Спектрально-флуоресцентные свойства kfp и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно резонансном переносе энергии
На правах рукописи
Русанов Александр Леонидович СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА KFP И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭТОГО БЕЛКА ДЛЯ СОЗДАНИЯ СЕНСОРОВ, ОСНОВАННЫХ НА ИНДУКТИВНО РЕЗОНАНСНОМ ПЕРЕНОСЕ ЭНЕРГИИ Специальность 03.01.04 – «биохимия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА 2010
Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова доктор химических наук,
Научный консультант:
профессор А.П. Савицкий доктор химических наук,
Официальные оппоненты:
профессор, чл.-корр. РАН А.Г. Габибов доктор биологических наук, профессор А.А. Красновский Биологический факультет
Ведущая организация:
Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова
Защита состоится «10» февраля 2011 г. в «14» часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, строение 1.
Автореферат разослан «29» декабря 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Флуоресценция используется для визуализации Актуальность проблемы.
процессов клеточной биологии на различных уровнях, от отдельных молекул до целых организмов. Традиционные методы, основанные на флуоресцентных красителях, часто требуют дополнительной очистки меченых соединений и их инвазивного введения внутрь клетки. Эти ограничения можно преодолеть благодаря использованию зеленого флуоресцирующего белка GFP и его гомологов. При этом присоединение их к интересующим белкам, благодаря их относительно небольшой и компактной структуре, слабо или совершенно не влияет на исходные свойства изучаемых белков.
Использование флуоресцирующих белков позволяет вести неинвазивное наблюдение экспрессии репортерных генов, внутриклеточного перемещения белков и динамики биохимических сигналов в живых клетках и организмах. Открытие фотопереключаемых белков существенно расширило возможности применения флуоресцирующих белков в молекулярной и клеточной биологии и явилось основой для разработки микроскопии сверхвысокого разрешения. Одним из фотопереключаемых белков является красный белок asCP (использованный, в частности, для метода RESOLFT, достигающего разрешения 50-100 нм), который обладает способностью обратимого фотопереключения между флуоресцирующей и нефлуоресцирующей формами. Однако механизм фотопереключения (разгорания флуоресценции) asCP и его мутантной формы KFP (kindling fluorescent protein, asCP A143G) с оптимизированными свойствами разгорания вс ещ остатся невыясненным.
Использование методов, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии (FRET) между двумя флуоресцирующими белками позволило существенно увеличить возможности применения этих белков в качестве маркеров в живых клетках для наблюдения за биологическими механизмами и физиологическими функциями клетки.
FRET-биосенсоры на основе флуоресцирующих белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами, в которых используется конъюгация с синтетическими красителями. Во-первых, они могут быть сконструированы путем генетических манипуляций и доставлены в клетки с помощью трансфекции и последующей экспрессии;
во-вторых, им можно придать сигналы внутриклеточной или тканевой локализации, что позволяет вести наблюдение как за органеллами и отдельными клетками, так и за целыми организмами.
Одним из подходов для скрининга противоопухолевых препаратов in vivo является детекция апоптоза в клетках мишенях. Для визуализации процессов in vivo на уровне одной клетки перспективным объектом является семейство каспаз, а именно, каспаза-3, как один из ключевых ферментов, участвующих в развитии процесса апоптоза в клетке.
Белковые сенсоры, в основу которых положен принцип индуктивно-резонансного переноса энергии между двумя красными белками, одним из которых является KFP, наиболее отвечают задачам увеличения эффективности детекции активности каспазы- in vitro и in vivo. Измерение кинетик затухания флуоресценции позволяет решить проблему калибровки сенсора, а использование нефлуоресцирующего акцептора избавляет от спектральной контаминации, т.е. попадания эмиссии донора в канал регистрации акцептора, характерную для стандартной методики измерения по интенсивности флуоресценции. Применение красных флуоресцирующих белков позволяет уменьшить автофлуоресценцию тканей и увеличить проницаемость света вглубь тканей.
Таким образом, изучение и характеристика спектрально-флуоресцентных свойств белка KFP является актуальной задачей при разработке новых методов субдифракционной флуоресцентной микроскопии и создании новых сенсоров для детекции ферментативной активности в живых клетках и организмах.
Цели и задачи работы. Целями настоящей работы было изучение спектральных и физико-химических свойств KFP, а также создание и характеристика FRET-сенсора на его основе для детекции активации каспазы-3 in vivo.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. изучить pH-зависимость флуоресценции и положения максимумов эмиссии, возбуждения и поглощения KFP;
2. определить влияние pH на эффективность разгорания и тушения KFP;
3. изучить спектральные свойства и оценить эффективность переноса энергии во FRET сенсоре на основе двух красных белков;
4. определить эффективность расщепления конструкции под действием каспазы-3;
Научная новизна. Впервые было показано, что флуоресцентные свойства KFP обусловлены набором конформеров, равновесие между которыми определяется значением pH. Исследована зависимость свойства разгорания и тушения флуоресценции KFP в зависимости от pH. Установлено существование в щелочной области pH двух флуоресцирующих конформеров по-разному реагирующих на действие синего света.
