Изучение биодеструкции и биосовместимости полимерных систем на основе полиоксиалканоатов

На правах рукописи

Босхомджиев Араша Петрович ИЗУЧЕНИЕ БИОДЕСТРУКЦИИ И БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИОКСИАЛКАНОАТОВ 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: кандидат биологических наук Г.А. Бонарцева

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.Б. Шехтер доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 22 апреля 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119 071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан 19 марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в России необходимость изучения и создания новых биоразлагаемых полимерных материалов для медицины стоит очень остро в связи с тем, что на рынке биоразлагаемых медицинских изделий превалируют изделия импортного производства из химически синтезируемых полимеров (полилактиды (ПЛА) и полигликолиды), которые являются быстро деструктируемыми биоматериалами и по своим характеристикам часто не удовлетворяют требованиям медицинских изделий с контролируемым процессом деструкции.

В последние годы в мире ведутся активные исследования полиоксиалканоатов (ПОА) – нового класса природных полиэфиров, обладающих биосовместимостью с живой тканью и не подверженных быстрой гидролитической деградации. Возможность получать полимеры и сополимеры ПОА с заданными свойствами, такими как мономерный состав, молекулярная масса, кристалличность и т.д., позволяет прогнозировать широкую сферу применения данных материалов для медицины применительно к ортопедии, сердечно-сосудистой хирургии, урологии, герниопластике и фармакологии. Однако результаты, полученные к настоящему времени разными исследователями, фрагментарны и часто весьма противоречивы, что связано как с технологическими методами получения этих биополимеров (вид микроорганизма продуцента, условия биосинтеза, состав, метод экстракции, чистота), так и с методами исследования полимеров in vitro и in vivo, поэтому комплексное детальное изучение ПОА с учетом вышеперечисленных существенных факторов и свойств является весьма актуальным.

В нашем институте в течение многих лет ведутся работы по изучению биосинтеза и физико-химических свойств ПОА с целью их возможного использования в медицине. Данная работа является их логическим продолжением и посвящена комплексному изучению процессов биодеструкции и биосовместимости поли-3-оксибутирата (ПОБ) и сополимера поли-3 оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ) в условиях, приближенных к физиологическим in vitro и в опытах на животных in vivo.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является комплексное изучение биодеградации и биосовместимости полимерных систем на основе поли-3-оксибутирата разной молекулярной массы и его сополимера с 3-оксивалератом in vitro и in vivo. В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

Получить и охарактеризовать пленочные системы из ПОБ и ПОБВ разной 1.

молекулярной массы.

Изучить гидролитическую и ферментативную деструкцию пленочных систем из 2.

ПОБ и ПОБВ разной молекулярной массы в сравнении с полилактидами в модельных системах in vitro.

Исследовать биодеградацию и биосовместимость полимеров из ПОБ и ПОБВ при 3.

их подкожной имплантации крысам линии Вистар в сравнении с ПЛА.

Оценить возможность использования ПОБ в качестве покрытия сеток «Линтекс 4.

Эсфил» – медицинского изделия, применяемого в герниопластике.

Научная новизна работы. Впервые проведен комплексный анализ особенностей течения процессов деструкции полиоксиалканоатов широкого набора молекулярных масс (от 169 кДа до 1482 кДа) в условиях in vitro и in vivo. Исследован механизм деструкции пленочных систем из ПОА. Показано, что как гидролитическая, так и ферментативная деструкция пленок ПОБ и ПОБВ происходит одновременно и на поверхности и в объеме полимера и зависит от толщины полимерной пленки, молекулярной массы, химического состава и кристалличности полимера. Установлено влияние фермента липазы как неспецифической эстеразы на биодеградацию полиоксибутирата. Выявлено, что тканевая реакция на имплантацию пленочных систем из ПОА характеризуется умеренной воспалительной реакцией, которая достоверно ниже реакции на имплантацию ПЛА. Показано, что ПОА разной ММ не оказывают токсического действия и являются биосовместимыми.

Практическая ценность работы. Подкожная имплантация пленочных систем из ПОБ и ПОБВ разной ММ крысам линии Вистар на большом объеме операций (150 животных) позволила изучить тканевую реакцию на данные полимеры. Выявлено, что тканевая реакция на имплантацию пленок из полиоксиалканоатов характеризуется умеренной воспалительной реакцией, что позволило предложить использование ПОБ в качестве покрытия сеток «Линтекс Эсфил». Новый сетчатый эндопротез с покрытием из ПОБ может быть предложен для использования в герниопластике для лечения брюшной грыжи, т.к. результаты исследований выявили лучшую тканевую реакцию, проявляемую в виде менее интенсивной и продолжительной воспалительной фазы, более коротких сроков образования и созревания соединительной ткани по сравнению с полипропиленовым аналогом.

Полученные в работе результаты необходимы для разработки широкого спектра изделий медицинского назначения на основе полиоксиалканоатов: хирургических нитей, шурупов и пластин для хрящевой и костной фиксации, мембран для лечения пародонтоза, раневых покрытий, заплаток для восстановления дефектов кишечника, перикарда и кости, чехлов для восстановления нервных каналов и т.д.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (273 источников). Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 45 рисунков и 8 таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Международной школе конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии на 7-ой Рамочной Программе» (Санкт-Петербург, 2006), XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), третьей Санкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007), 17-ом Европейском съезде по гипертонии (Милан, Италия, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, Украина, 2007), 23-ей ежегодной научной конференции Американского Общества Гипертензии на секции молодых ученых «Young Investigator-in-Training

Abstract

Competition» (Новый Орлеан, США, 2008), VI открытой международной конференции молодых ученых по высокомолекулярным соединениям ВМС 2008 (Киев, Украина, 2008).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 17 печатных работ (5 статей, из них 2 статьи в рецензируемых российских журналах и 12 тезисов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования и материалы. В работе были исследованы экспериментальные образцы ПОА, полученные нами в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Для синтеза полимеров использовали штамм продуцент Azotobacter chroococcum 7Б, способный к сверхсинтезу ПОБ (до 80% ПОБ от сухого веса клеток). Штамм выделен из ризосферы пшеницы (дерново-подзолистая почва). Для достижения сверхсинтеза поли-3-оксибутирата в клетках культуру азотобактера выращивали при 30°C в течение 48 часов на среде Берка в условиях избыточного содержания источника углерода в среде (г/л): МgSO4.7H2O – 0,4;

FeSO4.7H2O – 0,01;

Na2MoO4.2H2O – 0,006;

цитрат Na – 0,5;

CaCl2 –0,1;

K2HPO4.3H2O – 1,05;

KH2PO4 – 0,2;

сахароза – 40. Для синтеза сополимера ПОБВ концентрация сахарозы была снижена до 30 г/л среды, спустя 10 часов после начала инкубации культуры в питательную среду было добавлено 20 мМ валериановой кислоты (в виде натриевой соли).

В работе были использованы следующие реактивы: полилактиды (Fluka, ММ=67, 152 и 400 кДа), натрий фосфорнокислый 1-замещенный (NaH2PO4, ХИММЕД, ММ=121), трис (С4H11NO3, ММ=121,1, SERVA, Германия), азид натрия (NaN3, Sigma-Aldrich, США), липаза из поджелудочной железы свиньи (A = 20 U/mg, MМ = 50 кДа, KMF Laborchemie Handels Gmbh, Германия,), хлороформ (трихлорметан CHCl3, ЗАО «ЭКОС-1», РФ), соляная кислота (HCl, «ОСЧ 20-4», ХИММЕД, РФ), натрий гидроокись (NaOH, ХЧ, ХИММЕД, РФ), тиопентал натрия (C11H17N2O2SNa, БИОХЕМИ Гмбх, Кундль, Австрия). При операциях на крысах линии Вистар использованы хирургические нити (шелковая плетеная нить 4/0, ВОЛОТЬ, РФ).

