Аммонийокисляющие бактерии и археи в почвах европейской части россии.
На правах рукописи
Черобаева Анна Сергеевна АММОНИЙОКИСЛЯЮЩИЕ БАКТЕРИИ И АРХЕИ В ПОЧВАХ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ.
Специальность 03.02.03. – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, молекулярно-биологические исследования проводились в институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и Абердинском университете.
Научный консультант: доктор биологических наук А. Л. Степанов
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н. Д. Ананьева доктор биологических наук А. Х. Тамбиев Ведущее учреждение: Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А.Тимирязева (РГАУ - МСХА)
Защита диссертации состоится 15 ноября 2011 года в _ в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, д.1, корп. 12, факультет Почвоведения.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «»_2011 года.
Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета или прислать отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, д.1, корп. 12, факультет Почвоведения, Ученый совет.
Ученый секретарь диссертационного совета:
доктор биологических наук, профессор Г.М. Зенова Актуальность темы. Деятельность нитрифицирующих микроорганизмов во многом определяет характер протекания других процессов биологического цикла азота в почвах, их активность является одним из важнейших источников нитратов в почве (Кудеяров, 1999).
Последние достижения молекулярной биологии изменили сложившиеся представления о цикле азота, протекающем в почвах и океанах. Есть основание полагать, что существенный вклад в процесс нитрификации вносят не только автотрофные нитрифицирующие бактерии и гетеротрофные микроорганизмы, но также и недавно открытые аммонийокисляющие археи (Knneke et al., 2005).
Способность к органотрофному и миксотрофному росту свидетельствует о наличии у них более гибкого механизма адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды по сравнению с нитрифицирующими бактериями, что определяет широкое распространение архей в почвах и морских экосистемах (Leininger et al., 2006, Nicol et al., 2006). Из-за сложности методических приемов идентификации, аммонийокисляющие археи в почвах России до настоящего времени остаются мало исследованы.
Целью работы являлось изучение разнообразия нитрифицирующих бактерий, определение численности аммонийокисляющих бактерий и архей в основных типах почв европейской части России методами молекулярной биологии.
Задачи исследования:
сравнить эффективность известных методов выделения ДНК из почв и разработать собственные модификации. Адаптировать ПЦР и ДГГЭ методы для анализа аммонийокисляющих бактерий и архей в разных типах почв.
проанализировать разнообразие микробных сообществ аммонийокисляющих бактерий в накопительных культурах и почвенных образцах.
провести сравнительный анализ численности аммонийокисляющих бактерий и архей в почвах разных типов.
определить влияние температуры на нитрифицирующую активность в ходе длительной инкубации почвенных микрокосмов.
Научная новизна. С помощью филогенетического анализа сообщества нитрифицирующих бактерий установлено близкое родство клонов из дерново подзолистой и серой лесной почв к роду Nitrosospira, из каштановой почвы – Nitrosospira и Nitrosovibrio, из чернозема типичного - Nitrosomonas. На основании анализа реал-тайм ПЦР обнаружена тенденция к увеличению количества нитрифицирующих архей в кислых почвах, а бактерий – в почвах с нейтральным и слабощелочным значениями рН. Впервые показано, что во всех исследованных почвах европейской части России доминирует сообщество аммонийокисляющих архей, причем в ненарушенных экоценозах их количество заметно увеличивается;
в агроценозах возрастает доля нитрифицирующих бактерий. Показано, что независимо от значений рН среды, в почвах всегда обнаруживаются алкалофильные и ацидофильные археи, но в разных соотношениях. Согласно температурному эксперименту, длительные заморозки влияют на нитрифицирующую активность, в то время как кратковременные заморозки не оказывают существенного воздействия на уровень нитрифицирующей активности почв. Установлено, что бактерии более устойчивы к действию низких температур, а состав сообщества архей резко изменяется после длительных заморозков.
Практическая значимость. Отработаны основные методы детекции ключевого функционального гена нитрифицирующих бактерий и архей с помощью спектра молекулярно-биологических методов. Модифицированы ПЦР и ДГГЭ протоколы для анализа сообщества нитрификаторов в разных типах почв европейской части России. Полученные в настоящей работе последовательности генов amoA депонированы в базе данных GenBank под номерами JF 496679–JF 496706. Предложенный методический подход позволяет уточнить составляющие баланса биологического азота в почвах, а также изменения характера трансформации азота в почве в условиях меняющегося климата и высокого антропогенного воздействия на почвы, что необходимо при составлении региональных прогнозов устойчивого развития сельского хозяйства. Результаты работы используются в курсах лекций по микробной трансформации азота, читаемых на факультете почвоведения МГУ.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2011» (МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 2009, 2011), молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Институт микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН, Москва, 2009), Международной конференции по общей и прикладной микробиологии «BioMicroWorld2009» (Португалия, 2009).
Публикации. Материалы диссертации изложены в 3 публикациях, все статьи в реферируемых журналах из списка ВАК, 4 тезисов докладов.
