Получение генетически кодируемых fret-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков dsred2 и tagrfp
На правах рукописи
Арсланбаева Ляйсан Равиловна ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ FRET-СЕНСОРОВ КАСПАЗЫ-3 НА ОСНОВЕ ТЕРБИЙ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ПЕПТИДА И КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ DsRed2 И TagRFP Специальность 03.01.04 – «биохимия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН
Научный консультант: доктор химических наук, профессор А.П. Савицкий
Официальные оппоненты: доктор биологических наук К.А. Лукьянов, доктор биологических наук, профессор Н.В. Карапетян Биологическ факультет
Ведущая организация:
Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова
Защита состоится «10» февраля 2011 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха по адресу: 199071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 199071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.
Автореферат разослан «27» декабря 2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Апоптоз является одним из вариантов программированной гибели клеток.
Он участвует в гистогенезе и поддержании гомеостаза организма. Нарушения процесса апоптоза приводят к развитию нейродегенеративных, опухолевых, аутоиммунных заболеваний. За запуск протеолитического каскада каспаза зависимого апоптоза отвечают инициаторные и эффекторные каспазы. Среди них каспаза-3 является центральным ферментом апоптоза, так как на ней сходятся рецепторный и митохондриальный пути активации протеолитического каскада. В активном состоянии она инициирует активацию других эффекторных каспаз и гидролизует различные клеточные субстраты. Фермент представляет интерес как терапевтическая мишень при воздействии на клетку различных лекарственных препаратов, индуцирующих апоптоз. Уровень активности каспазы-3 является важным прогностическим маркером для оценки агрессивности патологических процессов и эффективности действия лекарственных средств.
Для изучения ферментативной активности в живых клетках в последнее время активно разрабатываются FRET-биосенсоры, в основе действия которых лежит метод индуктивно-резонансного переноса энергии. По изменению параметров FRET можно проводить прямой мониторинг ферментативной активности.
В настоящее время активно ведется разработка FRET-биосенсоров, где в качестве доноров и акцепторов используются флуоресцентные белки. Объединение нуклеотидной последовательности флуоресцентных белков и субстрата каспазы-3 в единой рамке считывания является основой разработки генетически кодируемых сенсоров каспазной активности. Индуктивно-резонансный перенос энергии в данных сенсорах проявляется как динамический тип тушения флуоресценции донора и, соответственно, характеризуется снижением времени жизни донора в возбужденном состоянии. Гидролиз линкера, содержащего аминокислотную последовательность DEXD, специфически распознаваемой каспазой-3, приводит к физическому разделению донора и акцептора, в результате чего условия переноса Принятые сокращения: Трп-СП – триптофан в составе тербий-связывающего пептида, Tb3+ – ион тербия, Tb3+-СП – тербий-связывающий пептид, DsRed2 – красный флуоресцентный белок (Discosoma Red fluorescent protein), TagRFP – красный флуоресцентный белок (Red Fluorescent Protein), Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 – гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида, линкера с сайтом распознавания каспазы-3 и красного флуоресцентного белка DsRed2, Tb3+-СП DEVD-TagRFP – гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида, линкера с сайтом распознавания каспазы-3 и красного флуоресцентного белка TagRFP, FRET – флуоресцентный резонансный перенос энергии (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
энергии нарушаются и, соответственно, снимается тушение. Данные сенсоры обладают преимуществами по сравнению с синтетическими флуорогенными субстратами. Это связано с тем, что генетически кодируемые сенсоры экспрессируются самой клеткой и не требуют внешней инъекции, кроме того они являются высоко стандартизованными метками со строго определенными точками присоединения белков друг к другу.
Для решения проблемы фонового сигнала клеток, связанной с автофлуоресценцией биомолекул и светорассеянием, разрабатывают сенсоры на основе белков со спектром флуоресценции в красной и дальнекрасной области.
