Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом rt-pcr
На правах рукописи
НЕМЦОВА ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА
ОПТИМИЗАЦИЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА КУСТИСТОЙ
КАРЛИКОВОСТИ МАЛИНЫ МЕТОДОМ RT-PCR
специальность 03.00.23. – Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009
Диссертационная работа выполнена в ФГОУ ВПО Брянской
государственной сельскохозяйственной академии и ИННО-центре биотехнологии и экологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского.
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Заякин Владимир Васильевич
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Белошапкина Ольга Олеговна кандидат биологических наук Молканова Ольга Ивановна
Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН
Защита состоится «26» мая 2009 г. в 12.00 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул.
Тимирязевская, д.49;
тел./факс. (495) 976-08-
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан «23» апреля 2009 г. и размещен на сайте университета: www.timacad.ru.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Е.А. Калашникова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. В настоящее время во всем мире описано около 30 вирус ных болезней малины, снижающих ее урожайность и ухудшающих качество посадочного материала [Приходько, 1997;
Упадышев, 2004;
Jones, 2004]. Наи более распространенным и трудноконтролируемым патогеном малины и еже вики является вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), который выяв лен во всех областях возделывания культур рода Rubus: в Восточной и Запад ной Европе, Скандинавии, Северной и Южной Америке, Австралии, Новой Зе ландии, Южной Африке, Китае. Поражая различные сорта малины, ВККМ при водит к возникновению хлорозов, некрозов, появлению деформированных и «рассыпчатых» плодов, снижению продуктивности растений. При заболевании число костянок в ягодах снижается до 10-12 шт., в то время как в норме дохо дит до 60 [Strik, 2003]. ВККМ способен снижать урожайность до 50 % даже при бессимптомном протекании инфекции [Murant, 1976б;
Jones, 1986а]. В естест венных условиях вирус передается при семенном размножении и с пыльцой.
Это делает контроль за его распространением в селекционных питомниках и производственных плантациях особенно сложным.
Проведенное в 1991-1996 гг. обследование посадок малины Кокинского опорного пункта ВСТИСП (Брянская область) показало присутствие некоторых опасных вирусных заболеваний (ВМР, ВЛКПЗ, ВЧКТом, ВКПМ) [Приходько, 1997]. Однако это обследование не включало скрининг материала на наличие и распространение ВККМ, хотя в посадках малины повсеместно обнаруживается появление симптомов «рассыпчатости» плода, что свидетельствует о возмож ном присутствии данного вируса в селекционном материале.
В последнее десятилетие, в связи с появлением нового штамма ВККМ (RB – resistance breaking), поражающего сорта, устойчивые к обычным S изолятам ви руса, а также с обострением проблемы контроля за распространением этого па тогена, активно ведется работа по разработке различных методов обнаружения ВККМ. Так, за рубежом регулярно проводится скрининг ВККМ на плантациях малины и ежевики с использованием ИФА [Martin, 1998а]. В лабораторном ма териале вирус анализируется методами IC-RT-PCR [Kokko, 1996] и RT-LAMP [Wang, 2008].
Отечественные разработки методов диагностики ВККМ отсутствуют, а го товые коммерческие наборы для его обнаружения труднодоступны. В зарубеж ной литературе имеется упоминание о наличии ВККМ в образцах из России [Jones, 1998в], но информация о его распространении и характеристика мест ных изолятов на территории РФ отсутствует.
Поэтому, в настоящее время представляется актуальной разработка доступ ного метода диагностики ВККМ, позволяющего провести скрининг этого виру са, как в посадках малины, так и в лабораторном материале, размножаемом в культуре in vitro.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлась раз работка методики диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR, а также опти мизация условий анализа вируса в различных сортах и формах малины в поле вых условиях и in vitro.
Для разработки методики решались следующие задачи:
• Подбор оптимального метода для выделения РНК малины.
• Выбор праймеров, обеспечивающих специфическую и эффективную ам плификацию фрагментов вирусного генома.
• Разработка системы положительных и отрицательных контролей и под бор оптимальных условий для проведения RT-PCR.
Для проверки работоспособности методики диагностики ВККМ и характе ристики местного изолята вируса предполагалось провести:
• Скрининг ВККМ в растениях различных сортов и форм малины Кокин ского ОП ВСТИСП в полевых условиях и в культуре in vitro.
• Изучение возможности передачи вируса при семенном размножении раз личных сортов и форм малины.
• Изучение возможности обнаружения вируса в различных тканях малины в зависимости от стадии годового цикла развития растений.
• Клонирование фрагмента гена белка оболочки ВККМ и определение его нуклеотидной последовательности для идентификации штамма, распростра ненного в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП.
Научная новизна и значимость. На основе RT-PCR разработана доступная методика чувствительного анализа вируса кустистой карликовости в инфици рованных растениях малины.
Осуществлен подбор последовательностей праймеров для амплификации нескольких участков гена белка оболочки РНК-2 ВККМ.
Впервые проведено частичное обследование на наличие ВККМ полевого и лабораторного материала малины, в том числе и ремонтантной. Все изученные формы содержали вирус. Подтверждена способность вируса передаваться при семенном размножении ремонтантной малины. Выявлены толерантные к ВККМ сорта малины. Показано, что выделение меристем ремонтантной мали ны и введение в культуру in vitro, не приводит к освобождению от ВККМ.
