Салем выявление и дифференциация возбудителей коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней методом мультиплексной полимеразной цепной реакции
На правах рукописи
АБИД Набиль Бен Салем ВЫЯВЛЕНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОРОНАВИРУСНОЙ И РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ СВИНЕЙ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 03.00.06 «Вирусология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владимир – 2007
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир Научный руководитель – кандидат биологических наук Прохватилова Лариса Борисовна
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук Сухарев Олег Иванович, Российский университет Дружбы Народов, г. Москва;
доктор биологических наук, старший научный сотрудник Глобенко Людмила Алексеевна, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.
Ведущая организация – ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров Владимирской области)
Защита диссертации состоится «25» декабря 2007г. в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Автореферат разослан «22» ноября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г. М. Семенова 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Желудочно-кишечные заболевания новорожденных поросят наносят большой экономический ущерб странам с развитым свиноводством. Высокая патогенность возбудителей данных заболеваний, их устойчивость во внешней среде, способность к персистенции в организме хозяина приводит к быстрому распространению этих болезней.
Возбудителями желудочно-кишечных заболеваний являются инфекционные агенты различной природы: вирусной (коронавирусный, ротавирусный и энтеровирусный гастроэнтериты);
бактериальной (дизентерия, сальмонеллез, колибактериоз и др.);
грибковой (кандидамикоз) и паразитарной (балантидиоз, эймериоз и криптоспоридиоз) [www.pighealth.com/diseases/DIARRHEA.HTM, 2007].
К коронавирусам свиней относятся трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГЭС), эпидемическая диарея свиней (ЭДС), респираторный коронавирус свиней (РКВС) и гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней. Из них только ТГЭС и ЭДС могут вызывать желудочно-кишечную патологию [P. Debouck and M. Pensaert, 1980;
K. Harada et al., 1963].
Кроме коронавирусов к данной группе патогенов можно отнести ротавирус свиней (РВС). В настоящее время известно 7 групп ротавирусов:
А, B, C, E, D, F и G [M.E. Conner et al., 1994;
L.J. Saif, 1990;
K.W. Theil, 1990], из которых первые 4 выделяются от свиней с диарейным синдромом [М.К.
Estes, 1990].
Для вирусных диарей характерно сходство клинических признаков, патоморфологических изменений и эпизоотологических особенностей.
Поражается обычно тонкий отдел кишечника – эпителиальные клетки ворсинок и микроворсинок, что приводит к нарушению пристеночного пищеварения, транспорта ионов и всасывания. Развиваются диареи, обезвоживание, истощение, что и вызывает падеж, особенно среди новорожденных поросят [O. Kim and C. Chae, 2003;
K.W. Theil et al., 1978;
L.
Vellenga et al. 1988]. Учитывая сходство в течении заболевания, важную роль играет своевременная и точная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики.
Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия (ЭМ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция нейтрализации (РН), не всегда обладают достаточной чувствительностью. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), главным достоинством которой является специфичность, чувствительность. Кроме этого, мультиплексный вариант ПЦР является быстрым методом для выявления нескольких возбудителей в одной реакции. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вирусов. Однако метод выявления и дифференциации вирусов этой группы не был разработан в Российской Федерации.
Перечисленные обстоятельства явились основанием при определении темы диссертационной работы.
Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка метода выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РВС и ЭДС в вируссодержащих образцах с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- провести сравнительный анализ первичной структуры известных штаммов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС;
- сконструировать синтетические олигонуклеотиды, позволяющие выявлять фрагменты генома указанных вирусов в мультиплексной полимеразной цепной реакции;
- разработать метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции;
- установить первичную структуру амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС;
- провести сравнительный анализ первичной структуры фрагментов генома полевых изолятов данных вирусов.
- изучить возможность применения разработанного метода для выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС в материалах от естественно инфицированных или экспериментально зараженных этими вирусами свиней, а также в культуральных вируссодержащих материалах.
Научная новизна и теоретическое значение. Разработан метод выявления и дифференциации вирусов коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней в образцах вируссодержащего материала с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Впервые определена нуклеотидная последовательность уникального фрагмента генома в полевых изолятах вируса ЭДС, выделенных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры фрагмента гена М данных изолятов вируса ЭДС. Доказано, что выявленные изоляты содержали нуклеотидные замены в трех позициях гена М. Эти замены отсутствуют у других штаммов вируса ЭДС, нуклеотидные последовательности которых депонированы в Genbank.
