Программируемая клеточная смерть saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном
На правах рукописи
КНОРРЕ Дмитрий Алексеевич Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном 03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2005
Работа выполнена в отделе Биоэнергетики Научно Исследовательского Института Физико-Химической Биологии им А.Н.Белозерского при МГУ им.
М.В.Ломоносова
Научный консультант: академик РАН В.П.Скулачев
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Звягильская Р.А.
доктор биологических наук, профессор Самуилов В.Д.
Ведущая организация: ГУ Российский Онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН
Защита состоится « 14 » июня 2005 года в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр-т. 33, корп.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр-т. 33, корп. Автореферат разослан « 13 » мая 2005 года
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1. Актуальность темы Контролируемая элиминация клеток играет важную роль в онтогенезе, функционировании иммунитета и поддержании тканевого гомеостаза. До недавних пор считалось, что программируемая клеточная смерть (апоптоз) свойственна только многоклеточным животным или растениям (Vaux et al., 1996). Однако увеличение количества полностью отсеквенированных геномов позволило обнаружить гомологи апоптотических белков в одноклеточных эукариотах и даже в бактериях (Koonin & Aravind, 2002).
Одновременно было найдено, что программируемую клеточную смерть, сходную по цитологическим признакам с апоптозом высших эукариот, можно вызвать различными искусственными и природными индукторами у целого ряда одноклеточных организмов: дрожжей, кинетопластид, инфузорий, одноклеточных водорослей (см. Гордеева и др., 2004).
До недавнего времени основным объектом исследования при изучении апоптоза были клеточные линии высших эукариот. Между тем использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма значительно удобнее в экспериментальном плане. Половой феромон (-фактор) в высоких концентрациях вызывал программируемую гибель небольшой фракции клеток дрожжей дикого типа (Severin & Hyman, 2002), но при использовании штаммов, сверхчувствительных к половому феромону, практически все клетки, обработанные феромоном, были нежизнеспособны. Такая система открывает широкие возможности для проведения поиска генов, участвующих в регуляции программируемой гибели дрожжей.
Для линий клеток многоклеточных животных в ряде случаев достаточно подробно изучен механизм реализации программы самоубийства, тогда как в случае пекарских дрожжей до сих пор были получены только предварительные сведения, не раскрывающие механизмов этой программы.
Поскольку цитологические и молекулярные признаки программируемой гибели одноклеточных организмов во многом схожи с таковыми для клеток многоклеточных животных, то есть основание полагать, что исследование механизма программируемой гибели дрожжей позволит выявить некоторые общие закономерности апоптоза.
Особый интерес в этой связи представляет собой исследование роли митохондрий в программе самоубийства дрожжевой клетки. Для клеток млекопитающих было показано, что митохондрии играют важную роль в регуляции программы самоубийства. Кроме того, энергетический статус клетки находится в значительной степени предопределяется функциональным состоянием митохондрий. При апоптозе клеток многоклеточных животных митохондрии являются основным источником активных форм кислорода. In vitro было показано, что митохондрии дрожжей также могут образовывать активные формы кислорода (Сhance, 1979).
Однако до сих пор оставалось неизвестным, являются ли митохондрии источником активных форм кислорода (АФК) in vivo. Исследование этого вопроса позволило бы в определенной степени управлять процессом программируемой смерти в одноклеточных организмах.
Понимание механизмов контролируемой клеточной смерти дрожжей имеет значение не только в связи с тем, что позволяет проводить аналогии с апоптозом высших эукариот. Очевидно, что механизмы самоубийства клеток грибов и млекопитающих могут иметь более или менее существенные отличия, на основе этих отличий возможно создание новых специфических антигрибковых препаратов (Philips et al. 2003).
2. Цель и задачи работы Целью данной работы было исследование механизма запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванной их половым феромоном, а также поиск генов, кодирующих белки, участвующие в распространении или регуляции этого процесса. Особенное внимание предполагалось уделить роли митохондрий, которые в других системах являются ключевыми регуляторами запрограммированной гибели клеток.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Провести поиск генов, кодирующих белки, участвующие в распространении каскада самоубийства у дрожжей.
2. Методами флуоресцентной микроскопии определить последовательность внутриклеточных событий, наблюдаемых в ответ на добавление к клеткам дрожжей феромона в высокой концентрации.