Определена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента гена белка оболочки ВККМ длиной 383 bp. Установлено, что изолят ВККМ, распространенный на территории Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наибольшее сходство с изолятом R15, относящимся к группе RB штаммов.
Практическая ценность исследований. Разработана методика диагности ки ВККМ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода RT-PCR. Составлены наборы, предназначенные для анализа ВККМ в полевых и лабораторных растениях малины, культивируемых in vitro.
Данная методика необходима для производства безвирусного посадочного материала, а также при проведении селекции малины, направленной на созда ние сортов, устойчивых к ВККМ.
Получена генетическая конструкция, содержащая фрагмент гена белка обо лочки ВККМ, которая может быть использована для создания модельных трансгенных растений малины при изучении механизмов устойчивости к виру су, а также для получения резистентных к ВККМ сортов малины.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Методика обнаружения ВККМ на основе RT-PCR.
2. Скрининг ВККМ в полевом и лабораторном материале малины.
3. Идентификация штамма ВККМ, распространенного в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Молодые ученые – возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 2006), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты со временной биотехнологии» (Брянск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе статья в журнале «Сельскохозяйственная биология», включенном в пере чень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК Мини стерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четы рех глав, выводов, рекомендаций производству, списка литературы и приложе ния. Объем работы составляет 163 страницы. В диссертации содержится 22 ри сунка и 9 таблиц. Список использованной литературы содержит 251 источник, в том числе 218 работ иностранных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Методика и условия исследования Исследования проводились в Центре биотехнологии БГСХА и в ИННО центре биотехнологии и экологии БГУ в период с 2005 по 2008 гг. Анализиро вались полевые растения малины, сеянцы, а также пробирочные клоны на раз личных этапах клонального микроразмножения. Использовались сорта и фор мы малины селекции академика РАСХН Казакова И.В.: неремонтантный – Бальзам;
ремонтантные – Атлант, Бабье лето-2, Бриллиантовая, Брянское диво, Брянская юбилейная, Геракл, Жар-птица, Золотые купола, Золотая осень, На дежная, Пингвин, 13-39-11, 2-205-1А, 1-220-1, 16-136-6, 37-15-4, 18-183-1, 8 202-1, 3-2-1;
а также ремонтантный сорт Калашник (автор – Кичина В.В.).
1.1. Выделение РНК. Выделение РНК проводилось из тканей малины мас сой 3-500 мг. Для выбора оптимальной методики сравнивались препараты РНК, полученные с использованием четырех модифицированных стандартных мето дов [Chomczynski, 1987;
Клеменс, 1987;
Генетическая инженерия растений, 1991], а также с использованием набора DiatomTM RNA Prep 100 («Изоген»).
Общими модификациями являлись: проведение дополнительных этапов очист ки;
изменение состава некоторых буферов;
применение нерастворимого поли винилпироллидона для связывания примесей;
использование гликогена для осаждения РНК. Определение качества полученных препаратов РНК малины осуществлялось спектрофотометрическим и электрофоретическим методом, а также по результатам RT-PCR.
1.2. Проведение RT-PCR. RT-PCR проводился по методикам, рекомендуе мым фирмами изготовителями обратной транскриптазы M-MLV и Taq полимеразы («Силекс», «СибЭнзим»), с небольшими изменениями. Подбор праймеров и определение их температуры плавления осуществлялись с помо щью программы Vector NTI.
Для проведения PCR использовались следующие температурные условия:
1. Предварительная денатурация 94°С – 3 мин;
2. (10 циклов) денатурация 94°С – 1 мин;
отжиг +56°С при использовании праймера RBDV-СP-3Sal, +50°С при использовании праймера RBDV-CP-2Bam – 1 мин;
синтез 72°С – 1 мин;
3. (20 циклов) денатурация 94°С – 1 мин;
отжиг +51°С при использовании праймера RBDV-СP-3Sal, +45°С при использовании праймера RBDV-CP-2Bam – 1 мин;
синтез 72°С – 1 мин;
4. заключительная элонгация 72°С – 3 мин.
1.3. Конструирование вектора, содержащего фрагмент ВККМ. Создание генетической конструкции, содержащей фрагмент ВККМ, проводилось с ис пользованием стандартных методик [Маниатис, 1984;
Генная инженерия расте ний, 1991]. Вирусспецифичный фрагмент ДНК длиной 383 bp использовался для лигирования в pal-TA вектор. Плазмидная ДНК двух клонов, содержащая вирусспецифичный фрагмент, использовалась для секвенирования («Евроген»).
Нуклеотидные последовательности клонированного фрагмента сравнивались со всеми вирусными последовательностями РНК-2 ВККМ, имеющимися в Gen Bank (с использованием программы ClustalW2 и MEGA4).