Выделение и очистка ПОА из биомассы. Выделение из биомассы и очистка полимера включали следующие стадии: получение очищенной сухой биомассы (центрифугирование, промывка биомассы изопропанолом, сушка при 60°С), получение раствора ПОА (экстракция полимера из сухой биомассы хлороформом при умеренном нагревании (35-40°С), фильтрация, упаривание раствора), получение очищенного ПОА (осаждение ПОА из раствора изопропанолом, фильтрация и промывка полученного геля изопропиловым спиртом, сушка при температуре 60°С).

Определение молекулярной массы ПОА. Молекулярную массу полимера определяли методом вискозиметрии. Измерения вязкости раствора ПОА в хлороформе проводили при 30°С.

Молекулярную массу вычисляли по уравнению Марка – Хаувинка – Куна, используя коэффициент [] = 7,7 -5М0,82, где - вязкость, М – молекулярная масса ПОБ (Akita et al., 1975).

Исследование состава полимера методом ядерно-магнитного резонанса. Спектры 1H ЯМР 1-2% растворов поли-3-гидроксибутирата и поли-3-гидроксибутирата-3-гидроксивалерата в дейтерированном хлороформе сняты на спектрометре MSL-300 "Bruker" (Германия). Рабочая частота – 300 МГц. Химические сдвиги отсчитывали от сигнала остаточных протонов CDCl3 – 7,20 ppm. Количество накоплений NS = 40. Процентное содержание элементарных звеньев гидроксивалерата в сополимере ПОБ-ОВ рассчитывали по соотношению интегральной интенсивности сигнала метильной группы гидроксивалерата (0,89 ppm) к сумме интегральных интенсивностей сигналов метильной группы гидроксивалерата (0,89 ppm) и метильной группы гидроксибутирата (1,27 ppm) (Bloembergen et al., 1986).

Определение степени кристалличности образцов полимера методом рентгеноструктурного анализа. Методом рентгеноструктурного анализа были определены химическая структура, тип кристаллической решетки и степень кристалличности полимера.

Рентгеноструктурные исследования изотропных образцов проводили на установке на базе 12 кВт генератора с вращающимся медным анодом «RU-200 Rotaflex» фирмы «Rigaku» (Япония) в режимах на прохождение (40 кВ, 140 мА). Использовалось излучение CuK с длиной волны = 0,1542 нм. Для получения двумерных картин дифракции в больших углах и построения дифрактограмм пользовались двухкоординатным позиционно-чувствительным детектором «GADDS» фирмы «Bruker AXS» (Германия) с плоским графитовым монохроматором, установленном на первичном пучке. Диаметр коллиматора составлял 0,5 мм (Ребров и др., 2002).

Изготовление пленок ПОА, ПЛА и их композитов, модифицирование пленок. Пленки получали методом полива растворов ПОА и ПЛА в хлороформе на обезжиренную поверхность стекла. Были получены серии пленок из ПОБ толщиной 40 мкм, диаметром 30 мм разной ММ:

169 кДа, 349 кДа, 510 кДа, 950 кДа, 1482 кДа и сополимера 3-оксибутирата с 3-оксивалератом с ММ 1056 кДа. Дополнительно были получены серии пленок из полилактидов (Fluka) толщиной 40 мкм, диаметром 30 мм разной ММ: 67 кДа, 152 кДа и 400 кДа. Кроме того, была получена смесевая композиция ПОБ с ПЛА. Высокомолекулярный ПОБ (ММ = 950 кДа) и низкомолекулярный ПЛА (ММ = 67 кДа) в соотношении полимеров 1:1 по массе были растворены совместно в хлороформе;

после его испарения были получены пленки композита.

Исследование биодеградации пленок ПОА in vitro. Для измерения гидролитической деструкции пленок ПОБ, ПЛА, ПОБВ и смесевой композиции пленки инкубировали в 0,025 М фосфатном буферном растворе (рН = 7,4) при 37° и 70°С в течение 83 дней в пробирках с 15 мл буфера. Перед взвешиванием пленки промывали дистиллированной водой и высушивали при температуре 70°С в течение 1 часа, затем проводили взвешивание на весах (ошибка измерения d=0,1 mg). Для изучения ферментативной деструкции in vitro пленки ПОБ и ПОБВ инкубировали в 0,2 М Трис буфере (рН = 7,7) при 37°С с добавлением 10 мг/мл липазы (из поджелудочной железы свиньи, A = 20 U/mg, MМ = 50 кДа KMF Laborchemie Handels GmbH) в течение 3 месяцев. В буферный раствор добавляли азид натрия (NaN3) 2 г/л для ингибирования роста микроорганизмов и предотвращения их вклада в биодеструкцию. Замену буфера в пробирках производили через каждые 3 суток в экспериментах с фосфатным буфером и через 2 суток в экспериментах с липазой. Для измерения веса полимера, пленки через каждые 2-3 суток вынимали из буферного раствора и сушили в течение 4 часов при 40°С (Freier et al, 2002). Перед измерениями пленки обрабатывали 0,1% SDS в дистиллированной воде в течение часов, отмывали детергент водой и затем высушивали.

Исследование биодеградации пленок ПОА in vivo. Для оценки биодеградации ПОБ и ПОБВ in vivo, пленки толщиной 10, 20 и 40 мкм размером 15х15 мм помещали подкожно на брюшину самцам крыс линии Wistar (1 крыса – 1 имплант) (Miller, Williams, 1987). Образцы пленок ПОБВ и ПЛА имели толщину 40 мкм. В эксперименте использовали ПОБ ММ: 510, 950, 1482 кДа, ПЛА ММ=152 кДа и ПОБВ ММ=1056 кДа. Предварительно пленки стерилизовали автоклавированием и дополнительно промывали спиртом и дистиллированной водой перед непосредственной имплантацией пленок. В экспериментах было использовано 150 животных.

Перед операцией крысам вводили раствор тиопентала натрия и ожидали наступления наркоза.

Фиксацию пленок к тканям не проводили. На 7, 14, 30, 90 и 180 сутки животных выводили из эксперимента. Животных вскрывали, извлекали соединительнотканные капсулы с имплантатами, полимерные пленки извлекали из капсул при помощи глазных ножниц и пинцета. Пленки обрабатывали 0,1% SDS в дистиллированной воде в течение 2 часов, отмывали детергент водой и высушивали. При постоперационном контроле состояния животных ни в одном случае не было отмечено отторжения имплантируемых образцов. Для всех полимеров исследование внутренних органов не выявило отличий между контрольной и опытными группами животных.

Нанесение покрытия из ПОБ на сетчатые эндопротезы из полипропилена и исследование их биосовместимости. В экспериментах на животных использовали сетчатые полипропиленовые эндопротезы фирмы «Линтекс Эсфил» (Россия) в качестве контроля и опытные образцы сеток, покрытых ПОБ. Для этого образец сетки 15х15 мм погружали в 1% раствор хлороформа с ПОБ ММ = 510 кДа с последующим высушиванием на воздухе, досушиванием при 70°С в течение 2-х часов и стерилизации путем автоклавирования при 0,5 атм в течение 20 минут. При этом получали толщину покрытия сеток 5-7 мкм. Измерения проводили с помощью механического микрометра. Отличительной особенностью данного эксперимента является моделирование брюшной грыжи, создание дефекта брюшины.

Производился продольный разрез брюшины длиной 1,5 см, подбрюшинно помещался образец эндопротеза, который закрывал созданный дефект, а затем эндопротез фиксировался к брюшине с помощью нити ВОЛОТЬ 4/0. Имплантация завершалась наложением швов на кожу. Мы оценивали тканевую реакцию и сроки образования соединительной ткани в зоне имплантации эндопротезов. Сроки вывода животных из эксперимента и методика наркотизирования и стерилизации аналогична эксперименту, проводимому по изучению биодеградации пленок ПОБ in vivo.