2. Провести ингибиторный анализ, определить, на каком этапе каскада действуют различные ингибиторы электронтранспортной цепи, разобщители, антиоксиданты и ингибиторы синтеза белка.
4. Определить роль идентифицированных белков в каскаде самоубийства.
3. Научная новизна Разработана экспериментальная система, в которой добавление неспецифического активатора кальциевых каналов (амиодарона), вызывающая повышение концентрации внутриклеточного кальция, приводит к тем же внутриклеточным событиям (образование АФК, фрагментация ДНК, фрагментация митохондрий и клеточная смерть), что и добавление полового феромона.
Установлена последовательность событий при самоубийстве S.
cerevisiae, вызванной физиологическим фактором - высокой концентрацией полового феромона.
1) Активация МАР-киназного каскада 2) Увеличение концентрации внутриклеточного кальция 3) Гиперполяризация митохондрий 4) Образование митохондриями активных форм кислорода 5) Выход цитохрома с из межмебранного пространства митохондрий 6) Деполяризация и фрагментация митохондрий 7) Гибель клеток Идентифицирован новый белок Ysp1p (Yeast suicide protein), который действует на этапе фрагментации митохондрий. Показано, что образование активных форм кислорода является не побочным проявлением программы самоубийства, вызванной высокой концентрацией феромона, а необходимым этапом. Показано, что феромон-индуцированная гибель дрожжей, также как и апоптоз клеток высших эукариот, сопровождается фрагментацией ядерной ДНК.
4. Научно-практическая ценность Работа имеет теоретическое значение для понимания базовых принципов механизмов реализации апоптотического каскада в различных клетках.
Наличие в одноклеточных организмах физиологической программы самоубийства делает дрожжи не только удобным инструментом для изучения механизмов апоптоза, но также и многообещающей моделью для изучения общих принципов “альтруистической“ смерти организмов.
5. Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном семинаре отдела биоэнергетики НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского при МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке».
6. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы (7 глав), раздела «Методы исследования» (7 глав), результатов (10 глав), обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 157 страницах, содержит 47 рисунков и таблиц. Список литературы включает 222 работы из них 213 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Обзор литературы В обзоре литературы рассмотрено большинство известных к настоящему моменту примеров активной гибели одноклеточных организмов.
Обсуждаются механизмы реализации и регуляции каскада самоубийства у одноклеточных, вызванного различными индукторами. Рассмотрены известные механизмы образования АФК в дрожжах.
2. Материалы и методы В работе были использованы штаммы дрожжей S. cerevisiae W303-1B, W303-1B cmd1-6, W303 cyc3 и W303 -. Кроме этого, в ходе работы были получены несколько штаммов, устойчивых к высоким концентрациям полового феромона, в том числе W303-1B ysp1. Дрожжи выращивали на богатых средах, содержащих в качестве истоника углерода галактозу и раффинозу или, при проведении генетического скрининга, на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Для приготовления твердых сред в указанные выше среды добавляли бакто-агар (20 г/л). Клетки выращивали и инкубировали при температуре 30 С, при этом работали с культурой, находящейся в логарифмической фазе роста.
Программируемую гибель индуцировали половым феромоном ( мкг/мл) или амиодароном (80 мкМ). Для определения процента выживания после обработки феромоном или амиодароном, суспензию клеток разводили и высеивали на твердую среду. Через 48 часов подсчитывали количество образовавшихся колоний. В тех случаях, когда процент гибели был низким (менее 40%), выживаемость определяли по окрашиванию метиленовым синим или пропидий иодидом. Образование активных форм кислорода определяли по окрашиванию клеток дихлорфлуоресцеином диацетатом.
Потенциал митохондрий в целых клетках оценивали по флуоресценции тетраметилродамина или потенциалзависимого митотрекера оранжевого.
Для определения скорости дыхания целых клеток и митохондрий использовали полярографический метод.
3. Результаты 3.1. Исследование зависимости гибели клеток от концентрации полового феромона показало, что при концентрации феромона 100 мкг/мл достигается максимальный процент гибели, дальнейшее увеличение концентрации не приводило к увеличению процента мертвых клеток (Рис.1). Для проведения генетического скрининга необходимо было создать систему, где процент выживания клеток не превышал 3-4%. Показано, что фаза клеточного цикла и репликативный возраст клетки не влияли на восприимчивость клеток штамма W303-1B к летальной концентрации полового феромона. Поэтому для проведения генетического скрининга и исследования действия ингибиторов нами был выбран штамм W303-1B cmd1-6, гиперчувствительный к половому феромону. Феромон в концентрации 100 мкг/мл вызывал гибель более 95% клеток (Рис.1).
Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в суспензии клеток штамма W303-1B cmd1-6 через час сокращалось на 20-25%, тогда как окраска прижизненным красителем метиленовым синим не выявляла даже 1% в этот временной интервал. Это наблюдение служит важным подтверждением того, что клетки этого штамма, обработанные -фактором, не лизировались неспецифически, а гибли активным способом.
Число колоний, % W303-1B 20 W303-1B cmd1- 0 50 100 150 -фактор, мкг/мл Рисунок 1. Зависимость гибели дрожжей штаммов W303 и W303 cmd1-6 от концентрации -фактора.
3.2. Исследовали влияние антиоксидантов: водорастворимого N ацетилцистеина и жирорастворимого -токоферола, а также ингибиторов дыхательной цепи: миксотиазола (ингибитора комплекса III) и KCN (ингибитора цитохромоксидазы), на программируемую гибель клеток штамма W303 cmd1-6, вызванную избытком феромона (Рис.2). Оказалось, что все они в той или иной мере спасали клетки от гибели, однако ингибиторы дыхательной цепи и -токоферол в концентрации 10 мкМ ингибировали и «классический» ответ на феромон, т. е. предотвращали образование половых выростов. Поэтому осталось непонятным, что именно оказывает ингибирующее действие: блокирование дыхательной цепи (в случае с миксотиазолом и KCN) или подавление каких-либо ранних этапов ответа на феромон, возможно, общих для «классического» ответа и феромон индуцируемой гибели.
Число колоний, % Миксотиазол, 1 мкМ Миксотиазол, 0,5 мкМ KCN, 1 мМ Контроль -токоферол, 10 мкМ N-ацетилцистеин, 30 мМ -токоферол, 2,5 мкМ Рисунок 2. Влияние антиоксидантов и ингибиторов дыхательной цепи на гибель дрожжей, вызванную феромоном (100 мкг/мл).
3.3 Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов самоубийства дрожжей был проведен генетический скрининг генов, кодирующих белки, участвующие в этом каскаде. Для этого был использован штамм W303 cmd1 6, гиперчувствительный к половому феромону. Мы трансформировали этот штамм транспозоном, который замещал случайный участок последовательности геномной ДНК. Полученную смесь мутантов обрабатывали феромоном и высеивали на твердую среду.
Устойчивость к высокой концентрации феромона могла возникать в следующих случаях: (1) нарушение каскада самоубийства;
(2) нарушение общего участка каскада для самоубийства и полового ответа на феромон;
(3) потеря функциональных митохондрий (согласно работе Severin & Hyman, 2002);
(4) компенсация гиперчувствительности к феромону.
Список идентифицированных Транспозонная библиотека генов дрожжевого генома Дрожжевая Определение геномная Дрожжевая геномная ДНК места ДНК интеграции транспозона и Обработка рестриктазой NotI нарушенного Дрожжевая Дрожжевая гена геномная amp leu геномная ДНК ДНК Набор фертильных мутантов S. сerevisiae, транспозон устойчивых к высоким Высокоэффективная интегративная концентрациям трансформация штамма S. cerevisiae, фактора (~3%) Гиперчувствительного к -фактору Набор мутантов S. сerevisiae, Обработка –фактором растущих на среде без лейцина (100 мкг/мл) Обработка феромоном Набор фертильных мутантов -фактором ( S. сerevisiae, устойчивых к мкг/мл) высоким концентрациям Набор мутантов S. сerevisiae, фактора (~4%) устойчивых к высоким концентрациям Обработка феромона (100%) -фактором (100 мкг/мл) Тест на стерильноcть Набор фертильных мутантов S.
сerevisiae, устойчивых к высоким концентрациям -фактора (~30%) Рисунок 3. Схема генетического скрининга. Проценты в скобках обозначают процент клеток, оставшихся после соответствующего теста. За 100 % принято количество мутантных клеток после первичного теста на устойчивость к феромону.
