия препарата человеческого лейкоцитарного интерферона. АИА исследуемого штамма считали высокой при инактивации человеческого лейкоцитарного интерферона в концентрации более 2 ед., средней – от 1,1 – 2ед, низкой – от 0 до 1 ед.
Адгезивные свойства культур E.coli, Enterococcus spp. и St. aureus, выделенных в контроле, на 14 и на 28 сутки после начала введения растворов дельта-эндотоксинов и гемолитических штаммов E. coli (по 10 произвольно выбранных штаммов) оценивали по методике В.И. Бриллис и соавт. (1986) с определением среднего показателя адгезии (СПА), коэффициента участия эритроцитов в адгезивном процессе (К,%) и индекса адгезивности микроорганизма (ИАМ).
Статистическая обработка результатов исследований выполнена на персональном ЭВМ типа IBM «Pentium IV», графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2003, использовались методы статистической обработки данных и результатов исследований «Биометрия» (Лакин, 1990). Вычислялся также коэффициент ранговой корреляции Спирмена с целью определения фактической степени параллелизма между двумя количественными рядами изучаемых признаков и оценки тесноты установленной связи с помощью количественно выраженного коэффициента.
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Электрофоретическое разделение белковых компонентов параспоральных кристаллов B.thuringiensis subsp. kurstaki Z-52.
После электрофоретического разделения белков было выявлено, что преобладающими являются фракции с Mr 120–140 кДа (49,0–52,0%) и 65– кДа около (45%). В незначительных количествах в пробах обнаруживали компонент с Mr около 5–10 кДа. Следовательно, растворы кристаллов представляют собой многокомпонентные системы, включающие 3-4 белковые фракции с различными электрофоретическими характеристиками, что подтверждает результаты, полученные ранее для разных подвидов B.
thuringiensis (Chestukhina et al., 1994).
3.2 Изменение характера поведения и симптомов проявления дисбактериоза у мышей после перорального введения дельта эндотоксинов B. thuringiensis.
У мышей, получавших дозы дельта-эндотоксина от 1 до 50 мг/кг веса, как и в контроле, в течение всего периода эксперимента явно выраженных признаков дисбактериоза не наблюдалось, кроме некоторого снижения активности в поведении у незначительного числа особей в опыте. Вздутие живота и наличие диареи у ряда животных в группе С появились уже к концу первой недели после начала эксперимента и сохранялись, постепенно усиливаясь, в течение всего периода наблюдений. На 28-е сутки число мышей с признаками заболевания составило 14 из 30 особей, или 46,7%.
В экспериментальных группах 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 вес каждой мыши составил в среднем от 26,0 до 26,5 г, а среднее количество корма, поедаемого в сутки одним животными, было сравнимо с таковым в контрольной группе и составило 10,4 - 11,0 г в сутки. В 9-й группе (группа С) среднее количество поедаемого корма одним животным сократилось к 28 - м суткам с 11,0 до 8, грамма, а вес одной мыши составил, в среднем, 23,1 г.
3.3 Определение влияния перорального введения дельта эндотоксинов B. thuringiensis на изменение состава и численности кишечной микробиоты белых мышей.
В результате проведенных бактериологических исследований содержимого прямого отдела толстого кишечника животных было установлено, что пероральное введение дельта - эндотоксинов в дозах от 1,0 до 50,0 мг/ кг веса практически не оказывало влияния на изменение состава и численности кишечной микрофлоры.
Таблица 1. Состав микробиоты кишечника мышей при введении дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis (100 мг/кг веса) Количественное содержание микробиоты lg КОЕ/г Микроорганизмы Контроль 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки 6,4±0,13 6,0±0,20 5,7±0,30* 5,5±0,20* 5,2±0,30* Bifidobacterium spp.
13,9±0,96 12,5±0,30 11,0±0,60* 10,8±0,04* 9,6±0,70* Lactobacillus spp.
4,5±0,11 4,3±0,20 3,9±0,30* 3,9±0,10* 3,6±0,50* Bacteroides E. соli (тип.) 7,4±0,16 7,3±0,10 7,0±0,10* 6,9 ±0,10* 6,7±0,20* E. coli(гем.) ед** ед** 1,1 ±0,10* 1,3±0,20* 1,7 ±0,10* 1,03±0.01 1,2±0,10 1,4±0,10* 1,6±0,20* 1,9±0,20* Klebsiella spp 2,7±0,04 2,8±0,20 3,0±0,60 3,0±0,20 3,3±0,10* Proteus spp.