Объем работы: Диссертация изложена на 126 страницах, состоит из 3 глав, сопровождается 23 иллюстрациями и 6 таблицами. Список литературы включает 156 наименований, из которых 135 на иностранном языке.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. А.Л. Степанову за ценные рекомендации и повседневное внимание к работе, к.б.н. И.К. Кравченко и к.б.н. А.К. Кизиловой за научные консультации и помощь в выполнении работы, сотрудникам Абердинского университета (Шотландия, г. Абердин) – проф. Д. Проссеру и Г.
Николь за помощь в освоении молекулярно-биологических методов. Отдельная благодарность к.б.н. Е.В. Лебедевой за предоставление культуры Candidatus Nitrososphaera gargensis и научно-практические рекомендации.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 1. Объекты и методы исследования.
Работа проводилась на четырех типах почв – дерново-подзолистая, серая лесная, каштановая и чернозем типичный (табл. 1). Образцы отбирались в ненарушенных экоценозах лесной зоны (дерново-подзолистая, серая лесная), степной зоны (чернозем, каштановая) и агроценозах (для всех типов почв).
Для поддержания накопительных культур автотрофных нитрифицирующих бактерий вносили 0,1 г почвы в стеклянную колбу объемом мл с 50 мл минеральной среды следующего состава (г/л): (NH4)SO4 – 2;
K2HPO4 – 0,5;
NaCl – 2;
MgSO4·7H2O – 0,2;
FeSO4·7H2O – 0,05;
CaCO3 – 6;
раствор микроэлементов (10.00 мл/100 мл) [19], pH 7,6 (Alef, 1998). Колбы инкубировали в статических условиях при температуре 25°С в течение 2–4 недель.
Часть экспериментов проводили с почвенными микрокосмами. Для этой этого 10 г предварительно просеянной почвы помещали в 30-ти мл универсальные флаконы с закручивающимися крышками и увлажняли дистиллированной водой до 30% от ПВ.
Таблица 1. Некоторые характеристики образцов почв, использованных в настоящей работе.
Место отбора Срок Название почвы, Соб рН Код образца образцов, отбора, материнская Растительность щ, вод координаты глубина порода % Дерново- Лесная опытная Мощнодерновая подзолистая дача слабо - и лесной,РГАУМСХА среднеподзолиста Смешанный 4.6 2. экоценоз им. я на моренном лес Сентяб (ДП эко) К.А.Тимирязева, песке и супеси рь Москва г.
Дерново- Полевая станция Мощнодерновая 5–10 см подзолистая РГАУМСХА им. среднеподзолиста Бессменный агроценоз К.А. я на моренном яровой ячмень 5.3 1. (ДП агро) Тимирязева, песке и супеси с 1912 г.
Москва Серая лесная лесной Вторичный Опытно-полевая 6.5 2. экоценоз лиственный лес Серая лесная опытная станция Ноябрь (СЛ эко) среднесуглиниста ИФХиБПП РАН, 2008 г.
я на лессовидном Серая лесная Пшеница, Пущино,Москов 7–10 см суглинке агроценоз вариант ская область 6.0 1. (СЛ агро) полевого опыта без удобрений Чернозем Воронежская Ковыльно степной область, разнотравно Типичный 6.7 7. экоценоз (ЧЗ Таловский район злаковая степь Июнь чернозем на эко) 2008 г. карбонатных Чернозем Воронежская 5–10 см лессовидных Пшеница, поле агроценоз область, суглинках без внесения 6.2 6. (ЧЗ агро) Таловский район удобрений Каштановая Волгоградская Лугово степной область,Ольховс каштановая почва экоценоз кий р-н,с. на легком Залежь луговая 6.9 4. (КШ эко) Зензеватка, суглинке Июль 2008 г.
5–10 см Каштановая почва Каштановая Волгоградская Бессменная агроценоз область,Ольховс на легком пшеница с 5.5 3. (КШ агро) кий р-н, с. суглинке 2003г.
Зензеватка Температурный эксперимент с замораживанием-размораживанием микрокосмов проводили с образцами двух почв разного физико-химического состава, сходного рН-7,2, из разных климатических зон. Умеренно континентальный климат каштановой почвы (2,89 мкг N-NO3-/г сут, 0,02 мкг N NH4+/г, Собщ 4,9%) характеризуется резким колебанием дневных и ночных температур, а также большой амплитудой колебаний между летними и зимними температурами. Дерновая почва (15,1 мкг N-NO3-/г сут, 1,5 мкг N-NH4+/г, Собщ 5,7%) – из умеренного океанического климата с ровным температурным режимом и редкими заморозками (Шотландия, г. Абердин). Проводили два эксперимента, различающихся длительностью инкубации при низкой температуре. 1) Длительное замораживание (2 недели при -10°С) (рис. 1, А). Отбор проб для анализа: до замораживания микрокосмов на 1-е, 5-е, 7-е сутки, после размораживания – трижды в течение 1-х суток, а затем на 2-е, 3-е, 5-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки. 2) Короткие циклы замораживания-размораживания (три последовательных цикла:
сутки при -10°С и 2-е суток при +30°С) (рис. 1, Б). Отбор проб для анализа: до замораживания микрокосмов на 1-е, 5-е, 7-е сутки, затем на 1-е и 2-е сутки после размораживания для каждого цикла, и на 7-е, 14-е, 21-е сутки завершающей инкубации.