Световая микроскопия. Животных забивали методом растяжения позвонков. Материал, предназначенный для исследования (кожа – пленка – окружающие ткани, сетка – брюшина – окружающие ткани), бережно иссекали ножницами с острыми браншами, превышая во всех направлениях необходимый размер на 1-2 мм. Далее полученный материал помещали в фиксатор – 4% формалин и заливали в парафин по стандартной методике. Исследовали макропрепаратов, из которых сделали 300 серийных срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином и изучали их с помощью светооптического микроскопа «Leica» Атомно-силовая микроскопия. Микрофотографии поверхности пленок ПОБ получены методом атомно-силовой микроскопии. Для исследования пленок ПОБ использовали атомно силовой микроскоп «Solver PRO-M» (Россия, Зеленоград). Исследуемый кусочек пленки размером ~2x2 мм2 закрепляли на держателе двухсторонним скотчем. Сканирование проводили в полуконтактном режиме с использованием кантилеверов NSG01 (типичная жесткость 5,1 Н/м), частота сканирования составляла 1-3 Гц, размер кадров от 3х3 до 20х20 мкм2. Для описания поверхности образцов вычисляли два параметра шероховатости среднюю – N N r rn Rq = Ra = n N N шероховатость: и среднеквадратичную шероховатость: n = n =1.

Эти параметры вычисляли по трем кадрам 20х20 мкм, в каждом кадре 512х512 точек.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование гидролитической деструкции пленок ПОА in vitro 1.1. Кинетика гидролитической деструкции ПОБ и его производных В работе гидролитическая деструкция была исследована в двух различных водных средах:

в фосфатном буфере рН=7,4 и в Трис буфере рН=7,7 при 37°С в течение 3-х месяцев. Анализ кинетических кривых показывает, что максимальная скорость потери веса отмечается у наиболее чувствительного к деградации низкомолекулярного ПЛА (ММ 67 кДа) и у ПОБ с относительно низкой ММ 169 кДа;

кроме того, у этих полимеров гидролитическая деструкция заметно отличается в разных средах: в фосфатном буфере этот процесс происходит быстрее (рис. 1).

Потеря веса (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Время (сутки) 67 кДа ПЛА (Трис) 67 кДа ПЛА (ФБ) ПОБВ (ФБ) 169 кДа ПОБ (Трис) 169 кДа ПОБ (ФБ) 349 кДа ПОБ (ФБ) 510 кДа ПОБ (ФБ) 950 кДа ПОБ (ФБ) 400 кДа ПЛА (ФБ) композит (ФБ) Рис. 1. Деградация полимеров ПОБ, ПОБВ, ПЛА разной ММ и композита в фосфатном буфере (ФБ) pH=7,4 и Трис буфере (Трис) pH=7,7 in vitro при t° 37°С Важно отметить, что устойчивость к гидролитической деструкции в тех же условиях возрастает с увеличением ММ образцов ПОБ, что отражено на рис. 1. Действительно, потеря веса у низкомолекулярного ПОБ (ММ 169 кДа) происходит быстрее, и остаточный вес образца составляет 87,4% от начального веса к 84 суткам инкубации. У высокомолекулярных образцов ПОБ 349, 510 и 950 кДа значение остаточного веса выше и составляет 94-98%.

Сопоставление кривых потери веса для пленок с близкими ММ биополимеров: ПЛА и ПОБ (ММ = 400 и 510 кДа соответственно) показало, что полилактиды теряют вес быстрее, чем аналогичные образцы ПОБ. Этот факт подтверждают литературные данные о более высокой скорости деструкции ПЛА по сравнению с ПОБ (Qu et al, 2006;

Kunze et al, 2006).

Потеря веса (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Время (сутки) 169 кДа ПОБ 349 кДа ПОБ 500 кДа ПОБ 67 кДа ПЛА 400 кДа ПЛА композит 950 кДа ПОБ ПОБВ Рис. 2. Деградация пленок из ПОБ, ПЛА, ПОБВ и композита в фосфатном буфере при t° 70°С рН=7, Деградация ПОБВ идет достаточно медленно: в течение 60 суток потери веса почти не происходит, в этот период пленка теряет всего 1% от своего веса, а после 70 суток начинается заметное постепенное падение веса. На рис. 1 также видно, что композит ПОБ и ПЛА деградирует приблизительно с той же скоростью, что и высокомолекулярный ПОБ, входящий в его состав, тогда как низкомолекулярный ПЛА гидролизуется с более высокой скоростью.

Чтобы выяснить влияние температуры на степень гидролиза ПОБ и интенсифицировать процесс, была выбрана более высокая температура – 70°С и использован фосфатный буфер с pH=7,4. Как и следовало ожидать, ускорение гидролиза в этих условиях было весьма заметным, что представлено на рис. 2.

К 45 суткам инкубации пленки из ПЛА превращались в мелко дисперсный порошок, потеря их веса для образца с ММ=67 кДа составляла 50,1% и с ММ=400 кДа – 39,5%. ПОБ с небольшой ММ=169 кДа после 83 дней инкубации в буфере терял 38,5% от первоначального веса пленки и был сильно фрагментирован. Через 83 дня инкубации пленки ПОБ с большей молекулярной массой (349, 510 и 950 кДа) теряли меньший процент веса: 20,2%, 10% и 15,4% соответственно. Интересно, что для композитных пленок потеря веса к 83 суткам составляла 50,8%, тогда как пленки из ПОБВ при возрастании температуры были весьма устойчивы и к концу 95 суток теряли лишь 4,1% от исходного веса полимера. Здесь следует отметить, что при биосинтезе введение в макромолекулу ПОБ звеньев 3-оксивалерата приводит к двум противоположно влияющим на сорбцию воды процессов. С одной стороны, происходит увеличение гидрофобности цепи, т.е. отношение числа сложноэфирных групп к углеводородным группам (метильным, этильным и метиленовым) уменьшается, тогда как степень кристалличности в таком полимере падает с 70 примерно до 30 вес.%. Каждый из этих процессов противоположным образом влияет на сорбционную емкость воды сополимером. В целом, с одной стороны гидрофобизация снижает содержание воды, но с другой стороны, падение степени кристалличности – его повышает (Iordanskii et al, 1984). Поэтому более высокая устойчивость сополимера к гидролизу, по видимому, связана с преобладанием влияния гидрофобизации полимерной цепи ПОБВ.

1.2. Изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ При изучении гидролитической деструкции in vitro мы оценивали не только потерю веса пленок, но и изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ. Максимальное снижение молекулярной массы у всех изучаемых образцов полимеров наблюдается при их инкубации в фосфатном буфере при 70оС (рис. 3).

ММ 12345 12345 0 45 Время, сутки Рис. 3. Изменение ММ образцов ПОБ и ПОБВ в фосфатном буфере рН=7,4 при t° 70°С.

Обозначения: 1 – 169 кДа ПОБ, 2 – 349 кДа ПОБ, 3 – 510 кДа ПОБ, 4 – 950 кДа ПОБ, 5 – 1056 кДа ПОБВ Так, после 83 дней инкубации снижение ММ у полимерных пленок ПОБ достигало 81,65% для образца с ММ 169 кДа и составляло 31 кДа и достигало 91% для образца с ММ кДа и составляло 46 кДа. Значительное уменьшение ММ у всех исследованных образцов было отмечено уже к 45 суткам инкубации, потом падение ММ замедлялось. Например, ПОБ с исходной ММ = 349 кДа к 45 суткам имел ММ = 39 кДа, при дальнейшей инкубации к 83 суткам ММ снижалась незначительно – до 35 кДа. Для сравнения укажем, что у того же полимера с ММ 349 кДа в других температурных условиях при 37°С в том же фосфатном буфере снижение ММ было в 7 раз меньше: а именно, к 45 суткам инкубации – 286 кДа, к 83 дням – 266 кДа.

В экспериментах на Трис буфере при 37°С мы наблюдали такое же снижение молекулярной массы ПОБ 349 кДа к концу эксперимента (265 кДа), как и на фосфатном буфере (табл. 1).