2,3±0,20 2,5±0,10 2,5±0,20 2,7±0,30* 2,9±0,20* Enterococcus spp.
1,1±0,10 1,2±0,10 1,3±0,20 1,3±0,10 1,4±0,10* Enterococcus fec.
3,1±0,30 3,4±0,40 3,2±0,20 3,5±0,30 3,6±0,10* Staphylococcus spp.
ед** ед** 1,2 ±0,10* 1,3±0,20* 1,5 ±0, St. aureus Грибы р. Сandida 1,0±0,03 1,1±0,10 1,3±0,10* 1,4±0,10* 1,6±0,20* - 1,5 ±0,20* 2,1±0,20* 2,3±0,20* 2,3±0,10* Citrobacter spp.
- 1,4 ±0,10* 1,8±0,10* 1,9±0,20* 2,0±0,10* Morganella morganii - 1,3±0,10* 1,5±0,10* 1,6±0,10* 1,8±0,20* Yersinia enterocolitica Примечания: *Статистически значимые различия с контрольным вариантом;
** микроорганизмы обнаруживаются в единичных количествах;
- микроорганизмы в посевах не обнаруживаются. Количество повторностей n=10, результаты достоверны при р0,005.
Наблюдалось лишь незначительное, статистически не достоверное уменьшение количества бифидобактерий, лактобацилл, бактероидов и эшерихий с нормальной ферментативной активностью на 28-е сутки.
Гемолитические штаммы St. aureus и E. coli высевались в единичных количествах.
При введении высоких доз препарата (100 мг/кг, табл.1) было отмечено подавление роста нормальной микрофлоры в толстом кишечнике, количество доминирующих видов - бифидобактерий и лактобактерий на 28-е сутки уменьшилось по сравнению с контролем, соответственно, с 6,4±0,13 до 5,2±0,8 lg КОЕ/г и с 13,9±0,96 до 9,6±0,70 lg КОЕ/г, количество бактероидов уменьшилось с 4,5±0,11 до 3,6±0,50 lg КОЕ/г, а число жизнеспособных клеток кишечной палочки сократилось с 7,4±0,16 до 6,7±0,20 lg КОЕ/г.
Штаммы золотистого стафилококка и эшерихий, обладающие гемолитической активностью, в контрольной группе и на 7-е сутки обнаруживались в единичных количествах, а на 28-е сутки их количество составило в среднем 1,5 - 1,7 lg КОЕ/г. Количество клебсиэлл, протей и дрожжеподобных грибов рода Candida также значимо увеличилось на 28-е сутки по сравнению с контролем. Кроме того, в микробном пейзаже толстого кишечника на 7 сутки эксперимента проявились условно-патогенные бактерии Citrobacter spp., Morganella morganii и Y. Еnterocolitica в количестве 1,3-1,5 lg КОЕ/г, и на 28 сутки их число составило 1,8-2,3 lg КОЕ/г.
Индекс встречаемости микроорганизмов в микробиоте толстого кишечника при введении высоких доз дельта-эндотоксинов (100 мг/кг веса) на 28-е сутки для бифидобактерий и лактобактерий составил 100%, т.е. во всех пробах были обнаружены микроорганизмы данного вида. Тот же показатель для бактероидной микрофлоры уменьшился с 58,4±4,6 % в контроле до 52,0±7,0 % на 28-е сутки, а для клеток кишечной палочки соответственно, с 84, ±11,2 % в контроле, до 73,5±10,8 % на момент окончания эксперимента.
Частота встречаемости условно-патогенных микроорганизмов в экспериментальных группах, напротив, увеличилась, и составила для протеи 39,8±7,7% и клебсиэлл 42,5±6,3%. Частота встречаемости бактерий Enterococcus и Staphylococcus увеличилась соответственно до 39,8±5,4% и 38,2±4,4%. Enterococcus fecalis высевались в 42,1±5,0% проб, а грибы р.
Candida высевались в 18,2 ±4,1% проб. Установлено, что доминантными видами, формирующими микробиоту в контрольной группе животных, являются лактобактерии, бифидобактерии, бактероиды и кишечные палочки с нормальной ферментативной активностью, в совокупности их доля составила около 75% (рис.1). Доля условно-патогенных микроорганизмов — клебсиэлл, протей и грибов рода Candida составила чуть более 25%. Было установлено, что на 7-е, 14-е, 21-е и особенно на 28-е сутки эксперимента выявляется структурная перестройка биоценоза, которая проявляется в уменьшении индекса доминирования микроорганизмов, составляющих нормальную микробиоту кишечника (до 52% на 28 сутки) и увеличении значимости условно-патогенных видов (до 48%).
