Молекулярные механизмы реализации геропротекторной активности пептида дельта-сна
На правах рукописи
Кутилин Денис Сергеевич МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ ГЕРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДА ДЕЛЬТА-СНА 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону 2013 2
Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону)
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Бондаренко Тамара Ивановна
Официальные оппоненты: Горошинская Ирина Александровна, доктор биологических наук, профессор, руководитель биохимической лаборатории ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» (г. Ростов-на-Дону) Друккер Нина Александровна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» (г. Ростов-на-Дону)
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр неврологии" РАМН (г. Москва)
Защита диссертации состоится «19» июня 2013 г. в 11.00 час. на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (344090, г. Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1, актовый зал).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.
Автореферат разослан «» мая 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.208.07, кандидат биологических наук, с.н.с. Е.В. Асланян
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Старение, по современным представлениям, представляет собой многопричинный разрушительный процесс возрастзависимого увеличения числа отклонений от гомеостаза на молекулярном, субклеточном, клеточно-тканевом и системном уровнях, определяемый генетически детерминированной биологической организацией живой системы (Фролькис В.В., 1992;
Москалев А.А., 2010). Этому процессу присуще нарушение хрупкого баланса прооксидантно-антиоксидантного равновесия и адаптационных возможностей в различных тканях и органах, что в итоге приводит к развитию ряда патологических состояний, свойственных пожилому возрасту, таких, как атеросклероз, сахарный диабет, нейродегенеративные, иммунологические и эндокринные нарушения, онкологические заболевания и др. (Хавинсон В.Х. и др., 2003;
Серова Л.Д. и др., 2003;
Halliwell B., Gutteridge J.M.C., 2007). Окислительный стресс, при старении имеющий необратимый и нарастающий характер (Терешина Е.В., 2003), вызывает повреждение основных макромолекул клетки - белков, липидов и ДНК, что ведет к инактивации ферментов, повреждению мембран, нарушению стабильности передачи генетической информации и клеточного деления, а также накоплению аберрантных балластных полимеров (Harman D., 2006). Детальное изучение старения на молекулярном и клеточном уровнях, а также изучение роли апоптоза и генетической нестабильности в возрастных патологиях позволили в настоящее время осуществить переход от понимания старения как пассивного накопления ошибок к представлениям о регуляторных эпигенетических изменениях, влияющих на экспрессию генов (Москалев А.А., 2008).
Рост числа пожилых и старых людей в составе общества высокоразвитых стран приводит к возникновению крупных социально-экономических проблем. При этом возрастные нарушения функций организма человека становятся одной из основных причин его смерти (Рыжак Г.А., Коновалов С.С., 2004;
Анисимов В.Н., 2008). В связи с чем, одной из приоритетных задач современной биомедицины является профилактика ускоренного старения и возрастной патологии, направленная на сохранение активного долголетия, увеличение средней продолжительности жизни и достижения видового предела жизни человека (Hayflik L., 2000;
Анисимов В.Н., 2008).
В настоящее время у геронтологов особый интерес вызывает изучение геропротекторных свойств разнообразных пептидов. Исследования последних десятилетий выявили, что регуляторные пептиды могут быть наиболее перспективными фармакологическими средствами в плане замедления возрастных и стресс-индуцированных изменений в организме (Karelin A.A. et al., 1998). В результате многолетних исследований Морозов В.Г. и Хавинсон В.Х. (1996, 1997, 2000) обосновали концепцию биорегулирующей терапии, основанной на применении пептидных биорегуляторов при различных заболеваниях, патологических состояниях и старении организма, а также предложили молекулярную модель, лежащую в основе биологических эффектов этих пептидов (Хавинсон В.Х. и др., 2005, 2009, 2012). Спектр регуляторных пептидов чрезвычайно широк. Одним из них является дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), имеющий следующую первичную структуру - WAGGDASGE.
Изучение биологической активности ДСИП выявило уникальные антистрессорные и адаптогенные способности пептида, его кардио- и нейропротекторные эффекты, антиметастатическое, антитоксическое, антидепрессивное и противосудорожное действие, антигипоксические и др. свойства (Sudakov K.V. et al., 1983;
Бондаренко Т.И. и др., 1984-2012;
Менджерицкий А.М. и др., 1987-2007;
Ульянинский Л.С. и др., 1990;
Khvatova I.L.et al., 2003;
Михалева И.И., Войтенков Б.О., 2007;
Mikhaleva I.I. et al., 2011). Интересным открытием явилось установление геропротекторной активности ДСИП (Попович И.Г и др., 2003), позже подтвержденное в работах других авторов (Майборода Е.А., 2009;
Войтенков В.Б. и др., 2009).
Вместе с тем, механизм геропротекторного действия ДСИП в настоящее время окончательно не известен.
В связи с этим целью нашей работы явилось изучение молекулярных механизмов реализации геропротекторной активности ДСИП.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
1. Исследовать влияние ДСИП на состояние глутатионзависимого звена антиоксидантной системы (активность глутатионпероксидазы (ГПО), глутатион-S-трансферазы (Г-S-Т), глутатионредуктазы (ГР) и концентрацию восстановленного глутатиона (GSH)) в разных тканях (мозге, сердечной и скелетной мышцах, печени, почках, селезенке и семенниках) и эритроцитах крыс в возрасте 4-24 месяца.
2. Исследовать влияние ДСИП на экспрессию генов супероксиддисмутазы 1 (СОД 1) и глутатионпероксидазы 1 (ГПО 1) в мозге и крови крыс в процессе физиологического старения организма.
3. Установить влияние ДСИП на активность ферментов электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий (НАДН-дегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы) в мозге, сердечной мышце и печени крыс при физиологическом старении организма.
4. Изучить влияние ДСИП на окислительную модификацию суммарных белков (по содержанию сульфгидрильных, карбонильных групп и битирозина) разных тканей крыс (мозга, сердечной и скелетной мышц, печени, почек, селезенки, семенников) в ходе постнатального развития.
5. Исследовать влияние ДСИП на состояние мембран лизосом и интенсивность лизосомального протеолиза в мозге, сердечной мышце и печени крыс в постнатальном онтогенезе.
6. Изучить влияние ДСИП на уровень хромосомных аберраций и митотическую активность в эпителии роговицы глаза крыс в условиях физиологического старения организма.
Научная новизна работы. В работе впервые показано, что ДСИП участвует в регуляции возрастного окислительного стресса, обладая мощным антиоксидантным эффектом, реализующимся через стимуляцию активности ключевых антиоксидантных ферментов посредством влияния на экспрессию их генов, а также через стабилизацию активности ферментов ЭТЦ митохондрий и снижение окислительной модификации белков разных тканей.
На основе анализа метаболических эффектов ДСИП при физиологическом старении организма предложена схема, объясняющая молекулярные механизмы реализации его геропротекторного действия. Обоснована возможность использования синтетического аналога эндогенного ДСИП в профилактике метаболических нарушений стареющего организма и преждевременного старения.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. ДСИП повышает ёмкость глутатионзависимого звена антиоксидантной системы в тканях крыс на разных этапах онтогенеза, причем это влияние имеет наиболее выраженный характер в постмитотических необновляемых тканях.
2. В основе модулирующего влияния ДСИП на активность антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы) в мозге и ядросодержащих клетках крови лежит его способность увеличивать экспрессию генов супероксиддисмутазы 1 и глутатионпероксидазы 1 в соответствующих клетках животных при физиологическом старении организма.
3. ДСИП оказывает стабилизирующее действие на активность НАДН-дегидрогеназы в митохондриальной фракции разных тканей крыс при старении, что в совокупности с увеличением ёмкости антиоксидантной системы (АОС) должно снижать выработку свободных радикалов и их негативное действие на макромолекулы клеток.
4. ДСИП приводит к снижению окислительной модификации суммарных белков тканей крыс при старении, в разной степени влияя на уровень сульфгидрильных, карбонильных групп и битирозина, причем степень влияния данного пептида имеет тканеспецифический и хронологически зависимый характер. В основе этого эффекта, вероятно, лежит способность ДСИП повышать емкость АОС организма и увеличивать интенсивность лизосомального протеолиза, последнее должно способствовать деградации аберрантных белков.
5. ДСИП обладает стабилизирующим влиянием на мембраны лизосом мозга, сердечной мышцы и печени крыс разного возраста, что может быть важной составной частью мембранопротекторного действия пептида при старении.
6. Введение ДСИП животным в течение их жизни приводит к снижению числа хромосомных аберраций и увеличению пролиферативной активности эпителия роговицы глаза крыс разных возрастных групп, что может быть следствием снижения окислительной модификации ДНК.
Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане выполненная работа вносит существенный вклад в понимание роли регуляторных пептидов в поддержании гомеостаза при физиологическом старении организма, а также позволяет углубить и расширить наши представления о молекулярных механизмах реализации геропротекторной активности ДСИП. Результаты исследования свидетельствуют о несомненном потенциале ДСИП в качестве геропротектора, сочетающего свойства разных групп геропротекторных препаратов. Действие ДСИП осуществляется на молекулярном, клеточном, органном и организменном уровне, купируя проявления окислительного стресса, играющего важную роль в нарушении гомеостаза при старении организма. Изученные метаболические эффекты ДСИП при старении организма являются основой его геропротекторной активности и дают объяснение ряду обнаруженных ранее положительных эффектов ДСИП, в частности, раскрывают механизм его онкопротекторного действия. Особенности изменения ряда биохимических параметров в сердечной мышце под влиянием ДСИП, безусловно, свидетельствует о его кардиопротекторной функции при старении организма. Способность повышать пролиферативную активность показывает возможность применения этого пептида в терапии в качестве митогенного стимулятора для заживления тканей. А интенсификация лизосомального протеолиза под влиянием ДСИП позволяет прогнозировать возможность его применения с лечебно-профилактической целью при так называемых лизосомальных болезнях накопления. Всё это имеет большое значение в реализации эндогенных механизмов замедления старения организма и обосновывает возможность применения ДСИП для коррекции широкого спектра метаболических нарушений, развивающихся в процессе старения организма, а также для повышения качества жизни. Результаты, полученные в работе, используются на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета при чтении курсов «Биохимия», «Биология старения», «Биохимия аминокислот и пептидов», «Основы патологических процессов» и «Биохимия внутри- и межклеточных коммуникаций».
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на V национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 2010), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011), 7-Международном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2011), 7-Международной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2011), 4 Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011), Всероссийской научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2011), Всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования» (Махачкала, 2011), II Международной научно практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Новосибирск, 2011), XII международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2011), 16-ой Международной Пущинской школе конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2012), II Всероссийской с международным участием молодежной научной школе-конференции «Биология будущего:
традиции и новации» (Екатеринбург, 2012), III Съезде геронтологов и гериатров России (Новосибирск, 2012), на научной сессии факультета биологических наук ЮФУ (Ростов-на Дону, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 1,77 п.л., личный вклад - 66 %.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 196 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 184 отечественных и 222 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 61 рисунком.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперимент выполнен на 158 белых крысах - самцах в возрасте 2, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 20, 22 и 24 месяцев, которые содержались в условиях вивария на стандартном рационе.
Подопытным животным в утренние часы ежемесячно, начиная с 2 месячного возраста, курсами по 5 последовательных дней подкожно вводили ДСИП, растворенный в стерильном физиологическом растворе, из расчета 100 мкг/кг массы тела животного. Для интактных 4- месячных крыс контролем служили 2 месячные животные, а для подопытных - интактные животные соответствующего возраста. При обнаружении у крыс опухолевого роста или воспалительных процессов их исключали из эксперимента. Дизайн эксперимента представлен в таблице 1.
В эксперименте использован синтетический аналог ДСИП, синтезированный в Институте биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва).
Эксперимент проведен в соответствии с декларацией о биоэтике, «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.) и ГОСТ Р 53434 2009.
Таблица Дизайн эксперимента Возраст 2 4 4 6 6 8 8 12 12 16 16 18 18 20 20 22 22 24 животных + + + + + + + + + (в Д Д Д Д Д Д Д Д Д месяцах) и С С С С С С С С С условия И И И И И И И И И экспери мента П П П П П П П П П Кол-во 10 10 10 10 10 10 10 7 8 8 9 8 8 7 10 6 6 5 животных в группе Подопытных и контрольных животных декапитировали в утренние часы, чтобы избежать суточных колебаний метаболизма. Активность глутатионзависимых ферментов (ГПО, Г-S-Т, ГР) и содержание GSH определяли в супернатанте гомогенатов мозга, печени, сердца, селезенки, почек, семенников, фрагмента скелетных мышц (четырехглавой мышцы бедра задних конечностей), приготовленных на физиологическом растворе, и в гемолизате эритроцитов. Активность ГПО определяли с гидроперекисью третбутила (Моин В.М., 1986), активность Г-S-Т - по конъюгации глутатиона с 1,2-динитро-хлор-бензолом (ХДНБ) (Habig W.H. et al., 1974), активность глутатионредуктазы - по скорости окисления НАДФ*Н, сопровождающегося снижением оптической плотности раствора при длине волны 340 нм (Юсупова Л.Б., 1989). Концентрацию восстановленного глутатиона определяли колориметрически по методу Ellman G.L. (1959), содержание белка - колориметрически по методу Lowry O.H. et al. (1951) в модификации Schacterle G.R., Pollack R.L. (1973) и спектрофотометрически (Северин С.Е., Соловьева Г.А., 1989). Концентрацию гемоглобина определяли гемоглобинцианидным методом с использованием коммерческого набора реагентов (ЭКОлаб-Гемоглобин, Россия).
Выделение и очистку тканевых белков проводили методом Yoshino Y. (1970) и Wherret G.R. (1971) в модификации Пушкиной Н.В. (1976). В выделенных и очищенных суммарных белках тканей определяли содержание сульфгидрильных групп колориметрическим методом по реакции с реактивом Эллмана (Веревкина И.В. и др., 1977), содержание карбонильных групп спектрофотометрическим методом (Levine R.L. et al., 1990) в модификации Дубининой Е.Е. и др. (2000) и оценивали образование битирозиновых сшивок спектрофлюориметрически (Davies K.J.A., 1987).
Выделение митохондриальной фракции мозга, сердечной мышцы и печени осуществляли методом дифференциального центрифугирования (Северин С.Е., Соловьева Г.А., 1989) и определяли в ней активность маркерного фермента митохондрий сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (Ещенко Н.Д., Вольский Г.Г., 1982) и активность НАДН дегидрогеназы по скорости восстановления гексацианоферрата калия (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977).
Фракцию, обогащенную лизосомами, выделяли по методу Sawant P.L. et al. (1964). В лизосомальной и цитоплазматической фракциях мозга, сердечной мышцы и печени определяли активность кислых пептидгидролаз методом, описанным Покровским А.А. и Арчаковым А.И.
(1968) с модификациями (Крупенникова Е.Ю., 1985).
Для изучения профиля экспрессии генов супероксиддисмутазы 1 (Sod1) и глутатионпероксидазы 1 (Gpx1) выделяли тотальную (суммарную) РНК из ткани мозга и цельной крови крыс методом гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции с использованием коммерческого набора «РИБО-золь-В» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия).
Количественный анализ экспрессии генов Sod1 и Gpx1 проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Для синтеза кДНК использовали набор реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Перед проведением реакции обратной транскрипции согласно рекомендациям Епринцева А.Т. и др. (2008) для проверки качества выделенной РНК проводили электрофорез в 2% геле агарозы, содержащем 1хTBE буфер, по методу, описанному Masek T. et al. (2005). В качестве гена «домашнего хозяйства» использовали ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). В геномном банке на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov получили последовательности, кодирующие ферменты СОД 1, ГПО 1 и GAPDH для Rattus norvegicus (alba). На их основе с помощью компьютерных программ Primer BLAST и Primer 3 разработали праймеры (таблица 2), которые затем были синтезированы по заказу в лаборатории ЗАО «Евроген» (Россия).
Таблица 2.
Последовательность нуклеотидов праймеров, использованных при проведении ПЦР-РВ Ген Последовательности нуклеотидов праймеров Прямой:
GAPDH AAGCTGTGGCGTGATGGCCG Обратный: GCCGCCTGCTTCACCACCTT Прямой:
Sod1 CATGGCGATGAAGGCCGTGT Обратный: AGCCAAGCGGCTTCCAGCATTT Прямой:
Gpx 1 CTCTCCGCGGTGGCACAGTC Обратный: GCACGGGAAACCGAGCACCA Для проведения ПЦР-РВ использовали реакционную смесь qPCR-mix-HS-SYBR (ЗАО «Евроген», Россия) с интеркалирующим красителем SYBR Green I. ПЦР-РВ проводили на аппарате i-Cycler с оптической приставкой iQ5 (Bio-Rad Laboratories, США) по каналу FAM/GREEN (470/510 нм). Относительный уровень экспрессии гена (т.е., относительную концентрацию мРНК) рассчитывали по методу СТ: R=Е-Ct, где Ct = Ct (Sod1 или Gpx1) - Ct (GAPDH);
Ct -пороговый цикл (Епринцев А.Т. и др., 2008).