Разработана модель для детекции ферментативной активности каспазы-3 in vitro методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Предлагаемый подход основан на применении красного флуоресцирующего белка TagRFP в качестве донора и хромопротеина KFP в качестве акцептора, в результате чего затухание флуоресценции такой конструкции происходит гораздо быстрее, чем для индивидуального донора. Эффективность переноса энергии в созданной генно инженерной конструкции составила 51.1%. Методом планарного имиджинга с временным разрешением показана возможность детекции активации апоптоза у животных in vivo.
Данная методика позволяет различать флуоресцентные метки с близкими максимумами эмиссии, такие как DsRed2 и TagRFP, что невозможно при использовании обычного метода регистрации по интенсивности.
Практическая значимость. Установленные зависимости разгорания и тушения флуоресценции KFP позволяют расширить применение данного белка в качестве маркера в клеточной и молекулярной биологии, а также в микроскопии сверхвысокого разрешения. Созданная генно-инженерная конструкция на основе двух красных флуоресцирующих белков дат возможность регистрации ферментативной активности каспазы-3 на клеточном уровне методом флуоресцентной микроскопии с временным разрешением.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (201 ссылка). Диссертация содержит страницы печатного текста, включает 53 рисунка и 5 таблиц.
Основные результаты диссертационной работы были Апробация работы.
представлены на следующих международных и российских конференциях: V Съезд Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), II International symposium Topical problems of biophotonics – 2009 (Nizhny Novgorod – Samara - Nizhny Novgorod, 2009), Школа-конференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2010 (Москва, 2010), XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences 2010 (Oulu, Finland, 2010).
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Спектрально-флуоресцентные свойства KFP 1.1. Анализ pH-зависимостей asCP и его мутантов Применение цветных белков зависит от высокого квантового выхода флуоресценции или от его регулирования внешними параметрами. Нами было показано, что увеличения интенсивности флуоресценции можно добиться не только путем накачки белка интенсивным светом, но также и при изменении pH. Белок asCP и его мутанты практически не флуоресцируют при нейтральных значениях pH, но при титровании в щелочную область pH наблюдается значительное возрастание флуоресценции. Для белка дикого типа заметный рост наблюдается при pH больше 7, для мутанта asCP A143S после достижения pH равного 8, а для KFP при pH более 9.
При этом такое увеличение флуоресценции KFP полностью обратимо: увеличение pH приводит к появлению флуоресценции, в то время как обратное титрование от pH до 7 возвращает белок в нефлуоресцирующее состояние.
Изменение pH приводит также к изменению положения максимума в спектрах флуоресценции белка. В нейтральной области pH синхронно происходит сдвиг в положении максимумов эмиссии и возбуждения флуоресценции KFP, который говорит о том, что в белке происходят конформационные изменения, затрагивающие область хромофора. При этом скачок в положении максимумов наблюдается при более низких значениях pH, чем заметное изменение интенсивности флуоресценции (рис. 1А).
Значительное изменение положения максимума поглощения KFP также наблюдается при варьировании pH. При нейтральных значениях pH максимумы поглощения (рис. 1Б) и возбуждения (рис. 1А) совпадают (565 нм), в то время как по достижению pH равного 8.5 максимум возбуждения резко сдвигается до 571 нм (рис. 1А) и остатся неизменным при дальнейшем увеличении pH. Данное наблюдение может быть объяснено появлением другой конформации белка с отличающимися флуоресцентными свойствами. При движении в щелочную область pH происходит постепенное уменьшение максимума длины волны поглощения, что может быть интерпретировано, как появление новой мажорной нефлуоресцирующей конформации, максимум поглощения которой смещн в коротковолновую область.
Сдвиг в положениях максимумов эмиссии и возбуждения происходит при pH 8.5, в то время как заметное увеличение интенсивности флуоресценции наблюдается при pH больше 9. Это факт может быть объяснн следующим образом. При нейтральных pH (ниже 8) в растворе доминирует специфическая белковая конформация с низким квантовым выходом флуоресценции. В щелочной области pH между 8 и 9 возникает другая конформация, для которой максимумы эмиссии и возбуждения заметно отличаются, по сравнению с предыдущей конформацией. Однако доля этой вновь возникшей конформации очень мала и белок в целом флуоресцирует слабо. При pH в районе 10 концентрация этого конформера значительно увеличивается и белок становится флуоресцирующим, что сопровождается возрастанием интенсивности и квантового выхода флуоресценции. Однако доля флуоресцирующего конформера вс ещ слишком мала, чтобы оказывать влияние на сдвиг положения максимума поглощения или е можно было зарегистрировать по изменению спектров поглощения. В процессе титрования в щелочную область pH оптическая плотность образцов уменьшается (рис. 1Б). Эти данные указывают на сложность в идентификации появления новой, pH-индуцированной, флуоресцентной конформации белка при наблюдении за спектрами поглощения.
Таким образом, изменение pH сопровождается сдвигом равновесия между различными конформациями белка, представляющими собой набор флуоресцирующих и нефлуоресцирующих форм.