Yersinia enterocolitica 100% Morganella morganii Citrobacter spp.
Дрожжеподобные грибы 80% р. Candida St. aureus Staphylococcus spp.
Enterococcus f ecalis 60% Enterococcus spp., Proteus spp.
40% Klebsiella spp E. coli(гем.) E. соli (тип.) 20% Bacteroides Lactobacillus spp.
Bif idobacterium spp.
0% Контроль 7-е сутки 14-е 21-е 28-е сутки сутки сутки Рис. 1. Индексы доминирования микроорганизмов биоценоза толстого кишечника мышей при введении дельта-эндотоксинов B. thuringiensis (100мг/кг веса) На 14-е и 28-е сутки эксперимента от 24-х животных с признаками дисбактериоза (в группе С) был высеян 251 штамм, а от мышей контрольной группы - 192 штамма грамположительных и грамотрицательных условно патогенных бактерий, а также грибов. В микробном пейзаже условно патогенных грамотрицательных бактерий превалировали штаммы E. coli: 49 в контрольной группе и 80 в группе С с признаками дисбактериоза, что составило соответственно 48,5 и 54,8%. Также наблюдалось большое количество штаммов Proteus spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp. В группе условно-патогенных грамположительных бактерий, выделенных из фекалий мышей с признаками дисбактериоза, большую долю составляли бактерии родов Staphylococcus ( штаммов, или 65,7%) и Enterococcus (15 штаммов, или 14,3%). В контрольной группе в основном высевались Staphylococcus epidermidis (37 штаммов, или 40,6%) и Enterococcus spp. (31штамм, или 34,1%). Таким образом, сопряженными таксонами микроорганизмов, чаще встречающимися совместно в группах биоценозов животных с выраженными признаками дисбактериоза, оказались бактерии родов Escherichia-Staphylococcus.
Важной особенностью микробиоценоза, формирующегося под влиянием высоких доз эндотоксинов B. thuringiensis (100мг/кг веса), является появление на 14-е сутки большого количества гемолитических (Hly+) штаммов St. aureus и E. coli, которые в контроле выделялись в единичных количествах (табл. 2).
На 28 сутки после начала введения дельта - эндотоксинов число штаммов E. coli Hly+ обнаруживались в 22,5±5,3% проб. Всего было выделено штамма, или 28,5 % от общего числа, из них лактозонегативными (lac-) оказалось 5 штаммов, или 6,3%. Штаммы St. aureus Hly+ высевались в 5,1% исследуемых анализов, общее их количество составило 11 из 50 выделенных, или 42,0%.
Таблица 2. Частота обнаружения и количество штаммов E. coli Hly+ и St.
aureus Hly+ в 1 г кишечного содержимого у мышей группы С Всего было выделено штаммов Количество В том числе Из них В том числе St.
штаммов E. coli St. aureus E. coli lac E. coli Hly+ aureus Hly+ Контроль В ед. 59 2 0 0 В% 0 3,4±0,40 0 0 ИВ микроорганизмов, % 2, 0±0,5 0 0 14 сутки В ед. 63 16 2 11 В% 100,0 25,4 3,2 100,0 27, ИВ микроорганизмов, % 15,0±2,4 3,3±0,5 10,5±1,6 2, 5±0, 28 сутки В ед. 80 23 5 50 В% 100,0 28,5 6,3 100,0 22, ИВ микроорганизмов, % 20,7±5,3 12,2±4,2 17,8±4,2 5,1±1, Примечание: ИВ — индекс встречаемости.
Появление в микробном пейзаже эшерихий гемолитических и лактозонегативных штаммов с высоким патогенным потенциалом свидетельствует о формировании патологического биоценоза в толстом кишечнике животных, основной причиной которого, видимо, является введение животным в течение достаточно длительного времени высоких доз дельта эндотоксинов B. thuringiensis.
3.4 Особенности межбактериальных взаимодействий в условиях формирующегося патобиоценоза толстого кишечника.
Показано, что при развитии дисбактериоза наблюдается увеличение антигенной нагрузки условно-патогенных микроорганизмов и, как правило, усиление их антагонизма в отношении других симбионтов кишечника (Барановский и Кондрашин, 2000). Н основе изучения чувствительности различных видов микроорганизмов к антагонистическому действию гемолитических эшерихий, выделенных при экспериментальном дисбактериозе, было выяснено, что все они оказались в той или иной степени чувствительны к подобному действию, проявляющемуся в формировании зон подавления роста при совместном культивировании (табл. 3).