Другим подходом является использование в качестве доноров во FRET-паре флуоресцирующих комплексов лантанидов с микро- и миллисекундным временем жизни в возбужденном состоянии. При переносе энергии от донора-лантанида время жизни возбужденного состояния акцептора увеличивается на порядки по сравнению с естественным временем жизни флуоресценции. Перекрывание спектра флуоресценции тербия и возбуждения красных флуоресцентных белков создает условия для эффективного переноса энергии и последующего испускания микросекундной флуоресценции красным флуоресцентным белком. Использование спектроскопии с временной задержкой позволит избежать регистрации короткоживущего фонового сигнала клеток, что важно в условиях низкой интенсивности сигнала FRET-пары.
Цели и задачи работы Целью данной работы являлась разработка генетически кодируемых сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Получение генно-инженерных конструкций, содержащих участки ДНК, кодирующие тербий-связывающий пептид, линкер с сайтом распознавания каспазы-3 и один из красных флуоресцентных белков DsRed2 или TagRFP;
2. Оптимизация условий синтеза, выделения и очистки гибридных белков до гомогенного состояния;
3. Изучение условий, при которых перенос энергии происходит максимально эффективно;
4. Изучение гидролиза полученных FRET-сенсоров каспазой-3.
Научная новизна Впервые получены генетически кодируемых FRET-пары Tb3+-СП-DEVD DsRed2 и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP, внутри которых происходят два индуктивно-резонансных переноса энергии: от тербий-связывающего пептида к иону Tb3+, и от иона Tb3+ к красному флуоресцентному белку. На основании изменений времени жизни Tb3+ была рассчитана эффективность переноса энергии от Tb3+ к хромофору белка. Для белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 она составила 28%, для белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP – 35%. Показано, что повышение ионной силы в растворе приводит к снижению времени жизни Tb3+ в возбужденном состоянии в обеих FRET-парах. Белок Tb3+-СП-DEVD-DsRed2, который по данным динамического светорассеяния является тетрамером, не гидролизуется каспазой-3, в отличие от димерного белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP, который эффективно расщепляется каспазой-3 за исследуемые промежутки времени. Полученный FRET сенсор Tb3+-СП-DEVD-TagRFP может быть использован для изучения ферментативной активности каспазы-3 в живых клетках.
Практическая значимость работы Полученный FRET-сенсор Tb3+-СП-DEVD-TagRFP может быть использован для определения активности каспазы-3 in vitro.
Апробация работы Основные материалы диссертации были доложены на международной научной конференции International Symposium «Topical Problems of Biophotonics – 2007» (Нижний Новгород–Москва–Нижний Новгород, 2007), на всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008), на V съезде Российского фотобиологического общества (Московская обл., г. Пущино, 2008), на международной научной конференции II International Symposium «Topical Problems of Biophotonics – 2009» (Нижний Новгород–Самара–Нижний Новгород, 2009).
Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 124 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 ссылок. Диссертация содержит 35 рисунков и 8 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты исследования Конструирование рекомбинантных плазмид. В качестве вектора для клонирования использовали трансляционный вектор pET22b («Novagen», США).
Фрагмент ДНК, содержащий слитые в единой рамке считывания последовательности, кодирующие Tb3+-СП (YIDTNNDGWYEGDELLA) и белок DsRed2, клонировали в векторе pET22b по сайтам NdeI и EcoRI. Между последовательностью Tb3+-СП и геном DsRed2 по сайту SalI вводили линкер, кодирующий пептид с сайтом распознавания каспазы- (VDGGSGGDEVDGWGGSGLD). В результате была получена плазмида pET22b/Tb3+-СП-DEVD-DsRed2.
Плазмида pET22b/Tb3+-СП-DEVD-TagRFP, содержащая слитые в единой рамке считывания последовательности, кодирующие Tb3+-СП, линкер с сайтом распознавания каспазы-3 и белок TagRFP, получена путем замещения SalI-EcoRI фрагмента, содержащего ген DsRed2, в плазмиде pET22b/Tb3+-СП-DEVD-DsRed на SalI-EcoRI-фрагмент, содержащий ген TagRFP.