Для того чтобы исключить пункт 2, мы проверяли способность выживших клеток спариваться с клетками противоположного типа спаривания и в дальнейшем рассматривали только эти мутанты. Для исключения пункта 3 мы проверяли способность клеток расти на несбраживаемом субстрате (глицерине) и в дальнейшем использовали только эти мутанты. Полученный набор мутантов мы проверяли еще два раза на устойчивость к феромону и, если они проявляли стабильную устойчивость, определяли какого участка геномной ДНК они лишены (схема генетического скрининга представлена на рисунке 3).
В полученных мутантных линиях клеток определяли расположение вставки транспозона. Для этого из дрожжей выделяли геномную ДНК и расщепляли рестриктазой Hind III. В кассете генов, содержащейся в транспозоне, содержался единственный сайт для рестриктазы Hind III, поэтому в результате рестрикции мы получали смесь фрагментов геномной ДНК и фрагмент ДНК, содержащей наряду с геномной ДНК участок транспозона до сайта рестрикции Hind III. Полученную смесь фрагментов лигировали с плазмидой pBC KS+, обработанной рестриктазой Hind III и ДНК фосфатазой. Далее смесь плазмид трансформировали методом электропарации в бактерии E. coli линии ХL-1 Blue. Трансформированные бактерии выращивали на твердой среде с добавленными хлорамфениколом и ампициллином. В этих условиях вырастали только те бактерии, в которые была трансформирована плазмида, содержащая фрагмент транспозона и, следовательно геномной ДНК дрожжей. Из полученных штаммов бактерий выделяли плазмидную ДНК и секвенировали ее. Полученные последовательности сравнивали с помощью программы для выравнивания последовательностей BLAST с геномной ДНК дрожжей и идентифицировали ген (или гены), нарушенные в результате встраивания транспозона. В результате, были идентифицировано 28 генов, которые представленны в таблице 1.
Обсуждение роли каждого конкретного гена, обнаруженного в результате скрининга, выходит за рамки работы. Все обнаруженные гены могут быть разделены на несколько групп.
Таблица 1. Гены, предположительно участвующие в регуляции или реализации каскада клеточного самоубийства дрожжей, вызванного высокой концентрацией полового феромона.
N ORF Названия гена 1 YCR105W ADH 2 YHR155W YSP1* 3 YFR044C YFR044c 4 YLR044C PDC 5, YPL064C CWC 6 CWC 7 YLR371W ROM 8 YOR121C YOR121C 9 -10 YDR335W MSN 11 YDR102C и YDR103W YDR102C и STE 12 YLL021W SPA2/FUS6/PEA 13 YDL005C MED 14 YDR181C SAS 15 YOR213C SAS 16 YNL257C SIP 17 YNL236W SIN4/BEL2/GAL22/MED 18 YDL135C и PPH21 RDI1 и PPH 19 RDN58-1, RDN18-1/ RDN58-2, RDN58-1, RDN18-1/ RDN58-2, RDN18-2 RDN18- 20-21 YLR163C MAS1/MIF 22-23 YLR119W SRN2/SRN10/VPS 24 YDR336W YDR336W 25 YPR148С YPR148С 26 YMR114С и/или YMR115w YMR114С и/или FMP 27 YLR162W YLR162W 28 YBR108W YBR108W Одни из них (MSN5, STE5 и SPA2) участвуют в регуляции полового каскада и, следовательно будут оказывать влияние и на апоптотический каскад, вызванный феромоном. Однако в настоящей работе нас в большей степени интересовали белки, участвующие на поздних этапах каскада самоубийства. Второй группой генов оказались транскрипционные факторы и глобальные регуляторы транскрипции (MED2, SAS4, SAS5, SIP3);
нарушение их функции влияет на уровень экспрессии очень большого числа генов, поэтому мы также не стали получать клеточные линии, лишенные этих генов. Также, в рамках работы, нас не интересовали гены рибосомальной РНК, гены, инактивация которых летальна (MAS1) или приводит к значительному замедлению роста на несбраживаемых субстратах (YDR336W). Из оставшихся генов для дальнейшего изучения были выбраны генов: ADH1, YHR155W, PDC1, YLR044C, CWC27 и YOR121C. Мы полагали, что интерес представляют гены с неизвестными функциями, а также ген CWC27, который оказался гомологом генов, кодирующих циклофилины, которые входят в состав Са2+-зависимой, CsA-чувствительной поры митохондрий многоклеточных животных. Поэтому дальнейшая наша задача заключалась в том, чтобы определить, будет ли направленная инактивация обнаруженных нами генов понижать восприимчивость клеток к половому феромону. Для этого методом ПЦР мы сконструировали фрагмент ДНК, состоящий из гена HIS1, фланкированного участками геномной ДНК дрожжей, соответствующих участкам ДНК, фланкирующим гены, которые необходимо было инактивировать. Этими фрагментами ДНК мы трансформировали штамм W303-1B cmd1-6. Таким образом, было получено мутантов: yfr044c, cwc27, pdc1, yhr155w, ycr105w, rom2,, yor121.