Высокую чувствительность к антагонистическому действию гемолитических эшерихий проявили типичные E. coli и Lactobacillus spp.
Среднюю чувствительность - штаммы St. epidermidis, Proteus spp., Citrobacter spp. и Klebsiella spp. Наименее чувствительными к ингибирующему действию E. coli Hly+ оказались штаммы золотистого стафилококка.
Таблица 3. Чувствительность индикаторных штаммов бактерий к антагонистическому действию E. coli Hly+ № Индикаторные Число Чувствительных штаммов Чувствительность в п/п виды штаммов, мм подавления роста Ед. % ед 1 19 12,0±1,4 67,2±5,2 7,9±1,1 +++ St. epidermidis 2 46 28,0±4,3 61,2±3,4 4,8±1,2 ++ St. aureus 3 Proteus spp. 21 11,0±0,9 52,3±4,5 6,2±1,9 +++ 4 19 11,1±0,5 58,8±2,7 5,3±1,5 +++ Citrobacter spp.
5 17 9,3±0,9 54,7±5,1 7,1±0,8 +++ Klebsiella spp.
6 E. coli тип. 57 23,2±1,3 40,7±2,2 10,2±0,9 ++++ 7 Lactobacillus spp. 84 53,3±4,1 63,5±4,9 19,1±1,8 ++++ Примечание: ++ слабая степень чувствительности (размер зоны подавления роста индикаторных штаммов до 5,0 мм);
+++ средняя степень чувствительности (размер зоны подавления роста индикаторных штаммов от 5,0 до 10 мм);
++++ высокая степень чувствительности (размер зоны подавления роста индикаторных штаммов более 10 мм).
Таким образом, гемолитические штаммы E. сoli, выделенные из патобиоценоза толстого кишечника былых мышей, сформированного под влиянием дельта-эндотоксинов, обладали антагонистическим действием по отношению к некоторым видам микроорганизмов, входящим в состав симбионтной микробиоты, со способностью в разной степени ингибировать рост как близкородственных энтеробактерий (E. сoli тип.), так и неродственных микроорганизмов — лактобактерий, цитробактерий, стафилококков, протей и клебсиэлл. Проведенные исследования позволили оценить характер ассоциативных взаимодействий E. coli Hly+ с симбионтными микроорганизмами в условиях дисбактериоза как антагонистический тип межмикробных взаимоотношений, при котором может изменяться персистентный потенциал бактерий и их биологические свойства.
3.5 Изменение персистирующих свойств штаммов бактерий E. coli и St. aиreus, выделенных от мышей с экспериментальным дисбактериозом, обусловленном действием дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis 3.5.1 Антилизоцимная активность (АЛА). Были изучены показатели персистенции 49 штаммов E. coli, выделенных от животных контрольной группы, и 80 штаммов – от животных группы С на 28 сутки (эксперимент), а также 50 штаммов St. aиreus, высеянные от животных экспериментальной группы и 26 штаммов, высеянных от животных группы С на 14 сутки (контроль).
Результаты исследования показали, что штаммы E. coli, выделенные от мышей с экспериментальным дисбактериозом, достоверно чаще (р0,05) проявляли антилизоцимную активность, чем штаммы, выделенные от контрольных животных. Штаммов, обладающих высокой способностью инактивировать лизоцим, наблюдалось в 2,3 раза больше, чем в контроле, и в 1,3 раза больше штаммов, имеющих среднюю АЛА. Число неактивных штаммов уменьшилось в 1,4 раза (рис. 2).
Эксперимент 2, Эксперимент 44,6 13,5 13,5 28,7 44,5 40 Контроль Контроль 62,2 14,5 10,9 12,4 5 70,5 17,5 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Неактивные Низкая АИА Неактивные Низкая АИА Средняя АИА Высокая АИА Средняя АИА Высокая АИА Рис. 2. Количество (%) штаммов Рис. 3. Количество (%) штаммов E. coli с различной АЛА St. aиreus с различной АЛА Штаммы St. aиreus, выделенные от мышей с проявлениями дисбактериоза на 28 сутки (50 штаммов), также достоверно чаще (р0,05) проявляли более высокую антилизоцимную активность, чем штаммы, выделенные от животных с проявлениями дисбактериоза на 14 сутки (контроль). В частности, штаммов, обладающих высокой способностью инактивировать лизоцим, наблюдалось в 1,9 раза больше, и в 2,3 раза больше штаммов, имеющих среднюю АЛА. Таким образом, возрастание антилизоцимной активности зависело от времени воздействия токсина на микробиоту кишечника (рис. 3).