2. Результаты и обсуждение 2.1. Оптимизация методов выделения РНК из тканей малины. Так как ткани малины содержат много полифенольных соединений и полисахаридов, то РНК, выделенная стандартными методами, характеризовалась высокой степе нью деградации и наличием примесей. Поэтому, данные методы были модифи цированы для выделения РНК из малины. Результаты спектрофотометрической оценки качества препаратов РНК, полученных четырьмя модифицированными методами из тканей полевых растений ремонтантной малины, показаны в таб лице 1. Наиболее качественные образцы были получены при использовании модифицированных фенолхлороформенного метода и метода экстракции гуа нидинизотиоционатом. Качество препаратов РНК, выделенных данными мето дами, достоверно отличалось от качества препаратов РНК, полученных с ис пользованием фенолтриизопропилнафталинсульфонатного метода и метода экстракции горячим фенолом (при Р0,05).
Таблица 1 – Спектрофотометрическая оценка качества РНК, выделенной различными модифицированными методами из тканей полевых растений ре монтантной малины Среднее зна- Среднее зна Методы чение чение А260/А230 А260/А Фенолхлороформенный метод с применением 1,19 а 1,42 а для экстракции SDS Метод экстракции гуанидинизотиоционатом 1,14 а 1,35 аб Фенолтриизопропилнафталинсульфонатный 0,71 б 1,23 аб метод Метод экстракции горячим фенолом 0,66 б 1,18 б НСР0,05 0,24 0, НСР0,05 – значение наименьшей существенной разности при уровне вероятности 0,05;
а – отличие от группы б достоверно;
б – отличие от группы а достоверно;
аб – отличия от групп а и б недостоверны;
значения, обозначенные одной и той же буквой достоверно не от личаются Оценка статистической значимости средних значений отношений оптиче ских плотностей препаратов РНК показала, что отличия между образцами, вы деленными модифицированными фенолхлороформенным методом и методом экстракции гуанидинизотиоционатом, недостоверны при P0,05. Однако опти мальным для выделения РНК из полевых растений малины являлся фенолхло роформенный метод, так как во всех сравнительных экспериментах значения А260/А230 и А260/А280 для препаратов РНК, полученных данным методом, были всегда выше, чем для препаратов, полученных методом экстракции гуанидини зотиоционатом.
2.2. Характеристика праймеров, используемых для диагностики ВККМ методом RT-PCR. Для обеспечения видоспецифичности анализа были выбра ны три пары праймеров (таблица 2). Подбор праймеров проводился при анализе консенсусной последовательности гена белка оболочки шести наиболее изу ченных на тот момент изолятов ВККМ, нуклеотидные последовательности РНК-2 которых опубликованы в GenBank: RBDV-M, RBDV-Can, RBDV-CanS, RBDV-D1, RBDV-D200, RBDV-R15. Последовательности праймеров компле ментарны наиболее консервативным участкам гена белка оболочки ВККМ, по этому их можно использовать для диагностики всех наиболее распространен ных изолятов вируса. Это является существенным отличием разработанных праймеров от зарубежных аналогов, применяемых для обнаружения конкрет ных штаммов ВККМ – например, для изолята R15 [Kokko, 1996б].
Праймеры выбраны таким образом, чтобы исключить возможность перекре стной реакции с ВМЛ (вирус мозаики люцерны, род Ilarvirus), сходным с ВККМ по нуклеотидной последовательности.
Таблица 2 – Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для диагностики ВККМ (сайты рестрикции выделены курсивом) Название, тип 5'-3' последовательность RBDV-CP-1 обратный cgt cat gga tct aaa att tat c RBDV-CP-2 Bam обратный сас agg аtс саа ста ttg tgg agg att tgc RBDV-CP-3 Sal обратный tgt cgt cga cgg сас cgc сс RBDV-CP+1 прямой tat gag ctt tat aac cgt aag RBDV-CP+2 Eco прямой сас aga att ctt ttg tcg ggt tca gtg ag RBDV-СP+3 Eco прямой сас aga аtt сgа cat gtc tat gtc tgc таа gg Во всех праймерах кроме RBDV-CP-3Sal, сайты рестрикции добавлены искусственно Применение различных комбинаций двух пар праймеров для индикации ВККМ в пробах обеспечивало синтез четырех фрагментов ДНК рассчитанного размера. При использовании одной из пар праймеров (RBDV-CP+1 и RBDV CP-1) амплификация вирусных фрагментов ожидаемой длины не происходила или происходила неэффективно. Это вероятно связано с особенностями вто ричной структуры вирусной РНК или последовательностью нуклеотидов мест ного изолята вируса.
Расположение праймеров в нуклеотидной последовательности РНК-2 по зволяло провести контрольные эксперименты, подтверждающие специфич ность анализа ВККМ (рис. 1). Нуклеотидная последовательность, ограниченная праймерами RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2, имела расчетную длину 706 пар осно ваний. Этот участок содержал внутри более короткие последовательности 654 bp, 426 bp, 373 bp, которые амплифицировались с помощью праймеров, до полнительно содержащих сайты рестрикции, в виде фрагментов длиной 674 bp (праймеры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-2Bam), длиной 435 bp (праймеры RBDV-СP+2Eco и RBDV-CP-3Sal) и длиной 383 bp (праймеры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-3Sal) соответственно.