Получение высокоочищенных фракций гибридных белков Tb3+-СП-DEVD DsRed2 и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP. Для изучения процессов переноса энергии с участием ионов Tb3+ нельзя было использовать методику получения и очистки белка с использованием полигистидиновой аффинной последовательности, поскольку полигистидиновая аффинная метка будет связывать ионы Tb3+. Поэтому первоначально была выбрана методика получения и очистки рекомбинантных белков путем интеин-опосредованной хроматографии, которая предполагает получение высокоочищенных фракций белков, не содержащих каких-либо аффинных меток. Однако оказалось, что получение функционально активных белков этим методом характеризуется низким выходом целевых белков при их выделении. В связи с этим был выбран классический многостадийный способ очистки с использованием дробного осаждения белков сульфатом аммония, анионообменной хроматографии на носителе MonoQ («Pharmacia LKB Biotechnology», Швеция) и гель-фильтрации с использованием колонки Superdex 200 10/300 («GE Healthcare», Швеция). В подобранных условиях достигалась высокая степень очистки гибридных белков и нарабатывалось количество белка, достаточное для проведения экспериментов.
Определение агрегатного состояния гибридных белков. Определение агрегатного состояния белков Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP проводили методом динамического светорассеяния с использованием прибора DynaPro Titan («Wyatt Technology», США). Расчет гидродинамических радиусов проводили в приближении сферической модели белков с помощью программы Dynamics 6.7.7.9 («Wyatt Technology», США).
Фотообесцвечивание гибридных белков. Фотообесцвечивание белков Tb3+ СП-DEVD-DsRed2 и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP проводили в 10 мМ HEPES буфере, рН 7.0 в объеме 100 мкл. В экспериментах использовали пикосекундный Nd:YAG лазер с длиной волны 532 нм импульсной накачкой, диодной линейкой и с электрооптическим управлением генерацией. Мощность облучения составила мВт, частота генерации импульса – 300 Гц.
Результаты и их обсуждение Конструирование FRET-сенсоров каспазы-3 заключается в присоединении молекул донора и акцептора на N- и C-концы линкера, содержащего сайт распознавания DEXD. Активация фермента ведет к гидролизу специфической последовательности, что приводит к физическому разделению донора и акцептора.
В результате перенос энергии прекращается и, соответственно, снимается тушение.
Таким образом, по изменению параметров FRET можно напрямую определять активность фермента.
Схема полученных в данной работе каспазы- FRET-биосенсоров представлена на рис. 1.
Рис. 1. Схематическое представление сенсоров каспазы-3 на основе Tb3+-СП и красных флуоресцентных белков TagRFP и DsRed2.
Данные биосенсоры каспазы-3 Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 и pET22b/Tb3+-СП DEVD-TagRFP сконструированы на основе тербий-связывающего пептида YIDTNNDGWYEGDELLA, линкера VDGGSGGDEVDGWGGSGLD с сайтом узнавания каспазы 3 (DEVD) и флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP.
Определение агрегатного состояния гибридных белков.
С помощью метода динамического светорассеяния были получены данные по эффективным диффузионным радиусам и соответствующим им молекулярным массам. Для белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 величина радиуса в приближении сферической модели составила 5 нм, что соответствует молекулярной массе кДа, для белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP – 3.5 нм, что соответствует 64 кДа.
Вычисленная молекулярная масса мономера Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 составляет 29.4 кДа, а мономера Tb3+-СП-DEVD-TagRFP – 30.5 кДа. Исходя из этого, можно заключить, что белок Tb3+-СП-DEVD-DsRed2, наиболее вероятно, находится в данных условиях в тетрамерном состоянии, а белок Tb3+-СП-DEVD-TagRFP в димерном.