Повышение в микробном пуле числа штаммов St. aиreus и E. coli со средней и высокой антилизоцимной активностью способствует защите бактериальных клеток от бактерицидных факторов макроорганизма, бактерии приобретают дополнительные средства дистанционного действия, направленного на инактивацию механизмов иммунитета организма и, как следствие, происходит увеличение общего числа штаммов St. aиreus и E. coli, высеваемых из микробиоценоза толстого кишечника животных, сформированного под влиянием высоких доз эндотоксинов. Такое явление наблюдается при дисбактериозе, обусловленном, в частности, применением антибиотиков (Барановский и Кондрашин, 2000).
3.5.2 Антиинтерфероновая активность (АИА). Из 49 штаммов E. coli, выделенных из контрольной группы животных, 32 штамма (65,2%) оказались неактивны, 4 штамма (8,1%) проявили низкую АИА, 8 (15,2%) – среднюю степень АИА и 5 (11,5%) – высокую степень АИА.
Из 80 штаммов E. coli, выделенных от животных экспериментальной группы, неактивными оказалось уже меньше половины – 39 штаммов (49,8%), что в 1,3 раза меньше, чем в контроле. Количество штаммов с низкой АИА также уменьшилось, но незначительно – до 6 (7,2%), а вот количество штаммов со средней степенью АИА увеличилось до 17 (20,5%) или в 1,3 раза, а штаммов с высокой АИА выросло до 21 (22,5%), или почти в 2 раза (рис.4).
Эксперимент Эксперимент 49,8 7,2 20,5 22,5 10 37,2 24,5 28, Контроль Контроль 65,2 8,1 15,2 11,5 15,2 48,1 25,2 11, 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Неактивные Низкая АИА Неактивные Низкая АИА Средняя АИА Высокая АИА Средняя АИА Высокая АИА Рис. 4. Количество (%) штаммов E.coli с Рис. 5. Количество (%) штаммов St. aиreus с различной АИА различной АИА Изучение показателей АИА штаммов St. aиreus показало, что из штаммов, выделенных от животных экспериментальной группы, неактивным оказался каждый десятый штамм, что в 1,5 раза меньше, чем в контроле.
Количество штаммов с низкой АИА уменьшилось до 19 (37,2%), число штаммов со средней степенью инактивировать интерферон практически не изменилось - 12 (24,5%), а штаммов с высокой АИА возросло до 14 (28,3%), или почти в 2,5 раза (рис. 5).
Известно, что при дисбактериозе персистентные характеристики ассоциантов в микробиоценозе не остаются инертными (Бухарин, 2009), и повышение персистентного потенциала условно-патогенной микрофлоры происходит как под действием ассоциантов – симбионтов, при формировании патобиоценозов, так и под воздействием лекарственных средств или других биологических препаратов, например, токсинов бактерий, что было показано в нашем случае.
3.6 Изменение фактора патогенности (адгезивных свойств) штаммов бактерий, выделенных от мышей с экспериментальным дисбактериозом Исследование адгезивных свойств микроорганизмов (табл. 4) показало, что штаммы St. aureus, Enterococcus spp. и E. coli, выделенные от животных экспериментальных групп А и Б на 14 на 28 сутки, не отличались по показателям адгезии от штаммов, выделенных от животных контрольных групп. Штаммы St. aureus и Enterococcus spp., выделенные от животных, получавших растворы токсина в дозе 100 мг/кг веса, имели более высокие показатели адгезивной активности (СПА и К%;
Р0,05) как на 14, так и на сутки эксперимента по сравнению с микроорганизмами контрольных групп, и это четко коррелировало с увеличением их общего содержания в кишечном содержимом животных.
Типичные эшерихии отличались сниженными по сравнению с контрольной группой показателями адгезии по сравнению с контрольной группой (СПА и К%;
Р0,05) на всех сроках проведения эксперимента при применении дозы токсина в 100 мг/кг, что коррелировало со снижением их содержания в кишечнике.