Рис. 1 – Расположение амплифицируемых с использованием различных пар праймеров фрагментов в нуклеотидной последовательности РНК-2 ВККМ, ко дирующей ген белка оболочки 2.3. Положительные и отрицательные контроли при проведении RT-PCR. Специфичность определения ВККМ подтверждена рядом положи тельных и отрицательных контролей. При обратной транскрипции с праймером RBDV-CP-2Bam синтезировались длинные цепи кДНК, на которых в дальней шем всегда наблюдалась амплификация 4-х фрагментов:
длиной 726 bp при использовании пары праймеров RBDV-CP+2Eco и RBDV-CP-2Bam (рис. 2а, трек 2;
рис. 2б, треки 2, 3);
длиной 674 bp с праймерами RBDV-CP+3Eco и RBDV-CP-2Bam (рис. 2а, трек 3);
длиной 383 bp при использовании пары RBDV-CP+3Eco и RBDV-CP-3Sal (рис. 2б, трек 5);
длиной 435 bp, амплифицируемую с помощью праймеров RBDV-СP+2Eco и RBDV-CP-3Sal.
В случае обратной комбинации – праймер RBDV-CP-3Sal использовался для синтеза кДНК, а праймеры, фланкирующие более длинный участок (RBDV CP+2Eco и RBDV-CP-2Bam), для полимеразной цепной реакции – амплифика ции вирусспецифичных фрагментов не происходило (рис. 2в, трек 2). В этом случае область комплементарности RBDV-CP-2Bam находилась за границей длинных цепей, образованных при использовании для обратной транскрипции праймера RBDV-CP-3Sal – вариант отрицательного контроля амплификации.
Если же на стадии PCR при этом использовался тот же праймер RBDV-CP-3Sal, в сочетании с праймером RBDV-CP+3Eco или RBDV-CP+2Eco, наблюдалась эффективная амплификация фрагментов длиной 383 bp (рис. 2б, трек 4) и 435 bp (рис. 2в, трек 3) соответственно.
Для постановки отрицательных контролей использовались нуклеиновые ки слоты культур, не поражающихся ВККМ (люпин, пшеница или ячмень), а так же осуществлялись эксперименты с проведением PCR без стадии обратной транскрипции. Эти контроли ставились многократно, но ни разу не дали поло жительного результата (рис. 3, трек 10, рис. 5, трек 12).
в) а) б) Рис. 2 – Специфичность анализа ВККМ при различных комбинациях использования праймеров:
а) треки 1 – маркер pUC-19/MspI, 2 – фрагмент длиной 726 bp (RBDV CP+2Eco и RBDV-CP-2Bam), 3 – фрагмент длиной 674 bp (RBDV-CP+3Eco и RBDV-CP-2Bam);
б) треки 1 – pUC-19/MspI;
2, 3 – фрагмент длиной 706 bp (RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2);
4, 5 – фрагмент длиной 383 bp (RBDV-CP+3Eco и RBDV-CP 3Sal). На стадии обратной транскрипции в обоих случаях использовался прай мер RBDV-CP-2Bam, кроме трека 4 на рис. 2б – праймер RBDV-CP-3Sal;
в) треки 1 – Gene Ruler™ 3 kb DNA Ladder, 2 – праймеры RBDV-CP+2Eco и RBDV-CP-2Bam, 3 – фрагмент длиной 435 bp (RBDV-CP+2Eco и RBDV-CP 3Sal). На стадии обратной транскрипции использовался праймер RBDV-CP-3Sal 2.4. Влияние концентрации РНК малины для обратной транскрипции на протекание RT-PCR. Амплификация вирусспецифичных фрагментов про исходила при использовании для обратной транскрипции РНК в количестве 0,3 1,4 мкг на пробу (в зависимости от метода выделения РНК) и практически от сутствовала при содержании РНК в смеси в количестве 2-3 и 0,1 мкг. Это свя зано с тем, что слишком низкая концентрация РНК с небольшим количеством вирусного компонента не обеспечивала протекание обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с достаточной интенсивностью. Высокое содер жание РНК в количестве 2-3 мкг приводило к ингибированию ферментов RT PCR из-за большого содержания примесей (белков, фенольных соединений), что способствовало уменьшению интенсивности свечения полос на электрофо реграмме или их отсутствию, а, следовательно, к недостоверным результатам.
2.5. Влияние методов выделения РНК на эффективность диагностики ВККМ в тканях малины методом RT-PCR. Анализ методов выделения РНК показал, что амплификация вирусных фрагментов протекала при использова нии РНК, выделенной из полевых растений малины модифицированными фе нолхлороформенным методом, методом экстракции гуанидинизотиоционатом и методом экстракции горячим фенолом. При использовании для проведения анализа РНК, выделенной из тех же растений фенолтриизопропилнафталин сульфонатным методом, амплификации специфических вирусных фрагментов не происходило. Это согласовывалось с данными, полученными при спектро фотометрической оценке – препараты, выделенные этим методом из полевых растений, характеризовались наличием примесей при небольшом количестве РНК на пробу. Это затрудняло протекание RT-PCR и приводило к появлению ложноотрицательных результатов.
Для получения препаратов РНК из тканей, не содержащих большое количе ство примесей (пробирочные растения, листья сеянцев, почки), эффективными являлись все методы выделения. Причем не наблюдалось ощутимых различий в интенсивности флуоресценции вирусспецифичных полос. Поэтому для выделе ния РНК из пробирочных растений и из сеянцев применялся наиболее быстрый модифицированный метод экстракции гуанидинизотиоционатом.