Таблица 1. Изменение ММ пленок из ПОБ и ПОБВ в фосфатном буфере при t° 37 и 70°С и в Трис буфере при t° 37°С in vitro Пленка/срок (сутки) 37°С Фосфатный буфер 37°С Трис 70°С Фосфатный буфер 169 кДа ПОБ 169± 45 130±4 - 37± 83 116±5 132±4 31± 349 кДа ПОБ 349± 45 286±8 - 39± 83 266±10 265±11 35± 510 кДа ПОБ 510± 45 328±8 - 113± 83 306±12 306±15 46± 950 кДа ПОБ 950± 45 670±22 - 143± 83 482±19 - 86± ПОБВ 1056± 45 775±25 - 116± 83 591±16 551±13 50± Наибольшая потеря ММ была у сополимера ПОБВ и составляла 95,26% от начального значения в эксперименте при инкубации пленок в фосфатном буфере при 70°С. Полимер ПОБ, имеющий ММ 950 кДа на 83 сутки того же эксперимента терял 90,94% от начальной ММ полимера. Большая скорость деструкции ПОБВ по сравнению с деструкцией ПОБ, вероятно, связана с тем, что введение в полимерную цепь ПОБ звеньев оксивалерата вызывает появление большего количества аморфных областей, которые играют решающую роль в деструкции полимера.

1.3. Анализ поверхности пленок ПОБ методом атомно-силовой микроскопии Морфология, структура и шероховатость поверхностей пленок ПОБ, подвергнутых воздействию различных коррозионных сред (фосфатный буфер, раствор NaOH) исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). На рис. 4 представлен в качестве контрольного образец ПОБ с ММ=169 кДа, полученный методом полива его раствора в хлороформе на стеклянную подложку.

Анализ шероховатости различных поверхностей одной и той же пленки показал, что средняя и среднеквадратичная шероховатость плоскостей, обращенных к воздуху и стеклу, отличаются приблизительно в десять раз. Подобные различия связаны с условиями десорбции растворителя (хлороформа) из формируемых пленочных образцов ПОБ. В случае испарения хлороформа с поверхности в окружающую воздушную среду поток растворителя формирует дополнительные каналы – поры, которые фиксируются по мере затвердевания и кристаллизации образца. В то же время, морфология ПОБ на противоположной поверхности менее подвержена воздействию транспорта растворителя и обусловлена поверхностной энергетикой (поверхностным натяжением) на границе стекло-ПОБ.

А Б Рис. 4. Шероховатая поверхность пленки полиоксибутирата 169 кДа, контрольная пленка(А) и шероховатая поверхность пленки, выдержанной в фосфатном буфере в течение 83 суток при температуре 70С (Б) (ув. х300) Инкубация образца ПОБ в буферном растворе (Трис и фосфатный буфер) в течение длительного времени (83 суток) приводит к троекратному возрастанию шероховатости на поверхности, ранее обращенной к стеклу, и практически не влияет на шероховатость и морфологию противоположной поверхности (табл. 3, рис. 4).

1.4. Исследование кристалличности ПОБ и ПОБВ В наших экспериментах у всех исследованных полимеров было отмечено возрастание кристалличности в начальный период и затем её постепенное снижение на последнем сроке, когда некоторые образцы были уже сильно фрагментированы, а в случае композита и ПЛА представляли практически порошок.

На рис. 5 приведены сравнительные дифрактограммы исходной пленки 950 кДа, не подвергавшейся деградации, и пленок, выдержанных в фосфатном буфере при 37°С на сроках 45 и 83 суток. Рассчитанные на основе полученных дифрактограмм значения степени кристалличности составляли 74,8%, 76,5% и 77,9% для исходной пленки и пленок на сроках и 83 суток соответственно. Так как структура полимера предполагает наличие аморфных и кристаллических областей, а аморфные области подвергаются гидролизу в первую очередь (Spyros et al, 1997), очевидно, что при последовательном разрушении аморфных областей снижается молекулярная масса полимера и повышается степень его кристалличности.

Рис. 5. Дифрактограммы пленок ПОБ ММ 950 кДа в процессе деструкции во времени (Б) В таблице 2 приведены данные по определению кристалличности изучаемых полимеров.

Из данных таблицы видно, что максимальная кристалличность отмечена у пленки из ПОБ кДа – 74,8%, а наименьшее у пленки из ПОБВ – 61,2%. Известно, что присутствие оксивалерата в ПОА существенно влияет на характеристики полимера, снижая кристалличность материала, делая его по сравнению с полиоксибутиратом более эластичным, упругим и удобным для переработки (Luizier et al, 1992), что хорошо согласуется с полученными нами данными по определению кристалличности ПОБ и его сополимера.

Также из таблицы видно, что начальные значения кристалличности прямо пропорциональны ММ;

чем выше ММ, тем выше значение кристалличности. Это не относится к сополимеру из ПОБВ, кристалличность которого имеет значение 61,2%, тогда как у пленок ПОБ, имеющих минимальную ММ 169 кДа, значение кристалличности равняется 71,2%.

Исследования изменения кристалличности в процессе деградации in vitro показали, что изменение кристалличности полимеров ПОБ и ПОБВ имеет волнообразную природу: сначала значение кристалличности возрастает за счет вымывания аморфных областей полимера, затем постепенно снижается за счет появления амофных областей из кристаллических. Наблюдаются и обратные тенденции превращения кристаллических областей в аморфные (табл. 2).

По-видимому, процессы вымывания аморфных областей и образования аморфных областей из кристаллических происходят одновременно и независимо, благодаря чему общая кристалличность полимера в процессе его деструкции изменяется волнообразно и разнонаправленно в зависимости от условий эксперимента.

Таблица 2. Изменения кристалличности ПОБ и ПОБВ в процессе деградации in vitro в фосфатном буфере Степень Пленки Условия кристалличности Вес пленки, в % Сх в % контроль 71,2±1,7 37°C 45 сут. 72,1±1,5 88,9±0, 37°C 83 сут.

ПОБ 169 кДа 70,7±1,2 87,5±1, 70°C 45 сут. 68,0±1,6 82,3±0, 70°C 83 сут. разрушается 61,5±2, контроль 71,1±1,9 37°C 45 сут. 80,7±1,7 97,2±0, 37°C 83 сут.

ПОБ 349 кДа 72,8±1,4 97,1±1, 70°C 45 сут. 69,0±2,3 91,1±0, 70°C 83 сут. 80,3±2,2 79,8±1, контроль 74,7±1,7 37°С 45 сут. 73,8±1,3 97,8±0, 37°С 83 сут.

ПОБ 510 кДа 79,1±2,2 97,8±1, 70°С 45 сут. 63,5±2,5 96,6±0, 70°С 83 сут. 75,7±2,0 89,9±1, контроль 74,8±1,6 37°С 45 сут. 76,5±1,8 94,7±0, 37°С 83 сут.

ПОБ 950 кДа 77,9±1,2 94,2±1, 70°С 45 сут. 65,5±2,3 94,5±1, 70°С 83 сут. 72,1±2,1 84,6±2, контроль 61,2±1,4 37°С 45 сут. 65,8±1,5 99,2±0, 37°С 83 сут.

ПОБВ 58,1±1,3 95,7±2, 70°С 45 сут. 67,0±1,4 99,8±0, 70°С 83 сут. 70,1±1,7 95,8±1, Таким образом, на основании полученных результатов по изучению гидролитической деструкции ПОА многоэтапная картина этого процесса выглядит следующим образом: в первый период (несколько недель) происходит растворение «вымывание» аморфной фазы, в результате чего кристалличность полимера может несколько возрасти, далее происходит разрыв полимерных цепей и образование тетра-, димеров и мономеров и снижение молекулярной массы, затем развиваются процессы эрозии материала и происходит собственно снижение массы полимера (образца или изделия). Этот процесс длителен и в зависимости от условий среды и физико химических свойств ПОА может продолжаться многие месяцы. Изменение соотношения мономеров в ПОА сопровождается существенными изменениями физико-химических свойств материала.