Изучение переноса энергии В полученных конструкциях присутствуют две донорно-акцепторные пары, между которыми происходит перенос энергии. Первый перенос энергии происходит от Трп-СП к Tb3+. Второй перенос энергии происходит от сенсибилизированного Tb3+ к флуоресцентному белку (DsRed2 или TagRFP).
Результатом этих двух процессов является долгоживущая флуоресценция Tb3+ и белков DsRed2 и TagRFP, которая регистрируется с микросекундной временной задержкой.
Сенсибилизация флуоресценции Tb3+ происходит через индольное кольцо триптофана, находящемся в 7 положении. Наличие триптофана приводит к реализации эффекта «антенны», состоящей в передаче энергии электронного возбуждения с триплетного уровня Трп-СП (донора) на резонансный излучательный уровень иона Tb3+ (акцептора), испускающего характерную для него долгоживущую флуоресценцию.
Для подтверждения этого процесса в полученных FRET-парах проводили облучение эквимолярных растворов Tb3+ и гибридных белков на длине волны возбуждения триптофана (280 нм) при регистрации флуоресценции Tb3+ на длине волны 545 нм. Полученные спектры возбуждения, регистрируемые с задержкой мкс, показали возбуждение Tb3+ в обеих FRET-парах: Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP (рис. 2).
Рис. 2. Спектры возбуждения микросекундной флуоресценции белков Tb3+-СП DEVD-DsRed2 (а) и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP (б), нормированные на оптическую плотность по 277 нм в отсутствие (1) и в присутствии 150 мМ NaCl (3), и обесцвеченная форма этого же белка в отсутствие (2) и в присутствии 150 мМ NaCl (4).
Рис. 3. Спектры микросекундной флуоресценции Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 (а) и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP (б), нормированные на оптическую плотность по 277 нм в отсутствие (1) и в присутствии 150 мМ NaCl (3), и обесцвеченная форма этого же белка в отсутствие (2) и в присутствии 150 мМ NaCl (4).
Дополнительным подтверждением возбуждения сенсибилизированных ионов Tb3+ явились спектры микросекундной флуоресценции гибридных белков (рис. 3), в которых присутствуют пики флуоресценции Tb3+ (490 и 545 нм). Отсюда следует, что сенсибилизированное возбуждение и флуоресценция Tb3+ в обеих FRET-парах обусловлено переносом энергии от Трп-СП к иону Tb3+.
Второй индуктивно-резонансный перенос энергии происходит от возбужденного Tb3+ к хромофорам красных флуоресцентных белков.
Сенсибилизированную микросекундную флуоресценцию белков-акцепторов определяли по интенсивностям их максимумов при 586 нм и 584 нм для белков DsRed2 и TagRFP, соответственно. Регистрация спектров микросекундной флуоресценции FRET-пар с временной задержкой 100 мкс показала, что, помимо флуоресценции Tb3+, наблюдаются максимумы, соответствующие микросекундной флуоресценции хромофоров флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP (рис. 3).
Как видно на рис. 3 в результате второго переноса энергии происходит увеличение времени жизни белков DsRed2 и TagRFP в возбужденном состоянии по сравнению с их естественными временами. Известно, что собственное время жизни белка DsRed2 составляет 3.6 нс, белка TagRFP – 2.2–2.3 нс. Так как регистрация спектров микросекундной флуоресценции велась с временной задержкой, то присутствие характеристических пиков DsRed2 и TagRFP указывает на увеличение их времени жизни флуоресценции до значений, превышающих 100 мкс.
Оценка эффективности переноса энергии от Tb3+ к красному флуоресцентному белку, не может быть выполнена на основе изменения интенсивности флуоресценции донора (которая на рисунке нормирована на поглощение по 277 нм). Это связано с тем, что вклад флуоресцентного белка в значение оптической плотности на 277 нм не может быть точно определен.
