Разработка новых методов исследования лимфоцитов и эритроцитов с помощью иммунологических биочипов.
На правах рукописи
.
ШИШКИН Александр Валентинович
РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ
И ЭРИТРОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ
БИОЧИПОВ.
03.00.04- биохимия.
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2008.
1
Работа выполнена в государственном учреждении Гематологическом научном центре Российской Академии Медицинских Наук.
Научные руководители:
Доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов Академик РАН И РАМН А.И. Воробьев
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук Егорова Марина Олеговна Доктор биологических наук Рябых Татьяна Павловна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Защита состоится 2008 г. в _ час.
на заседании Диссертационного совета Д001.042.02 в государственном учреждении Гематологическом научном центре РАМН (125167 г. Москва Новый Зыковский проезд д.4-а)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН
Автореферат разослан «» 2008 г.
Ученый секретарь диссертационого совета Д 001.042. кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние годы быстро развивается аналитические (диагностические) системы нового поколения - биочипы. С их помощью возможно параллельное проведение большого количества однотипных исследований. При массовом производстве себестоимость одного биочипа ничтожно мала, а их использование позволяет резко снизить расходы на проведение анализа. Весьма перспективным представляется создание иммунологических биочипов, позволяющих осуществлять определение поверхностных антигенов клеток. Наиболее востребованными они должны оказаться в области гематологии, где установление иммунофенотипа клеток опухоли является одним из ключевых критериев постановки диагноза.
В настоящее время иммунофенотип клеток устанавливается с помощью ряда методов, позволяющих одновременно определять лишь один антиген (иммуноцитохимические методы и большинство иммунофлюоресцентных методов) или небольшое количество антигенов (проточная цитофлюориметрия). Использование биочипов позволит определять наличие в исследуемом образце клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены, с помощью панелей, включающих большое число антител. Биочипы могут применяться для скрининговых исследований.
Работы по созданию биочипов для определения поверхностных антигенов клеток в настоящее время проводятся несколькими зарубежными исследовательскими группами.
При создании биочипов, зарубежные исследователи не ставили никаких дополнительных задач, кроме определения поверхностных антигенов клеток. В то же время, возможно применение нескольких новых подходов, способных значительно расширить возможности использования биочипов.
Весьма перспективной представляется окраска связавшихся на биочипе клеток для проведения их морфологического исследования. Такой подход позволит определить, какие именно типы клеток экспрессируют тот или иной поверхностный антиген. Кроме того, существует возможность значительного повышения чувствительности анализа за счет точной регуляции скорости потока жидкости при отмывке биочипов. Также представляется перспективной разработка способа сортировки клеток на биочипе (концентрирования в области пятен биочипа клеток, экспрессирующих определяемые антигены).
Цель работы. Создание иммунологических биочипов, позволяющих осуществлять определение клеточных поверхностных антигенов, а также проводить морфологическое исследование связавшихся клеток.
Задачи исследования:
1. Разработка методики изготовления биочиов: выбор материала подложек для изготовления биочипов и способа иммобилизации антител.
2. Оценка возможности использования созданных биочипов для определения поверхностных антигенов нормальных клеток крови (эритроциты и лимфоциты здоровых доноров) и клеток лимфатических опухолей (лимфоциты больных хроническим В лимфолейкозом), а также для определения процентного содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены.
3. Оценка возможности окрашивания связавшихся с биочипом клеток одним из общепринятых методов и проведения их морфологического исследования.
4. Оценка чувствительности анализа и поиск путей ее повышения.
5. Оценка возможности концентрирования клеток в области пятен биочипа.
Научная новизна.
В данной работе предложен ряд новых подходов к использованию биочипов и продемонстрирована возможность их осуществления.
1) Показана возможность осуществления окраски связавшихся с биочипом клеток и проведение их морфологического исследования.
2) Разработан способ проведения анализа на биочипах с использованием проточной установки, позволяющий значительно повысить чувствительность метода.
Показано, что могут быть созданы скорости потока, при которых происходит отрыв неспецифически связавшихся клеток, а клетки, даже недостаточно прочно связавшиеся с антителами (из-за плохой очистки или низкой аффинности используемых антител и (или) невысокой экспрессии определяемых антигенов), остаются на поверхности пятен биочипа.
3) Показана возможность проведения исследования процесса отрыва связавшихся с антителами клеток при различных скоростях потока жидкости.
4) Разработан новый способ концентрирования в области пятен биочипа клеток, присутствующих в смешанной клеточной суспензии в небольших количествах.
Практическая ценность и область применения результатов.
Полученные результаты позволили решить ряд методических и технологических проблем, связанных с разработкой, изготовлением и практическим использованием биочипов для определения поверхностных антигенов клеток. Это должно оказаться весьма полезным в случае, если подобные биочипы будут в дальнейшем разрабатываться и производиться в нашей стране. Технология изготовления биочипов была адаптирована к предполагаемым условиям производства (методом микроконтактного нанесения).
Было продемонстрировано хорошее соответствие (в пределах ошибки среднего) результатов определения процентного содержания клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены, при проведении анализа с помощью биочипов с данными проточной цитофлюориметрии. При этом с помощью биочипа одновременно может быть определено гораздо большее количество поверхностных антигенов (на разных клетках).
Использование прозрачных подложек сделало возможным проведение микроскопического исследования связавшихся с биочипом клеток в проходящем свете.
Использование окраски позволяет осуществлять морфологическое исследование параллельно с определением поверхностных антигенов у одних и тех же клеток, что невозможно при использовании других методов.
Отмывка биочипа в проточной камере позволяет избежать отрыва клеток, слабо связавшихся с антителами, что делает возможным определение слабо экспрессированных поверхностных антигенов.