(А) длина волны максимума интенсивности, нм интенсивность эмиссия возбуждение интенсивность 565 555 6 8 pH (Б) нормированная оптическая плотность 568 1, максимум поглощения, нм 566 0, 0, максимум поглощения 0, оптическая плотность 0, 0, 6 7 8 9 10 pH Рис. 1. (А) Зависимость интенсивности флуоресценции и положения максимумов эмиссии и возбуждения KFP от pH. (Б) Влияние pH на значение оптической плотности и положение максимума поглощения KFP.
1.2. Кинетики разгорания и тушения KFP Нами были изучены кинетики разгорания KFP под действием лазерного излучения с длиной волны 532 нм при различных pH. На рис. 2 приведены результаты для pH 6.42;
8.77 и 10.6. Интенсивность флуоресценции увеличивается и достигает максимального значения через ~ 100 секунд.
pH = 10. Интенсивность флуоресценции pH = 8. pH = 6. 60 90 120 150 180 210 Xвремя, сек Axis Title Рис. 2. Кинетики разгорания KFP при различных значениях pH.
Наблюдается увеличение максимальной интенсивности флуоресценции при движении в щелочную область, что соответствует данным, полученным при облучении светом низкой интенсивности. При этом в области щелочных pH коэффициент усиления k, высчитываемый как отношение интенсивностей флуоресценции после и до облучения белка светом, практически не меняется при облучении интенсивным зеленым светом.
Таким образом, интенсивно флуоресцирующие конформации белка образуются при высоких значениях pH, не требуя при этом накачки светом, в отличие от классического фотоиндуцируемого разгорания.
Была также исследована кинетика тушения флуоресценции при облучении «разгоревшегося состояния» лазером с длиной волны возбуждения 473 нм (рис. 3). При этом было исследовано влияние последовательности включение лазеров, чтобы выяснить влияет ли синий цвет на разгоревшуюся форму белка или препятствует появлению новой флуоресцирующей формы.
зелный лазер (532 нм) интенсивность флуоресценции зелный (532 нм) + синий (473 нм) лазеры отсутствие облучения 1000 одновременное включение зелного (532 нм) и синего (473 нм) лазеров 0 100 200 300 400 время, сек Рис. 3. Кинетика разгорания и тушения KFP при pH = 9.41.
В начальный момент времени белок облучали зеленым лазером, после чего включали синий лазер при работающем зеленом, т.к. разгоревшаяся форма KFP может быть затушена с помощью синего света. Интенсивность флуоресценции мгновенно падала до некоторого постоянного значения, не изменяющегося с течением времени.
Затем белок в течение ~ 250 секунд не подвергался облучению. Далее одновременно включали синий и зеленый лазеры. При этом было показано, что интенсивность конечного сигнала не зависит от того, какая форма белка (флуоресцирующая или темная) подвергается воздействию излучения.
Исследование pH-зависимостей свидетельствует о том, что увеличение pH приводит к росту остаточной флуоресценции после включения синего лазера (рис. 4), что говорит о накоплении новой флуоресцирующей формы, невосприимчивой к облучению светом с длиной волны 473 нм. В диапазоне pH от 7.81 до 9.80 интенсивность флуоресценции резко увеличивается под действием облучения зелным светом и достигает максимума за ~ 100 секунд. Синий свет практически полностью тушит индуцированную флуоресценцию. В то же время в области более щелочных pH (10.14) белок уже находится во флуоресцирующем состоянии, не требующем облучения зелным светом, а воздействие синего света не приводит к полному тушению флуоресценции.
включение синего лазера (473 нм) облучение зелным лазером (532 нм) при одновременно работающем зелном нормированная флуоресценция 1, 0, pH = 10. 0, pH = 9. 0,4 pH = 8. pH = 7. 0, 0, 0 50 100 время, сек Рис. 4. Кинетики разгорания флуоресценции KFP при облучении зелным светом (532 нм) и тушения синим светом (473 нм) при различных значениях pH.
Таким образом, набор конформаций белка, возникающий в области щелочных значений pH, может быть разделн на две популяции: первая из них не гасится синим светом и е доля возрастает с увеличением pH, а вторая чувствительна к облучению синим светом и е доля снижается по мере движения в щелочную область pH.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что: 1) интенсивность флуоресценции KFP может быть значительно увеличена в области высоких значений pH;
2) природа увеличения флуоресценции заключается в появлении в щелочной области pH новых белковых конформаций со смещнными положениями максимумов поглощения, возбуждения и эмиссии, доля которых при кислых и нейтральных pH незначительна;
3) pH-индуцированное разгорание ведт к увеличению доли флуоресцирующих конформеров, не восприимчивых к действию синего света.
Результаты этих экспериментов могут быть обобщены в виде схемы, представленной на рис. 5.
Рис. 5. Схема обратимых переходов между тмными и флуоресцирующими формами KFP. q – квантовый выход, k – коэффициент усиления флуоресценции. R – флуоресцирующая форма, R’ – тмная форма белка. R* и R’* - возбужднные состояния.