Однако 4 из 7 полученных мутантов (cwc27, pdc1, yor121 и rom2) оказались неустойчивыми к половому феромону, что указывало на то, что эффективность нашего скрининга составляет приблизительно 40%. В оставшихся мутантных клетках мы определили скорость роста в среде, содержащей глицерин в качестве источника углеродов и отбросили мутант yfr044с, у которого скорость удвоения в этих условиях оказалась в 1,7 раза меньше, чем у остальных мутантов и родительской линии.
На основании полученных данных для дальнейшего изучения был выбран белок, кодируемый геном YHR155W. Он был инактивирован у клеток штамма W303-1B с помощью той же конструкции, что была использована на клетках W303-1B cmd1-6. Инактивация гена приводила к резкому снижению процента гибели клеток в ответ на высокие (100 мкг/мл) концентрации фактора (Рис. 4). При этом клетки, лишенные гена YSP1, были даже несколько более чувствительны к низкой концентрации полового феромона.
30 % Гибель клеток, % 25 % 20 % 15 % 10 % 5% 0% N-ацетилцистеин Контроль ysp -токоферол Рисунок 4. Снижение процента гибели клеток в штамме c инактивированным геном YSP1 или в присутствии антиоксидантов: 20 мкМ -токоферола или 30 мМ N-ацетилцистеина. ПКС дрожжевых клеток индуцировали -фактором (100 мкг/мл) и оценивали по окраске метиленовым синим через 4 часа после добавления индуктора.
Известно, что добавление даже низких концентраций полового феромона вызывает накопление ионов Сa2+ клетками дрожжей (Iida et al.
1990). Мы предположили, что повышение концентрации Сa2+ в цитоплазме (как и в случае некоторых вариантов апоптоза многоклеточных) может являться сигналом в каскаде самоубийства клеток, вызванного высокой концентрацией полового феромона. Поэтому мы сравнили действие феромона с действием веществ, искусственно повышающих концентрацию внутриклеточного Сa2+: Сa2+-переносчика A23187 и неспецифического активатора Сa2+-каналов амиодарона. Оказалось, что все эти вещества приводят к (1) повышению мембранного потенциала митохондрий, (2) образованию АФК и (3) гибели клеток (Рис.5). Однако в случае А23187 все эти внутриклеточные события наблюдались только в 10% клеток, тогда как амиодарон вызывал быстрый ответ практически во всех клетках. Более того, гиперполяризация митохондрий, образование АФК и гибель клеток в ответ на амиодорон происходили в той же последовательности, что и при обработке клеток высокой концентрацией феромона, однако в случае амиодарона отсутствовал полуторачасовой лаг-период. На основание этих наблюдений мы предположили, что амиодарон вызывает ту же цепь событий внутри клетки, что и феромон, но на более поздней стадии – повышении концентрации внутриклеточного кальция. Поэтому для проведения ингибиторного анализа и дальнейшего изучения последовательности молекулярных событий программируемой клеточной смерти мы использовали амиодарон. Гибель клеток, вызванная амиодароном, происходила независимо от синтеза белка. Добавление 15 мкг/мл циклогексимида не приводило к увеличению процента выживших клеток, обработанных 80 мкМ амиодароном. Мутации, делающие клетки дрожжей стерильными (неспособными к половому размножению), также не влияли на их восприимчивость к амиодарону. В нашей лаборатории А. Позняковским и Ф. Севериным было показано, что в клетках, обработанных амиодароном наблюдалась фрагментация ядерной ДНК и выход цитохрома с в цитоплазму (Pozniakovsky et al., 2005). Для количественной оценки выхода цитохрома с был использован метод, описанный нами ранее (Knorre et al., 2002). Однако оказалось, что обработка клеток амиодароном сильнейшим образом влияла на метод выделения митохондрий на этапе получения протопластов, поэтому от использования этого метода в системе с амиодароном пришлось отказаться.