Поэтому спектры микросекундной флуоресценции гибридных белков, нормированные на оптическую плотность по 277 нм, могут представлять ошибочные данные об относительных интенсивностях микросекундной флуоресценции гибридных белков.
В данной работе определение эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии, происходящего от Tb3+ к хромофорам красных флуоресцентных белков, производилось на основе изменений времени жизни донора (Tb3+), так как известно, что вследствие переноса энергии время жизни донора в возбужденном состоянии сокращается. Для измерения времени жизни донора (Tb3+) в отсутствие акцептора было проведено фотообесцвечивание хромофоров красных флуоресцентных белков, которое дает возможность получить донор, у которого время жизни флуоресценции не снижается за счет безызлучательной дезактивации акцептором. Фотообесцвечивание хромофоров белков DsRed2 и TagRFP, подвергавшихся облучению в течение 1–2 часов, контролировали по уменьшению полос их собственного поглощения в видимой области (рис. 4).
Рис. 4. Спектры поглощения белков Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 (а) и Tb3+-СП-DEVD TagRFP (б), нормированные на оптическую плотность при 277 нм в отсутствие (1) и в присутствии 150 мМ NaCl (2), и обесцвеченная форма этого же белка в отсутствие (3) и в присутствии 150 мМ NaCl (4).
Времена жизни Tb3+ в обеих FRET-парах и их обесцвеченных формах, т.е. в присутствии и в отсутствие хромофоров красных флуоресцентных белков, рассчитывали в приближении одноэкспоненциальной модели затухания. Время жизни Tb3+ во FRET-паре Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 составило 0.37 мс, а в его обесцвеченной форме – 0.52 мс. Время жизни Tb3+ в белке Tb3+-СП-DEVD-TagRFP составило 0.28 мс, в его обесцвеченной форме – 0.44 мс (табл. 1).
Из данных табл. 1 следует, что в результате переноса энергии времена жизни Tb снизились. Эффективность переноса энергии от Tb3+ к акцепторам DsRed2 и 3+ TagRFP рассчитывали по формуле:
E = 1 – DA/D, где Е – эффективность переноса энергии, DA – время жизни донора в присутствии акцептора, D – время жизни донора в отсутствие акцептора.
Таблица 1. Время жизни Tb3+ и эффективность переноса энергии во FRET парах в присутствии и в отсутствие NaCl.
Гибридный белок Буфер, время жизни Эффективность переноса Tb3+ в энергии от Tb3+ к возбужденном флуоресцентному белку состоянии, мс (DsRed2/TagRFP), % Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 10 мМ HEPES 0. буфер, рН 7. Обесцвеченная форма 0. Tb3+-СП-DEVD-DsRed Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 10 мМ HEPES 0. буфер, рН 7.0, 150 мМ NaCl Обесцвеченная форма 0. Tb3+-СП-DEVD-DsRed Tb3+-СП-DEVD-TagRFP 10 мМ HEPES 0. буфер, рН 7. Обесцвеченная форма 0. Tb3+-СП-DEVD-TagRFP Tb3+-СП-DEVD-TagRFP 10 мМ HEPES 0. буфер, рН 7.0, 150 мМ NaCl Обесцвеченная форма 0. Tb3+-СП-DEVD-TagRFP Для белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 эффективность переноса энергии от Tb3+ к хромофору DsRed2 составила 28%, для белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP – 35% (табл.
1), т.е. эффективность переноса энергии от Tb3+ к акцептору выше во FRET- паре Tb3+-СП-DEVD-TagRFP.