Таблица 4. Адгезивные свойства бактерий, выделенных из биотопа толстого кишечника мышей Сроки Дозы Микроорга введения введения СПА К(%) ИАМ низмы токсинов мг/кг веса Контроль 2,56±0,30 70,40±4, 55 3,60±0, St. aureus 25,0 2,48±0,53 69,85±5,10 3,51±0, 50,0 2,76±0,40 71,20±4, 42 3,78±0, 14 сутки 100,0 3,12*±0,20 78,10*±2,34 4,00±0, 25,0 2,32±0,21 72,40±5,85 3,24±0, 28 сутки 50,0 2,46±0,12 71,51±5,67 3,40±0, 100,0 3,33*±0,24 81,32*±4,56 4,09±0, Контроль 2,30±0,40 62,96±5,13 3,65±0, Enterococcus spp. 25,0 2,42±0,54 64,26±6,09 3,67±0, 14 сутки 50,0 2,48±0,62 65,54±7,18 3,87±0, 100,0 3,28*±0,22 72,5*±3,42 4,51±0, 25,0 2,28±0,56 63,00±4,83 3,59±0, 28 сутки 50,0 2,44±0,45 62,88±6,65 3,80±0, 100,0 3,56*±0,52 74,24*±5,05 4,77±0, Контроль 2,16±0,18 65,34±5,27 3,31±0, E.coli типичные 25,0 2,24±0,33 63,54±9,16 3,52±0, 50,0 2,09±0,35 66,43±7,74 3,15±0, 14 сутки 100,0 1,80*±0,12 55,12*±4,02 3,25±0, 25,0 2,20±0,25 64,35±8,12 3,40±0, 50,0 2,10±0,24 63,43±6,64 3,30±0, 28 сутки 100,0 1,72*±0,10 52,32*±3,08 3,27±0, * Статистически значимые различия с контрольным вариантом (Р0,05, при n = 10) Микроорганизм считался неадгезивным при ИАМ 1,75;
низкоадгезивным — от 1, до 2,5;
среднеадгезивным — от 2,51 до 4,0;
высокоадгезивным при ИАМ выше 4,0.
Отсутствие достоверных различий в численности представителей всех рассматриваемых видов бактерий при воздействии дельта-эндотоксинов в дозах от 25 до 50 мг/кг веса животных в течение всего срока исследования оказалось сопоставимо с отсутствием различий в показателях их адгезии.
Установлена статистически значимая взаимосвязь между адгезивными свойствами бактерий и их количественным содержанием в кишечном содержимом мышей (СПА и Lg КОЕ/г на 14 и 28 сутки исследования;
коэффициент ранговой корреляции Спирмена r=0,54, что указывает на умеренную тесноту связи между этими двумя признаками, при Р0,05).
Таким образом, изменение показателей адгезии микроорганизмов зависело от вида микроорганизма, а также от доз и продолжительности применения растворов дельта-эндотоксинов и могло быть одной из причин количественных изменений в микробиоценозе толстого кишечника животных.
Анализ проведенных исследований по изучению адгезивных способностей гемолитических E.coli, выделенных из толстого кишечника мышей, показал, что большинство штаммов, высеянных из биотипа на 14 сутки эксперимента, обладали среднеадгезивными свойствами, а высеянных на сутки эксперимента - высокоадгезивными. Среднее значение СПА составило 6,04±0,60, что более чем в 2 раза больше, чем в контрольной группе, среднее значение ИАМ составило 7,62±0,53, это в 1,8 раз больше, чем в контроле. При этом среднее количество участвующих в адгезивном процессе эритроцитов было примерно на том же уровне - 79,24±4,30%.
Выявленная в ходе исследований способность гемолитических E.coli активно прикрепляться к поверхности эукариотических клеток доказывает то, что данные микроорганизмы обладают способностью к усилению адгезии в условиях развивающегося под действием дельта-эндотоксинов дисбактериоза, что создает условия для последующей их инвазии в ткани хозяина, что обычно приводит к развитию инфекций.
Таким образом, пероральное введение невысоких доз дельта эндотоксинов B. thuringiensis от 1 до 50 мг/кг веса мышей в течение достаточно длительного времени не оказало существенного влияния на микроорганизмы, входящие в состав микробиоценоза толстого кишечника животных. Негативные изменения наблюдались лишь при применении дозы 100 мг/кг веса.
Тем не менее, следует отметить, что внедрение интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур неизбежно повлечет расширение применения микробиологических средств защиты растений, что приводит обычно к широкомасштабному загрязнению окружающей среды спорами, клетками и метаболитами микроорганизмов. Основными бактериальными загрязнителями при этом являются бактерии рода Bacillus - В. cereus и B.
thuringiensis. Кроме того, существуют риски возможного негативного влияния токсичных трансгенных белков Bt растений, объемы выращивания которых во всем мире постоянно увеличиваются.