Нуклеотидные последовательности фрагмента гена М выявленных нами изолятов вируса ЭДС были депонированы в международной базе данных Genbank под номерами доступа: EU167541, EU179721, EU179722, EU179723, EU179724, EU179725, EU179726, EU179727, EU179728, EU179729, EU и EU179731.
С использованием разработанного метода определена нуклеотидная последовательность фрагментов геномов полевых изолятов РВС и ТГЭС, выделенных на территории РФ.
Изучены вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами ТГЭС, РВС и ЭДС.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработана «Методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции» (2007г.), которая позволяет выявлять и дифференцировать корона- и ротавирусы свиней в патологических и культуральных вируссодержащих материалах.
Методика прошла комиссионные испытания, рассмотрена и одобрена ученым советом, утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ».
Основные положения, выносимые на защиту:
- метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС, основанный на амплификации консервативных участков геномов указанных вирусов в ПЦР;
- результаты оптимизации условий проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции при выявлении и дифференциации коронавирусов и ротавируса свиней;
- первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов ТГЭС, ЭДС и РВС;
- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и изолятов коронавирусов и ротавируса свиней;
- результаты применения разработанного метода выявления и дифференциации указанных вирусов в материалах от естественно инфицированных и экспериментально зараженных этими вирусами свиней, а также в культуральном вируссодержащем материале.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005- гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, одна из них опубликована в журнале “Ветеринарная патология”, который предусмотрен перечнем ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования: материалы и методы, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 236 источников, в том числе 24 на русском языке и зарубежных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы Биологические материалы. В работе были использованы вирулентный культуральный штамм «Ленинградский», аттенуированный культуральный штамм «Краснодонский» вируса ТГЭС и производственный модифицированный культуральный штамм «КР-47» вируса РВС, депонированные во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемые в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ) под регистрационными номерами «Ленинградский-ВНИИЗЖ-ДЕП», «Краснодонский-ВНИИЗЖ-ДЕП» и «КР-47-ВНИИЗЖ-ДЕП», соответственно.
Ферменты. В работе были использованы следующие ферменты:
- РНК-зависимая ДНК-полимераза из вируса миелобластоза птиц (Promega, США);
- Taq-ДНК-полимераза (СибЭнзим, Новосибирск);
- Олигонуклеотиды для ПЦР (ЗАО «Синтол», Москва, Россия).
Реактивы. В работе использовали следующие реактивы:
- гуанидин тиоцианат (ГТЦ) (Promega, США);
- минеральное масло «Маркол-52» (Esso,Франция);
- трис-(гидроксиметил)-аминометан (Serva, США);
- этилендиаминтетрауксусная кислота (динатриевая соль) (Serva, США);
- агароза (Promega, США);
- бромистый этидий (Sigma, США);
- маркер молекулярных весов Х174/HaeIII (Fermentas, Литва).
2.2. Методы Выделение суммарной РНК. Суммарную РНК из культуральной вируссодержащей суспензии и патологического материала от животных выделяли по методу Грибанова О.Г. (1997) с модификациями. Суспензию (10%) гомогената ткани стенок кишечника или фекалий в объеме 100 мкл помещали в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и смешивали с мкл раствора 4 М ГТЦ, тщательно перемешивали на вортексе и инкубировали при 56оС в течение 10-15 мин. К смеси добавляли 300 мкл 96% этанола, перемешивали переворачиванием несколько раз и пропускали через стекловолокнистые фильтры GF/F под вакуумом. Фильтры три раза промывали 80% этанолом (по 700-800 мкл). Остатки этанола удаляли центрифугированием в течение 30 с при 10000 g. После центрифугирования фильтры переносили в чистые пробирки, добавляли 50-100 мкл деионизированной воды и центрифугировали при 10000 g в течение 15 с, при этом раствор РНК оставался на дне пробирок. Полученную таким образом РНК хранили в течение дня при температуре +4 оС или замораживали при -20 оС для дальнейшего использования.
Денатурация дцРНК. Поверх раствора РНК (3 мкл) наслаивали 20 мкл минерального масла и денатурировали прогреванием при 85оС в течение мин, после чего быстро охлаждали на льду.