K – константы равновесия между тмными и флуоресцирующими конформациями белка.
При низких pH существует равновесие между флуоресцирующей R(1) (возбуждение 566 нм, эмиссия 585 нм) и тмной R’(1) (максимум поглощения 566 нм) формами белка, и доля нефлуоресцирующей фракции существенно больше. Квантовый выход флуоресценции в этом диапазоне pH невысок (q = 0.001 на рис. 5). Облучение интенсивным зелным светом приводит к увеличению интенсивности флуоресценции более чем в 20 раз (k = 20-30).
При движении в область щелочных pH образуется флуоресцирующая форма R(2), которая также поглощает на длине волны 584 нм, а флуоресцирует на 600 нм.
Образованию этой формы соответствует скачок в положении максимумов эмиссии и возбуждения.
Данная конформация находится в равновесии с соответствующей темной формой R’(2), поглощающей на 566 нм. Квантовый выход флуоресценции в этом диапазоне также составляет 0.001. Однако при дальнейшем движении в область щелочных pH тмная форма R’(2) переходит в тмную форму R’(3) с максимумом поглощения на 554 нм. R’(3) находится в равновесии с флуоресцирующей формой R(2), но при этом равновесие сдвигается в сторону флуоресцирующей формы. Происходит резкое увеличение концентрации R(2), а, соответственно, возрастает интенсивность и квантовый выход флуоресценции.
Набор новых конформаций белка, возникающий в области щелочных значений pH, также может быть разделн на две популяции: первая из них R(2)fl не гасится синим светом и е доля возрастает с увеличением pH, а вторая R(2)bq чувствительна к облучению синим светом и е доля снижается по мере движения в щелочную область pH (рис. 6).
Рис. 6. Равновесие между двумя флуоресцирующими формами KFP, одна из которых чувствительна к действию синего света (R(2)bq), а другая – нет (R(2)fl).
2. FRET-пара на основе двух красных белков 2.1. Обоснование выбора FRET-пары В качестве донора и акцептора для конструкций на основе индуктивно резонансного переноса энергии были выбраны красные флуоресцирующие белки TagRFP (максимум возбуждения 555 нм, максимум эмиссии 584 нм) и KFP (максимум возбуждения 580 нм, максимум эмиссии 600 нм), соответственно. TagRFP представляет собой яркий мономерный белок с высоким квантовым выходом флуоресценции (q = 0.48), в то время как KFP - практически нефлуоресцирующий тетрамерный белок (квантовый выход флуоресценции q 0.001). При этом оба белка не токсичны для клеток.
Максимумы эмиссии TagRFP и возбуждения флуоресценции KFP очень близки, что ведт к хорошему спектральному перекрыванию.
Фрстеровский радиус для такой пары белков, в предположении свободной ориентации белков относительно друг друга (2 = 2/3), равен 47. На эффективность переноса энергии влияет расстояние между донором и акцептором и относительная ориентация дипольных моментов эмиссии донора и поглощения акцептора. Поскольку диаметр -бочонка флуоресцирующего белка равен 24, минимально возможное расстояние между центрами двух бочонков (и, соответственно, хромофорами) равно 24.
Эффективность переноса энергии в этом случае составляет 98.2% (для ориентационного фактора 2= 2/3) или 99.7% (для фиксированной ориентации с 2 = 4). Эффективность переноса для других возможных расстояний между донором и акцептором приведена в таблице 1.
Таблица 1. Зависимость эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии от значений расстояний между донором и акцептором и от ориентационного фактора.
2 2/3 r, 24 45 65 120 24 45 65 E, % 98.2 56.2 12.4 0.4 99.7 88.3 45.3 2. 2.2. Конструирование плазмиды Для изучения индуктивно-резонансного переноса энергии в клетках млекопитающих была сконструирована плазмида, содержащая слитые в единой рамке считывания гены красных флуоресцирующих белков TagRFP и KFP, разделенные линкерной последовательностью из 23 аминокислот с сайтом узнавания каспазы-3 DEVD. В качестве исходного был использован челночный вектор pKindlingRed-N (Evrogen, Россия).
Важным этапом является выбор линкера, содержащего сайт распознавания каспазой-3. Анализ литературных данных показал, что в большинстве случаев используются аминокислотные последовательности, состоящие из гибких и гидрофильных остатков (случайные последовательности из глицина и серина), поскольку предполагается, что они образуют статистический клубок и не взаимодействуют с белковыми доменами. При этом длина линкера, а также его структура могут оказывать существенное влияние на уровень FRET, а также на эффективность экспрессии конструкций в клетках.
Полученная генетическая конструкция, кодирующая слитые гены красных флуоресцирующих белков, разделнных линкерными последовательностями с сайтом узнавания каспазы-3 (рис. 7), позволяет проводить трансфекцию эукариотических клеток для оптимизации индуктивно-резонансного переноса энергии.
pTRK- EcoRI KpnI BamHI PCMV IE KFP TagRFP GTGGSGGDEVDGTGGSGDPPVAT Рис. 7. Схема сконструированной рекомбинантной плазмиды для изучения индуктивно резонансного переноса энергии в эукариотических клетках.