Быстрое появление устойчивости к используемым токсинам, в том числе трансгенным, у бактерий и грибов, изменение биологических свойств микроорганизмов, являющихся компонентами различных биотопов, появление резистентности условно-патогенных микроорганизмов к применяемым антибиотикам, а также риски появления новых более патогенных штаммов фитовирусов при взаимодействии их с трансгенными конструкциями – вот неполный список возможных рисков, связанных с действием биопестицидов и Bt трансгенных растений, содержащих белки, обладающие бактерицидной, фунгицидной и инсектицидной активностью.
При оценке возможных экологических и пищевых рисков дальнейшее изучение действия дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на микробиоту различных биотопов теплокровных животных и человека представляется весьма важным.
ВЫВОДЫ 1. Длительное пероральное введение высоких доз дельта-эндотоксинов B.
thuringiensis (100 мг/кг веса) вызвало проявление дисбиотических изменений в микробиоценозе толстого кишечника у 46,7% тестируемых мышей, что проявилось в появление диареи и изменении характера поведения животных.
В контроле и в группах животных, получающих дозы токсина от 1 до 50 мг/кг веса, подобных изменений отмечено не было.
2. При пероральном введении животным токсина от 1 до 50 мг/кг веса в течение 28 суток в биотопе толстого кишечника наблюдалось небольшое, статистически недостоверное уменьшение количества доминирующих видов микроорганизмов и увеличение содержания добавочных и транзиторных условно-патогенных видов.
Использование per os дельта-эндотоксинов в дозе 100 мг/кг уже на 7-е 14-е сутки привело к статистически значимому уменьшению по сравнению с контролем количества доминирующих видов и появлению значительного числа штаммов клебсиэлл, протей, дрожжеподобных грибов рода Candida, Citrobacter spp., Morganella morganii, Y. Еnterocolitica, гемолитических эшерихий и золотистого стафилококка. Выявлено уменьшение доли и индекса встречаемости доминирующих микроорганизмов и увеличение тех же показателей у добавочных и транзиторных видов бактерий.
3. У животных с признаками дисбактериоза чаще высевались штаммы условно-патогенных грамотрицательных энтеробактерий родов E. сoli, Proteus spp., Klebsiellae spp., Citrobacter spp., а в группе условно-патогенных грамположительных бактерий - штаммы Staphylococcus spp. и Enterococcus spp.
Обнаружилось большее количество гемолитических штаммов бактерий родов E. coli и St. aиreus. В микробиоценозе толстого кишечника животных с дисбактериозом выявлены сопряженные таксоны условно-патогенных микроорганизмов - бактерий родов Escherichia- Staphylococcus.
4. Выделенные из кишечника мышей с экспериментальным дисбактериозом гемолитические штаммы E. coli обладали антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам, входящим в состав микробиоты толстого кишечника, со способностью ингибировать рост как близкородственных энтеробактерий, в том числе типичную кишечную палочку, так и неродственных – стафилококков, лактобактерий, протей и клебсиэлл.
5. Установлено увеличение числа штаммов бактерий E. coli и St. aиreus с высокой и средней антилизоцимной и антиинтерфероновой активностью, выделенных от мышей с экспериментальным дисбактериозом, вызванным применением дельта-эндотоксинов B. thuringiensis. Выявлено, что усиление адгезивности St. aureus и Enterococcus spp. и увеличение их общего содержания в кишечном содержимом животных с выраженным дисбактериозом на 14 и сутки исследования имеют четкую корреляцию. Те же дозы токсина приводили к некоторому снижению адгезивности типичных E. coli по сравнению с контрольной группой, что коррелировало со снижением их содержания в кишечнике.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Климентова, Е.Г. Особенности микробиоты толстого кишечника теплокровных животных при дисбактериозе, обусловленном действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis/ Е.Г. Климентова, Л.К. Каменек, А.А. Купцова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. — 2011. — №3 (98)— Выпуск 14. — C.76-84.
2. Климентова, Е.Г. Изменение микрофлоры толстого кишечника у мышей при длительном пероральном введении -эндотоксина Bacillus thuringiensis /Е.Г. Климентова, А.А. Купцова, Л.К. Каменек, В.В. Гулий //Сельскохозяйственная биология. —2011. — №4. – С.115-120.