1 5 7 123 5 7 14 А 1 неделя 3 недели +30°С +30°С 2 недели, -10°С 1 5 7 12 12 12 7 14 Б 1 неделя 3 недели +30°С +30°С -10°С Рис. 1. Схема эксперимента с длинными (А) и короткими (Б) циклами замораживания-размораживания микрокосмов. На рисунке: 1,5,7,… - указаны сроки отбора образцов (сутки) для проведения последующего химического и молекулярного анализа почвы из микрокосмов.
Для определения интенсивности нитрификации, образцы почвы (4 г) помещали в пробирки (50 мл, “Labcare”, Великобритания) и добавляли раствор KCl (1М) в соотношении 1:8. Концентрацию нитритов и аммония определяли колориметрически с помощью поточного инъекционного анализа (“FIA star Analyzer”, США).
Для выделения ДНК из накопительных культур микроорганизмов применяли Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США). Суммарную ДНК из почв экстрагировали с помощью PowerSoil DNA, руководствуясь инструкциями производителя.
В работе использованы пять методов выделения ДНК из почвенных образцов, два из которых соответствуют коммерческим протоколам, два разработкам авторов, в один авторский метод внесены собственные модификации.
Метод 1 - коммерческий набор реактивов: ДНК выделяли из почвенного образца массой 0,5 г в соответствии с протоколом производителя Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit («MoBio», США).
Метод 2 - коммерческий набор реактивов. Экстрагировали ДНК из почвенного образца 0,5 г согласно рекомендациям производителя FastDNA spin kit for soil.
(«Qbiogene», Канада).
Метод 3 – авторский протокол С.Итиса с соавт. (Yeates et al., 1998). Основные положения протокола: Масса почвенного образца – 100 г. Объем экстракционного буфера Tris-HCl (100мМ Tris-HCL, 100мМ EDTA, 1,5M NaCl, рН 8,0) – 100 мл.
Механическая обработка: 100 г стеклянных шариков (1мм). Центрифугирование на скорости 5,5 об/мин, 2 мин. Химический лизис: 10 мл 10% раствора SDS, при +65°С, 1 час;
Tris-HCl 10 мин при 65°С. Преципитация: полиэтиленгликоль (PEG) и 1,6 М NaCl, при комнатной температуре 2 часа. 5 мин на льду, центрифугирование - 30 мин, 16.000 g.
Метод 4 – авторская разработка Р. Гриффитса с соавт. (Griffiths et.al., 2000). Для выделения ДНК использовали почвенный образец массой 0,5 г. Экстракционный СТАВ-буфер – 0,5 мл. Для механической обработки применяли 0,5 г силиконовых шариков (0,5 мм) и центрифугирование на скорости 4,0 об/мин, 30 сек. Очистка от белков: фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1). Преципитация: 1,6 M полиэтиленгликоль-6000/NaCl, инкубация в течение ночи при 4°С.
Метод 5 - метод Р. Гриффитса с соавт. (Griffiths et.al., 2005) в собственной модификации. К оригинальному протоколу (Griffiths et.al., 2005) добавили этап начальной инкубации почвы и СТАВ-экстракционного буфера – 2 часа на льду (для улучшения качества преципитации ДНК и РНК). Для почв с высоким содержанием гуматов увеличили объем СТАВ-экстракционного буфера до 0,7 мл. Увеличили время механической обработки образцов на центрифуге до 40 сек, на 5,5. об/мин.
Использовали коммерческий набор (“Qiagen”, MaxTract High Density Великобритания) для улучшения выхода ДНК.
Выделенные препараты почвенной ДНК использовали для амплификации фрагментов 16S рРНК и amoA генов аммонийокисляющих бактерий (АОБ) и архей (АОА) с помощью специфических праймерных систем (табл. 2). Для всех ПЦР реакций объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал однократный ПЦР буфер (17 мМ (NH4)SO4, 67 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 2 мМ MgCl2), 4 мкл dNTP, 30 пмоль каждого из праймеров, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы (“Sigma”, Великобритания).
Количественный анализ состава сообщества нитрифицирующих бактерий и архей проводили при помощи метода реал-тайм ПЦР. Для определения числа копий генов amoA бактерий и архей использовали праймерные системы amoA 1F/amoA-2R (Rotthauwe et al., 1997) и CrenamoA616r/CrenamoA23f (Nicol et al., 2008), соответственно. Для всех ПЦР реакций объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 0,2 мг/мл BSA (“Invitrogen”, Великобритания), 0,9 мкМ каждого праймера и 12,5 мкл 2-х кратного QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (“Qiagen”, Великобритания). В каждую пробирку с реакционной смесью добавляли 5 мкл ДНК анализируемых образцов.
Таблица 2. Описание нуклеотидных праймеров и заданных температурно временных условий ПЦР в данной работе.