Для изучения свойств рекомбинантных белков in vitro слитые гены TagRFP и KFP, соединенные линкерной последовательностью, были клонированы также в прокариотическом трансляционном векторе pET22b.
2.3. Характеристика размеров TagRFP-23-KFP Экспрессия слитых генов красных флуоресцирующих белков в клетках E. coli приводит к синтезу полноразмерного продукта с молекулярной массой 54.6 кДа. Очистка полученной конструкции проводилась с помощью ионообменной хроматографии и гель фильтрации. Чистота выделенного препарата оценивалась с помощью электрофореза и составляла не менее 95%. Наблюдаются две основные полосы – 37 и 20 кДа, в то время как в районе 55 кДа, белковых фракций нет. Поскольку при созревании KFP, в полипептидной цепи образуется разрыв между Cys62 и Met63, при проведении денатурирующего электрофореза, должны наблюдаться две полосы. Первая соответствует полноразмерному TagRFP с линкером и 66 аминокислотами с N-конца KFP (молекулярная масса данного фрагмента около 35 кДа), а вторая - 170 аминокислотам с C-конца KFP (20 кДа). Таким образом, данные денатурирующего электрофореза свидетельствуют о полном созревании KFP, входящего в состав конструкции.
Была проведена оценка размеров выделенной конструкции. По результатам гель фильтрации на носителе Superdex 200 10/300 GL молекулярная масса TagRFP-23-KFP составляет 250 кДа. В результате экспериментов по динамическому светорассеянию было вычислено, что гидродинамический радиус конструкции TagRFP-23-KFP равен 5, нм, что в приближении сферической модели соответствует молекулярной массе равной 208 кДа.
Таким образом, поскольку суммарная молекулярная масса TagRFP, линкера и KFP составляет 54,6 кДа, выделенная белковая конструкция TagRFP-23-KFP, по-видимому, имеет тетрамерную структуру. Вероятно, сохраняется исходное олигомерное состояние KFP.
2.4. Спектральные свойства выделенной конструкции Существенное снижение интенсивности флуоресценции полученного белка слияния на длине волны эмиссии TagRFP, по сравнению с индивидуальным TagRFP свидетельствует о наличии переноса энергии между донором и акцептором. Максимум спектра поглощения выделенной конструкции TagRFP-23-KFP находится между максимумами поглощения индивидуальных TagRFP и KFP (рис. 8). В то же время он практически идентичен суммарному спектру поглощения TagRFP и KFP, который был получен сложением коэффициентов экстинкции двух этих белков на соответствующих длинах волн. Таким образом, можно говорить, что соотношение концентраций TagRFP и KFP в выделенном образце близко к 1:1.
TagRFP-23-KFP 1, TagRFP KFP оптическая плотность 0, нормированная 0, 0, 0, 0, 480 500 520 540 560 580 600 длина волны, нм Рис. 8. Спектры поглощения индивидуального TagRFP (светло-серая линия), белка слияния TagRFP-23-KFP (чрная линия) и KFP (тмно-серая линия). Прерывистой линией представлен расчтный суммарный спектр поглощения TagRFP-KFP.
2.5. Определение эффективности переноса энергии TagRFP в конструкции TagRFP-23-KFP Для оценки отношения квантовых выходов свободного TagRFP и TagRFP в конструкции TagRFP-23-KFP, было выяснено относительное поглощение TagRFP в белке слияния. В первую очередь было проведено разложение спектра поглощения KFP на два пика с помощью распределения Гаусса. Были определены положения и полуширины пиков и в дальнейшем данные значения были использованы при разложении спектра поглощения белка слияния (рис. 9). Спектр поглощения TagRFP-23-KFP был разложен с помощью четырх гауссианов. При этом две компоненты относятся к KFP, а другие две - к TagRFP.
1, TagRFP-23-KFP оптическая плотность 1, 0, 0, KFP TagRFP 0, 0, 0, 450 500 550 600 длина волны, нм Рис. 9. Разложение спектра поглощения конструкции TagRFP-23-KFP.
Далее проводилось вычисление вклада TagRFP в суммарную оптическую плотность конструкции TagRFP-23-KFP на длине волны возбуждения флуоресценции.
Для этого суммировались оптические плотности каждой из двух компонент TagRFP на длине волны 532 нм (DTag532). Вычислив площадь под спектром эмиссии флуоресценции TagRFP-23-KFP (Sem) при возбуждении светом 532 нм, можно найти отношение Sem/DTag532.
Вычисляя такое же отношение для индивидуального TagRFP (S/D), было найдено отношение квантовых выходов TaRFP в составе конструкции и в виде индивидуального белка: n = (Sem/DTag532)/ (S/D) = 48,9%, т.е. в полученной конструкции квантовый выход флуоресценции TagRFP снижается более чем в два раза, по сравнению с квантовым выходом свободного TagRFP. Это свидетельствует о наличии индуктивно-резонансного переноса энергии в полученной конструкции, эффективность которого составляет E = 100% - 48.9% = 51.1%. Для такой эффективности переноса энергии, среднее расстояние между хромофорами должно быть в пределах от 45 до 65, в зависимости от значения ориентационного фактора (см. Табл. 1).