Рисунок 5. Повышение мембранного потенциала митохондрий и образование АФК клетками дрожжей в ответ на повышение концентрации внутриклеточного кальция. Флуоресценция митотрекера оранжевого (a-d), ДХФ-ДА (e-g) и дифференционно-интерференционный контраст (h). Контрольные клетки (а,е,h);
А23187, 50 мкМ (b,f);
амиодарон, 80 мкМ, (с,g);
феромон, 100 мкг/мл (d).
Фотография (h) показывает то же поле зрения, что и (е), но в проходящем свете.
3.5. Мы исследовали на восприимчивость к амиодарону различные мутантные линии S. cerevisiae: штамм W303-1B cyc3, лишенный цитохром c-гем лиазы, ответственной за образование обоих изоформ цитохрома с из апоцитохромов;
- клетки, лишенные митохондриальной ДНК;
штамм W ysp1;
а также клетки, обработанные различными ингибиторами дыхательной цепи, разобщителями и антиоксидантами (Рис.6).
Число колоний, % N-ацетилцистеин -токоферол Миксотиазол Контроль ysp FCCP, 0,4 мкМ FCCP, 6 мкМ cyc Рисунок 6. Действие различных ингибиторов и мутаций на восприимчивость клеток дрожжей к 80 мкМ амиодарону. Миксотиазол добавляли до конечной концентрации 7 мкМ;
N-ацетилцистеин - 30 мМ;
-токоферол - 20 мкМ. FCCP – трифлуорометоксикарбонилцианид фенилгидразон Оказалось, что клетки, обработанные миксотиазолом, ингибитором дыхательной цепи, а также мутанты, лишенные активной дыхательной цепи (cyc3 и -), были в значительно меньшей степени восприимчивы к амиодарону. Антиоксиданты (жирорастворимый витамин Е и водорастворимый N-ацетилцистеин) также предотвращали гибель, вызванную амиодароном. Из этого мы сделали вывод, что образование АФК и функционирующая дыхательная цепь митохондрий необходимы для реализации каскада событий, вызванного добавлением амиодарона.
3.6. Исследования методами флуоресцентной микроскопии показали, что образование АФК (по флуоресценции ДХФ-ДА, предварительно загруженного в клетки) происходило через 10-15 минут после добавления амиодарона, в то время как потенциалзависимые митотрекер и тетраметилродамин (зонды на потенциал на митохондриальных мембранах) увеличивали интенсивность флуоресценции практически сразу же после добавления амиодарона. Интересно, что гиперполяризация наблюдалась как в клетках, выращенных на галактозе с раффинозой (то есть с нормально функционирующими митохондриями), так и в экспоненциально растущих на глюкозе клетках, то есть в условиях глюкозной репрессии.
В опытах по измерению дыхания целых клеток амиодарон вызывал резкое увеличение отношения скорости дыхания в присутствии FCCP к скорости дыхания в присутствии олигомицина, что хорошо коррелирует с данными флуоресцентной микроскопии и указывает на то, что амиодарон вызывает повышение трансмембранного потенциала (Рис.7). При этом важно отметить, что амиодарон не оказывал описанного выше эффекта на выделенные митохондрии, а в высоких концентрациях даже ингибировал дыхание. Это указывало на то, что на целых клетках гиперполяризацию митохондрий вызывает некий промежуточный фактор. Возможно, что таким фактором являются ионы кальция. Perez-Vazquez и соавторы (2003), показали увеличение дыхательного контроля митохондрий дрожжей S. cerevisiae за счет закрытия ионами кальция неспецифического митохондриального канала.
Из рисунка 7 видно, что амиодарон в концентрации 5 мкМ не вызывал изменения скорости дыхания. Олигомицин в концентрации от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл также не влиял на скорость дыхания целых клеток S. cerevisiae, однако при одновременном добавление амиодарона (5 мкМ) и олгиомицина (10 мкг/мл) наблюдалось уменьшение скорости дыхания клеток (Рис.2).
Аналогичный эффект наблюдался в случае FCCP. Добавление 1 мкМ FCCP приводило к стимуляции дыхания дрожжевых клеток всего в 1,4 раза, тогда как в присутствии амиодарона FCCP стимулировал дыхание более чем в 2, раза.