Группа Температурно-временные организмов, ПЦР праймеры Источник условия проведения ПЦР гены-мишени 5 мин при 95°С, следующие Протеобактери циклов - 30 с при 94°С, 30 с при и 56°С, 1 мин при 72°С;
25 циклов 341F/907R Muyzer et al., 16S рРНК – 30 с при 92°С, 30 с при 56°С, мин при 72°С;
10 мин при 72°С 5 мин при 95°С, следующие Kowalchuk et al., циклов - 30 с при 94°С, 30 с при CTO189f/CTO АОБ 56°С, 1 мин при 72°С;
25 циклов 4r 16S рРНК Muyzer et al., – 30 с при 92°С, 30 с при 56°С, P3/P мин при 72°С;
10 мин при 72°С 5 мин при 94°С;
следующие АОБ циклов – 45 с при 94°С, 30 с при amoA-1F/ Rotthauwe et. al., фрагмент гена 57°С, 1 мин при 72°С;
7 мин при amoA-2R amoA 72°С 5 мин при 95°С;
следующие циклов - 30 с при 94°С, 30 с при Lane, Crenarchaeota A 109f/1492 r 57°С, 1 мин при 72°С;
25 циклов Ochsenreiter et al., 16S рРНК 771f /957r – 30 с при 92°С, 30 с при 57°С, 1 мин при 72°С;
2 мин при 72°С 5 мин при 95°С, следующие АОА циклов - 30 с при 94°С, 30 с при CrenamoA23f/ фрагмент гена 57°С, 1 мин при 72°С;
25 циклов Nicol et al., CrenamoA616r – 30 с при 92°С, 30 с при 57°С, amoA мин при 72°С;
8 мин при 72°С ДГГЭ анализ проводили с ампликонами 16S рРНК и amoA генов аммонийокисляющих бактерий и архей, использовали гели, содержащие 8% (вес/объем) полиакриламида и разные проценты линейного градиента денатурантов - формамида и мочевины (табл. 3). ДГГЭ анализ выполняли на приборе DCode Universal Mutation Detection System (“Bio-RAD”, США). Были заданы следующие условия ДГГЭ: электрофорез в 6,5 л 0,5ТАЕ буфере при постоянной температуре 60°С в течение 900 мин и напряжении 75 В. Дальнейшие процедуры окрашивания нитратом серебра выполняли согласно ранее описанной методике (Kowalchuk et al., 1997), для сканирования использовали сканер Epson GT9600.
Таблица 3: Описание используемых праймеров и условий проведения ДГГЭ для каждой группы микроорганизмов.
Группа Процент линейного организмов, ПЦР праймеры ДГГЭ протокол градиента гены-мишени денатурантов CTO189f/CTO654r Muyzer et al., АОБ 35-70% 16S рРНК P3 (357f-GC) / P2(518r) Kowalchuk et al., АОБ Rotthauwe et. al., фрагмент гена amoA-1F/amoA-2RT-ТG 45-65% Okano et al., amoA A109f /1492r Lane, АОА Ochsenreiter et al., 2003 35-65 % 16S рРНК 771f /957r-GC АОА CrenamoA23f/Crenamo фрагмент гена A616r Nicol et al., 2008 15-60% (без GC клампа) amoA Метод молекулярного клонирования применяли для анализа состава сообщества нитрифицирующих бактерий. Предварительно очищенные ПЦР продукты использовали для трансформации компетентных клеток E.coli DH10B с помощью коммерческого набора реактивов pGEM-T Easy vector system I (“Promega”, США). Создание клонотеки проводили путем отбора случайным образом 50 колоний с положительной реакцией. Затем для каждой колонии была поставлена ПЦР реакция с универсальными плазмидными праймерами M13F и M13R и наличие вставки оценивали методом агарозного электрофореза. ПЦР продукт, полученный после амплификации из колонии, очищали с помощью кита Ultra Clean PCR CleanUp (“MO BIO”, США) согласно рекомендациям производителя. Секвенирование проводили в сервисной лаборатории с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v. 3 (“Applied Biosystems Inc.”, США). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей был проведен с помощью программного пакета BLAST[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]. Редактирование и выравнивание нуклеотидных последовательностей производили при помощи пакета программ редактора BioEdit [http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit.html].
Транслированные белковые последовательности обрабатывали с помощью программы TREECONW [http://bioc-www.uia.ac.be/u/yudp/treeconw.html] для построения дендрограммы, отражающей степень сходства анализируемых и референтных последовательностей гена amoA.
Полученные в настоящей работе последовательности генов amoA были депонированы в базе данных GenBank под номерами JF 496679–JF 496706.
ГЛАВА 2. Результаты и обсуждения Оптимизация молекулярно-биологических методов для анализа 1.
аммонийокисляющих бактерий и архей в зональных почвах.
С целью подбора оптимального протокола для каждого изучаемого типа почвы мы проверили пять методов выделения ДНК из почвенных образцов.
Использование коммерческих реактивов позволило стабильно получать препараты ДНК из всех образцов почв, причем в лесных и степных экоценозах концентрация ДНК достигала от 20 до 30 мкг/г сухой почвы. Менее эффективным этот метод оказался в отношении чернозема типичного и каштановой почвы (табл.4).