На гистологическом препарате эпителия роговицы глаза крыс, приготовленном по методике, описанной Гостимским С.А. и др. (1974), определяли уровень хромосомных аберраций согласно оригинальному варианту анафазного анализа (Fiskesjo G., 1985) и уровень митотической активности (Гостимский С.А. и др., 1974).
Статистическую обработку результатов исследования проводили при помощи стандартного лицензионного пакета MS Excel 2003. Достоверность различий между опытными и контрольными группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Отклонения между рядами считали достоверными при p0,05-0,001. Корреляционный анализ проводили с использованием линейного коэффициента корреляции (коэффициента корреляции Пирсона, r).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ДСИП на состояние глутатионзависимого звена антиоксидантной системы в разных тканях и эритроцитах крыс при физиологическом старении организма.
Сохранение активности антиоксидантных ферментов на определенном уровне играет важную роль в снижении темпов развития старения (Halliwell B., 1997).
Нами обнаружен неоднородный характер возрастных изменений компонентов глутатионзависимого звена АОС (ГПО, Г-S-Т, ГР и GSH) в исследованных тканях и эритроцитах крыс. Так, активность ГПО при физиологическом старении организма в мозге, сердечной и скелетных мышцах, печени, селезенке и почках максимально снижается в 16- мес., в эритроцитах - в 22 и 24 мес. возрасте, при этом в печени, селезенке, почках и семенниках обнаружено увеличение активности ГПО с максимумом в 6 мес. возрасте и отсутствие достоверных изменений в 24 мес. по сравнению с 2 мес. возрастом (рис.1 и 2). Корреляционный анализ показал, что наиболее сходный характер возрастных изменений активности ГПО имеют ткани, образованные одним подтипом постмитотических соматических клеток.
Общей особенностью для всех исследованных тканей является повышенная активность Г-S-Т в 4-22 мес. период онтогенеза по сравнению с 2-х мес. возрастом и нелинейная тенденция возрастных изменений активности фермента. В мозге, печени, сердечной мышце, почках и семенниках активность Г-S-Т статистически значимо снижается в 24 мес. только по сравнению с 22 мес. возрастом, а в мозге и почках - в 18 и 24 мес. соответственно по сравнению с 2-х мес.
возрастом.
Максимальное статистически значимое снижение активности ГР в онтогенезе по сравнению с её активностью в 2-х мес. возрасте наблюдается в ткани селезенки в 12 мес., в скелетных мышцах и почках в 16 мес., а в эритроцитах - в 22 мес.возрасте. В мозге, сердечной мышце, печени и семенниках достоверного возрастного снижения активности ГР по сравнению с её активностью у 2-х мес. крыс не обнаружено.
Максимальное снижение содержания GSH при старении по сравнению с 2-х мес.
крысами наблюдается в сердечной мышце, менее значительные изменения происходят в скелетных мышцах и далее в семенниках, мозге, почках и печени;
а минимальное возрастное снижение концентрации наблюдается в селезенке и эритроцитах (рис. 3 и 4).
а) 600 в) б) ** ** ** ** мкмоль/мин/г белка мкмоль/мин/г белка мкмоль/мин/г белка * * * 400 400 * * * * * * * * * * * * 300 * ** * * ** * * 200 200 * 100 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст,месяцы возраст,месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 1. Влияние ДСИП на активность ГПО в мозге (а), сердечной мышце (б) и скелетных мышцах (в) крыс при физиологическом старении организма. Здесь и далее на рис. 2-16: * - достоверность различий по сравнению с 2-х месячными животными (р10,05 - 0,001);
** - то же по сравнению с животными соответствующего возраста без введения ДСИП (р20,05 - 0,001);
*** - то же по сравнению с животными предшествующей возрастной группы (р30,05 - 0,001).
Введение ДСИП животным в течение их жизни приводит к увеличению активности ГПО, наиболее значительно в сердечной мышце (на 58% в 8 мес.), семенниках (на 43% в 6 мес.) и мозге (на 36% в 16 мес.);
менее эффективно - в скелетных мышцах (на 24% в 6 мес.), почках (на 22% в 16 мес.), эритроцитах (на 19% в 24 мес.), селезенке (на 18% в 20 мес.) и печени (на 7% в 12 мес.). Отличий в характере воздействия ДСИП на активность ГПО в разных тканях нами не обнаружено (рис. 1 и 2). Изменение активности этого фермента может быть связано с влиянием ДСИП во-первых, на экспрессию соответствующего гена и синтез соответствующего белка;
во вторых, на высвобождение НАДФН из комплекса с каталазой, что в свою очередь активирует ГР и стимулирует функционирование ГПО (Kirkman H.N., Gaetani G.F., 1984).
в) а) 400 б) * * * * * * мкмоль/мин/г белка * * ** мкмоль/мин/г белка мкмоль/мин/г Hb ** ** * * ** * * 200 200 * * ** ** 100 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы возраст,месяцы д) г) 700 * ** мкмоль/мин/г белка мкмоль/мин/г белка 600 * 500 * * * * * интактные животные * ** 300 ** 200 животные с введением ДСИП * ** * 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст, месяцы Рис. 2. Влияние ДСИП на активность ГПО в печени (а), селезенке (б), эритроцитах (в), семенниках (г) и почках (д) крыс при физиологическом старении организма. Обозначения как на рис. Глутатион-S-трансферазы (Г-S-Т) также являются важным компонентом антиоксидантной защиты при окислительном стрессе (Соколовский В.В., 1988). При введении ДСИП у животных наблюдается увеличение активности Г-S-Т во всех исследованных нами тканях и эритроцитах крыс в разные периоды онтогенеза, но максимальное увеличение активности происходит: в мозге - на 328% в 18 мес.;
в сердечной мышце - на 65% в 24 мес.;
в скелетных мышцах - на 53% в 12 мес.;
в печени - на 21% в 6 мес.;
в почках - на 20% в 12 мес.;
в семенниках - на 63% в 18 мес.;
в селезенке - на 22% в 12 мес.;
в эритроцитах - на 61% в 24 мес.
по сравнению с интактными животными сходных возрастных групп. Т.е. ДСИП с максимальной эффективностью влияет на активность Г-S-Т в мозге, сердечной мышце, семенниках и эритроцитах на поздних этапах онтогенеза, в то время как в других тканях этот эффект выражен не столь значительно и проявляется несколько ранее.
Описанное выше позволяет говорить о тканеспецифичных и асинхронных проявлениях влияния ДСИП на активность ГПО и Г-S-Т, антиперекисная активность которых протекает с участием GSH, выступающего в качестве донора водорода. Устранение избытка перекисей сопровождается уменьшением восстановленной (GSH) и увеличением окисленной (GSSG) форм глутатиона. Последняя восстанавливается за счет действия НАДФН-зависимой глутатионредуктазы (ГР) (Reed D., 1986).
Введение ДСИП приводит к увеличению активности ГР в эритроцитах и во всех тканях крыс, за исключением ткани почек. В сердце, мозге и селезенке наибольший его эффект наблюдается в 12 мес. возрасте, когда увеличение активности ГР составляет 17%, 123% и 124% соответственно;
в эритроцитах, мышцах и печени - в 18, 22 и 24 мес. возрасте, когда активность фермента увеличивается на 58%, 24% и 177% соответственно;
а в семенниках - в 6 мес.
возрасте, когда увеличение активности ГР составляет 48% по сравнению с его активностью у интактных животных сходного возраста.
Стимуляция активности ГР под действием ДСИП, более выраженная в печени, селезенке и мозге, должна способствовать увеличению уровня GSH в тканях, поддерживая тем самым тиол-дисульфидное равновесие в них.
Нами установлено, что введение ДСИП приводит к увеличению содержания GSH в эритроцитах и во всех исследованных тканях, и его воздействие также имеет тканеспецифичный и возрастзависимый характер.