2. Исследование биодеструкции пленок ПОБ и ПОБВ в модельных опытах с липазой in vitro и в опытах in vivo 2.1. Кинетика биодеструкции ПОБ и ПОБВ в модельных экспериментах с липазой in vitro и в опытах с крысами линии Wistar in vivo Нами были проведены две серии экспериментов: in vitro (пленки инкубировались в Трис буфере с добавлением липазы) и in vivo (пленки имплантировались подкожно крысам).

В эксперименте in vitro были исследованы полимеры ПЛА 67 кДа, ПОБ с ММ 169, 349 и кДа, а также ПОБВ (рис. 6).

Потеря веса (%) 0 20 40 60 80 100 Время(сутки) 67 кДа ПЛА+Lip 67 кДа ПЛА 510 кДа ПОБ+Lip 510 кДа ПОБ ПОБВ+Lip ПОБВ 169 кДа ПОБ+ Lip 169 кДа ПОБ 349 кДа ПОБ+ Lip 349 кДа ПОБ Рис. 6. Деградация пленок из ПОБ, ПЛА, ПОБВ в Tрис буфере с липазой (+Lip) in vitro при t° 37°С, рН=7, Из данных, представленных на рисунке следует, что после 95 дней инкубации влияние липазы на потерю веса пленок из ПОБ и ПОБВ практически отсутствует. Достоверного снижения массы пленок из ПОБ и ПОБВ в течение всего наблюдаемого периода не зафиксировано. В то же время, образцы пленок из ПЛА после 75 суток под действием липазы теряли 54% от первоначального веса, тогда как в контроле без липазы потеря веса пленок из ПЛА составляла всего 15%.

Исследования биодеградации полимеров in vivo показали, что после внедрения имплантата ПОБ в организм животного наблюдаются воспалительно-репаративные изменения, которые приводят к образованию капсулы, которая формируется новой соединительной тканью (рис. 7).

Рис. 7. Фотография частично деструктировавшей пленки 510 кДа ПОБ, имплантированной подкожно – in vivo в крысе через 2 недели (А), через 3 месяца (Б) Поэтому особенностью биодеградации полимера in vivo является то, что распад ПОБ происходит внутри капсулы. Известно, что основными клеточными элементами, участвующими в деструкции инкапсулированного полимера, являются макрофаги и гигантские клетки инородных тел (ГКИТ) (Zhao et al, 1992;

Kao et al, 1994;

Tang et al, 1999). В эксперименте in vivo наблюдалось почти полное рассасывание полимера через 6 месяцев после имплантации пленок из ПОБ ММ 510 кДа (рисунок 8). К этому времени начальный вес пленки у полимеров 950 и 1482 кДа уменьшался на 93% и 83% соответственно.

Потеря веса, % 0 1 2 3 4 5 Время(месяцы) 510 кДа in vivo 950 кДа in vivo 1482 кДа in vivo 510 кДа in vitro 37C 950 кДа in vitro 37C 510 кДа ПОБ 70C ФБ 950 кДа ПОБ 70C ФБ Рис. 8. Сравнительная деградация пленок из ПОБ in vitro в фосфатном буфере при t° 37 и 70°C pH=7.4 и in vivo при подкожной имплантации крысам линии Wistar Эти эксперименты наглядно показали, что разрушение ПОБ происходит значительно быстрее в организме животного, чем в условиях in vitro, что объясняется наличием в организме большого числа неспецифических эстераз, способных расщеплять полимер. Вклад неспецифических эстераз, макрофагов и ГКИТ в биодеградацию ПОА был продемонстрирован ранее в ряде работ (Lobler et al, 2002;

Hoshino et al, 2002;

Shishatskaya et al, 2005).

2.2. Изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ В эксперименте по изучению ферментативной деструкции in vitro, пленки инкубировали в Трис буфере рН=7,7 при 37°С (контроль) и в тех же условиях с добавлением липазы в течение 83 суток. Из данных представленных на рисунке 9 видно, что добавление липазы существенно снижает ММ у всех исследованных образцов ПОБ и ПОБВ по сравнению с контролем без липазы.

ММ 200 34 1234 12 0 Время, сутки Рис. 9. Изменение ММ пленок из ПОБ и ПОБВ в Tрис буфере in vitro с липазой (+Lip) и контроль (к) при t° 37°С рН=7,7. Обозначения: 1 - 169 кДа ПОБ к., 2 - 169 кДа ПОБ +Lip, 3 - 349 кДа ПОБ к, 4 - 349 кДа ПОБ +Lip, 5 - 510 кДа ПОБ к, 6 - 510 кДа ПОБ +Lip, 7 - 1056 кДа ПОБВ к, 8 - 1056 кДа ПОБВ +Lip В этом эксперименте ММ у ПОБ 169 кДа снижалась на 21,9% до 132 кДа в контроле и на 38,5% до 104 кДа с добавлением липазы, у ПОБ 349 кДа на 24,1% до 265 кДа в контроле и на 56,2% до 153 кДа с липазой, у ПОБ 510 кДа на 40% до 306 кДа в контроле и на 73,1% до 137 кДа с липазой;

у ПОБВ 1056 кДа на 47,8% до 551 кДа в контроле и на 75,1% до 263 кДа с липазой.

Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что ферментативная деструкция ПОБ и ПОБВ протекает гораздо быстрее (примерно в 2 раза), чем гидролитическая, если судить о ней по падению ММ. Из сопоставления этих результатов с результатами предыдущих разделов можно заключить, что уменьшение ММ не вызывает снижения общей массы пленок. Этот эффект можно объяснить тем, что липаза, имея достаточно малый размер, способна проникать в объем полимерной матрицы ПОБ и ПОБВ, тем самым, увеличивая площадь ферментативной атаки. Поэтому общая скорость реакции между субстратом и ферментом также растет, но продукты реакции, вследствие их высокой ММ, низкой растворимости в воде и стерических затруднений не могут десорбироваться из объема полимерных образцов.

Кроме того, в экспериментах in vivo на крысах линии Вистар нами было определено изменение ММ у образцов ПОБ – 510, 950 и 1482 кДа через 1 месяц после имплантации. Как и в экспериментах in vitro здесь также наблюдалось снижение ММ образцов. В организме животного снижение ММ у образца ПОБ 510 кДа достигало 57,8% и составляло 215 кДа, у образца ПОБ 950 кДа достигало 54,1% и составляло 436 кДа, т.е. было заметно выше, чем в условиях in vitro в фосфатном буфере, где снижение ММ было 35,7% для образца 510 кДа (до 328 кДа) и 29,5% для образца 950 кДа (до 670 кДа). Однако при 70°С в фосфатном буфере рН=7,4 через 45 суток инкубации мы наблюдали еще большее падение ММ у исследованных образцов у ПОБ 510 кДа – 77,8% (до 113 кДа) и у ПОБ 950 кДа – 84,8% (до 144 кДа), что заметно резче, чем снижение ММ у этих образцов in vivo. В эксперименте с липазой к 83 суткам снижение ММ для образца 510 кДа составляло 72,9% (+Lip до 138 кДа) и 40% (контроль до кДа), т.е. за временной промежуток почти в 3 раза больший, чем в вышеприведенном 1 мес.

эксперименте на животных. Образец ПОБ 1482 кДа показал самое высокое падение ММ в экспериментах на животных: через 1 месяц после имплантации образца крысам падение ММ достигало 62% от начальной величины и составило 566 кДа. К сожалению, определить значения ММ исследованных образцов на следующих сроках было невозможно в связи с тем, что они не имели достаточной массы для вискозиметрии. Таким образом, можно сказать, что падение ММ ПОБ и ПОБВ in vivo происходит гораздо быстрее, чем в условиях гидролитической и даже ферментативной деструкции биополимера с липазой in vitro, что связано со значительным вкладом в биодеструкцию этих полимеров клеточных элементов ткани, макрофагов и ГКИТ.