2.6. Скрининг ВККМ методом RT-PCR в полевых растениях и сеянцах малины. С использованием разработанной методики анализировались пробы РНК индивидуальных растений малины и усредненные пробы РНК из тканей 10 растений каждой формы (листья, цветы и ягоды цветущих растений). Образ цы, в которых была обнаружена инфекция, отображены в таблице 3. Среди них имеются сорта и формы с явными признаками поражения ВККМ в полевых ус ловиях («рассыпчатость» плодов) – сорта Бальзам, Бриллиантовая, Брянская юбилейная, Золотые купола, Калашник, Надежная и формы 13-39-11, 2-205-1А, 3-2-1. При анализе индивидуальных растений каждого из перечисленных сор тов идентифицированы вирусные фрагменты в 100 % случаев. Это исключает другие возможные причины появления «рассыпчатых» ягод в посадках (напри мер, физиологические). Массовое поражение посадок малины ВККМ является следствием отсутствия контроля за распространением этого патогена в течение длительного времени.
Таблица 3 – Сорта и формы малины, инфицированные ВККМ в полевых условиях и in vitro Наличие Наличие Наличие ВККМ в по- ВККМ в симптомов левых усло- культуре in ВККМ («рас № Сорт Номер виях (по ре- vitro (по ре сыпчатые»
зультатам зультатам плоды) RT-PCR) RT-PCR) 1. Атлант 25-15-1 + + нет 2. Бабье лето-2 8-242-1 + + нет 3. Бальзам – + не изуч. да 4. Бриллиантовая 22-15-1 + не изуч. да 5. Брянское диво 8-79-2 + + нет Брянская юби 6. 5-159-2 + + да лейная 7. Геракл 50-253-1 + + нет 8. Жар птица 3-72-2 не изуч. + нет 9. Золотая осень 24-139-2 + не изуч. нет 10. Золотые купола 8-225-2 + не изуч. да 11. Надежная 2-200-20 + + да 12. Пингвин 4-43-1 + не изуч. нет 13. – 3-2-1 + не изуч. да 14. – 13-39-11 + не изуч. да 15. – 37-15-4 не изуч. + не изуч.
16. – 18-183-1 не изуч. + нет 17. – 8-202-1 не изуч. + не изуч.
18. – 1-220-1 не изуч. + не изуч.
19. – 2-205-1А + + да 20. – 16-136-6 не изуч. – не изуч.
21. Калашник – + не изуч. да В питомнике имеются сорта без видимых признаков поражения ВККМ. К ним относятся перспективные и высокоурожайные ремонтантные сорта Атлант, Бабье лето-2, Брянское диво, Геракл, Золотая осень, Пингвин. Результаты ана лиза цветущих растений некоторых из них изображены на рис. 3. Для повыше ния надежности анализа использовали две комбинации праймеров для проверки каждой пробы (пара RBDV-CP+3Eco и RBDV-CP-3Sal и пара RBDV-СP+2Eco и RBDV-CP-3Sal). Во всех случаях синтезировались вирусные ампликоны длиной 383 bp (рис. 3, треки 6-9) и 435 bp (рис. 3, треки 2-5). В полевых условиях сни жения продуктивности растений этих сортов не обнаружено, поэтому возмож но, что они являются толерантными к ВККМ и вирусная инфекция в них проте кает бессимптомно.
С целью изучения возможности передачи ВККМ при семенном размноже нии, анализировались сеянцы ремонтантной малины, не достигшие цветения. В трех из пяти исследованных семей сеянцев ВККМ не выявлен (Брянская юби лейнаясвободное опыление, 2-205-1Асвободное опыление, ГераклБрянское диво). ВККМ был обнаружен при анализе сеянцев, полученных из семян сорта Надежная (при свободном опылении) и сорта Геракл (при свободном опыле нии) со степенью встречаемости 38% (рис. 4) и 10% соответственно.
Рис. 3 – Инфицированность ВККМ цветущих растений различных сортов ремонтантной малины в полевых условиях: треки 1 – маркер Gene Ruler™ 3 kb DNA Ladder;
2, 6 – Атлант;
3, 7 – Пингвин;
4, 8 – Золотая осень;
5, 9 – Брянское диво;
10 – отрицательный контроль (PCR на ДНК малины). Праймеры RBDV CP+2Eco и RBDV-CP-3Sal – длина вирусного ампликона 435 bp (треки 2-5), праймеры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-3Sal – 383 bp (треки 6-9) Рис. 4 – Инфицированность ВККМ сеянцев ремонтантной малины: треки – маркер Gene Ruler™ 3 kb DNA Ladder, 2-8 – сеянцы, полученные при свобод ном опылении сорта Надежная. Во всех случаях использовались праймеры RBDV-CP+2Eco и RBDV-CP-3Sal (синтез вирусного фрагмента длиной 435 bp) Наличие ВККМ в сеянцах, полученных при скрещивании пораженных форм, подтверждает предположение о том, что передача вируса среди растений малины, в том числе и ремонтантной, может осуществляться посредством се мян [Jones, 1986а]. Однако для различных сортов процент инфицированных ВККМ сеянцев может варьировать, что необходимо учитывать в процессе про ведения селекции.