а) 12 в) б) ** ** * ** мкмоль/г белка * мкмоль/г белка мкмоль/г белка 8 * * 6 * ** * * * 4 ** * * ** ** * ** * ** * 0 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст, месяцы возраст,месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 3. Содержание GSH в мозге (а), сердечной (б) и скелетных мышцах (в) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. При введении ДСИП содержание GSH максимально увеличивается в сердечной мышце на 109% в 22 мес.;
в скелетных мышцах - на 40% в 22 мес.;
в семенниках - на 38% в 24 мес.;
в мозге - на 31% в 22 мес.;
в печени - на 40% в 4 мес.;
в почках - на 54% в 22 мес.;
в селезенке - на 11% и в эритроцитах - на 29% в 4 мес. возрасте по сравнению с интактными животными соответствующего возраста (рис. 3 и 4). Специфика изменений соответствует пролиферативной активности тканей и их делению на статичные (сердечная и скелетная мышцы, нейроны мозга) и растущие-обновляемые (печень, почки, селезенка и тестикулы), причем в последних степень выраженности влияния ДСИП ниже (по средней величине изменений и числу возрастных групп, в которых они проявились).
б) 12 в) а) ** ** ** мкмоль/г белка мкмоль/г белка мкмоль/г Hb 20 * * ** * * * * 15 * * * * * 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст,месяцы возраст,месяцы г) 40 д) ** ** мкмоль/г белка мкмоль/г белка 30 15 интактные животные ** * * * * * * * животные с введением ДСИП 20 10 * * * * * * * 10 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст,месяцы Рис. 4. Содержание GSH в печени (а), селезенке (б), эритроцитах (в), семенниках (г) и почках (д) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Таким образом, описанные выше особенности изученных компонентов АОС могут служить объяснением различий в характере старения рассматриваемых тканей, а наблюдаемые эффекты возрастных колебаний (наличие пиков активности ферментов или содержания GSH) можно считать результатом сочетания онтогенетических и сезонных сдвигов функциональной активности АОС.
Стимулируя активность ГПО, Г-S-Т, ГР и воздействуя на содержание GSH, ДСИП повышает ёмкость и регулирует согласованное действие ферментативного и неферментативного звеньев АОС, что обеспечивает более высокий уровень неспецифической резистентности организма и его адаптивных возможностей к воздействию разнообразных по своей природе факторов, предохраняет клетки от окислительного разрушения важнейших макромолекул, тем самым, препятствуя процессу старения.
Учитывая способность ДСИП стимулировать активность СОД и ГПО при старении, и отсутствие четких представлений о молекулярных механизмах реализации этой способности, нами проведено изучение его влияния на профили экспрессии генов цитозольной супероксиддисмутазы (Cu, Zn-СОД, СОД 1) и цитозольной глутатионпероксидазы (ГПО 1) в мозге и крови крыс при физиологическом старении организма методом ПЦР в реальном времени.
Влияние ДСИП на профиль экспрессии генов СОД 1 и ГПО 1 в мозге и крови крыс при старении организма. Нами установлено, что с возрастом относительная экспрессия гена СОД 1 (Sod1) в мозге снижается на 34%, 34%, 31% и 33% в 12, 16, 20 и 24 мес. возрасте соответственно по сравнению с 2-х мес. животными. В 6 мес. возрасте наблюдается гиперэкспрессия изучаемого гена, превышающая аналогичный показатель у 2-х мес. животных на 91%. В возрасте 4, 8, 18 и 22 мес. достоверного отличия от уровня экспрессии этого гена у мес. крыс не обнаружено. Обнаруженное нами возрастное снижение экспрессии гена СОД 1 в мозге положительно коррелирует с данными по возрастному снижению активности данного фермента (r = 0,812), полученными ранее в исследованиях Бондаренко Т.И. и соавт. (2011). В мозге млекопитающих старение ассоциировано с увеличением окислительного повреждения ядерной ДНК (Martin I., Grotewiel M.S., 2006), особенно в промоторных областях генов нейронов, так как эти области содержат GC-богатые последовательности, которые очень чувствительны к повреждению и не защищены эксцизионной репарацией (Москалев А.А., 2008). Для стабильно экспрессируемых (таких, как ген GAPDH) генов стареющего кортекса характерно небольшое число повреждений ДНК в своей промоторной области, тогда как большинство генов с возрастзависимым снижением регуляции, к числу которых относится и Sod1, имеют значительно большее число повреждений (Lu T. et al., 2004;
Englander E. W. et al., 2006).
б) а) * ** ** ** ** 10-5 у.е.
** 10-5 у.е.
** * ** * 400 * ** ** ** * ** * ** ** ** * ** * 200 * * * 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 5. Относительное содержание мРНК (т.е. уровень относительной экспрессии гена) СОД 1 в мозге (а) и цельной крови (б) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Таким образом, повреждение ДНК может снижать экспрессию наиболее уязвимых генов, что подтверждается нашими результатами по возрастному изменению экспрессии Sod1 в мозге крыс. В то же время, старение сопровождается компенсаторной активацией генов (Москалев А.А., 2008), чем, вероятно, и может быть объяснено отсутствие отличий в экспрессии Sod1 у животных в возрасте 18 и 22 мес. по сравнению с 2 мес. животными.
Эукариоты обладают уникальной способностью использовать для регуляции транскрипции своих генов изменения структуры хроматина. Установлено, что при старении усиливается гетерохроматинизация эухроматиновых районов хромосом, которая коррелирует с инактивацией ранее активных генов (Lezhava T., 2006). Хавинсоном В.Х и соавт. (2003-2009) показана способность регуляторных пептидов увеличивать содержание эухроматина в ядре. Это означает, что большее число генов оказывается доступным для факторов транскрипции, а транскрипция происходит более интенсивно и синтез белка увеличивается.
При введении ДСИП нами обнаружено увеличение экспрессии гена Sod1 в мозге на 14%, 73%, 74%, 201%, 45%, 195% и 55% в 6, 8, 12, 16, 20, 22 и 24 мес. возрасте соответственно по сравнению с интактными животными сходных возрастных групп. В 4 и 18 мес. возрасте при введении ДСИП экспрессия данного гена не изменяется по сравнению с его экспрессией у интактных животных аналогичного возраста (рис. 5а). Эти результаты согласуются с данными Бондаренко Т.И. и соавт. (2011) об увеличении активности СОД при введении ДСИП у животных разного возраста.
Нами обнаружено, что с возрастом экспрессия Sod1 в цельной крови крыс снижается на 20%, 31%, 44%, 53%, 63%, 82% и 76% в 8, 12, 16, 18, 20, 22 и 24 мес. возрасте соответственно по сравнению с 2 мес. животными. В 6 мес. возрасте, так же как и в мозге, наблюдается повышенная экспрессия гена, превышающая аналогичный показатель у 2 мес. крыс на 21%.
ДСИП оказывает стимулирующее влияние на экспрессию Sod1, повышая её на 30%, 24%, 60%, 97%, 56%, 62% и 41% в 8-24 мес. возрасте по сравнению с интактными животными сходного возраста, при этом не влияет на экспрессию этого гена в возрасте 4 и 6 мес. (рис. 5б).
Также нами изучено возрастное изменение экспрессии гена ГПО 1 (Gpx1) и влияние ДСИП на этот процесс. Показано, что экспрессия Gpx1 в мозге крыс с возрастом снижается на 53%, 59%, 74%, 82%, 75%, 82% и 75% в 4, 8, 12, 16, 18, 20 и 24 мес. возрасте соответственно по сравнению с 2 мес. животными. При этом в 6 и 22 мес. возрасте экспрессия этого гена достоверно не отличается от его экспрессии у 2 мес. животных. Как следует из наших данных, снижение экспрессии Gpx1 в мозге крыс обнаруживается гораздо раньше, чем Sod1.
Введение ДСИП животным в течение их жизни приводит к увеличению экспрессии Gpx в мозге на 110%, 44% и 19% в 6, 16 и 22 мес. возрасте соответственно по сравнению с интактными животными сходного возраста (рис. 6а). Возможно, менее значительное воздействие ДСИП на экспрессию Gpx1 по сравнению с экспрессией Sod1 в мозге связано с тем, что, несмотря на возрастную дегенерацию транскриптома (Rodwell G.E. et al., 2004), Gpx экспрессируется на достаточном уровне для выполнения ГПО своей физиологической роли, что косвенно подтверждается данными литературы (Меньщикова Е.Б. и др., 2006). Сравнение изменения экспрессии Gpx1 в мозге с возрастом и при введении ДСИП с изменением активности ГПО в мозге соответствующих групп животных показывает, что в обоих вариантах преобладает отчетливая положительная корреляция (в группах интактных животных r = 0,880, в группах животных с введением ДСИП r = 0,790), т.е. возрастной экспрессионный профиль Gpx вполне соответствует обнаруженным нами биохимическим изменениям активности ГПО в мозге.