Для повышения выхода препарата ДНК из чернозема типичного, применялся метод С. Итиса с соавт. (Yeates et al., 1998) с использованием большой навески почвы, интенсивной механической обработки и длительного периода преципитации ДНК. Метод повысил концентрацию ДНК в препарате из чернозема типичного, но отличался низкой воспроизводимостью и не использовался в дальнейших исследованиях. С помощью метода Р. Гриффитса (Griffiths et al., 2000), известного как способа более мягкой экстракции ДНК с минимизацией механической обработки и щадящего химического лизиса, были получены препараты с высоким содержанием ДНК только из дерново-подзолистой и серой лесной почвы, также из этих почв удалось выделить РНК. Мы предприняли попытку модифицировать метод Р. Гриффитса (Griffiths et al., 2000), изменив процедуры экстракции, гомогенизации и применили коммерческий набор MaxTract High Density (“Qiagen”, Великобритания), что в целом увеличило выход ДНК для ряда почв с высоким содержанием гумуса. Особенно успешной наша модификации оказалась в отношении чернозема типичного и серой лесной почвы из ненарушенных экоценозов.
Таблица 4: Значения концентрации препарата ДНК, выделенного разными методами.
Концентрация препарата ДНК (мкг/г сухого веса) Код образца Метод 1а Метод 2б Метод 3в Метод 4г Метод 5д ДП эко 10.4 ± 9.3 29.3 ± 1.3 18.3 ± 0.2 246.7 ± 2.5 25.5 ± 5. ДП агро 9.8 ± 8.7 12.4 ± 11.1 13.4 ± 2.5 4.3 ± 3.8 30.7 ± 8. СЛ эко 11.2 ± 9.5 21.4 ± 11.9 20.9 ± 4.2 13.5 ± 7 104.3 ± СЛ агро 10.6 ± 7.2 12.9 ± 11.1 14.6 ± 2.8 90.0 ± 6.3 15.5 ± 6. ЧЗ эко 8.4 ± 5.8 15.6 ± 9.5 34.7 ± 8.1 0.3 ± 0.1 35.2 ± 3. ЧЗ агро 6.9 ± 7.4 10.3 ± 7.6 29.5 ± 5.0 0.6 ± 0.2 66.4 ± 2. КШ эко 8.6 ± 8.3 16.2 ± 9.5 23.7 ± 1 26.2 ± 6.3 16.3 ± 9. КШ агро 12.6±10.03 24.8±2. 7.9±7.8 7.3±0.5 5.8±6. Представленные нами результаты по эффективности пяти разных методов выделения ДНК показывают, что с помощью коммерческого набора реактивов FastDNA spin kit for soil («Qbiogene», Канада) можно стабильно получать продукт средней концентрации 10-20 мкг/г из всех изучаемых почв, независимо от количества гуминовых кислот, органических веществ, глинистых минералов и уровня рН.
Первым этапом проверки качества препарата ДНК являлся метод «вложенной» или nested PCR на фрагменты рибосомальных генов, он успешно использовался для детекции аммонийокисляющих бактерий из препаратов ДНК, выделенных коммерческим набором реактивов. Метод Р. Гриффитса (Griffiths et и наша модификация давали стабильные продукты для al., 2000) аммонийокисляющих бактерий (рис. 2, Б, Г), но значительную вариабельность сигнала при анализе сообщества аммонийокисляющих архей в почвах, богатых гумусовыми веществами и глинистыми минералами (Рис.2, Ж).
Более чувствительный метод ПЦР для детекции функциональных генов выявил, что способ выделения ДНК не влияет на качество продуктов гена amoA бактерий (Рис.3,А) однако присутствие гуминовых кислот и глинистых минералов ингибирует амплификацию функционального гена архей в черноземе типичном и каштановой почве, независимо от способа выделения ДНК (рис.3, Б, В, Г).
Рис.2. Результаты 2-х этапного «nested» ПЦР анализа фрагмента гена 16S рРНК АОБ (А,Б,В,Г,Д) и АОА (Е,Ж). (А, В, Е) – 1-й этап ПЦР анализа;
(Б, Г, Д, Ж) – 2-й этап ПЦР анализа. Для всех: Ч – чернозем типичный, К – каштановая почва, С – серая лесная почва, Д – дерново-подзолистая почва;
1 – агроценоз, 2 – ненарушенный экоценоз;
ОК – отрицательный контроль, М – маркер молекулярного веса ДНК (1000 пн), мет. – метод.
А мет.2 Б мет. В мет.4 Г мет. Рис.3. Результаты ПЦР анализа фрагмента функционального гена amoA АОБ (А) и АОА (Б, В, Г). Ч – чернозем типичный, К – каштановая почва, С – серая лесная почва, Д – дерново-подзолистая почва;
1 – агроценоз, 2 – ненарушенный экоценоз;
ОК – отрицательный контроль, М – маркер молекулярного веса ДНК (1000 пн), мет. – метод.
Полученные ПЦР – продукты успешно использовались для ДГГЭ анализа 16S рРНК генов (рис. 4). Оказалось, что способ выделения препарата ДНК значительно влияет на качество ДГГЭ профиля при анализе аммонийокисляющих архей. На диаграмме четко прослеживается уменьшение числа полос и их интенсивности при использовании метода Р. Гриффитса (Griffiths et al., 2000), по сравнению с коммерческим набором. С другой стороны, независимо от метода, которым выделяли ДНК, продукты амплификации с бактериальными праймерами всегда давали четкие полосы и максимальное разделение ДНК разных микроорганизмов в образце.