2.7. Скрининг ВККМ методом RT-PCR в растениях ремонтантной ма лины, размножаемых в культуре in vitro. Одним из основных способов раз множения ремонтантной малины является метод культуры тканей in vitro [Нам, 1998]. В связи с этим проведен анализ пробирочных растений, а также расте ний, высаженных в стерильный почвенный субстрат для укоренения. ВККМ обнаружен в 12-ти из 13-ти проанализированных сортов и форм ремонтантной малины: Атлант, Геракл, Бабье лето-2, Брянская юбилейная, Брянское диво, Жар-птица, Надежная, 2-205-1А, 1-220-1, 8-202-1, 18-183-1, 37-15-4 (таблица 3).
Рис. 5 – Инфицированность ВККМ некоторых форм ремонтантной малины, размножаемых микроклонально: треки 1 и 13 – маркер pUC-19/Msp I;
2, 3, 4 и – соответственно формы 1-220-1, Жар птица, Брянское диво и 16-136-6 (in vitro);
6, 7, 8 и 9 – соответственно формы 1-220-1, Жар-птица, Брянское диво и 16-136-6 (акклиматизация в почвенном субстрате);
11 – форма 2-205-1А (in vitro);
12 – отрицательный контроль (PCR на ДНК растений малины формы 2 205-1А без обратной транскрипции). Во всех случаях использовались прайме ры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-3Sal ВККМ определялся как в пробирочных растениях, так и растениях, адапти рованных к стерильному субстрату, но во втором варианте определение давало более надежные результаты, поскольку амплифицированные фрагменты накап ливались в большем количестве, а в образце 1-220-1 вирус выявлялся только после переноса растений в почвенный субстрат (рис. 5, треки 2 и 6). Не подчи няются этой закономерности результаты анализа сорта Жар-птица – из элек трофореграммы следует, что ВККМ определялся в пробирочных растениях, но отсутствовал в растениях, высаженных в субстрат. Это может быть связано с тем, что для анализа использовалась усредненная проба РНК различных кло нов. Возможно, что часть из них получена из здоровых меристем.
ВККМ не обнаруживался в растениях формы 16-136-6 (рис. 5, треки 5 и 9), даже после 2-х кратного проведения анализа. Возможно, что при введении в культуру данной формы использовались экспланты безвирусных растений или она является резистентной к вирусу.
На рис. 6 показаны результаты анализа индивидуальных пробирочных рас тений ремонтантной малины формы 18-183-1. Для повышения надежности ин дикации использовали две комбинации праймеров для проверки каждого клона (пара RBDV-CP+2Eco и RBDV-CP-2Bam и пара RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP 2Bam). При этом амплификация с использованием одной и той же РНК всегда приводила к появлению вирусспецифичных фрагментов длиной 726 bp (рис. 6, треки 2-7) и длиной 674 bp (рис. 6, треки 8-13).
Анализ отдельных пробирочных клонов растений сортов Бабье лето-2 ( растений), Брянское диво (4 растения), Атлант (5 растений), форм 8-202-1 ( растений) и 37-15-4 (5 растений) также показал 100% распространенность ВККМ.
Рис. 6 – Инфицированность ВККМ пробирочных растений ремонтантной малины формы 18-183-1: треки 1 – маркер pUC-19/MspI, 2-7 – РНК пробироч ных растений (фрагмент длиной 726 bp, амплифицируемый с использованием праймеров RBDV-CP+2Eco и RBDV-CP-2Bam), 8-13 – анализ РНК тех же кло нов пробирочных растений с использованием праймеров RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-2Bam (фрагмент длиной 674 bp) 2.8. Диагностика ВККМ в растениях ремонтантной малины на разных стадиях годового цикла развития. Важной характеристикой аналитической методики является возможность диагностики вируса в разных тканях в зависи мости от физиологического состояния растения, фазы онтогенеза, сезонных из менений. С использованием разработанной методики ВККМ определялся в ли стьях и ягодах ремонтантной малины в течение всего периода вегетации, но не поддавался определению в покоящихся почках в зимнее время (рис. 7, треки 10 13). Вероятно, это связано с уменьшением скорости размножения вируса и снижением его содержания в тканях.
ВККМ определялся вскоре после начала пробуждения почек (рис. 7, треки 2-5) – вирусспецифичные ампликоны синтезировались при использовании для анализа РНК распускающихся почек прошлогодних побегов. Однако в этом случае флуоресценция вирусных ампликонов менее интенсивная, чем при ис пользовании РНК плодоносящих растений (рис. 7, треки 6-9).