Экспрессия Gpx1 в крови интактных животных увеличивается на 399% в 6 мес. возрасте и снижается на 33%, 35%, 45% и 42% в 16, 20, 22 и 24 мес. возрасте соответственно по сравнению с 2 мес. животными, тогда как в 4, 8, 12 и 18 мес. возрасте достоверных отличий не наблюдается.
Введение ДСИП животным способствует повышению экспрессии Gpx1 в крови на 14%, 46%, 43%, 49% и 65% в 4, 12, 16, 18 и 22 мес. возрасте по сравнению с интактными животными сходного возраста. В крови 6, 8, 20 и 24 мес. животных достоверных отличий в экспрессии этого гена по сравнению с интактными животными не обнаружено (рис. 6б).
б) а) ** * ** 10-3 у.е.
10-3 у.е.
* * * ** * * * ** * ** ** * ** ** * * * 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст,месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 6. Уровень относительной экспрессии Gpx1 в мозге (а) и цельной крови (б) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Таким образом, очевидно, что повышение ёмкости АОС организма при старении на фоне введения ДСИП реализуется через стимуляцию экспрессии соответствующих генов антиоксидантных ферментов. Однако, некоторые исследователи полагают, что реализация пептидами своих антиоксидантных свойств возможна и через регуляцию функциональной активности дыхательной цепи митохондрий (Анисимов С.В. и др., 2002).
Влияние ДСИП на активность ферментов электронтранспортной цепи митохондрий разных тканей крыс при старении организма. Ингибирование избыточного свободнорадикального окисления играет важную роль в нормальной деятельности митохондрий, основным источником генерации супероксидного анион-радикала в которых являются убихинон и НАДН-дегидрогеназа комплекса I ЭТЦ митохондрий (Beckman K.B., Ames B.N., 1998).
В нашем исследовании установлено возрастное снижение активности НАДН дегидрогеназы в митохондриальной фракции головного мозга крыс на 69%, 71%, 72%, 77%, 74%, 71%, 72% и 42% в 4-12 и 18-24 мес. возрасте соответственно по сравнению с 2 мес.
животными, что согласуется с данными Blalock E.M. et al. (2003). Введение ДСИП животным приводит к снижению активности НАДН-дегидрогеназы в митохондриальной фракции мозга крыс на 20%, 35%, 17% и 27% в 6, 8, 18 и 20 мес. возрасте соответственно по сравнению с интактными животными сходного возраста (рис. 7а). При этом активность НАДН дегидрогеназы в митохондриальной фракции мозга в группах животных с введением ДСИП не снижается ниже отметки 5,97 мкмоль/мг белка*мин. Это, по мнению Balaban R.S. et al. (2005), соответствует некоему стационарному уровню АТФ, обеспечивающему нормальное функционирование клетки. Возможно, что инактивация этого фермента снижает скорость генерации энергии (наподобие снижения калорийности питания), подавляя не только продукцию АТФ (не ниже определенного уровня), но и образование свободных радикалов (Москалев А. А., 2008).
а) б) в) 35 70 * *** K3[FE(CN)6]/мг*мин мкмоль K3[FE(CN)6]/ K3[FE(CN)6]/мг*мин * * *** *** ** ** * * мкмоль 20 ** мкмоль ** * * мг*мин * * * *** *** * *** * *** * * * * ** * * ** *** * 10 ** ** ** ** ** 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 7. Активность НАДН-дегидрогеназы в митохондриальной фракции мозга (а), сердечной мышцы (б) и печени (в) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Иная картина возрастных изменений активности НАДН-дегидрогеназы наблюдается в митохондриальной фракции, выделенной из сердечной мышцы. В ней значительные изменения активности фермента происходят гораздо позже (в 12 мес.), чем в митохондиальной фракции мозга, и, в отличие от последней, в возрасте 24 мес. изменения активности данного фермента относительно 2 мес. крыс отсутствуют (рис. 7б). Активность НАДН-дегидрогеназы снижена на 5%, 44%, 43%, 43%, 56% и 62% в 4, 12, 16, 18, 20 и 22 мес. возрасте соответственно по сравнению с 2 мес. животными. Введение ДСИП приводит к увеличению активности НАДН дегидрогеназы в митохондриальной фракции сердечной мышцы на 41% и 59% в 20 и 22 мес.
возрасте соответственно по сравнению с интактными животными сходного возраста, т.е. в те возрастные периоды, когда происходит максимальное снижение активности фермента у интактных животных соответствующего возраста. При этом активность НАДН-дегидрогеназы в группах с введением ДСИП после 8 мес. возраста стабилизируется около отметки 38,85±0, мкмоль/мг белка* мин.
Характер возрастного изменения активности НАДН-дегидрогеназы в митохондриях, выделенных из печени, напоминает аналогичный в митохондриальной фракции мозга с теми лишь отличиями, что отсутствуют столь выраженные пики повышенной активности, характерные для мозга, и снижение активности фермента в процентном отношении несколько меньше, чем в мозге. Введение животным ДСИП приводит к снижению активности НАДН дегидрогеназы в митохондриальной фракции печени на 7% и 41% в 4 и 18 мес. возрасте, и повышению активности на 19% в 12 мес. возрасте по сравнению с животными сходного возраста без введения ДСИП. Таким образом, несмотря на определенные различия в характере изменения активности НАДН-дегидрогеназы под влиянием ДСИП в разных тканях, прослеживается общая тенденция на стабилизацию её активности на определенном уровне, более выраженная в сердечной мышце и менее выраженная, но раньше обнаруживаемая в мозге (рис. 7в).
В литературе имеются противоречивые данные, касающиеся изменения активности комплекса II ЭТЦ (СДГ) c возрастом. Наши данные согласуются с данными, полученными Канунниковой Н.П. и др. (2011), и свидетельствуют о том, что с возрастом активность СДГ снижается в мозге в 24 мес. возрасте, в сердечной мышце - в 18, 22 и 24 мес. возрасте, и в печени - в 20, 22 и 24 мес. возрасте по сравнению с 2 мес. животными. Достоверных изменений активности СДГ в митохондриальной фракции исследованных нами тканей при введении ДСИП не обнаружено.
Таким образом, ДСИП способен воздействовать на функциональное состояние митохондрий, оказывая влияние на комплекс I ЭТЦ, а это, в свою очередь, возможно, снижает продукцию свободных радикалов митохондриями, что в совокупности со способностью данного пептида повышать емкость АОС организма может приводить к снижению уровня свободнорадикального окисления белков и ДНК.
Влияние ДСИП на окислительную модификацию суммарных белков разных тканей крыс при физиологическом старении организма. Активные кислородные метаболиты при старении способны вызывать различные повреждения белковых молекул, такие как окисление аминокислотных остатков, образование белок-белковых сшивок, фрагментацию молекул. Содержание окисленно-модифицированных белков является важным показателем развития возрастного окислительного стресса (Зенков Н.К. и др., 2003).
Важную роль в поддержании окислительно-восстановительного баланса в организме играют легкоокисляющиеся белки, в состав которых входят SH-содержащие аминокислоты (Соколовский В.В., 1988). Результаты нашего исследования уровня сульфгидрильных групп (SH-групп) в суммарных белках тканей крыс при физиологическом старении организма свидетельствуют о наличии общей тенденции к его снижению. Максимальное снижение концентрации SH-групп в белках большинства тканей (исключение составляет сердечная мышца) приходится не на поздние этапы онтогенеза (22 и 24 мес.), а на более ранний период (12-20 мес. в зависимости от ткани). При этом степень нарушения тиолдисульфидного баланса не одинакова в разных тканях (рис. 8-9).
а) 500 б)400 в) ** ** ** * 400 ** ** ** * мкмоль/ г белка мкмоль/г белка мкмоль/г белка * * * ** *** * * *** * * * *** *** * * * ** * ** * 300 * ** * * ** * * ** * *** * *** * ** *** * *** * * *** 200 *** *** *** *** 100 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 8. Содержание SH-групп в суммарных белках мозга (а), сердечной (б) и скелетных мышц (в) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Максимальный эффект ДСИП (рассчитанный как среднее его статистически значимых положительных эффектов в каждом возрасте в процентах) наблюдается в сердечной мышце ( %), менее значительно его действие проявляется в почках (33%), селезенке (30%), печени (27%), в мозге (25%) и скелетных мышцах (25%), а минимальная эффективность характерна для семенников (15%). При этом максимальное увеличение концентрации SH-групп в суммарных белках печени и скелетных мышцах зафиксировано на ранних этапах онтогенеза (в 4 и 6 мес.