2.5. Измерение времён жизни флуоресценции TagRFP-23-KFP Следующим шагом по изучению свойств полученной конструкции было сравнение времн жизни флуоресценции индивидуального белка TagRFP и белка слияния TagRFP-23-KFP (рис. 10). Кинетики затухания флуоресценции белков t n A i I (t ) e обрабатывались по уравнению: i i нормированная интенсивность 1, TagRFP 0,8 TagRFP-23-KFP 0, 0, 5 10 15 20 время, нс Рис. 10. Кинетики затухания флуоресценции индивидуального TagRFP (серая линия) и белка слияния TagRFP-23-KFP (чрная линия).
Затухание флуоресценции TagRFP описывается с помощью одной экспоненты и временем жизни 1 = 2,42 нс. В то же время для конструкции TagRFP-23-KFP появляется ещ одна компонента 2 = 1,24 нс, что также говорит о наличии индуктивно-резонансного переноса энергии, поскольку время жизни флуоресценции в этом случае должно уменьшаться. При этом в случае белка слияния предэкспоненциальный множитель короткоживущей компоненты, отображающий относительное содержание в образце, в раза больше множителя для долгоживущей фракции (табл. 2). Наличие долгоживущей компоненты TagRFP-23-KFP может быть приписано фракции белка, в которой отсутствует перенос энергии.
Таблица 2. Времена жизни и предэкспоненциальные множители для TagRFP и TagRFP 23-KFP.
1 2 A1 A TagRFP 2.42 - 2760 TagRFP-23-KFP 2.45 1.24 686 Таким образом, наличие индуктивно-резонансного переноса энергии в белке слияния TagRFP-23-KFP, было подтверждено двумя различными методами.
3. Определение эффективности расщепления конструкции TagRFP-23-KFP под действием каспазы- 3.1. Стационарная флуоресцентная спектроскопия Для оценки эффективности расщепления конструкции под действием каспазы- было проведено измерение спектров флуоресценции до добавления фермента и после инкубации с ним. Белок слияния инкубировался с каспазой-3 в течение 24 часов при температуре 37С. Интенсивность флуоресценции возрастает приблизительно в два раза (рис. 11), что говорит об эффективном расщеплении линкера под действием протеиназы.
интенсивность флуоресценции TagRFP-23-KFP (контроль) TagRFP-23-KFP + каспаза- 540 560 580 600 620 640 660 680 длина волны, нм Рис. 11. Спектр флуоресценции конструкции TagRFP-23-KFP до (чрная линия) и после (серая линия) обработки каспазой-3.
3.2. флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением Инкубирование TagRFP-23-KFP с каспазой-3 также оказывает существенное влияние на времена жизни флуоресценции. Кинетики затухания флуоресценции конструкции до и после инкубирования с ферментом приведены на рис. 12. Расщепление линкера протеиназой ведт к изменению расстояния между донором и акцептором и, таким образом, влияет на эффективность переноса энергии.
TagRFP-23-KFP интенсивность флуоресценции TagRFP-23-KFP +каспаза- 0 5 10 15 20 время, нс Рис. 12. Кинетики затухания флуоресценции TagRFP-23-KFP до и после инкубирования с каспазой-3.
Затухание флуоресценции для нерасщеплнной конструкции TagRFP-23-KFP описывается с помощью функции двух экспонент с временами жизни 1 = 1.2 нс и 2 = 2. нс. Инкубирование белка слияния с ферментом приводит к увеличению среднего времени жизни флуоресценции. Кинетика затухания становится моноэкспоненциальной со временем жизни = 2.4 нс, таким же, как и для индивидуального белка TagRFP (табл. 3).
Таким образом, наблюдение за расщеплением TagRFP-23-KFP под действием каспазы- возможно вести в режиме флуоресцентных измерений с временным разрешением.
Таблица 3. Времена жизни флуоресценции TagRFP-23-KFP до и после обработки каспазой-3.
TagRFP-23-KFP TagRFP-23-KFP + каспаза- Времена Предэкспоненциальные Времена Предэкспоненциальные жизни, нс множители жизни, нс множители 2.45 686 (25.4%) 2.46 100% 1.24 2012 (74.6%) 3.3. Электрофорез и иммуноблоттинг Для подтверждения эффективного расщепления линкера под действием каспазы 3 был также проведн электрофорез образцов TagRFP-23-KFP до и после обработки протеиназой.
В исходной конструкции наблюдаются две основные полосы – 37 и 20 кДа.
Первая соответствует полноразмерному TagRFP с линкером и 66 аминокислотами с N конца KFP (молекулярная масса данного фрагмента около 37 кДа), а вторая - аминокислотам с C-конца KFP (20 кДа). После инкубации с каспазой-3 полоса 37 кДа исчезает, но появляется полоса в районе 27 кДа (TagRFP с участком линкера), что говорит об эффективном расщеплении линкера.