С1 С2 Ч1 Ч2 К1 К2 Д1 Д К 1 К2 Ч1 Ч2 С1 С2 Д1 Д С1 С2 К1 К2 Д1 Д2 Ч1 Ч Рис.4. Результаты ДГГЭ анализа фрагмента гена 16S рРНК АОБ и АОА с препаратом ДНК, выделенным разными способами. Слева – ДГГЭ профили, справа – диаграмма, построенная на основании анализа пиков интенсивности ДГГЭ полос с помощью Quantity One (version 4.5.0, BioRad). Ч – чернозем типичный, К – каштановая, С – серая лесная, Д – дерново-подзолистая почвы;
1 – агроценоз, 2 – экоценоз.
Таким образом, анализ сравнительных характеристик разных протоколов подтверждает правильность использования единого метода выделения ДНК для анализа сообществ бактерий и архей в разных почвах. Несмотря на значительную эффективность авторских протоколов в отношении отдельных почв, стабильным и универсальным методом выделения ДНК для всех почвенных образцов был признан коммерческий набор реактивов FastDNA spin kit for soil.
2. Сиквенсный и филогенетический анализ клонотек фрагментов гена amoA бактерий, полученных из почвенных образцов и накопительных культур.
Для ПЦР-продуктов были созданы библиотеки клонов фрагментов гена методом молекулярного клонирования, полученные фрагменты amoA проанализированы методом ферментативной рестрикции и объединены в рестрикционные группы, представители которых были секвенированы, в результате составлено дерево родства по фрагментам функционального гена amoA (рис.5). Работа проводилась на почвенных образцах зональных почв европейской части России и стабильных накопительных культурах нитрификаторов из этих почв, поддерживаемых в течение 1,5 лет. Полученные результаты продемонстрировали значительные различия в составе нитрифицирующих бактериальных сообществ почв различных почвенно-климатических зон.
Интересно отметить, что все клоны, выделенные из агроценоза дерново подзолистой почвы сосредоточены в одном кластере (Кластер 3), а клоны, выделенные из ненарушенного экоценоза присутствуют сразу в трех кластерах.
Это указывает на большее разнообразие нитрифицирующих бактерий в лесных фитоценозах, по сравнению с агроценозами. Другой важный вывод основан на встречаемости клонов из накопительных культур в разных кластерах, не сходных с положением клонов почв, из которых они были выделены (как, например, для серой лесной почвы). Данный факт свидетельствует о том, что для более полного анализа сообщества нитрификаторов необходимо проводить параллельный анализ, как почвенных образцов, так и накопительных культур. Установлено, что нитрифицирующие бактерии, представленные в меньшей концентрации в почвах, и не детектируемые методом молекулярного клонирования, могут быть изучены в накопительных культурах, где они представлены в большей концентрации. На основании филогенетического анализа сделан вывод о том, что в кислых почвах присутствуют бактерии рода Nitrosospira, в нейтральных и слабощелочных почвах – (причем в каштановой почве Nitrosospira, Nitrosovibrio, Nitrosomonas преобладают бактерии рода Nitrosospira, Nitrosovibrio;
в черноземе типичном – Nitrosomonas). Показано, что состав сообщества нитрификаторов в ненарушенных экоценозах более разнообразный, чем в агроценозах.
Рис.5. Дендрограмма, построенная на основе анализа транслированных аминокислотных последовательностей фрагмента гена amoA. Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом. Масштаб соответствует 10 аминокислотным заменам на 100 аминокислотных остатков. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap"-анализа 500 альтернативных деревьев (значимые значения более 50): Chestnut 4 (CHE-4) – каштановая, степь, Chestnut 1 – агроценоз;
Podzol forest (CHE-2) - дерново-подзолистая, лес, Podzol-agro – агроценоз;
Chernozem (CHE-3) – чернозем типичный, степь;
Gray-forest (CHE-5) – серая-лесная, лес, Gray-forest (CHE-6) – степь. CHE (2,3,4,5,6) – накопительные культуры.
3. Количественный анализ сообщества аммонийокисляющих бактерий и архей с помощью метода реал-тайм ПЦР.
Анализ методом ПЦР в режиме реального времени показал, что во всех основных типах почв европейской части России преобладает сообщество аммонийокисляющих архей. Причем количество архейных генов amoA на один-два порядка превосходило число бактериальных (табл. 5). Отмечена тенденция к увеличению содержания архей в ненарушенных экоценозах, а бактерий - в агроценозах. Численность аммонийокисляющих бактерий наиболее низкая в дерново-подзолистой и серой лесной почвах, несколько выше в каштановой почве, наиболее многочисленны бактерии в черноземе типичном.
Таблица 5: Количество копий гена amoA на 1 г почвы, определенное при помощи реал-тайм ПЦР.
Тип почвы Группа (число копий гена amoA) организмов ДП эко ДП агро СЛ эко СЛ агро ЧЗ эко ЧЗ агро КШ эко КШ агро АОА 8 8 8 6 8 8 8 3.0510 1.2310 7.910 7.0310 2.4510 0.9710 5.9410 7. АОБ 6 6 6 6 7 7 6 1.8210 3.0210 1.5510 410 1.5510 3.6610 7.9310 1. Представленные нами результаты согласуются с ранее опубликованными данными, приведенными в работе М.М. Умарова, А.В. Куракова и А.Л.