3. Климентова, Е.Г. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на теплокровных животных/ Е.Г. Климентова, Л.К. Каменек, А.А. Купцова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. — 2011.
— №3 (98)— Выпуск 14/1 — C.334-339.
Публикации в периодических изданиях, сборниках и материалах конференций 4. Каменек, Л.К. Перспективы использования дельта-эндотоксина Ваcillus thuringiensis как агента защиты растений от вредителей и болезней и получения экологически чистой продукции /Л.К. Каменек, Е.Г.
Климентова, Д.В. Каменек, А.А. Купцова, Л.Д. Терехина // Материалы научной конференции «Проблемы защиты растений в условиях современного сельскохозяйственного производства». – 2009. – ВИЗР, СПб.
– С. 71-73.
5. Купцова, А.А. Антибиотическое действие дельта-эндотоксина Ваcillus thuringiensis в отношении некоторых бактерий, входящих в состав микрофлоры кишечника теплокровных животных/ А.А. Купцова, Л.К.
Каменек, Е.Г. Климентова, Д.В. Каменек, Н.А. Феоктистова // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». – 2009. – М.: МАКС Пресс. – C.101.
6. Купцова, А.А. Изменение состава микрофлоры кишечника и биохимических свойств некоторых бактерий рода Escherichia под действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis/ А.А. Купцова //Материалы научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета». – 12 ноября 2009. – Казань:КГУ. – C.71-73.
7. Климентова, Е.Г. Антимикробная активность параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis в отношении бактерий-симбионтов кишечника животных /Е.Г.Климентова, Л.К. Каменек, А.А. Купцова // Любищевские чтения-2010.- Современные проблемы экологии и эволюции. Сборник материалов конференции. –2010. – Ульяновск: УлГПУ. – С. 349-352.
8. Купцова, А.А. Дисбиотические изменения в микрофлоре кишечника теплокровных животных под действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis /А.А.Купцова //Материалы международного молодежного научного форума Ломоносов – 2010. – Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, – М.: МАКС Пресс. – С. 170-171.
9. Климентова, Е.Г. Влияние применения биопестицидов на основе дельта эндотоксина почвенной бактерии Bacillus thuringiensis на теплокровных животных / Е.Г. Климентова, Л.К. Каменек, А.А. Купцова // Сборник материалов IV Всероссийской научной конференции с международным участием. –2010. – Томск: ТМЛ-Пресс. –Т.3. –С. 109-112.
10. Каменек, Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis как перспективный агент защиты растений от вредителей и болезней /Л.К. Каменек, Е.Г.
Климентова, Д.В. Каменек, А.А. Купцова //Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем», Всероссийский НИИ биологической защиты растений. — 21-24 сентября 2010 г. — Краснодар. — C.405-407.
11. Климентова, Е.Г. Экологические аспекты применения препаратов на основе Ваcillus thuringiensis в сельском хозяйстве / Е.Г. Климентова, А.А. Купцова // Материалы VII международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» — 2010. — Минск: «Беларуская навука». — С. 448-450.
12. Климентова, Е.Г. Действие Cry-белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis на микробиоценозы кишечника животных / Е.Г. Климентова, А.А. Купцова, Л.К. Каменек, Н.А. Феоктистова // Сборник материалов всероссийского симпозиума с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее. — 2011. — М.:МАКС Пресс. — С.60.
13. Купцова, А.А. Влияние длительного перорального введения дельта эндотоксинов Bacillus thuringiensis на теплокровных животных /А.А.
Купцова, Е.Г. Климентова, Л.К. Каменек //Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности: Сборник научных трудов научно практического семинара с международным участием. — 2011. — Ульяновск: УлГУ. — C.116-120.
14. Климентова, Е.Г. Действие дельта- эндотоксинов Bacillus thuringiensis на развитие дисбиотических изменений в биотопе толстого кишечника теплокровных животных / Е.Г.Климентова, Л.К. Каменек, А.А. Купцова, В.В. Гулий // Материалы международной научно-практической конференции. Минск, 5-8июля 2011. —2011. — Минск: «Несвиж». — С.
256-261.
15. Климентова, Е.Г. Влияние белков параспоральных кристаллов энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis на видовой состав микрофлоры толстого кишечника белых мышей /Е.Г. Климентова, А.А.
Купцова, Л.К. Каменек // Информационный бюллетень ВПРС МОББ. — 2011. — С. 100-104.