Обратная транскрипция. В пробирку с денатурированной РНК добавляли реакционную смесь, содержащую 5 мкл 5Х буфера для РНК зависимой ДНК-полимеразы, dNTP до конечной концентрации 1мМ, по пмоль праймеров S1-S2, M1-M2 и P1-P2, 1,25 ед. РНК-зависимой ДНК полимеразы и деионизированную воду до конечного объема 25 мкл.
Обратную транскрипцию проводили при температуре 42оС в течение 40 мин.
Реакцию остановливали прогреванием при 94оС в течение 3 мин.
Мультиплексная полимеразная цепная реакция (мПЦР). Первый этап мПЦР (амплификацию) осуществляли в реакционной смеси следующего состава: 3 мкл продуктов обратной транскрипции, по 5 пмоль праймеров, MgCl2 до конечной концентрации 3 мМ, 200 мкМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 2,5 мкл 10х буфера для Таq-полимеразы, и деионизированная вода до объема 25 мкл. Сверху наслаивали 20 мкл минерального масла. Амплификациию проводили при следующих температурных режимах:
- один цикл: при 94С в течение 4 мин;
- сорок циклов: при 94С – 1 мин, 60С – 1 мин и 72С – 1 мин;
- один цикл: при 72С в течение 5 мин.
Для проведения второго этапа мПЦР (реамплификации) использовали продукты амплификации (по 2 мкл). При этом реакционная смесь имела тот же состав. Реамплификацию проводили при следующих температурных режимах:
- один цикл: при 94С в течение 4 мин;
- тридцать циклов: при 94С – 30 с, 60С – 30 с и 72С – 1 мин;
- один цикл: при 72С в течение 5 мин.
Электрофорез в агарозном геле. 3 мкл продуктов реамплификации смешивали с 1 мкл буфера для нанесения проб и вносили в лунки 2% агарозного геля. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА в течение 15 20 мин.
Анализ полученных результатов. Размер фрагментов ДНК, полученных в мПЦР, определяли, сравнивая их электрофоретическую подвижность с маркером молекулярных весов. При этом фрагменты размером 950, 329-269, 425 и 317 п.н. в реакции амплификации и/или 792, 171-111, 291 и 208 п.н. в реакции реамплификации свидетельствуют о наличии в тестируемой пробе ампликонов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС или РВС, соответственно.
Очистка продуктов мПЦР. Пробу, содержащую амплифицированную ДНК, переносили в 1,5 мл пробирку, добавляли 200-300 мкл 4 М ГТЦ и перемешивали. Смесь пропускали через стекловолокнистые фильтры GF/F, используя вакуумный коллектор, а фильтры с сорбированной на них ДНК, промывали 80% этанолом. Остатки этанола удаляли центрифугированием при 10 тыс. g в течение 30 с. После этого на фильтры наносили 50 мкл деионизированной воды и центрифугировали 10-15 с при 10 тыс. g.
Секвенирование. Секвенирование продуктов мПЦР проводили с помощью автоматического секвенатора (ABI Prism 3100).
Анализ нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности генов вирусов ТГЭС, ЭДС, РВС и РКВС были получены из компьютерной базы данных GenВank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ последовательностей и выбор праймеров проводили с помощью пакета программ «BioEdit Sequence Alignment Editor» (Наll Т.А., версия 7.0.5.2, 2005) и программы «OLIGO» (версия 4.0).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Анализ нуклеотидных последовательностей генов вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС. Для разработки метода мПЦР с целью одновременного выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС были проанализированы нуклеотидные последовательности геномов этих вирусов, содержащиеся в компьютерной базе данных GenBank. Кроме того, при анализе использовали данные о первичной структуре вируса РКВС. Этот вирус, хотя и не является причиной желудочно-кишечных патологий, имеет высокую гомологию с вирусом ТГЭС и отличается от него делецией в гене S (размер делеции 621-681 нуклеотида) и в гене ORF3.
Всего было проанализировано 789 последовательностей генов вирусов, выделенных как от свиней, так и от других животных, а также от человека.
Из них 624 принадлежали ротавирусу, 90 – вирусу ТГЭС, 37 – вирусу ЭДС и 38 последовательностей генов - РКВС.
Выбор первичной структуры праймеров Было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей и выбраны праймеры, соответствующие консервативным областям последовательностей. При выборе праймеров из отмеченных консервативных участков руководствовались следующими критериями: содержание G+C должно составлять 30-60%, праймеры не должны включать самокомплементарных участков как внутри себя, так и между собой.