возрасте соответственно), в селезенке - в 16 мес., в мозге, почках и семенниках - в 22 мес., а в сердечной мышце - в 24 мес. Также у животных с введением ДСИП нами обнаружена выраженная положительная корреляция между уровнем SH-групп в белках и активностью ГПО (в скелетных мышцах), содержанием GSH и активностью ГР (в печени и селезенке), и содержанием GSH (в семенниках). В последние годы выдвигаются предположения, что посредством обратимого и необратимого окисления SH-групп в белках возможны изменения программ клеточного развития (Меньщикова Е.Б. и др., 2006). В этом свете, хронологически избирательное повышение уровня SH-групп в белках у животных с введением ДСИП, вероятно, имеет важное биологическое значение.
Наблюдаемое у животных с введением ДСИП увеличение уровня SH-групп может оказывать протекторное действие на другие функциональные группы белков, препятствуя, в частности, нарастанию ещё одного типа окислительной модификации белков - образованию карбонильных групп, которое происходит при окислении боковых цепей аминокислот (лизина, аргинина, гистидина, пролина, треонина, глутаминовой и аспарагиновой кислот) и затрагивает до 30% белка. Такая модификация метит белки для деградации цитозольными протеазами или протеосомой, но темп белкового обмена с возрастом снижается, что может приводить к накоплению поврежденных белков в стареющей клетке (Tavernarakis N., Driscoll M., 2002;
Martin I., Grotewiel M.S., 2006).
в) а) 500 б) ** ** * ** ** * ** ** мкмоль/ г белка мкмоль/г белка * *** 300 * ** *** *** * ** мкмоль/г белка ** *** * * *** * ** * * * ** * *** * *** 300 *** *** * * *** * *** * * * *** * 200 *** * 200 *** * 0 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст,месяцы возраст, месяцы г) ** мкмоль/г белка интактные животные * * ** ** * * * 300 *** * животные с введением ДСИП *** * * *** * *** *** Рис. 9. Содержание SH-групп в суммарных белках печени (а), селезенки (б), семенников (в) и почек (г) крыс разного возраста и 2 4 6 8 12 16 18 20 22 при введении ДСИП. Обозначения как на рис. возраст, месяцы Нами подтверждено, что во всех перечисленных выше тканях, за исключением семенников, уровень карбонильных групп (CO-групп) в белках на поздних этапах онтогенеза значительно выше, чем у молодых животных. При этом максимальное увеличение концентрации CO-групп по сравнению с их уровнем в белках 2 мес. крыс наблюдается в сердечной мышце, далее в порядке уменьшения в селезенке, мозге, почках, печени, семенниках и скелетных мышцах. Подкожное введение ДСИП животным в течение жизни способствует снижению уровня CO-групп в суммарных белках изученных тканей, при этом наиболее интенсивное снижение происходит в белках мозга - на 44% в 24 мес.;
в белках сердечной мышцы - на 32% в 20 мес.;
в белках скелетных мышц - на 21% в 20 мес.;
печени - на 34% в мес.;
почек - на 39% в 24 мес.;
селезенки - на 27% в 16 мес.;
семенников - на 18% в 12 мес.
возрасте по сравнению с интактными животными сходного возраста (рис. 10-11).
б) 80 в) а) 60 * * * *** * * * * *** мкмоль/ г белка * мкмоль/ г белка * ** *** мкмоль/ г белка * * * ** * 40 ** ** ** * *** ** ** ** * ** ** 40 * *** * * 20 * * * 20 0 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 10. Содержание карбонильных групп в суммарных белках мозга (а), сердечной (б) и скелетных мышц (в) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Наряду с карбонилпроизводными аминокислот показателем окислительной модификации белков также является уровень окисленной аминокислоты - тирозина (Арутюнян А.В. и др., 2000). Окисление тирозина в белках сопровождается образованием битирозина за счет поперечных сшивок между окисленными остатками этой аминокислоты (Хавинсон В.Х. и др., 2003).
Результаты нашего исследования показывают, что максимальное возрастное изменение концентрации битирозина наблюдается в белках сердечной мышцы и селезенки, а минимальное - в белках почек и семенников. В суммарных белках скелетных мышц возрастное увеличение концентрации битирозина менее выражено по сравнению с белками мозга и сердечной мышцы, и регистрируется только, начиная с 18 мес. возраста, как и увеличение концентрации CO-групп (рис. 12-13).
б) а)40 в) 30 * * * * *** * * * *** * * *** ** * * мкмоль/ г белка мкмоль/ г белка 30 ** ** мкмоль/ г белка *** * * ** * ** * ** * * * * ** * * * * *** * ** ** ** *** ** ** ** ** *** ** ** *** ** 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст,месяцы возраст, месяцы г) * * * * * мкмоль/ г белка *** интактные животные * ** ** ** * ** ** * ** 20 животные с введением ДСИП * Рис. 11. Содержание карбонильных групп в суммарных белках печени (а), селезенки (б), семенников (в) и почек (г) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы Введение ДСИП приводит к снижению концентрации битирозина в белках всех исследованных нами тканей по сравнению с его уровнем у интактных животных, причем наибольший эффект проявляется в белках тканей печени (на 33% в 18 мес.) и селезенки (на 35% в 16 мес.), менее выраженный - в белках скелетных мышц (на 31% в 20 мес.), почек (на 30% в 24 мес.), сердечной мышцы (на 28% в 24 мес. возрасте) и белках мозга (на 25% в 22 мес.), а минимальный - в семенниках (на 11% в 12 мес.). Таким образом, значительное влияние ДСИП на этот тип окислительной модификации белков наблюдается в основном в более позднем онтогенезе (рис. 12-13).
в) 0, а) 0,50 б) 0,15 * * * * * * * *** * *** *** 0,40 * 0, у.е./ мг белка *** у.е./ мг белка у.е./ мг белка * ** ** ** ** ** ** * * * * 0,10 ** * 0,30 *** * ** * 0, ** ** ** ** ** * 0, * * 0, 0, 0, 0,00 0,00 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 12. Содержание битирозина в суммарных белках мозга (а), сердечной (б) и скелетных мышц (в) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Наличие корреляционных взаимосвязей между уровнем CO-групп и SH-групп, битирозиновых сшивок в белках, восстановленного глутатиона и активностью антиоксидантных ферментов в исследованных тканях, свидетельствует о том, что обнаруженные эффекты ДСИП в регуляции окислительной модификации белков безусловно связаны с его способностью стимулировать АОС.
Подвергшиеся окислительной модификации белки и дефектные белки, являющиеся следствием повреждения генетического материала с возрастом, должны эффективно удаляться из клетки, что обеспечивается слаженной работой её протеолитических систем, в том числе протеолитических ферментов лизосом.
а) 0,15 б) 0,25 в) 0,15 * * * * *** * * * * * * * *** * ** * * *** *** 0, у.е./ мг белка у.е./мг белка у.е./ мг белка ** * 0,10 0, * ** ** ** ** * * * 0, * * *** * * ** ** *** ** ** ** ** ** ** ** 0, ** 0,05 0, 0, 0,00 0,00 0, 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы возраст, месяцы г) 0, интактные животные у.е./ мг белка * * * * * 0, животные с введением ДСИП *** ** ** ** ** ** 0,05 Рис. 13. Содержание битирозина в суммарных белках печени (а), селезенки (б), семенников (в) и почек (г) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. 0, 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы Влияние ДСИП на состояние мембран лизосом и интенсивность лизосомального протеолиза в разных тканях крыс при старении организма. Состояние мембран лизосом оценивали косвенным способом, определяя активность кислых пептидгидролаз (рН 4,5) (КПГ) во фракции, обогащенной лизосомами, и растворимой фракции, и по приросту их активности в последней судили о дестабилизации структуры лизосомальной мембраны. Нами обнаружено, что активность КПГ в растворимой фракции мозга крыс увеличивается в 6-20 и 24 мес. возрасте с максимумом в 18 мес. (на 83%) по сравнению с 2 мес. животными, что свидетельствует о возрастной дестабилизации структуры лизосомальной мембраны, сопровождающейся увеличением выхода кислых пептидгидролаз в цитозоль клетки (рис. 14).
б) в) a) 600 * 400 * * * * * * * * * мкг тирозина/ 10 мг * * мкг тирозина/10 мг мкг тирозина/ 10 мг ** * * * * 300 ** * * ** 400 ** белка* час * белка*час ** ** белка*час ** ** * * ** ** ** 200 ** ** ** ** * ** ** 200 * * ** ** ** ** * 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 14. Активность кислых пептидгидролаз в растворимой фракции мозга (а), сердечной мышцы (б) и печени (в) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Сходные изменения наблюдаются и в отношении мембран лизосом сердечной мышцы, однако степень выраженности возрастного повышения активности КПГ в растворимой фракции значительно выше: активность увеличивается в 4 и 8-24 мес. возрасте с максимумом в 18 мес.