Степанова «Микробиологическая трансформация азота в почве» (Умаров и др., где также отмечено возрастание количества автотрофных 2007), нитрифицирующих бактерий 1-ой фазы в хорошо окультуренных почвах и низкая плотность бактерий в кислых почвах под лесом. Согласно нашим данным, в кислых почвах, на фоне минимальной численности бактерий, возрастает количество аммонийокисляющих архей, это может объяснить высокий уровень нитрификации в кислых почвах европейской части России (рис.6).
Широкое распространение архей в кислых почвах основано на наличии у них более гибкого механизма адаптации по сравнению с бактериями и способности к миксотрофному росту. Резкое снижение численности архей зафиксировано в сельскохозяйственных почвах чернозема типичного, где бактерии более успешно конкурируют за субстрат. Таким образом, с помощью количественного анализа реал-тайм ПЦР показано, что количество архей возрастает в ненарушенных экоценозах, а бактерий – в агроценозах, разница в соотношении числа бактерий и архей наибольшая в кислых почвах и затем уменьшается по мере увеличения рН почвы. Впервые показано численное преобладание аммонийокисляющих архей во всех основных типах почв европейской части России. Очевидно, что при дальнейшей оценке нитрифицирующей активности в зональных почвах следует учитывать вклад в этот процесс не только автотрофных бактерий и гетеротрофных организмов, но также аммонийокисляющих архей.
Рис.6. Сравнительный анализ числа копий гена amoA АОБ и АОА по результатам метода реал-тайм ПЦР. ЧЗ – чернозем типичный, КШ – каштановая почва, СЛ – серая лесная почва, ДП – дерново-подзолистая почва;
агро – агроценоз, эко – ненарушенный экоценоз.
4. Изучение состава сообщества аммонийокисляющих архей на основе ДГГЭ анализа фрагмента функционального гена amoA.
С помощью ДГГЭ анализа функционального гена архей были получены интенсивные и четко разделенные полосы на геле (рис.7, А). Проводилось сравнение положения детектированных полос на геле с положением полос ДГГЭ маркера, составленного Г. Николь с соавт. (Nicol et.al., 2008). Анализ показал, что в каштановой почве доминируют полосы, соответствующие группе архей, выделяемых исключительно из щелочных почв, но также здесь в виде минорного компонента присутствует группа «архей из кислых почв» (рис. 7, Б). В дерново подзолистой почве детектируется группа архей, представители которой населяют исключительно кислые почвы с рН ниже 4,9, но также в дерново-подзолистой почве проявляются полосы, соответствующие группе «архей из щелочных почв».
Следовательно, независимо от значений рН среды, в почвах всегда присутствуют гены алкалофильных и ацидофильных архей, но в разных соотношениях: в кислых почвах преобладают строго ацидофильные виды, но также есть алкофилы;
в щелочных - доминируют алкофильные виды и встречаются ацидофильные археи.
Кэ Сэ Са Ча Дэ Чэ Да Ка М Кэ Сэ Са Ча Дэ Чэ Да Ка Б А Рис.7. Результаты ДГГЭ анализа АОА с использованием ПЦР-продуктов фрагмента гена amoA (A). Сравнительный анализ (Б) полученных фингерпринтов с полосами маркера – М (Nicol et al., 2008): i-vi – основные филогенетические группы АОА (Nicol et al., 2008): vi,i – кластер архей, выделяемых из почв с рН 7.5, ii – рН от 7. до 4.9, iii – рН 7.5, iv-v – рН 4.9. ДПэ– дерново-подзолистая почва, лес, ДПа – агроценоз;
;
СЛэ – серая лесная почва, лес, СЛа – агроценоз;
ЧЗэ – чернозем типичный, степь, ЧЗа – чернозем типичный, агроценоз;
Кэ – каштановая почва, степь, Ка – агроценоз.
5. Влияние длительных и коротких циклов замораживания-размораживания почвы на нитрифицирующую активность аммонийокисляющих микроорганизмов.
Отработанные методы применялись для анализа изменений в структуре сообщества бактерий и архей в ходе инкубационного эксперимента с длительными и короткими циклами замораживания-размораживания почвы. Актуальность подобного рода эксперимента продиктована ограниченностью сведений об откликах аммонийокислящих бактерий и архей на резкие понижения температуры, а также участившимися периодами оттепелей и заморозков вследствие глобального потепления климата. Результаты проведенного эксперимента с каштановой и дерновой почвой из двух разных климатических зон (см. описание эксперимента в гл.1) показали, что замораживание почвы на длительный срок повлияло на уровень нитрификации, в то время как циклическое замораживание-размораживание почвы не оказало существенного воздействия на нитрифицирующую активность (рис.8).