Желательно, чтобы праймеры имели достаточно высокую и одинаковую или близкую температуру плавления. При оценке использовали как термодинамический подход, так и эмпирический метод, основанный на G-C содержании последовательностей праймеров.
При выборе области для амплификации участка генома вирусов ТГЭС и ЭДС учитывали тот факт, что оба они относятся к семейству коронавирусов.
Таким образом, эти два вируса состоят в генетическом родстве. Анализ последовательностей этих двух вирусов показал, что, будучи выравненными, эти последовательности имеют участки с высокой гомологией.
При разработке праймеров для выявления вируса ТГЭС принималось во внимание, что вирус ТГЭС имеет в природе своего родственника – РКВС, который отличается от исходного вируса делецией в генах S и ORF3.
Поэтому логично было совместить методику выявления вируса ТГЭС и РКВС. Для этих двух вирусов были сконструированы одни и те же праймеры.
А дифференциация этих двух вирусов производилась по длине продуктов мПЦР. Сюда входили 3'-область гена Pol и 5'-область гена S. Всего было проанализировано 39 последовательностей генов POL и S штаммов вируса ТГЭС, 26 – РКВС и 5 – ЭДС.
Выбор праймеров был основан на принципе наибольшей комплементарности консервативным участкам генома вирусов ТГЭС и РКВС и одновременно наименьшей комплементарности аналогичным участкам генома вируса ЭДС. В результате сравнительного анализа первичной структуры фрагмента генома вирусов ТГЭС и РКВС было выбрано и синтезировано 6 праймеров, специфичных для данных вирусов (табл.1).
Таблица Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления вируса ТГЭС/РКВС Наимено- Положение в Последовательность нуклеотидов вание геноме* 5’ -АGGGТААGТТGСТСАТТАGАААТААТGGТААGТТ-З’ S1 20298- 5’ -СТААТТТАССАСТААССААСGТGGАGСТАТТА-З’ S2 21216- 5’ -АААААТТATTTGTGGTTTTGGTTGTААТGСС-З’ S3 20369- 5’ -GTGTAGTАААААСАТТAGCCACAТААСТАGСАСА-З’ S4 21127- 5’ -GCTCTАТСАСАТААСТСАGТССТАGАСАСТССТ-З’ S5 20180- 5’ -СТАGGGАСТGGССАТААGСААТТААСТААТА-З’ S6 21263- *соответствует нуклеотидной последовательности штамма вируса ТГЭС Purdue (номер доступа в GenBank NC_0023 06).
На рис.1 представлено расположение на геноме праймеров для выявления вирусов ТГЭС и РКВС.
Ген S Ген POL 3' РКВС 5' 3' ТГЭС 5' S3 S S1 S S5 S 20000 20500 21000 21500 *позиции праймеров в геноме Рис.1. Расположение праймеров на геноме вирусов РКВС и ТГЭС *Нумерация нуклеотидов соответствует нуклеотидный последовательности штамма вируса ТГЭС Purdue (номер доступа в GenBank NC_0023 06).
В качестве мишени для выявления РВС был выбран ген NSP5, как наиболее консервативный. Было проанализировано 9 нуклеотидных последовательностей этого гена, относящихся к ротавирусам свиней, последовательностей, относящихся к ротавирусам человека, и по одной последовательности, относящихся к ротавирусам крупного рогатого скота, овцы и обезьяны, после чего было сконструировано 6 праймеров (табл. 2).
Таблица Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления РВС Положение в Наименование Последовательность нуклеотидов геноме* 5’-GGCTTTTAAAGCGCTACAGTGATGTCTCT-3’ Р1 1- Р2 289- 5’-GGTCGTGATTGTGTTGATGAATCCATAGA-3’ 5’-CTCAGCATTGACGTAACGAGTCTTCC-3’ Р3 28- Р4 208- 5’-TGAGTGGATCGTTTGAAGCAGAATCAGA-3’ 5’-TCAACTCTTTCTGGAAAATCTATTGGTAGG-3’ Р5 100- Р6 262- 5’-GCCAGCGTCTGCATTTGTCTTAAC-3’ *нумерация нуклеотидов соответствует последовательности гена NSP штамма OSU ротавируса свиней (номер доступа в GenBank X15519).