2.3. Анализ поверхности пленок ПОБ методом атомно-силовой микроскопии Для выявления действия липазы на поверхность пленок были исследованы образцы ПОБ ММ 169 кДа, обработанные липазой в Трис буфере в течение 83 суток при tо 37оС. Из таблицы видно, что значения параметров шероховатости пленок после контакта с раствором липазы и буферным раствором близки. Отсюда можно сделать предварительный вывод, что начальная стадия гидролиза ПОБ как в присутствии, так и в отсутствии фермента развивается преимущественно в объемной области полимера. Причем, менее пористая структура поверхности полимера, обращенная к стеклу, подвергается большим изменениям, т.к.

представляет диффузионный барьер для проникновения фермента в объем ПОБ. Здесь наряду с объемными процессами протекает и поверхностный гидролиз. Напротив, поверхность, обращенная к воздуху с высокопористой морфологией, такого барьера не имеет, и мы имеем дело с односторонней диффузией молекул липазы в объем полимерного образца.

Таблица 3. Параметры шероховатости пленок ПОБ ММ 169 кДа Образец Поверхность Ra, нм Rq, нм контакта исходный воздух 130±10 165± исходный стекло 15±2 20± после контакта с буфером, 37оС воздух 135±5 166± после контакта с буфером, 37оС стекло 46±2 59± после контакта с липазой, 37оС воздух 127±7 161± после контакта с липазой, 37оС стекло 48±2 60± 2.4. Исследование кристалличности ПОБ и ПОБВ in vitro Для изучения изменения кристалличности в процессе ферментативной деструкции была исследована серия пленок ПОБ и ПОБВ, инкубировавшихся в Трис буфере с липазой в течение 83 суток. Были получены дифрактограммы и определена степень кристалличности исследованных образцов полимеров (табл. 4). Из таблицы видно, что степень кристалличности возрастает у всех образцов из ПОБ и ПОБВ, но большие значения соответствуют образцам, обработанным липазой. Это связано с действием фермента на аморфные области полимера, как на поверхности, так и внутри полимерной матрицы. За счет малого размера, фермент способен проникать в поры на поверхности пленки и дополнительно действовать изнутри.

К сожалению, измерить значения кристалличности образцов в экспериментах in vivo, после их извлечения из животных, было невозможно из-за прорастающей соединительнотканной капсулы, которая препятствует измерению.

Таблица 4. Изменение ММ, степени кристалличности и веса пленок из ПОБ и ПОБВ под действием липазы in vitro (продолжительность эксперимента 83 сут.) Степень Пленки Условия ММ кристалличности Вес пленки, в % Сх в % контроль 169±9 71,2±1,7 Трис без Lip 83 сутки ПОБ 169 кДа 132±4 72,4±1,4 96,4±2, Трис + Lip 83 сутки 104±5,5 75,8±1,5 96,3±2, контроль 349±12 71,1±1,9 Трис без Lip 83 сутки ПОБ 349 кДа 265±11 74,3±1,5 97,4±2, Трис + Lip 83 сутки 153±7 76,6±1,4 97,6±2, контроль 510±15 74,7±1,7 Трис без Lip 83 сутки ПОБ 510 кДа 306±15 73,1±1,6 99,0±1, Трис + Lip 83 сутки 137±8 71,3±1,2 97,5±1, контроль 1056±39 61,2±1,4 Трис без Lip 83 сутки ПОБВ 551±13 61,1±1,3 99,3±1, Трис + Lip 83 сутки 263±14 67,3±1,4 98,6±1, Механизм биодеградации ПОБ может включать совместное сочетание ферментативного и неферментативного разложения. Однако, этот факт совсем не означает, что биодеградация в этом случае представляет простую комбинацию (сложение) этих двух процессов. Более того, биодеградация ПОБ in vivo, проявляющаяся в снижении молекулярной массы и общей массы образца, остается объектом пристальных исследований, не имеющих однозначной интерпретации. Как уже отмечалось выше, при исследовании процесса гидролиза биополимера в условиях in vitro основной причиной расхождения в описании механизма гидролитической деструкции является использование в разных литературных источниках нестандартных и заметно отличающихся технологических условий получения полимера и модельных условий имитации живого организма (инкубационная среда, tC, рН и т.д.).

Таким образом, в наших экспериментах in vitro достоверно установлено, что добавление липазы в буферный раствор почти в 2 раза увеличивает падение ММ и вызывает возрастание кристалличности образцов, но не влияет на уменьшение веса пленки. В экспериментах на животных показано, что процессы снижения ММ, потери веса и роста степени кристалличности образцов полимеров из ПОА протекают быстрее, чем в модельных экспериментах биодеструкции с липазой in vitro.

3. Изучение биосовместимости пленок и сетчатых эндопротезов in vivo 3.1. Гистологическое изучение тканевой реакции и внутренних органов крыс при подкожной имплантации пленок из ПОБ, ПОБВ и ПЛА Общая картина тканевой реакции на имплантацию пленок из ПОБ, ПОБВ и ПЛА разной ММ и толщины выглядит следующим образом: на 7 сутки вокруг имплантата формируется тонкая соединительная капсула с большим количеством клеток воспаления (макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов), структура пленки остается без видимых повреждений;

на 14 сутки соединительно-тканная капсула утолщается. Внутренний слой капсулы относительно плотный, наружный рыхлый. Внутренняя поверхность капсулы выстлана макрофагами и единичными гигантскими клетками. Ткань капсулы состоит из коллагеновых волокон и фибробластов и в умеренной степени инфильтрирована лимфоцитами и макрофагами, пленка остается прозрачной без явных признаков деградации;

через 1 месяц имплантации пленки на поверхности имеют сильную шероховатость (признаки «изъеденности»), появляются глубокие трещины в толще пленки вследствие биодеградации полимера, на поверхности видны отдельные макрофаги.

Соединительно-тканная капсула в среднем несколько толще, чем капсула после 14 дней, хотя толщина её варьирует у разных животных. Капсула состоит из относительно зрелой соединительной ткани, содержащей коллагеновые волокна и фибробласты, а также немногочисленные лимфоциты и макрофаги. Нейтрофильные лейкоциты практически отсутствуют. На внутренней поверхности капсулы виден слой макрофагов и единичных гигантских многоядерных клеток;

после 3 месяцев капсула вокруг имплантата тонкая, зрелая, состоит из относительно рыхлой соединительной ткани. По сравнению со сроком в 1 месяц в ней значительно уменьшается лимфо-макрофагальная инфильтрация, общее количество фибробластов, а также количество макрофагов и гигантских клеток на внутренней поверхности.

По сравнению с контрольной группой капсула более зрелая и в меньшей степени инфильтрирована клетками. Полимерная пленка истончается. Через 6 месяцев после имплантации капсулы внутри были пустыми, пленки всех толщин были полностью резорбированы. Соединительно-тканная капсула в основном сохраняет свою толщину и структуру по сравнению с 3-х месячным сроком. В торцевой части она тонкая, в плоской части она несколько толще. Отличие от 3-х месячного срока заключается в разрыхлении коллагеновых волокон, уменьшении макрофагов и гигантских клеток на внутренней поверхности капсулы и в ещё большем уменьшении лимфо-макрофагальной инфильтрации (рис. 10, 11).

Гистологическое изучение внутренних органов (печень, почка, селезёнка) во всех опытных группах не выявило каких-либо различий на всех сроках имплантации.

Сопоставление реакции тканей на ПОБ, ПОБВ и полиэфиров типа ПЛА показывает значительно лучшую реакцию тканей и организма на полимеры из ПОА в сравнении с ПЛА, где реакцию тканей можно охарактеризовать как хроническое воспаление в связи с тем, что в результате быстрого гидролиза полилактидов и их сополимеров продукты гидролиза (молочная и др. кислоты) не успевают утилизироваться в организме и вблизи имплантата резко снижается рН окружающей среды (рис. 12А, Б). Хроническое раздражение ткани в результате снижения рН является серьезной проблемой применения полимерных имплантатов на основе сополимеров полилактидов и полигликолидов (Ignatius et al, 1996;

Agrawal et al, 1997).