Изучение влияния NaCl на микросекундную флуоресценцию обеих FRET пар показало, что добавление соли NaCl в раствор приводило к снижению интенсивности возбуждения Tb3+ и, как следствие, снижению микросекундной флуоресценции обеих FRET-пар (рис. 3). Кроме того, снизились времена жизни Tb3+: для белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 оно составило 0.35 мс, для его обесцвеченной формы – 0.42 мс, для белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP – 0.18 мс, его обесцвеченной формы – 0.33 мс. Эффективность переноса энергии при добавлении 150 мМ NaCl упала для белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 с 28% до 17% и, напротив, возросла для белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP с 35% до 44% (табл. 1). Данный эффект предположительно связан с динамическим тушением флуоресеценции тербия ионами Cl-.
Таким образом, продемонстрировано наличие двух процессов индуктивно резонансного переноса энергии в обеих FRET-парах: от Трп-СП к иону Tb3+, от иона Tb3+ к хромофорам белков-акцепторов. Изучение влияния ионной силы на флуоресценцию показало, что добавление NaCl к раствору белков приводит к дезактивации возбужденного состояния Tb3+, и, как следствие, к снижению интенсивности флуоресценции и времени жизни Tb3+ в обоих гибридных белках.
Анализ результатов гидролиза субстратов каспазы-3.
Гидролиз субстратов каспазой-3 изучали по увеличению времени жизни флуоресценции Tb3+ в течение исследуемого промежутка времени в режиме измерения фосфоресценции. На рис. 5 представлена зависимость времени жизни Tb3+ при инкубации субстратов с каспазой-3. Для белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP наблюдается увеличение времени жизни Tb3+ в течение инкубации с каспазой-3 по сравнению с контрольным образцом, не содержащим фермент. Данные свидетельствует, что разрезание линкера каспазой-3 приводит к снятию тушения флуоресценции Tb3+, которое вызвано безызлучательной дезактивацией акцептора.
Для белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 значения времени жизни Tb3+ в контрольном образце и в присутствии каспазы-3 не изменяются.
Рис. 5. Зависимость времени жизни Tb3+, флуоресценции сенсибилизированного в субстратах Tb3+-СП-DEVD-TagRFP (1 – в присутствии каспазы-3, – контрольный образец в отсутствие Tb3+-СП-DEVD каспазы-3) и DsRed2 (3 – в присутствии каспазы 3, 4 – контрольный образец в отсутствие каспазы-3) от времени инкубации с каспазой-3.
Данные результаты показывают, что расщепление каспазой-3 линкера между донором и акцептором происходит только в случае Tb3+-СП-DEVD-TagRFP, что приводит к прекращению переноса энергии и увеличению времени жизни донора.
Для определения кинетических параметров ферментативного расщепления субстрата Tb3+-СП-DEVD-TagRFP использовали методы интегральной кинетики.
Полученную кинетическую кривую линеаризовали, используя следующую формулу:
где, t – время инкубации субстрата с каспазой-3, s0 – начальная концентрация субстрата, s – текущая концентрация субстрата, V – скорость реакции, Km – константа Михаэлиса–Ментен. При этом текущую концентрацию субстрата рассчитывали, исходя из того предположения, что последняя точка на кинетической кривой соответствует полному израсходованию субстрата.
Линеаризация полученной кинетической кривой представлена на рис. 6.
Рис. 6. Линеаризация зависимости времени жизни Tb3+ флуоресценции при 3+ инкубации субстрата Tb -СП DEVD-TagRFP с каспазой-3.
Из параметров аппроксимирующей прямой 1/Vmax = 0.21 ± 0.06, Km/Vmax = 3.15 ± 0.21, были вычислены кинетические параметры субстрата Tb3+-СП-DEVD TagRFP: Vmax = kcat E0, E0 = 1.2 нМ, соответственно Vmax = 5 ± 1.5 мкМ/мин, kcat = 4.2·103 ± 1.2·103 мин-1, Km = 17 ± 6 мкМ.
Для независимого подтверждения параллельно с измерениями отбирали аликвоты растворов субстрата и фермента для анализа с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Как видно на рис. 7, при инкубации субстрата Tb3+-СП DEVD-TagRFP с каспазой-3 происходит постепенное исчезновение полосы 33. кДа, которая соответствует цельному субстрату, и появление полосы 27.7 кДа, которая соответствует одному из продуктов гидролиза (табл. 2).