Следует отметить, что выбранные для отжига праймеров участки гена NSP5 проявляют высокую степень консервативности не только для ротавирусов свиней, но и для представленных в базе данных ротавирусов животных и человека, что, учитывая относительную легкость межвидового переноса, отмеченного для ротавирусов, а также явление реассортации геномных сегментов, повышает степень надежности методики. На геноме праймеры располагаются следующим образом (см. рис. 2).
P P P5 P P3 P Ген NSP 5' 3' 100 200 0 *позиции праймеров в геноме Рис.2. Расположение праймеров на гене NSP5 РВС *Нумерация нуклеотидов соответствует нуклеотидной последовательности штамма OSU РВС (номер доступа в GenBank X15519).
В качестве мишени для выявления вируса ЭДС по признаку наибольшей консервативности был выбран ген М. Было проанализировано последовательностей этого гена вируса ЭДС, 8 – вируса вируса ТГЭС и 4 – вируса РКВС. Праймеры, сконструированные для данного вируса, представлены в таблице 3.
Таблица Нуклеотидные последовательности праймеров для выявления вируса ЭДС Наимено- Положение Последовательность нуклеотидов вание в геноме* 5’-GAATTTTACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGT-З’ М1 54- 5’-CGCCAGTAGCAACCTTATAGCCCTCTA-З’ М2 452- 5’-TGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTG-З’ М3 95- 5’-CCTGTCGGCCCATCACAGAAGTAGT-З’ М4 361- 5’-TTCAGCATCCTTATGGCTTGCATCA-З’ М5 238- 5’-TGCCAGATGAAGCATTGACTGAACG-З’ М6 553- *соответствует нуклеотидной последовательности гена М штамма вируса ЭДС CV777 (номер доступа в GenBank NC_003436).
Расположение этих праймеров на гене М генома вируса ЭДС показано на рис. 3.
M M M1 M M3 M Ген М 5' 3' 600 1 100 200 300 400 *позиции праймеров в геноме Рис. 3. Расположение праймеров на гене М вируса ЭДС.
*Нумерация нуклеотидов соответствует нуклеотидной последовательности штамма вируса ЭДС CV777 (номер доступа в GenBank NC_003436).
Таким образом, в результате сравнительного анализа первичной структуры геномов вирусов коронавирусной и ротавирусной инфекций свиней было сконструировано по 6 специфических праймеров для каждого вируса, чтобы при отработке условий реакции можно было выбрать наиболее оптимальные.
Оптимизация условий постановки мПЦР. Для оптимизации методики мПЦР были использованы культуральные штаммы «Ленинградский» и «Краснодонский» вируса ТГЭС с титром вируса 8,0 lgТЦД50/мл, а также производственный культуральный штамм «КР-47» ротавируса свиней, титр вируса 6,0 lgТЦД50/мл.
Выше указанные методики могут использоваться по отдельности, но они разрабатывались для совместного использования в мультиплексной ПЦР.
Поэтому были учтены следующие факторы: во-первых, длина получаемых в реамплификации фрагментов. Она была выбрана таким образом, чтобы можно было легко дифференцировать вирусы по результатам электрофореза. Во-вторых, температура плавления праймеров выбиралась приблизительно одинаковой для всех праймеров и достаточно высокой (около 60оС), чтобы повысить специфичность отжига.
Для увеличения чувствительности и специфичности реакции был разработан вариант «nested» ПЦР с двумя парами праймеров для каждого генома с разными комбинациями.
Были проверены различные комбинации праймеров для обратной транскрипции, амплификации и реамплификации. Две комбинации для каждого вируса, позволяющие получить наиболее специфичные фрагменты, в дальнейшем использовались в методике.
После того как были протестированы разработанные методики по отдельности было необходимо проверить их совместную работу.
Эксперименты показали, что, будучи использованы вместе в одной пробирке, данные методики работают корректно, то есть способны специфично распознавать искомые патогены.
В серии экспериментов были оптимизированы условия реакций:
концентрация ионов магния, концентрация праймеров, температурные режимы мПЦР.
Согласно проведенным исследованиям метод мПЦР был способен выявлять РВС в материале, содержащем вирус в концентрации 1,0 lg ТЦД50/мл, вирус ТГЭС – 2,0 lgТЦД50/мл. Аналитическая чувствительность метода не изменялась как при использовании одной пары праймеров, так и при проведении ПЦР в варианте мультиплекс.