Рис. 7 – Инфицированность ремонтантной малины ВККМ в разные перио ды сезонного цикла развития растений (форма 2-205-1А): треки 1 и 15 – маркер pUC-19/Msp I, 2 и 3 – распускающиеся почки (праймеры RBDV-CP+2 и RBDV CP-2), 4 и 5 – распускающиеся почки (праймеры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP 3Sal), 6 и 7 – замороженные листья и ягоды (праймеры RBDV-CP+2 и RBDV CP-2), 8 и 9 – замороженные листья и ягоды (праймеры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-3Sal), 10 и 11 – зимние покоящиеся почки (праймеры RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2), 12 и 13 – зимние покоящиеся почки (праймеры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-3Sal), 14 – «отрицательный контроль» – обратная транскрипция с праймером RBDV-CP-3Sal, PCR с праймерами RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2. Тре ки 4, 8, 12, 14 – для обратной транскрипции использовали праймер RBDV-CP 3Sal, в остальных случаях RBDV-CP- 2.9. Анализ нуклеотидной последовательности изолята ВККМ, распро страненного в посадках малины. Проведен генетический анализ двух нуклео тидных последовательностей клонированного фрагмента ВККМ длиной 383 bp и последовательностей гена белка оболочки всех известных в настоящее время изолятов вируса. Нуклеотидные последовательности клонированного фрагмен та имели наибольшее сходство с участком гена белка оболочки РНК-2 и РНК- изолята вируса R15, относящегося к группе RB изолятов [Natsuaki, 1991;
Mayo, 1991]. Степень гомологии последовательностей клонированного фрагмента 1 и 2 с последовательностью РНК-2 изолята R15 ВККМ составляла 99,2% и 98,1% соответственно.
Праймеры RBDV-СP+3Eco и RBDV-CP-3Sal полностью комплементарны последовательностям всех изолятов ВККМ, кроме штамма, распространенного в Китае [Chamberlain, 2003]. Поэтому с использованием данной пары можно проводить анализ всех остальных изолятов ВККМ, независимо от их серологи ческих свойств.
а R D RR Cm RR б M CanS z13-a z13-b Can D в GR Cm GR GR GR china 0.08 0.06 0.04 0.02 0. Рис. 8 – Филогенетические связи, выявленные на основе анализа нуклео тидных последовательностей гена белка оболочки ВККМ с использованием ме тода ближайших соседей (NJ): 1 и 2 – нуклеотидные последовательности кло нированного фрагмента, остальные – нуклеотидные последовательности раз личных изолятов ВККМ по данным GenBank Из данных дендрограммы (рис. 8), отображающей филогенетические связи, следует, что нуклеотидные последовательности клонированного фрагмента длиной 383 bp с высокой степенью достоверности (98%) образовывали отдель ный кластер совместно с изолятами R15 и D1 (кластер а). Штамм D1, относя щийся к группе S, получен в лабораторных условиях при непрерывном культи вировании изолята D200 в Nicotiana benthamiana [Jones, 2000а]. Последователь ности клонированного фрагмента 1 и 2 имели более тесную связь с изолятом R15, чем с D1. Это подтверждает то, что штамм ВККМ, распространенный в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наибольшее сходство с R изолятом ВККМ. Данный штамм относится к группе изолятов RB, преодоле вающих генетическую устойчивость малины к ВККМ. Поэтому, сорта, устой чивые к S изолятам, не являются перспективными для нашей зоны, что необхо димо учитывать в процессе проведения селекции.
Выводы 1. Разработана методика диагностики ВККМ на основе метода RT-PCR, по зволяющая идентифицировать вирус в полевых и пробирочных растениях ма лины. Специфичность определения ВККМ подтверждена системой положи тельных и отрицательных контролей. Амплификация фрагментов вирусного происхождения происходила при различных сочетаниях праймеров, только в том случае, если анализировались инфицированные ВККМ растения.
2. Установлено, что методика обладает достаточной чувствительностью – минимальное количество ткани для анализа ВККМ составляло 3-5 мг. Она ус пешно использована для обнаружения вируса в генеративных и вегетативных органах полевых растений малины при выраженных или отсутствующих сим птомах заболевания, а также в пробирочных растениях в процессе клонального микроразмножения.
3. Обнаружено, что препараты РНК малины, полученные стандартными ме тодами, характеризовались высокой степенью деградации и наличием приме сей. Поэтому эти методы были модифицированы: для выделения РНК из закон чивших рост грубых и замороженных тканей оптимальным являлся модифици рованный фенолхлороформенный метод с применением для экстракции SDS;
для выделения РНК из пробирочных растений, почек и сеянцев – модифициро ванный метод экстракции гуанидинизотиоционатом.
4. Показана зависимость между физиологическим состоянием растений и выявляемостью ВККМ методом RT-PCR. Вирус определялся в листьях и ягодах малины в течение всего периода вегетации, не поддавался определению в по коящихся почках в зимнее время и снова обнаруживался вскоре после начала пробуждения почек.
5. ВККМ обнаружен при обследовании посадок 15-ти сортов и форм мали ны Кокинского ОП ВСТИСП. При этом, несмотря на наличие вируса в сортах Атлант, Бабье лето-2, Брянское диво, Геракл, Золотая осень, Пингвин в поле вых условиях признаков инфекции и снижения продуктивности для них не на блюдалось. Возможно, что эти сорта являются толерантными к ВККМ и ин фекция в них протекает бессимптомно.
6. Выделение меристем ремонтантной малины и культивирование их in vitro при клональном микроразмножении не приводит к освобождению от ВККМ.
При анализе пробирочных растений 12-ти форм ремонтантной малины не обна ружено ни одного клона свободного от ВККМ.