(на 373%) по сравнению с 2 мес. животными. В растворимой фракции печени с возрастом активность КПГ также увеличивается в 8-24 мес. возрасте с максимумом в 24 мес. (на 181%) по сравнению с 2 мес. животными (рис. 14). Введение ДСИП приводит к снижению активности КПГ в растворимой фракции мозга на 41%, 50%, 58%, 55%, 45%, 77% и 32% в 6 и 12-24 мес.
возрасте соответственно;
в растворимой фракции сердечной мышцы на 44%, 36%, 27%, 10%, 22%, 23% и 36% в 4, 6, 12 и 18-24 мес. возрасте соответственно;
в растворимой фракции печени на 52%, 47%, 20%, 20%, 42%, 62% и 22% в 6-22 мес. возрасте соответственно по сравнению с интактными животными сходного возраста (рис. 14). Это может свидетельствовать о стабилизирующем влиянии пептида на мембраны лизосом этих тканей.
В ходе исследования нами подтвержден описанный в литературе факт возрастного изменения активности пептидгидролаз в лизосомальной фракции тканей животных и обнаружена способность ДСИП влиять на активность КПГ в лизосомах. По нашим данным, профиль возрастных изменений лизосомального протеолиза в мозге, сердечной мышце и печени имеет схожие черты (рис. 15).
б) в) а) 800 * * * * *** *** * *** мкг тирозина/ 10 мг ** мкг тирозина/ 10мг ** * * * 1000 * мкг тирозина/ 10 мг ** ** 600 *** ** * *** *** * ** ** ** * ** белка* час белка*час *** *** *** белка*час * *** * * ** 400 ** * * *** * 0 0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст,месяцы возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис 15. Активность кислых пептидгидролаз в лизосомальной фракции мозга (а), сердечной мышцы (б) и печени (в) крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Введение ДСИП оказывает неоднозначное влияние на внутрилизосомальную активность КПГ в мозге крыс разного возраста: активность КПГ во фракции, обогащенной лизосомами, увеличивается на 53%, 28%, 27%, 17% и 71% в 4, 6, 8, 20 и 24 мес. возрасте соответственно, и снижается на 43% и 18% в 12 и 16 мес. возрасте по сравнению с интактными животными сходного возраста. В данном случае объяснение описанных изменений хорошо укладывается в сформулированный Гомазковым О.А. (2011) принцип «цены баланса»: ДСИП повышает активность КПГ там, где в лизосомальной фракции тканей соответствующих возрастных групп интактных животных происходит её снижение, и снижает там, где наблюдается её повышение.
Введение ДСИП увеличивает интенсивность лизосомального протеолиза в сердечной мышце на 20% и 36% в 4 и 24 мес. соответственно;
в печени - на 22% и 37% в 8 и 24 мес.
соответственно по сравнению с интактными животными сходного возраста. Т.е. наибольшая эффективность ДСИП в регуляции активности КПГ во фракции, обогащенной лизосомами, проявляется в мозге и менее значительно его влияние в сердечной мышце и печени.
Способность ДСИП регулировать активность лизосомальных пептидгидролаз и повышать ёмкость АОС, должна играть, если и не ключевую, то важную роль в утилизации поврежденных белков при старении организма.
Подвергшиеся окислительной модификации белки и дефектные белки могут быть следствием повреждения с возрастом генетического материала. Поэтому, безусловно, изучение влияния ДСИП на окислительную модификацию ДНК при старении является важным для понимания молекулярного механизма реализации геропротекторной активности этого пептида.
Одним из проявлений подобного повреждения ДНК при старении может быть увеличение числа хромосомных аберраций (Хавинсон В.Х. и др., 2012).
Влияние ДСИП на частоту хромосомных аберраций и митотическую активность в эпителии роговицы глаза крыс при старении организма. Нами показано, что с возрастом в ткани эпителия роговицы глаза крыс происходит увеличение частоты хромосомных аберраций, причем в основном за счет аберраций типа единичный фрагмент (от 11 до 100% от общего числа аберраций) и хромосомный мост (от 0 до 85% от общего числа аберраций). Другие детектируемые аберрации: двойные и множественные фрагменты у исследованных возрастных групп животных встречаются редко, их число составляет от 0 до 10% и от 0 до 20% соответственно от общего числа аберраций. Это согласуется с данными Wojda A. и Witt M.
(2003) о том, что различные цитогенетические нарушения с возрастом накапливаются не в одинаковой степени. Частота хромосомных аберраций с возрастом увеличивается на 79%, 96%, 148%, 171%, 145%, 168% и 187% у 8-24 мес. животных соответственно по сравнению с 2-х мес.
животными. Снижение ёмкости антиоксидантной системы в тканях крыс в ходе онтогенеза и увеличение образования свободных радикалов и их продуктов может вызывать окислительные модификации ДНК и приводить, вследствие этого, к накоплению хромосомных аберраций.
Также одной из причин накопления повреждений ДНК с возрастом может быть снижение эффективности систем её репарации.
Введение ДСИП животным приводит к уменьшению числа хромосомных аберраций на 41%, 43%, 56%, 35%, 46% и 50% у 6, 16, 18, 20, 22 и 24 мес. животных соответственно по сравнению с интактными животными сходного возраста (рис. 16а), при этом не только уменьшается суммарный уровень хромосомных аберраций, но и изменяется распределение по их типам: практически во всех случаях ДСИП способствует снижению числа хромосомных мостов и двойных фрагментов. Эффект ДСИП в отношении снижения уровня хромосомных аберраций реализуется, вероятно, через его способность модулировать активность АОС организма. Это, в свою очередь, приводит к снижению концентрации малонового диальдегида (Бондаренко Т.И. и др., 2011), который, как показано Дмитриевым Л.Ф. (1992), может создавать межнитевые сшивки комплементарных цепей ДНК причем в местах будущих репликативных вилок, делая тем самым невозможной её репликацию и блокируя клеточный цикл. Вероятно, этот механизм также имеет непосредственное отношение к способности ДСИП воздействовать и на митотическую активность.
а) б) 1, * * ** * * * * 0, % хромосомных * * *** * 10 ** аберраций *** 0, ** ** ** ** % ** ** ** 0, *** ** 0, 0, 2 4 6 8 12 16 18 20 22 2 4 6 8 12 16 18 20 22 возраст, месяцы возраст, месяцы интактные животные животные с введением ДСИП Рис. 16. Уровень хромосомных аберраций (а) и митотический индекс (МИ) (б) в эпителии роговицы глаза крыс разного возраста и при введении ДСИП. Обозначения как на рис. Нами показано, что митотическая активность эпителия роговицы глаза увеличивается у интактных крыс в возрасте 22 и 24 мес. на 47% и 42% соответственно на фоне увеличения уровня хромосомных аберраций на 168% и 187% по сравнению 2 мес. крысами. У животных с введением ДСИП зафиксировано увеличение митотического индекса на 42%, 32%, 47% и 35% у 12, 16, 18 и 24 мес. животных соответственно по сравнению с интактными животными сходного возраста (рис. 16б). Полученные данные свидетельствуют о лимитирующем влиянии ДСИП на возрастное накопление нарушений клеточного цикла, а, следовательно, о его стабилизирующем влиянии на передачу генетической информации в процессе митоза от одной соматической клетки к другой.
Таким образом, анализ полученных результатов исследования свидетельствует о выраженном геропротекторном эффекте ДСИП, реализующимся через модуляцию важнейших метаболических путей, и позволяет говорить о его универсальной роли в поддержании структурно-метаболического гомеостаза в различных органах и тканях стареющего организма.
ВЫВОДЫ 1. Стимулируя активность глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, глутатионредуктазы и увеличивая концентрацию восстановленного глутатиона в тканях и эритроцитах крыс при старении организма, ДСИП повышает ёмкость и регулирует согласованное действие ферментативного и неферментативного звена АОС. ДСИП в разной степени влияет на компоненты глутатинозависимой АОС и это влияние имеет наиболее выраженный характер в постмитотических необновляемых тканях.
2. Введение ДСИП животным в течение их жизни увеличивает экспрессию генов супероксиддисмутазы 1 и глутатионпероксидазы 1 в мозге и ядросодержащих клетках крови, экспрессия которых снижается при физиологическом старении организма.