Низкомолекулярный пептид, второй продукт гидролиза, не задерживается в геле.
Полоса 29.9 кДа скорее всего является частично расщепленным белком Tb3+-СП DEVD-TagRFP, так как интенсивность этой полосы также падает по мере нарастания времени инкубации с каспазой-3. На электрофореграмме с белком Tb3+ СП-DEVD-DsRed2 исчезновение полосы субстрата не наблюдается.
Таким образом, полученные электрофоретические профили подтверждают данные спектральных измерений, указывающих на специфичный гидролиз субстрата Tb3+-СП-DEVD-TagRFP каспазой-3 и отсутствие расщепления субстрата Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 в условиях in vitro.
В табл. 3 представлено сравнение кинетических параметров полученного нами субстрата Tb3+-СП-DEVD-TagRFP и природных субстратов каспазы-3.
Рис. 7. Электрофоретический анализ реакционных смесей при различном времени инкубации с каспазой-3 и соответствующих контролей: 1 – субстрат в отсутствие каспазы-3, 2 – образец белка непосредственно после добавления каспазы-3, 3–9 – через 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 ч после инкубации с каспазой-3.
Таблица 2. Таблица молекулярных масс гибридных белков Tb3+-СП-DEVD TagRFP и Tb3+-СП-DEVD-DsRed2.
Гибридные Расчетная Наблюдаемая Динамическое молекулярная масса, молекулярная масса по белки светорассеяние кДа электрофорезу, кДа субстрат продукт субстрат продукт радиус, соответств гидролиза гидролиза нм ующая молекуляр ная масса, кДа Tb3+-СП- 3.5 64. 30.5 27.2 33.2 27. DEVD TagRFP Tb3+-СП- – 29.4 26.2 29.4 5 143. DEVD DsRed Таблица 3. Кинетические параметры субстратов каспазы-3.
kcat, с- Субстрат Mr, кДа Агрегатное Vmax, мкМ/с Km, kcat/Km, мкМ-1·с- состояние мкМ димер – – – PARP 226.4 [Casciola- [Mendoza Rosen, 1996] Alvarez, 1993] мономер – – – DNA-PKcs 450 7. [Casciola- [Casciola Rosen, 1996] Rosen, 1996] Tb3+-СП- димер 0.08 ± 0.03 17 ± 6 70 ± 61 4. DEVD-TagRFP Субстрат Tb3+-СП-DEVD-TagRFP, представляющий собой димер, по своим кинетическим свойствам близок к природным субстратам, что следует из сравнения значений kcat/Km. Субстрат Tb3+-СП-DEVD-DsRed2, находящийся в тетрамерном состоянии, за исследуемые промежутки времени не гидролизуется.
Наиболее вероятной причиной отсутствия ферментативного расщепления белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 может быть влияние олигомерного состояния флуоресцентного белка DsRed2, которое в совокупности с другими факторами, возможно, длиной линкера, нежелательными взаимодействиями каспазы-3 и флуоресцентного белка приводит к отсутствию доступа каспазы-3 к субстрату. При этом стерические затруднения не обусловлены различной молекулярной массой субстратов, так как субстрат DNA-PKcs, представляющий собой каталитическую субъединицу, гидролизуется эффективнее, чем димерный субстрат PARP (поли(АДФ-рибозо)полимераза), несмотря на то, что последний имеет практически вдвое меньшую молекулярную массу.
В заключение следует отметить, что наиболее подходящим биосенсором для in vivo определения активности каспазы-3 является субстрат Tb3+-СП-DEVD TagRFP. Данная FRET-пара впервые получена на основе Tb3+ в комплексе с тербий-связывающим пептидом и красного флуоресцентного белка TagRFP и является полностью генетически кодируемой. Это важно при использовании сенсора в живых и постоянно делящихся клетках, в связи с отсутствием необходимости внешней инъекции. С помощью данного FRET-сенсора можно эффективно снизить короткоживущий фоновый сигнал в живых клетках, что важно в условиях регистрации низкой интенсивности сигнала.