Для идентификации данных полос был проведн вестерн-блоттинг (рис. 13). В качестве первичных антител были выбраны антитела к TagRFP (Evrogen, Россия).
1 2 3 4 Рис. 13. 1 – индивидуальный TagRFP;
2 – индивидуальный KFP;
3 – маркеры молекулярной массы белка, кДа;
4 – исходный белок TagRFP-23-KFP;
5 – конструкция, обработанная каспазой-3. Чрной стрелкой отмечена полоса 37 кДа, соответствующая нерасщеплнной конструкции TagRFP-23-KFP.
Серой стрелкой – фрагмент 17 конструкции после расщепления (TagRFP с участком линкера).
Результаты блоттинга показывают, что данные антитела не связываются с KFP (вторая дорожка). При этом полосы индивидуального TagRFP, конструкции TagRFP-23 KFP и фрагмента расщеплнной конструкции хорошо видны. Исходная конструкция проявляется в виде интенсивной полосы в районе 37 кДа и слабоинтенсивной полосы в области 27 кДа (по-видимому, эта полоса соответствует небольшому количеству TagRFP, появляющемуся в результате неспецифического расщепления белка слияния протеазами клеток E.Coli, от которого не удатся избавиться в процессе очистки белка). После инкубирования с каспазой-3 проявляется лишь одна полоса 27 кДа.
Таким образом, конструкция TagRFP-23-KFP эффективно расщепляется под действием каспазы-3. Полученный белок может быть использован для исследования свойств белка слияния in vitro методами флуоресцентной микроскопии с временным разрешением.
4. Верификация полученной молекулярной модели на эукариотических клеточных линиях и животных 4.1. Трансфекция эукариотических клеток В ходе выполнения работы была проведена транзиторная кальциевая трансфекция клеточной линии млекопитающих HEK293 Phoenix гуманизированной плазмидной ДНК, содержащей ген полученной конструкции TagRFP-23-KFP. Экспрессия белковой конструкции была подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии.
Трансфецированные клетки обладали достаточно яркой флуоресценцией.
Была получена клеточная линия млекопитающих A549, трансфецированная плазмидой, кодирующей ген TagRFP-23-KFP. Показана стабильная и эффективная экспрессия и созревание белка слияния. При этом кинетика затухания флуоресценции клеток, несущих ген TagRFP-23-KFP, при 580 нм (узкополосный фильтр 580/14-25 нм, Semrock, США) характеризуется более быстрыми временами, чем кинетика для клеток экспрессирующих TagRFP. Времена жизни флуоресценции белков, экспрессированных в клетках, согласуются с результатами, полученными в экспериментах с очищенными белками. Результаты измерений для флуоресцирующей линии клеток А549 в режиме временного разрешения представлены в таблице 4.
Таблица 4. Времена жизни флуоресценции клеток линии A549, экспрессирующих TagRFP и TagRFP-23-KFP.
A549_TagRFP-23-KFP A549_TagRFP Времена жизни, нс Амплитуды Время жизни, нс Амплитуда 2.32 15172 (62.6%) 2.42 100% 1.26 9075 (37.4%) 4.2. Изучение активации каспазы-3 в клетках MelKor под действием индукторов апоптоза Активация каспазы-3 в клетках MelKor, трансфецированных плазмидой pTRK- детектировалась с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с временным разрешением MicroTime 200 (Picoquant, Германия). Наблюдалось изменение времени жизни флуоресценции клеток при добавлении индуктора апоптоза – антибиотика камптотецина.
Воздействие камптотецина приводит к изменению вида зависимости затухания флуоресценции с течением времени, при этом среднее время жизни флуоресценции увеличивается (рис. 14).
1, без индуктора log (интенсивность) 0,8 +камптотецин 0, 0, 0, 0, 0 5 10 15 20 время, нс Рис. 14. Кинетики затухания флуоресценции клеток MelKor pTRK23 до (черная кривая) и после инкубации с камптотецином (серая кривая).
Эти данные свидетельствуют об эффективном расщеплении линкера каспазой-3.
Обработка кинетик затухания флуоресценции клеток возможна с помощью трехэкспоненциальной модели, при этом времена жизни равны 1.2, 2.4 и 4.5 нс.
Инкубация с камптотецином приводит к увеличению доли фракции имеющей время жизни флуоресценции 2.4 нс, в то время как доля содержание фракции с временем жизни 1.2 нс снижается. Самое долгое время жизни 4.5 нс относится, по-видимому, к автофлуоресценции данного типа клеток.
4.3. Верификация полученной молекулярной модели на животных Для доказательства возможности регистрации расщепления конструкции на животных был проведн модельный эксперимент, в котором были использованы три флуоресцирующих белка с максимумами флуоресценции в красной области спектра TagRFP, TagRFP-23-KFP и DsRed2. На рис. 15 представлены результаты в режимах измерения по интенсивности и с временным разрешением.