Рис. 10. Морфология тканей вокруг пленок ПОБ 510 кДа толщиной 40 мкм через 7 (A), 14 (B), 30 (C), 90 (D) и 180 (E) суток после операции (краситель – гематоксилин эозин) Рис. 11. Морфология тканей вокруг пленок ПЛА толщиной 40 мкм через 7 (A), 14 (B), 30 (C), 90 (D) и 180 (E) суток после операции (краситель – гематоксилин эозин) Кол-во клеток Кол-во клеток 7 суток 14 суток 30 суток 90 суток 180 суток 7 суток 14 суток 30 суток 90 суток 180 суток Время (сутки) Время (сутки) Кол-во макрофагов Кол-во лимфоцитов Кол-во макрофагов Кол-во лимфоцитов Кол-во фибробластов Кол-во нейтрофилов Кол-во фибробластов Кол-во нейтрофилов А Б Рис. 12. Динамика изменения клеточного состава соединительнотканной капсулы вокруг пленок ПОБ 510 кДа толщиной 40 мкм (А) и пленок из ПЛА ММ 152 кДа толщиной 40 мкм (Б) через 7, 14, 30, 90 и 180 суток после операции Аналогичные результаты были получены и другими исследователями. В работах Фрейра с сотрудниками наблюдалось существенное снижение количества лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов после 6 месяцев имплантации пленок ПОБ одновременно со снижением толщины капсулы примерно до 80 – 100 мкм. Капсула состояла, главным образом, из коллагеновых волокон, наблюдалось значительное снижение числа клеток соединительной ткани. Небольшое количество экссудата макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов отмечено в тканях, непосредственно примыкающих (адгезированных) к имплантату на сроках 3 – 6 месяцев после имплантации ПОБ (Freier et al, 2002).

Таким образом, установлено, что воспалительная тканевая реакция на имплантацию пленок на основе ПОБ разной молекулярной массы и толщины на протяжении всего эксперимента независимо от химического состава полимера и толщины пленок была одинаковой. Присутствие оксивалерата в полимере не изменяло длительности и интенсивности фазы воспаления, а также характера фиброзной капсулы вокруг пленок. Однако по сравнению с ПЛА воспалительная реакция была менее выраженной, у ПЛА наблюдалась более острая фаза воспаления на начальном этапе и сохранялась до срока в 1 месяц. Отсутствие каких-либо патологических изменений во внутренних органах свидетельствует о том, что пленки на основе ПОБ не оказывают токсического воздействия. В пользу биосовместимости говорит и тот факт, что промежуточный продукт биодеградации ПОБ - D-3-оксимасляная кислота в норме содержится в крови и тканях всех животных в концентрациях 0,3 - 1,3 мМ (Wiggam et al, 1997;

Larsen et al, 2005).

3.2. Гистологическое изучение тканевой реакции и внутренних органов крыс на сетчатые эндопротезы Прорастание протезирующего материала схоже с первичным заживлением раны.

Пролиферация фибробластов, кровеносных сосудов, синтез коллагена – все это этапы одного процесса. Процессы, происходящие при этом, характерны для реакции воспаления. Во всех случаях имплантации эндопротезов на 7 сутки с момента операции развивалась тканевая реакция в виде острого неспецифического воспаления с отёком. Степень выраженности воспалительной реакции на 7 сутки проведения эксперимента в зоне имплантации эндопротеза в зависимости от материала была следующей: сильно выражена – при имплантации эндопротезов «Линтекс-Эсфил», умеренно выражена – в зонах имплантации эндопротеза «Линтекс-Эсфил» с покрытием ПОБ (рис. 13А, 14А). На 14 сутки во всех случаях было обнаружено формирование вокруг элементов эндопротеза рыхлой соединительной ткани без признаков «зрелости», с разнонаправленной ориентацией образующих её коллагеновых волокон(рис. 13B, 14B).

К 30 суткам с момента имплантации эндопротезов отмечено созревание рыхлой соединительной ткани вокруг эндопротеза (рис. 13C, 14C). Через 3 месяца наблюдается созревание плотной соединительнотканной капсулы с упорядочиванием волокон и циркулярной их ориентацией вокруг филаментов эндопротеза, прорастанием кровеносных сосудов в структуру сетчатого эндопротеза (рис. 13D, 14D). К 6 месяцам с момента имплантации эти процессы становятся более отчетливыми (рис. 13E, 14E). Оценка репаративных изменений (включающих смену клеточных ассоциаций с лимфо-макрофагальной на фибробластические образования, время и скорость формирования коллагеновых волокон вокруг филаментов эндопротеза, созревание новообразованной соединительной ткани) в зоне имплантации не показала каких-либо значимых различий, зависящих от вида имплантируемой сетки (рис. 15А, Б). Однако, если учитывать, что после изготовления срезов (микропрепаратов) из материала на 7, 14, 30 сутки сами филаменты наиболее часто сохранялись в срезах с сеткой покрытой ПОБ ММ 510 кДа, то можно сделать предположение о сравнительно более тесном контакте филаментов этих эндопротезов с элементами соединительной ткани, а значит более быстром сокращении воспалительной фазы и более качественном развитии репаративных процессов.

Рис. 13. Морфология тканей вокруг сеток «Линтекс Эсфил» через 7 (A), 14 (B), 30 (C), 90 (D) и 180 (E) суток после операции (краситель – гематоксилин эозин) Рис. 14. Морфология тканей вокруг сеток «Линтекс Эсфил» с покрытием ПОБ ММ 510 кДа через 7 (A), 14 (B), 30 (C), 90 (D) и 180 (E) суток после операции (краситель – гематоксилин эозин) 125 Кол-во клеток Кол-во клеток 7 суток 14 суток 30 суток 90 суток 180 суток 7 суток 14 суток 30 суток 90 суток 180 суток Время (сутки) Время (сутки) Кол-во макрофагов Кол-во лимфоцитов Кол-во макрофагов Кол-во лимфоцитов Кол-во фибробластов Кол-во нейтрофилов Кол-во фибробластов Кол-во нейтрофилов А Б Рис. 15. Динамика изменения клеточного состава соединительнотканной капсулы вокруг сеток «Линтекс-Эсфил» (А) и сеток «Линтекс-Эсфил», покрытых ПОБ ММ 510 кДа через 7, 14, 30, 90 и 180 суток после операции О биологической совместимости материалов, используемых для изготовления эндопротезов, свидетельствует отсутствие послеоперационных осложнений и отсутствие миграции имплантированных эндопротезов, а также образование соединительнотканной капсулы, прорастающей в элементы эндопротеза и вызывающей его «сморщивание» (редукцию). Необходимо отметить меньшую степень выраженности тканевой реакции на имплантацию эндопротезов «Линтекс-Эсфил» с покрытием ПОБ по сравнению с полипропиленовым аналогом, проявляемую в виде менее интенсивной и продолжительной воспалительной фазы, более коротких сроков образования и созревания соединительной ткани.

Выводы:

Впервые проведены комплексные исследования биосовместимости и биодеградации пленочных систем на основе синтезированных полиоксибутирата разной молекулярной массы и его сополимера с оксивалератом in vitro и in vivo.

Изучен механизм и кинетика деструкции полиоксиалканоатов in vitro. Показано, что гидролитическая деструкция пленок полиоксибутирата и его сополимера с оксивалератом происходит одновременно как на поверхности, так и в объеме полимера. Ферментативная деструкция происходит преимущественно в объеме полимера. Полученные результаты позволяют прогнозировать время деструкции этих полимеров в условиях in vivo.