7. Подтверждена способность ВККМ передаваться при семенном размно жении. В некоторых семьях ремонтантной малины вирусной инфекции выявле но не было, в других ВККМ обнаружен с различной степенью встречаемости (от 10% до 38%).
8. В результате генетического анализа установлено, что изолят ВККМ, рас пространенный в посадках малины Кокинского ОП ВСТИСП, имеет наиболь шее сходство с R15 изолятом, относящимся к группе RB штаммов. Степень го мологии двух нуклеотидных последовательностей клонированного фрагмента ВККМ с последовательностью РНК-2 изолята R15 составляла 99,2% и 98,1%.
Рекомендации производству Предложенную методику рекомендуется использовать для диагностики ВККМ в растениях малины, произрастающих в полевых условиях и в культуре in vitro. Это имеет значение для изучения распространенности ВККМ в посад ках, позволяет проводить отбор неинфицированных растений, организовывать производство здорового посадочного материала и планировать проведение се лекции малины на устойчивость к вирусу.
Сорта ремонтантной малины Атлант, Бабье лето-2, Брянское диво, Геракл, Золотая осень, Пингвин характеризуются высокой продуктивностью и отсутст вием признаков поражения ВККМ, несмотря на присутствие вируса. Рекомен дуется исследовать эти сорта на перспективность их использования в селекции как источник толерантности к ВККМ.
Для получения оздоровленного от ВККМ посадочного материала рекомен дуется проводить тестирование не только клонов пробирочных растений, но и растений, укорененных в стерильном почвенном субстрате.
Скрининг пораженных ВККМ растений малины в питомниках наиболее це лесообразно проводить в тканях однолетних побегов в период с августа по ок тябрь.
Для проведения массового тестирования ВККМ рекомендуется использо вать наборы, включающие праймеры, положительные и отрицательные контро ли, ферменты и стандартные буферы для обратной транскрипции и полимераз ной цепной реакции.
Генетическая конструкция, содержащая фрагмент ВККМ, может использо ваться для создания трансгенных растений малины, резистентных к этому ви русу.
Полученные результаты могут применяться в процессе преподавания учеб ных дисциплин биотехнология и вирусология студентам биологических специ альностей ВУЗов.
Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Нам И.Я., Заякин В.В., Немцова Е.В. Биотехнологические подходы в соз дании генетического разнообразия для селекции малины и люпина // Материа лы II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы куль турных растений в XXI веке» (23-30 ноября 2007 г). Санкт-Петербург, 2007. С.
316-318.
2. Немцова Е.В., Дроздов Е.В. Определение нуклеотидной последователь ности изолята ВККМ, распространенного в посадках ремонтантной малины Ко кинского ОП // Материалы международной научно-практической конференции «Современные проблемы эволюционной биологии» (Брянск, 12-14 февраля 2009 года). Брянск, 2009. С. 335-337.
3. Немцова Е.В., Заякин В.В. Обнаружение RBDV в образцах ремонтантной малины селекции опорного пункта ВСТИСП // Материалы международной на учно-практической конференции «Молодые ученые – возрождению агропро мышленного комплекса России» (Брянск, 23-24 мая 2006 года). Брянск, 2006. С.
14-17.
4. Немцова Е.В., Заякин В.В. Особенности использования метода RT-PCR для идентификации RBDV в тканях ремонтантной малины // Вестник Брянского госуниверситета. 2006. № 4. С. 76-79.
5. Немцова Е.В., Заякин В.В. Обнаружение вируса кустистой карликовости методом RT-PCR в некоторых генотипах ремонтантной малины селекции опор ного пункта ВСТИСП // Материалы четвертого съезда Общества биотехноло гов России (6 – 7 декабря 2006 г). Москва, 2006. С.98.
6. Немцова Е.В., Заякин В.В. Влияние физиологического состояния расте ний ремонтантной малины на выявление вируса кустистой карликовости мето дом RT-PCR // Материалы VI съезда физиологов растений России (Междуна родная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экоси стем»). Сыктывкар, 2007. С. 186-188.
7. Применение клеточных технологий для создания новых высокопродук тивных устойчивых к болезням форм растений малины и люпина с целью ис пользования в селекции / Нам И.Я., Заякин В.В., Заякина О.В., Немцова Е.В., Дроздов Е.В. // Итоговая конференция в рамках приоритетного направления «Живые системы» (6-7 декабря, 2007 г). Москва, 2007. С. 175-176.
8. Распространенность вируса кустистой карликовости малины при кло нальном микроразмножении различных форм ремонтантной малины / Немцова Е.В., Артюхова А.Н., Заякин В.В., Нам И.Я. // Вестник Брянского госуниверси тета. 2007. № 4. С. 209-213.
9. Скрининг вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR in vitro и в полевом материале / Немцова Е.В., Заякин В.В., Казаков И.В., Евдоки менко С.Н., Нам И.Я. // С.-х.биология. Сер. Биология растений. 2007. № 5. С.
119-123.
Принята к рассмотрению заявка на изобретение № 2007139203/13 (042908).
Заякин В.В., Нам И.Я., Немцова Е.В. «Набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса кустистой карликовости малины». 2008.
Публикация в журнале, включенном в перечень ВАК