Рисунок 7. Действие амиодарона на дыхание целых клеток. Скорость дыхания клеток (6*106 клеток/мл) измеряли полярографическим методом. Числа у кривых соответствуют скорости дыхания, нмоль O2/минуту на 107 клеток). Концентрация миксотиазола составляла 3,5 мкг/мл.
Этим эффектам, на наш взгляд, возможно два объяснения. Возможно, что амиодарон каким-то образом влиял на проницаемость цитоплазматической мембраны для этих веществ, или, действительно, происходила гиперполяризация митохондрий за счет (1) сокращения утечки протонов через внутреннюю мембрану и (2) активации NADH дегидрогеназ.
В пользу второго варианта свидетельствуют данные флуоресцентной микроскопии (в первые минуты после добавления амиодарона наблюдалось увеличение флуоресценции только потенциалзависимого митотрекера, но не других флуоресцентных зондов).
Было показано, что низкие концентрации FCCP (0,4 мкМ) вызывали увеличение выживаемости клеток, обработанных амиодароном, тогда как дальнейшее увеличение концентрации уменьшало этот эффект, а высокие концентрации (6 мкМ) даже немного увеличивали восприимчивость клеток к амиодарону. Аналогичный эффект наблюдали с другими разобщителями.
Кроме того, низкие концентрации FCCP предотвращали образование АФК, тогда как высокие – нет (Рис. 8). Полученные данные были подтверждены в нашей лаборатории Ф.Ф. Севериным флуоцитометрическими методами (Pozniakovski et al., 2005).
Рисунок 8. Образование АФК в ответ на добавление амиодарона в присутствии различных ингибиторов. Контроль, без амиодарона (а);
амиодарон, мкМ (b-g): FCCP, 0,4 мкМ (b);
FCCP, 6 мкМ (c);
миксотиазол 2 мкМ (f);
антимицин 10 мкМ (g).
Таким образом мы показали, что предотвращение гиперполяризации митохондрий предотвращает и образование АФК. Однако полная деполяризация митохондрий, происходившая в ответ на добавление 6 мкМ FCCP, не предотвращала образования АФК. Мы полагаем, что это связано с тем, что митохондрии, являясь основным источником АФК, одновременно являются и важным фактором, поддерживающим уровень антиоксидантов в клетке. Это согласуется с данными Grant и др. (1997), показавшими, что клетки дрожжей более восприимчивы к окислительному стрессу. Мы предположили, что местом образования АФК в дыхательной цепи митохондрий дрожжей является Q-цикл III дыхательного комплекса.
Действительно, добавление миксотиазола подавляло образование АФК в ответ на добавление амиодарона, а антимицин А, предотвращающий перенос электронов между цитохромами b и, таким образом, стабилизирующий убихинон в форме Q-., усиливал образование АФК (Рис.7).
3.7. После образования АФК в клетках происходила деполяризация и фрагментация митохондрий. Добавление антиоксидантов (N-ацетилцистеина) предотвращало образование АФК и фрагментацию митохондрий (Рис. 9). На основание этого мы заключили, что фрагментация митохондрий индуцируется АФК. Заметим, что фрагментация митохондрий происходит и в некоторых вариантах апоптоза животных клеток (Skulachev et al. 2004).
Рисунок 9. Фрагментация митохондрий в родительской линии клеток W303 1B (а-с) и в мутанте ysp1 (d). Объемная реконструкция серии снимков с меняющимся фокусом клеток, окрашенных митотрекером оранжевым.
Контрольные клетки (а), клетки, обработанные амиодароном (b,d), клетки, обработанные амиодароном и 30 мМ N-ацетилцистеином (c).
3.8. Мы решили исследовать, на каком этапе каскада действует идентифицированный нами белок Ysp1p. Анализ аминокислотной последовательности этого белка выявил, что он содержит один трансмембранный домен и PH (plextrin homology)-домен, который, по видимому, выполняет регуляторную функцию. Анализ информации, имеющейся в общедоступных базах данных (SGD) указывал на то, что этот белок локализован в митохондриях, хотя и не содержит в себе митохондриальной адресной последовательности. Эти данные подтверждались тем, что в наших условиях Ysp1p, соединенный с GFP (зеленым флуоресцентным белком), колокализовался с митотрекером оранжевым в клетках. Мы показали, что мутанты, лишенный гена YSP1, более устойчивы к феромону и амиодарону (Рис 4, 6), однако гиперполяризация митохондрий и образование АФК, вызываемые этими веществами, оказались такой же интенсивности, как и у клеток дикого штамма. Единственное отличие заключалось в том, что на поздней стадии процесса не происходило деполяризации и фрагментации митохондрий (Рис 9).