Показано, что скорость гидролитической деструкции in vitro пленочных систем из полиоксиалканоатов значительно ниже, чем из полилактидов и обратно пропорциональна молекулярной массе биополимеров.

Впервые разработан метод оценки ферментативной биодеструкции полиоксиалканоатов in vitro в присутствии липазы. Показано, что действие липазы как неспецифической эстеразы полиоксиалканоатов приводит к уменьшению молекулярной массы и увеличению кристалличности полимеров in vitro, моделируя процесс их биодеструкции in vivo.

Показано, что биодеградация полиоксиалканоатов in vivo происходит преимущественно за счет энзиматической деструкции с незначительным вкладом гидролитической. В процессе биодеструкции имплантаты полностью резорбируются через 6 месяцев после их имплантации.

Выявлено, что тканевая реакция на имплантацию пленочных систем из полиоксиалканоатов характеризуется умеренной воспалительной реакцией, которая достоверно ниже реакции на имплантацию полилактидов. Полимеры из полиоксиалканоатов не оказывают токсического действия и являются биосовместимыми.

Выявлена лучшая тканевая реакция на полипропиленовый сетчатый эндопротез с покрытием из полиоксибутирата по сравнению с полипропиленовым аналогом. Разработанный нами эндопротез не оказывает токсического действия и является биосовместимым, что позволяет рекомендовать его для медико-биологических испытаний с целью использования в хирургической практике.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Лучинина Е.С., Лившиц В.А., Босхомджиев А.П., Маркин В.С., Иорданский А.Л. Новые полимерные системы для контролируемого высвобождения дипиридамола и индометацина. Прикладная биохимия и микробиология. 2006 г., Т.42, №6, стр. 710-715. (Applied biochemistry and microbiology, 2006, Vol. 42, No. 6, p. 625-630).

2. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Иванов Е.А., Багров Д.В., Филатова Е.В., Иорданский А.Л., Бонарцева Г.А. Сравнительное изучение кинетики биодеградации биополимерных систем на основе поли-3-оксибутирата.

Биомедицинская химия. 2009 г., Т.55, вып.6, стр. 702-712.

Статьи:

1. Bonartsev A.P., Myshkina V.L., Nikolaeva D.A., Furina E.K., Makhina T.A., Livshits V.A., Boskhomdzhiev A.P., Ivanov E.A., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Biosynthesis, biodegradation, and application of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers - natural polyesters produced by diazotrophic bacteria. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, Ed: A. Mndez-Vilas, Formatex, Spain, 2007, Vol.1, p. 295-307.

2. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Иванов Е.А., Багров Д.В., Филатова Е.В., Бонарцева Г.А., Иорданский А.Л. Гидролитическая деструкция биополимерных систем на основе поли-3-оксибутирата. Кинетический и структурный аспекты. Пластические массы. 2009 г., вып. №8, стр. 13-18.

3. Бонаpцев А. П., Иоpданский А. Л., Бонаpцева Г. А., Босхомджиев А. П., Заиков Г. Е.

Биодегpадация и биомедицинское пpименение бактеpиального поли(3-оксибутиpата). Все материалы. Энциклопедический справочник. 2009 г., №11, стр. 31-41.

Тезисы докладов:

1. Bonartsev A.P., Postnikov A.B., Mahina T.K., Myshkina V.L., Voinova V.V., Boskhomdzhiev A.P., Livshits V.A., Bonartseva G.A., Iorganskii A.L. A new in vivo model of prolonged local nitric oxide action on arteries on basis of biocompatible polymer. The Journal of Clinical Hypertension, 2007, Suppl. A., V. 9, N. 5, p. A152.

2. Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Босхомджиев А.П., Лившиц В.А., Иванов Е.А., Постников А.Б., Николаева Д.А., Воинова В.В., Иорданский А.Л., Бонарцева Г.А., Медведева Н.А. "Создание модельных и лекарственных полимерных систем на основе поли-3-оксибутирата". Материалы докладов Международной конференции XIV студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 11-14 апреля 2007, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Т.1, стр. 19-20.

3. Bonartsev A.P., Livshits V.A., Ivanov E.A., Makhina T.A., Myshkina V.L., Boskhomdzhiev A.P., Voinova V.V., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Nanospheres and nanocapsules loaded with drugs and proteins on the base of biocompatible and biodegradable polymer, poly(3 hydroxybutyrate). Book of reports of KIST-MSU Joint Workshop on Nanotechnology, Seoul, Korea, November 13-14, 2007, p. 77-87.

4. Bonartsev A., Postnikov A., Mahina T., Myshkina V., Boskhomdzhiev A., Livshits V., Ivanov E., Voinova V., Nikolaeva D., Medvedeva N., Bonartseva G., Iorganskii A. A new model of prolonged local nitric oxide action on different blood vessels in vivo on basis of poly(3 hydroxybutyrate. Book of abstracts of 17th European Meeting of Hypertension, June 15-19, 2007, Milan, Italy, p. 138.

5. Livshits V.A., Ivanov E.A., Bonartsev A.P., Boskhomdzhiev A.P., Mahina T.K., Myshkina V.L., Voinova V.V., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Microspheres, nanospheres and membranes on the base of biocompatible and biodegradable polymer, poly(3-hydroxybutyrate), loaded with antiproliferative and antihypertensive drugs. The 23rd Annual Scientific Meeting of the American Society of Hypertension, May 14-17, 2008. The Journal of Clinical Hypertension, 2008, Suppl. A, Vol. 10, Iss. 5, p. A2.

6. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Бонарцева Г.А.

"Исследование биодеградации биополимера микробного происхождения - поли– оксибутирата". Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 11-14 апреля 2007, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Т.1, стр. 71-72.

7. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Бонарцева Г.А.

"Изучение биосовместимости и биодеструкции бактериального биопластика - поли– оксибутирата разной молекулярной массы". Тезисы докладов Третьей Санкт Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах", 17-19 апреля 2007, Санкт-Петербург, с. 328.

8. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л. "Изучение биодеградации парадонтологических мембран на основе поли–-оксибутирата". Тезисы докладов XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», 25-26 апреля 2007, Казань: Отечество, с. 310.

9. Bonartsev A.P., Voinova V.V., Postnikov A.B., Makhina T.A., Myshkina V.L., Livshits V.A., Boskhomdzhiev A.P., Ivanov E.A., Nikolaeva D.A., Bonartseva G.A., Iordanskii A.L. Book of abstracts of the XVI International Conference " Physiological model of sustained nitric oxide action onvascular tissues with using biocompatible polymer, poly(3-hydroxybutirate)", "New Information Technologies in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology". May 31 – June 9, 2008. Gurzuf, Ukraine., p. 107-108.

10. Бонарцева Г.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Николаева Д.А., Фурина Е.К., Босхомджиев А.П., Иванов Е.А., Лившиц В.А., Бонарцев А.П., Иорданский А.Л.

Разработка новых медицинских изделий с пролонгированным высвобождением инкапсулированных лекарственных препаратов на основе биосовместимых и биоразлагаемых полимеров. Материалы симпозиума "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств", 9-11 июня г., Москва, стр. 28.

11. Бонарцева Г.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Николаева Д.А., Фурина Е.К., Лившиц В.А., Иванов Е.А., Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Иорданский А.Л. Разработка новых инъекционных форм лекарственных препаратов пролонгированного действия на основе микросфер из биосовместимых и биоразлагаемых полимеров. Материалы симпозиума "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств", 9-11 июня 2008 г., Москва, стр. 26-27.

12. Bonartsev A.P., Livshits V.A., Ivanov E.A., Makhina T.A., Myshkina V.L., Boskhomdzhiev A.P., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Micro- and nanoparticles loaded with various drugs on the base of biocompatible and biodegradable polymer, poly(3-hydroxybutyrate). Book of abstracts of the 11th MipTec Conference – The Leading European Event for Drug Discovery.

Oct 14-16, 2008, Basel, Switzerland, p. 113.