ВЫВОДЫ Впервые получены генетически кодируемые FRET-пары на основе 1.
флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP, субстрата каспазы-3 и тербий связывающего пептида: Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 и Tb3+-СП-DEVD-TagRFP.
Продемонстрировано наличие двух процессов индуктивно-резонансного 2.
переноса энергии в обеих FRET-парах: от тербий-связывающего пептида к иону Tb3+, от иона Tb3+ к хромофорам флуоресцентных белков.
Определена эффективность переноса энергии от иона Tb3+ к хромофорам 3.
флуоресцентных белков, для белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2, она составила 28%, для белка Tb3+-СП-DEVD-TagRFP – 35%.
Показано, что добавление NaCl в раствор с гибридными белками приводит к 4.
дезактивации возбужденного состояния Tb3+, и, как следствие, к снижению интенсивности флуоресценции и времени жизни Tb3+ в обеих FRET-парах. Данный эффект предположительно связан с динамическим тушением флуоресеценции тербия ионами Cl-.
Показано, что димерный субстрат Tb3+-СП-DEVD-TagRFP подвергается 5.
гидролизу каспазой-3, что подтверждено методами фосфоресцентной спектроскопии и электрофореза.
В случае тетрамерного белка Tb3+-СП-DEVD-DsRed2 наблюдается 6.
отсутствие гидролиза каспазой-3 за исследуемый промежуток времени, что предположительно объясняется влиянием стерических факторов на доступ каспазы-3 к субстрату.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:
1. Turchin I.V., Kamensky V.A., Plehanov V.I., Orlova A.G, Kleshnin M.S., Fiks I.I., Shirmanova M.V., Meerovich I.G., Arslanbaeva L.R., Jerdeva V.V., Savitsky A.P.
Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals // Journal of Biomedical Optics. 2008. V.13. № 4.
2. Арсланбаева Л.Р., Жердева В.В., Ивашина Т.В., Винокуров Л.М., Русанов А.Л., Савицкий А.П. Генетически кодируемая FRET-пара на основе тербий связывающего пептида и красного флуоресцентного белка // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 2. с. 166–171.
Тезисы докладов на конференциях:
1. Arslanbaeva L.R., Meerovich I.G., Jerdeva V.V., Savitsky A.P. The Estblishment of stable high-level red fluorescent protein (TurboRFP)-Expressing melanoma cell line MelKor // International Symposium «Topical Problems of Biophotonics – 2007».
Россия, Нижний Новгород–Москва–Нижний Новгород, 4–11 августа 2007 г. С.
156–157.
Арсланбаева Л.Р., Меерович И.Г, Жердева В.В., Савицкий А.П. Получение 2.
флуоресцирующих опухолей человеческой линии melKor, экспрессирующей красный флуоресцирующий белок TurboRFP, в мышах линии Nu/Nu // Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва, 17–19 марта 2008 г. С. 11.
Арсланбаева Л.Р., Меерович И.Г., Савицкий А.П. Получение опухолевой 3.
клеточной меланомы линии melKor, стабильно экспрессирующей красный флуоресцентный белок TurboRFP в условиях in vitro и in vivo // V съезд Российского фотобиологического общества. Московская обл., г. Пущино, 8– июля 2008 г. С. 198.
4. Arslanbaeva L.R., Ivashina T.V., Jerdeva V.V., Savitsky A.P. Novel FRET-based genetically encoded sensor for caspase-3 activity detection // II International Symposium «Topical Problems of Biophotonics – 2009». Россия, Нижний Новгород–Самара– Нижний Новгород, 19–24 июля 2009 г. С. 27–28.