Для подтверждения специфичности разработанной методики ее проверили на материалах, содержащих гетерологичные вирусы. Для этого проводили реакцию мПЦР с использованием праймеров, специфических для одного вируса на материалах, содержащих другие вирусы, используемые в реакции. При этом ложноположительных результатов не наблюдалось, что позволяет говорить о специфичности методики.
В результате оптимизации условий реакции было выбрано по праймера для каждого вируса, позволяющие получить наиболее специфичные фрагменты в ПЦР.
Вирусспецифические фрагменты регистрировали визуально после электрофореза в 2% агарозном геле, просматривая гель в ультрафиолете. На рисунке 4 показана электрофореграмма разделения продуктов амплификации после проведения “nested” ПЦР.
Продукт амплификации М 1 2 3 4 5 М Продукт реамплификации М 1 2 3 4 5 М Рис. 4. Электрофореграмма продуктов мПЦР Цифрами обозначены дорожки: M – маркер молекулярных весов ДНК Х174/HaeIII (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.);
1 – вирусы ТГЭС, ЭДС и РВС;
2 – вода (отрицательный контроль ПЦР);
3 – полевой изолят вируса ЭДС;
4 – РВС штамм «КР-47»;
5 – штамм «Ленинградский» вируса ТГЭС.
Применение мПЦР для выявления коронавирусов и ротавируса свиней. В наших исследованиях в случае массовых диарей патологический материал исследовали на наличие ротавируса и коронавирусов свиней.
С использованием разработанного метода было исследовано 127 проб от свиней из 17 хозяйств РФ на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС.
Геном РВС был выявлен у свиней в 14 из 17-ти обследованных хозяйств.
Вирус ЭДС был выявлен у свиней в 9 хозяйствах. При этом в обследованных хозяйствах оба эти вируса содержались в патологическом материале одновременно. Геном вируса РКВС был выявлен в двух случаях.
Эпизоотические изоляты вируса ТГЭС не были обнаружены ни в одном из этих хозяйств.
Исследовано 127 образцов патологического материала от свиней с признаками диареи. Ротавирус был выявлен в 48 образцах, вирус ЭДС – в образцах. При этом в 7 образцах оба эти вируса содержались одновременно.
Для исследования использовали фекалии, кишечник, легкие и селезенку.
Вирусы ЭДС и РВС выявляли в кишечнике и в фекальных массах.
Положительные результаты для этих вирусов составляли приблизительно 33% от общего количества проб кишечника для каждого из вирусов, в фекальных массах обнаруживали 7,5% положительных образцов на вирус ЭДС и 41,5% положительных образцов на РВС. При этом в легком и селезенке геном вируса ЭДС не обнаруживали. Вирус РВС выявлялся в легком и селезенке в 37,5% случаев. В 7,5% проб кишечника и 4,5% проб фекалий выявляли одновременно геном вирусов ЭДС и РВС. Геном РКВС удалось обнаружить в 2-х образцах тканевой вакцины (табл. 4).
Таблица Результаты исследования патологических материалов от свиней методом мПЦР на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС Количество Количество положительных проб для исследованных вирусов Патматериал ЭДС/ проб ЭДС РВС РКВС РВС 54 18 18 4 Кишечник 65 5 27 3 Фекалии Легкое и 8 0 3 0 селезенка В нашей работе на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС были исследованы образцы от животных разных возрастных групп как с кишечной клиникой, так и от здоровых животных. В таблице 5 представлены результаты исследований животных разных возрастных групп.
Таблица Результаты исследований образцов от животных разных возрастных групп на наличие вирусов ТГЭС, РКВС, ЭДС и РВС методом мПЦР Количество положительных Количество проб для вирусов Возраст животных исследованных ЭДС/ ЭДС РВС РКВС проб РВС 1-30 дней 72 22 39 6 31-60 ней 10 1 5 1 61-90 ней 17 0 2 0 Здоровые 28 0 2 0 свиноматки Из таблицы видно, что вирус ЭДС выявляли у поросят в возрасте от одного дня до 60 дней. В отличие от него РВС выявляли у всех возрастных групп. В двух случаях РВС был выявлен при отсутствии диарейного синдрома у здоровых свиноматок. Смешанную инфекцию, когда в исследуемом материале одновременно обнаруживали вирусы ЭДС и РВС, регистрировали у поросят в возрасте от 1 до 60 дней.
У поросят в возрасте от 1 до 30 дней процент положительных проб составил 95,5% и 81% из общего количества положительных результатов для вирусов РВС и ЭДС, соответственно.