Следовательно, молекулярно-биологический анализ проводился только для эксперимента с длительным замораживанием микрокосмов, так как изменения активности здесь были более явными. Были получены ПЦР–продукты из препарата ДНК двух типов почв, с более четкой детекцией фрагмента гена amoA в дерновой почве. ДГГЭ анализ не выявил различий в составе сообщества бактерий после длительного замораживания почвы (рис.9, А, В). Однако длительная заморозка значительно повлияла на состав сообщества архей, причем только в дерновой почве (рис.9, Г). На ДГГЭ профиле четко прослеживается выпадение целых групп архей после замораживания микрокосмов, также изменяется состав сообщества в контроле на фоне длительной инкубации при положительной температуре. При этом состав сообщества аммонийокисляющих бактерий не изменялся.
А П П П Р1с Р1с Р1с Р1с Р Р Р Р Р Р 1с 5с 7с (2ч) (6ч) (12ч) (24ч) 2с 3с 5с 7с 14с 21с Время (сутки) Б П П П Ц1 Ц1 Ц2 Ц2 Ц3 Ц3 Р Р Р 1с 5с 7с 1с 2с 1с 2с 1с 2с 7с 14с 21с Время (сутки) Рис.8. Изменение нитрифицирующей активности в ходе эксперимента с длительными (А) и короткими циклами замораживания-размораживания (Б) почвы:
УКК – каштановая почва (из умеренного океанического климата), УОК – дерновая почва (из умеренного океанического климата);
П – предъинкубационный период до замораживания почвы;
Ц – номер цикла замораживания-размораживания;
Р – размораживание почвы при +30°С после последнего цикла;
1с, 5с, 7с… обозначены сроки отбора образцов.
Рис.9. Результаты ДГГЭ анализа фрагментов гена amoA аммонийокисляющих бактерий (А, В) и архей (Б, Г) в микрокосмах каштановой почвы (А, Б) и дерновой почвы (В, Г): 1 – образец, взятый перед началом эксперимента с замораживанием почвы, 2 – первая неделя после воздействия холодом, 3 – две недели после воздействия холодом, 4 – образец, взятый перед началом установки контрольных микрокосмов, 5 – последняя неделя инкубации контрольных микрокосмов.
ВЫВОДЫ 1. Адаптированы для работы с почвами разных типов основные методы молекулярно-биологической детекции ключевого функционального гена аммонийокисляющих бактерий и архей. Модифицированы ПЦР и ДГГЭ протоколы для анализа сообщества нитрифицирующих архей и бактерий в почвах европейской части России.
2. Показано, что в дерново-подзолистой и серой лесной почвах среди аммонийокисляющих бактерий доминируют представители рода Nitrosospira, в каштановой почве - Nitrosospira и Nitrosovibrio, в черноземе типичном Nitrosomonas.
3. Впервые установлено количественное преобладание генов нитрифицирующих архей в основных типах почв европейской части России. Отмечена тенденция к увеличению количества нитрифицирующих архей в почвах ненарушенных экоценозов, а бактерий – в агроценозах.
4. Доля нитрифицирующих архей наиболее высока в кислых почвах (рН 4.5-5.5);
по мере роста рН увеличивается численность аммонийокисляющих эубактерий.
5. Обнаружена разная устойчивость нитрифицирующих архей и бактерий к воздействию низких температур: бактерии более устойчивы к резким колебаниям температуры, а состав сообщества архей в этих условиях значительно меняется, особенно в почвах, не подверженных продолжительным заморозкам.
6. При анализе нитрифицирующей активности в почвах России, предложено наряду с традиционными микробиологическими, применять и молекулярно-биологические методы для оценки вклада в процесс нитрификации не только автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов, но также нитрифицирующих архей.
Основные положения диссертации изложены в следующих работах:
1. Черобаева А.С., Кизилова А.К., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Молекулярный анализ разнообразия нитрифицирующих бактерий в почвах лесной и степной зоны европейской части России // Микробиология, 2011, V. 80, № 3, с. 389-395.
2.Черобаева А.С., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Сравнительный анализ эффективности методов выделения почвенной ДНК для изучения разнообразия аммонийокисляющих бактерий и архей методом ПЦР-ДГГЭ // Вестник Московского университета, 2011, Сер. 17, № 2, с. 9-17.
3. Черобаева А.С., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Отклик аммонийокисляющих бактерий и архей на резкие изменения температуры в почвах разных климатических зон // Проблемы агрохимии и экологии, 2011, № 3, с. 17-24.
Черобаева А.С., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Нитрифицирующие 4.
микроорганизмы в почвах европейской части России // Материалы V Международной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», изд-во Макс-Пресс, 2009,с. 90-91.
Черобаева А.С., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Разнообразие 5.
нитрифицирующих микроорганизмов в разных типах почв европейской части России // Материалы международной конференции окружающей, III индустриальной и прикладной микробиологии «BioMicroWorld», изд-во BioMicroWorld, 2009, с. 224.
Черобаева А.С., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Состав сообщества 6.
нитрифицирующих микроорганизмов в накопительных культурах и почвах европейской части России // Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2010», изд-во Макс-Пресс, 2010, с.
80.
7. Черобаева А.С., Степанов А.Л., Кравченко И.К. Количественный анализ сообщества нитрифицирующих бактерий и архей в почвах европейской части России // Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2011», изд-во Макс-Пресс, 2011, с. 90-91.