Рис. 15. Результаты экспериментов по визуализации трх различных ex vivo флуорофоров, помещнных в стеклянные капсулы: капсулы с TagRFP и TagRFP-23-KFP были имплантированы под кожу, тогда как DsRed2 был помещн рядом с экспериментальным животным. Серым цветом обозначен контур тела мыши. Система визуализации позволяет вычислять времена жизни флуоресценции. Вверху слева представлено изображение по интенсивности флуоресценции, вверху справа – по временам жизни флуоресценции. Графики внизу демонстрируют обработку кинетик затухания флуоресценции различных флуорофоров.
Эти данные иллюстрируют преимущества метода регистрации с временным разрешением. Максимумы эмиссии TagRFP и DsRed2 практически идентичны (584 и нм, соответственно), поэтому спектральный метод измерения по интенсивности не позволяет различить эти белки в отличие от способа регистрации с временным разрешением. Средние времена жизни трх используемых белков, определнные в этом эксперименте, составляют 2.13 нс для индивидуального TagRFP, 1.6 нс для конструкции TagRFP-23-KFP и 3.35 нс для DsRed2, что позволяет дискриминировать эти флуорофоры по времени затухания флуоресценции.
Таким образом, показана возможность идентификации TagRFP-23-KFP и детекции индивидуального TagRFP на животных в режиме измерения кинетик затухания флуоресценции, поскольку данный процесс сопровождается изменением времн жизни флуоресценции. Это является основой для создания метода определения ферментативной активности каспазы-3 in vivo.
5. ВЫВОДЫ 1) Показано, что флуоресцентные свойства KFP обусловлены набором конформеров, равновесие между которыми зависит от значения pH. Движение в щелочную область pH приводит к увеличению концентрации флуоресцирующего конформера.
2) При щелочных pH установлено существование двух флуоресцирующих конформеров по-разному реагирующих на действие синего света. Один из них при облучении светом с длиной волны 470 нм возвращается в нефлуоресцирующее состояние, другой не чувствителен к облучению.
3) Получены плазмиды для экспрессии белка слияния TagRFP-23-KFP в прокариотических и эукариотических клетках.
4) Определена эффективность переноса энергии в созданном сенсоре TagRFP-23-KFP, равная 51.1%, что соответствует расстоянию между белками в 45-65.
5) Под воздействием каспазы-3 на полученный сенсор TagRFP-23-KFP, представляющим собой конструкцию на основе двух красных белков TagRFP и KFP, соединнных линкером с сайтом расщепления каспазой-3, уровень переноса энергии снижается с 51.1% до 0%.
6) Инкубация клеток линии MelKor, эскпрессирующих белок TagRFP-23-KFP, с индуктором апоптоза камптотецином приводит к исчезновению компоненты со временем жизни флуоресценции равным 1.2 нс, что характерно для расщепленной конструкции.
7) Показана возможность дискриминации расщеплнной и нерасщеплнной конструкции на животных in vivo флуоресцентными методами с временным разрешением.
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1) A.L. Rusanov, T.V. Ivashina, L.M. Vinokurov, I.I. Fiks, A.G. Orlova, I.V. Turchin, I.G. Meerovich, V.V. Zherdeva, and A.P. Savitsky. Lifetime imaging of FRET between red fluorescent proteins. J. Biophotonics, 2010, v. 3(12), p. 774-783.
2) A.L. Rusanov, A.P. Savitsky. Fluorescence resonance energy transfer between fluorescent proteins as powerful toolkits for in vivo studies. Las. Phys. Lett., 2011, v. 8(2), p.
91-102.
Тезисы 1) Савицкий А.П., Саркисов О.М, Немухин А.В., Григоренко Б.Л., Бравая К., Шелаев И., Русанов А. Фемтосекундная кинетика первичных фотопроцессов в разгорающемся белке KFP. Материалы V Съезда Российского фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование света при фотосинтезе», Пущино, 8–13 июня 2008 г., c.184.
2) Русанов А.Л., Ивашина Т.В., Савицкий А.П. Роль 178 положения в формировании хромофора KFP. Материалы V Съезда Российского фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование света при фотосинтезе», Пущино, 8–13 июня 2008 г., c. 202.
3) Русанов А.Л. Создание и изучение свойств FRET-конструкции на основе двух красных флуоресцирующих белков. XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 14-17 апреля 2009 г.
4) Rusanov A.L., Ivashina T.V., Savitsky A.P. Substrates for lifetime imaging of the caspase-3 activity. II International symposium Topical problems of biophotonics – 2009, Nizhny Novgorod – Samara - Nizhny Novgorod, 19-24 July 2009, p. 110.
5) Русанов А.Л., Савицкий А.П. ИРПЭ-конструкции на основе двух красных флуоресцирующих белков для имиджинга с временным разрешением. Школа конференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2010, Москва, 16 17 сентября 2010 г., с. 71.
6) I. Turchin, I. Fiks, M. Kleshnin, A. Orlova, A. Rusanov, A. Savitsky. Fluorescence tomography of red fluorescent protein expressed tumors in small animals. XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences 2010, Oulu, Finland, 9-11 June 2010, p.121.