При исследовании материалов, поступавших из различных хозяйств Российской Федерации, было выявлено 15 изолятов ротавируса свиней.
Методом нуклеотидного секвенирования определили первичную структуру амплифицированного в мПЦР фрагмента гена NSP5 данных изолятов вируса РВС.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка гена NSP5 выявленных нами изолятов вируса РВС показывает высокую консервативность этого фрагмента у всех штаммов и выявленных изолятов данного вируса.
Была построена дендрограмма, отражающая генетическое разнообразие штаммов и выявленных нами изолятов РВС (рис. 5).
HP HP Mc RMC Mc RMC RMC Краснодар/A CC CN OSU YM A RU Краснодар/Б Нижегород/05/ Татарстан/05/ Башкирия/06/ Ливны/07/ Ярославль/08/ Воронеж/А Воронеж/Б Вологда/11/ Курская/01/ Ульяновск/01/ Белгород/А Белгород/Б Белгород/В KU 96H Z 512 C v M Wa 96H 96H 96H 96H SA China RF M 512 A 512 B O K AU TBChen NR v v v v v процент нуклеотидных различий v 5 4 2 3 Рис. 5. Дендрограмма, отражающая филогенетические отношения штаммов и изолятов ротавирусов. Основана на сравнении нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка гена NSP Дендрограмма показала, что данные изоляты вируса РВС принадлежат к одной генетической группе (группа А), в которую входят известные штаммы ротавирусов свиней (HP140, HP113, OSU, CC86, CN86, RU172 и YM) и некоторые штаммы ротавируса человека (Mc345, RMC321, Mc323, RMC83, RMC100, 582 и 470). Из дендрограммы также видно, что, за исключением изолята «Краснодар/А», выявленные нами изоляты РВС имеют практически 100% гомологию.
Уровень отличий изолята «Краснодар/А» от других выявленных нами изолятов вируса РВС составляет примерно 1,4%, уровень его отличий от штаммов Mc345/RMC321, Mc323/RMC100//RMC83 и 582/470 ротавируса человека составил 4,3%, 2,8% и 1,9%, соответственно, тогда как остальные нами выявленные изоляты РВС отличались от данных штаммов на 2,9%, 1,4% и 0,50%, соответственно.
Геном вируса ЭДС был выявлен в 23 из 127 исследованных проб.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена нуклеотидная последовательность для 12 амплифицированных фрагментов гена М вируса ЭДС.
Результаты анализа показали, что выявленные нами изоляты вируса ЭДС на территории РФ содержали 3 нуклеотидные замены в трех позициях (144, 207 и 303) гена М. Было показано, что эти замены не влияли на аминокислотный состав белка М вируса ЭДС. Эти замены отсуствовали у других штаммов данного вируса.
Была построена дендрограмма, отражающая генетическое разнообразие штаммов и выявленных нами изолятов вируса ЭДС (рис.6). Она построена на основе сравнения нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка гена М. Данная дендрограмма показывала, что российские изоляты вируса ЭДС вместе с другими штаммами данного вируса формируют одну генетическую группу, в которую входят штаммы KPEDV, JMe2, Chinji99, LZC и Br1/87. Выявленные нами изоляты вируса ЭДС образуют один кластер внутри данной группы. Другие известные штаммы вируса ЭДС относятся к другой группе, при этом уровень отличий между этим двумя группами составляет более 4%.
Москва/07/ Вологдa/Б Вологдa/А Краснодар/A Самара/Б Курск/01/ Ярославль/08/ Ульяновск/01/ Белгород/05/ A Башкирия/06/ Краснодар/Б Самара/А KPEDV-9/ JMe KPEDV-9/ Chinju CV777/ LZC CV777/ Br1/ DX CH/HLJH/ CH/JSX/ CH/IMT/ B LJB/ QH JS-2004-- CH/IMB/ CH/HNCH/ CH/SHH/ процент нуклеотидных различий 2 1 4 Рис.6. Дендрограмма, отражающая филогенетические отношения штаммов и изолятов вируса ЭДС. Основана на сравнении нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка М гена При исследовании патологического материала, поступившего из хозяйств, мы не выявляли вирус ТГЭС. Оптимизация метода мПЦР проводилась с использованием культурального вируса, поэтому с целью изучения возможности применения данного метода для выявления генома вируса ТГЭС в тканях и органах животных было необходимо провести исследование патологического материала от свиней, содержащего вирус ТГЭС.