3. В митохондриальной фракции мозга крыс разного возраста под влиянием ДСИП обнаружено снижение активности НАДН-дегидрогеназы, что может оказывать лимитирующее действие на выработку свободных радикалов в ЭТЦ митохондрий, в то же время, поддерживая или не нарушая (в случае сукцинатдегидрогеназы) нормальное функционирование других ферментов ЭТЦ. Увеличение активности НАДН-дегидрогеназы в митохондриальной фракции сердечной мышцы и печени в группах животных с введением ДСИП наблюдается в те возрастные периоды, когда происходит максимальное снижение активности фермента у интактных животных соответствующего возраста. Это свидетельствует об общей тенденции на стабилизацию активности НАДН-дегидрогеназы на определенном уровне в митохондриальной фракции разных тканей при введении ДСИП.
4. Введение ДСИП приводит к снижению окислительной модификации суммарных белков тканей крыс при старении, причем степень влияния данного пептида имеет тканеспецифический и гетерохронный характер.
5. ДСИП оказывает стабилизирующее влияние на мембраны лизосом мозга, сердечной мышцы и печени крыс разного возраста, что сопровождается увеличением интенсивности лизосомального протеолиза и, вероятно, способствует деградации аберрантных белков.
6. Введение ДСИП животным в течение их жизни приводит к уменьшению числа хромосомных аберраций в эпителии роговицы глаза животных разных возрастных групп, что является важным фактором, снижающим риск развития спонтанных опухолей и повышающим выживаемость животных.
7. У животных разного возраста с введением ДСИП зафиксировано увеличение митотического индекса в эпителии роговицы глаза, что позволяет рассматривать данный пептид как потенциальный митогенный стимулятор, повышающий регенеративный потенциал ткани.
Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ Кутилин Д.С. Влияние пептида, индуцирующего дельта-сон, на окислительную 1.
модификацию белков в тканях и крови крыс при физиологическом старении организма / Бондаренко Т.И, Сорокина И.А., Майборода Е.А., Дурканаева О.А., Кутилин Д.С., Михалева И.И. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, №3.
- С. 350-354 (0,2 п.л., личн. вк. 45 %). (Bondarenko T. I., Sorokina I. A., Mayboroda E. A., Durkanaeva O. A., Kutilin D. S., Mikhaleva I. I. Effect of Delta Sleep-Inducing Peptide on Oxidative Modification of Proteins in Rat Tissues and Blood during Physiological Aging // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 153, № 3. - P. 371-374 (0,16 п.л., личн. вк. 45 %).) Кутилин Д.С. Влияние пептида дельта-сна на уровень хромосомных аберраций и 2.
митотическую активность эпителия роговицы глаза крыс при физиологическом старении организма / Кутилин Д.С., Бондаренко Т.И., Михалева И.И. // Валеология. - 2012. - №2. - С.
29-35 (0,29 п.л., личн. вк. 90 %).
Список работ, опубликованных по теме диссертации 3. Кутилин Д.С. Пептид дельта-сна как геропротектор / Бондаренко Т.И., Майборода Е.А., Сорокина И.А., Дурканаева О.А., Кутилин Д.С., Михалева И.И., Прудченко И.А. // В мат. V Национального конгресса геронтологов и гериатров Украины, Украина, Киев, 2010. - С. (0,04 п.л., личн. вк. 45 %).
4. Кутилин Д.С. Нейропептиды для медицины / Бондаренко Т.И., Майборода Е.А., Кутилин Д.С., Михалева И.И. // В мат. 7-Международного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Украина, Судак, 2011. - С. 101 (0,04 п.л., личн. вк. 55 %).
5. Кутилин Д.С. Фармакологическая эффективность дельта-сон индуцирующего пептида в профилактике преждевременного старения организма / Бондаренко Т.И., Майборода Е.А., Кутилин Д.С., Михалева И.И., Прудченко И.А. // В мат. Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2011. - С. 420 (0,04 п.л., личн. вк. 55 %).
6. Кутилин Д.С. Влияние пептида, индуцирующего дельта-сон, на состояние глутатионзависимой антиоксидантной системы тканей крыс при естественном старении организма / Кутилин Д.С., Бондаренко Т.И., Михалева И.И. // В мат. Всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования», Махачкала, 2011. - С. 53- (0,2 п.л., личн. вк. 80 %).
7. Кутилин Д.С. Влияние пептида, индуцирующего дельта-сон, на состояние глутатионзависимого звена антиоксидантной системы организма на разных этапах постнатального развития крыс // В сб. тр. аспирантов и соискателей ЮФУ, Ростов-на-Дону, 2011. - С.115-120 (0,24 п.л., личн. вк. 100 %).
8. Кутилин Д.С. Механизм действия синтетических аналогов природных олигопептидов антиоксидантов в онтогенезе животных / Бондаренко Т. И., Кутилин Д.С., Михалева И.И. // В мат. 2-ой Всероссийской научной конференции «Свободные радикалы и старение», Астрахань, 2011. - С. 28-30 (0,12 п.л., личн. вк. 70 %).
9. Кутилин Д.С. Влияние пептида дельта-сна на окислительную модификацию биополимеров в тканях крыс при их физиологическом старении / Кутилин Д.С., Бондаренко Т.И., Михалева И.И. // В мат. IV Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины», Ростов-на-Дону, 2011. - С. 177-178 (0,08 п.л., личн. вк. 75 %).
10. Кутилин Д.С. Регуляция природными метаболитами окислительной модификации белков при естественном старении организма / Бондаренко Т.И., Сорокина И.А., Майборода Е.А., Кутилин Д.С., Котов С.В., Дурканаева О.А., Михалева И.И. // В трудах II Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Новосибирск, 2011. - С. 79 (0,04 п.л., личн. вк. %).
11. Кутилин Д.С. Роль дельта-сон индуцирующего пептида в регуляции окислительного стресса при физиологическом старении организма / Бондаренко Т.И., Майборода Е.А., Кутилин Д.С., Михалева И.И. // В мат. 7-Международной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Смоленск, 2011. - С. 31-32 (0,08 п.л., личн. вк. 50 %).
12. Кутилин Д.С. Изыскание и изучение лекарственных средств, замедляющих процесс старения / Бондаренко Т.И., Майборода Е.А., Кутилин Д.С., Михалева И.И., Прудченко И.А. // В мат. XII международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке", Москва, 2011. - С. 39-40 (0,08 п.л., личн. вк. 45 %).
13. Кутилин Д.С. Роль дельта-сон индуцирующего пептида в регуляции уровня хромосомных аберраций и митотической активности эпителия роговицы глаза крыс при физиологическом старении организма // В мат. 16-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2012. - С. 425 (0,04 п.л., личн. вк.
100 %).
14. Кутилин Д.С. Разработка способов коррекции возрастного окислительного стресса / Бондаренко Т.И., Кутилин Д.С., Майборода Е.А., Михалева И.И. // В мат. III Съезда геронтологов и гериатров России, Новосибирск, 2012. - С. 46-47 (0,08 п.л., личн. вк. 50 %).
15. Кутилин Д.С. Роль дельта-сон индуцирующего пептида в регуляции окислительного повреждения белков при физиологическом старении организма / Кутилин Д.С., Котов С В.
// В мат. II Всероссийской с международным участием молодежной научной школы конференции «Биология будущего: традиции и новации», Екатеринбург, 2012. - С. 255- (0,2 п.л., личн. вк. 90 %).
Список использованных сокращений АОС - антиоксидантная система СОД - супероксиддисмутаза АТФ - аденозинтрифосфат СОД 1 - супероксиддисмутаза ГПО - глутатионпероксидаза СДГ - сукцинатдегидрогеназа ГПО 1 - глутатионпероксидаза 1 ХДНБ -1,2-динитро-хлор-бензол ГР - глутатионредуктаза ЭТЦ - электронтранспортная цепь Г-S-Т - глутатион-S-трансфераза СО-группы - карбонильные группы КПГ - кислые пептидгидролазы SH-группы - сульфгидрильные группы кДНК - комплементарная ДНК GSH - восстановленная форма МИ - митотический индекс глутатиона мРНК - матричная РНК Gpx 1 - ген глутатионпероксидазы НАДН - никотинамидадениндинуклеотид GAPDH - глицеральдегид-3 восстановленный фосфатдегидрогеназа НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат NCBI - National Center for Biotechnology восстановленный Information ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном Sod 1 - ген супероксиддисмутазы времени