Рисунок 10. Предполагаемая схема каскада программируемой гибели Saccharomyces cerevisiae, вызванной феромоном или амиодароном.
4. Заключение На основании полученных данных нами была предложена следующая схема событий, вызываемых добавлением высокой концентрации феромона к клеткам противоположного типа спаривания (Рис. 10). Феромон в высокой концентрации активирует каскад МАР-киназ, что приводит к экспрессии некоторых генов (Рис. 10, 1-4). Активность продуктов этих генов вызывает увеличение концентрации цитоплазматического кальция, что, в свою очередь, непосредственно или при помощи определенных белков вызывает сокращение утечки протонов сквозь внутреннюю мембрану митохондрий и активации NADH дегидрогеназ (Рис. 10, 5-6). Это, в свою очередь приводит к увеличению трансмембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий, что служит причиной увеличения скорости образования АФК комплексом III дыхательной цепи. АФК вызывают деполяризацию и фрагментацию (или набухание) митохондрий, выход цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий (Рис. 10, 7-10). Инактивация гена YSP1 подавляет фрагментацию митохондрий и снижает процент гибели клеток.
5. Основные выводы 1. Предложена схема событий, происходящих в клетках дрожжей S.
cerevisiae при клеточной смерти, вызванной феромоном. При повышении концентрации цитоплазматического кальция амиодароном или A наблюдается гиперполяризация митохондрий и образование активных форм кислорода. Показано, что повышение митохондрий является причиной образования АФК.
2. Показано, что добавление антиоксидантов предотвращает фрагментацию митохондрий и гибель клеток, вызванные амиодароном.
3. АФК являются не эпифеноменом клеточной смерти, вызванной феромоном или амиодароном, а необходимым компонентом каскада самоубийства.
4. Идентифицированы гены, предположительно участвующие в реализации или регуляции программируемой клеточной смерти у дрожжей.
Показано, что функция гена YSP1 необходима для протекания программы самоубийства клеток, вызванной амиодароном или избытком феромона.
5. Идентифицирована функция гена YSP1, который оказался необходим для фрагментации митохондрий, вызываемой АФК при программируемой гибели клеток. Показана митохондриальная локализация продукта этого гена.
6. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Knorre, D.A., Dedukhova, V.I., Vyssokikh, M.Yu., and Mokhova, E.N. (2003) Cyclosporin A-sensitive cytochrome c release and activation of external pathway of NADH oxidation in liver mitochondria due to pore opening by acidification of phosphate-containing incubation medium. Bioscience Reports 23 (2-3): 67-75.
2. Кнорре Д.А., Смирнова Е.А. и Северин Ф.Ф. (2005) Естественные условия для запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Биохимия 70 (2): 323-326.
3. Pozniakovsky, A.I., Knorre, D.A, Markova, O.V., Hyman, A.A., Skulachev, V.P. and Severin, F. F. (2005) Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. J. Cell. Biol. 168 (2): 257-269.
4. Кнорре, Д.А., Дедухова, В.И., Мохова, Е.Н (2002) Уменьшение рН среды инкубации вызывает активацию внешнего пути окисления экзогенного NADH, открытие Са2+-зависимой циклоспорин А чувствительной поры и выход цитохрома С из митохондрий печени крысы. III съезд биохимического общества (2002), Санкт-Петербург, Россия, с. 248-249.
5. Knorre, D.A., Pozniakowski, A., Hyman, A.A., Severin, F.F. (2003);
Genetic screen for activators of pheromone induced apoptosis-like death in yeast Europ. J.
Biochem., Supplement 1, P4.8-31.
6. Кнорре, Д.А., Смирнова, Е.А., Северин, Ф.Ф. (2004) Роль митохондрий в запрограммированной гибели Saccharomyces cerevisiae, вызванной половым феромоном. Ломоносовские чтения, с. 7. Knorre, D.A., Markova, E.A., Smirnova, E.A., Rikhvanov, E.G., Severin, F. F.
(2005) Fate of mitochondria in yeast programmed death. Международная конференция «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, МГУ, с. 28.