Более 17 лет назад вспышки данного заболевания наблюдались в одном из хозяйств Нижегородской области. От больных поросят был выделен и идентифицирован вирус ТГЭС, который поддерживается до сегоднящего дня путем ежегодного освежения на 25-30 домолозивных поросятах и используется для изготовления инактивированной тканевой вакцины против ТГЭС. Данный материал был исследован с помощью разработанной методики, и в нем был выявлен геном вируса ТГЭС.
Выявленный нами изолят вируса ТГЭС имел генетическое родство с известным штаммом TMK-22 и отличался от него лишь на 0,6%.
4. ВЫВОДЫ 1. Сконструированы праймеры к консервативным участкам генов NSP5, M и S вирусов РВС, ЭДС и ТГЭС для использования в мультиплексном варианте полимеразной цепной реакции, которая позволяет специфично выявлять указанные инфекционные агенты в вируссодержащих материалах.
2. Разработан метод выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, ЭДС и РВС на основе амплификации фрагментов генов NSP5, M и S, являющихся наиболее консервативными для выше указанных возбудителей.
3. Показано, что при помощи разработанного метода в 127 исследуемых пробах патологического материала от свиней вирус ЭДС выделен в 23;
вирус РВС – 48;
вирус РКВС в 2 случаях. Вирус ТГЭС был выявлен в патологическом материале только от экспериментально инфицированных поросят.
4. Установлено, что вирус РВС выявляется у свиней всех возрастных групп как при диарейном синдроме, так и от здоровых свиноматок, что указывает на возможность заражения новорожденных поросят. В наших исследованиях вирус ЭДС выявляется при гастроэнтеритах свиней в возрасте от 1 до 60 дней, хотя данным вирусом заражаются поросята всех возрастных групп. В отличие от РВС, вирус ЭДС не выявлен в селезенке и в легких.
5. Установлена нуклеотидная последовательность фрагментов генов NSP5, M и S вирусов РВС, ЭДС и ТГЭС, соответственно выделенных на территории Российской Федерации.
6. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей исследуемого фрагмента гена NSP5 штаммов и изолятов РВС показал высокую консервативность этого фрагмента у всех штаммов и изолятов данного вируса, выделенных в 14 хозяйствах 11 областей России.
7. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена М штаммов и выявленных нами изолятов вируса ЭДС установлено, что возбудители содержат несколько нуклеотидных замен, характерных только для вирусов, выявленных на территории РФ. Эти замены могут дифференцировать российские изоляты от других штаммов и изолятов вируса ЭДС.
8. С использованием разработанного метода геном вируса ТГЭС был выявлен в патологическом материале от экспериментально инфицированных поросят. Сравнительный анализ показал, что выявленный изолят имеет генетическое родство с известным штаммом TMK-22 вируса ТГЭС.
9. Разработанная методика выявления и дифференциации вирусов ТГЭС, РВС и ЭДС с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции позволяет выявлять РКВС и дифференцировать его от вируса ТГЭС.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ На основании проведенных исследований предлагается для использования в практической работе рассмотренная и одобренная ученым советом и утвержденная директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методика выявления и дифференциации вирусов трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и эпидемической диареи свиней с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции». Полученные данные о нуклеотидных последовательностях ротавируса и коронавирусов свиней могут быть использованы для индикации и дифференциации штаммов и полевых изолятов указанных вирусов.
6. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Абид, Н.С. Разработка метода выявления вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней с помощью полимеразной цепной реакции / Н.С.
Абид // Ветеринарная патология.- М, 2006.- T. 19, № 4. - с. 100 - 103.
2. Применение полимеразной цепной реакции для выявления ротавируса свиней группы А / Н.С. Абид, С.А. Чупин, Л.Б. Прохватилова, Т.З. Байбиков // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных.- Владимир, 2007.- Т.
5.- с. 264 - 271.
3. Разработка метода выявления вируса эпидемической диареи свиней с помощью полимеразной цепной реакции / Н.С. Абид, С.А. Чупин, Л.Б.
Прохватилова, Т.З. Байбиков // Генодиагностика инфекционных заболеваний:
VI Всероссийская науч.- практ. конф.- М, 2007. – T2. - с. 275-277.
Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 90 экземпляров, ноябрь 2007г.