Предложен способ концентрирования клеток на биочипе, который может быть использован для выделения из суспензии клеток, присутствующих в малых количествах в случае необходимости их дополнительного исследования при отсутствии клеточного сортировщика.
В зависимости от конкретных задач и уровня оснащенности лаборатории могут быть проведены различные виды дополнительных исследований связавшихся клеток. В наиболее простом варианте (при качественном или полуколичественном определении плотности связывания клеток) проведение анализа с помощью разработанных биочипов может быть выполнено в клинической лаборатории любого медицинского учреждения, включая поликлинику.
Достоверность научных положений.
Большинство экспериментов воспроизводилось не менее 3-4 раз с клетками одних и тех же доноров. В диссертации приводятся только те результаты, которые хорошо воспроизводились в предварительных экспериментах (были получены те же значения титра и близкие значения плотности заполнения пятен). На приведенных графиках и диаграммах указана ошибка среднего, рассчитанная по результатам каждого эксперимента в отдельности.
Только в экспериментах по исследованию процесса отрыва эритроцитов с поверхности биочипа при различных скоростях потока жидкости в проточной камере, в связи с большой трудоемкостью их исполнения, количественное определение плотности связывания эритроцитов проводилось однократно. В предварительных экспериментах проводилась качественная оценка плотности связывания клеток.
Личный вклад автора в выполнение работы.
Работа выполнена автором полностью самостоятельно, включая все предварительные эксперименты, а также отработку всех использованных методик. При проведении значительной части экспериментов автором использовались собственные клетки.
Без участия автора сотрудниками лаборатории функциональной морфологии гемобластозов ГУ ГНЦ РАМН осуществлялось выполнение ряда клинических анализов методом проточной цитофлюориметрии. С этими результатами сравнивались данные, полученные при исследовании тех же образцов клинического материала, проводившемся автором с помощью биочипов. Кроме того, сотрудниками Института молекулярной биологии РАН на промышленной установке методом микроконтактного нанесения была изготовлена небольшая опытная партия биочипов.
Положения, выносимые на защиту.
1. Отработана методика изготовления биочипов на выбранных прозрачных и оптически однородных пластиковых подложках, обеспечивающих иммобилизацию антител за счет адсорбции.
2. Созданные биочипы позволяют проводить определение поверхностных антигенов эритроцитов, а также лимфоцитов здоровых доноров и больных В-ХЛЛ. При этом может быть проведено определение процентного содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие поверхностные антигены, результаты которого хорошо совпадают с результатами, получаемыми с помощью проточной цитофлюориметрии.
3. Показана возможность окраски связавшихся с биочипом клеток и проведения их морфологического исследования.
4. Установлено, что чувствительность анализа зависит от условий отмывки биочипов.
Предложен способ отмывки биочипов в проточной камере, позволяющий добиться ее значительного повышения.
5. Разработан способ концентрирования в области пятен биочипа клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены, основанный на использовании циклического режима инкубации/отмывки биочипа в проточной камере при его взаимодействии с клеточной суспензией.
Апробация работы состоялась 27 марта 2008г. на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в ГУ Гематологическом научном центре РАМН. Результаты работы докладывались на II Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» г. Ижевск 2005г., IV Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» г. Ижевск 2007г., 11-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века» г. Пущино 2007г., школе-конференции молодых ученых аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия-2007» г. Пущино 2007г., V Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» г. Ижевск 2008, заседании Удмуртского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (г.
Ижевск) 7.02.2008г. Фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах лаборатории физической биохимии системы крови ГУ ГНЦ РАМН Внедрение результатов. Результаты внедрены в работу лаборатории физической биохимии системы крови ГУ ГНЦ РАМН, а также в работу Ижевской государственной медицинской академии (ИГМА) и используются для разработки новых образцов иммунологических биочипов.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ в материалах 5 научных конференций, 1 печатная работа опубликована в зарубежном научном журнале, входящем в базы данных Web of science и 3 печатные работы в журналах рекомендованных ВАК (из них 1 печатная работа опубликована в журнале, рекомендованном ВАК по медицинским специальностям).
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из четырех глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы.
Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, содержит 57 рисунков и таблиц. Библиография включает 120 наименований.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 Антитела В работе использовались моноклональные мышиные антитела (IgG), специфичные к антигенам лимфоцитов: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, СD19, CD20, CD21, CD22, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM (ООО «Сорбент», Москва), а также антитела (IgM), специфичные к поверхностным антигенам эритроцитов: А, В, D, С, с, Е, е (диагностикумы марки ЭРИТРОТЕСТтм- ЦОЛИКЛОН) (ООО «Гематолог», Москва) и человеческие сыворотки, специфичные к антигенам системы HLA I класса А2, А10, А11, А32, В44, В62, В51, В40, В41. (ЗАО «Межрегиональный центр иммуногенетики и гистотипирующих реагентов» г. Санкт-Петербург).
2.2 Реактивы.
Обезжиренное сухое молоко («Kroger», USA), раствор для градиентного центрифугирования Ficoll-paque, ЭДТА, таблетки для приготовления буфера PBS, 0,05% раствор детергента «Tween-20», метанол («Sigma Aldrich», USA).
2.3 Подложки Использовались следующие типы подложек: 1) полистироловые подложки;
2) полистироловые подложки, обработанные в высокочастотном газовом разряде;
3) полистироловые подложки, обработанные глутаровым альдегидом;
4) подложки из пластифицированного поливинилхлорида (ПВХ);
5) обезжиренные предметные и покровные стекла;
6) стекла с полимерным покрытием (нитроцеллюлоза);
7) пленки из нитроцеллюлозы;
8) стекла с алюминизированной поверхностью, покрытые аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) и обработанные окисленным декстраном.
2.4 Получение клеточной суспензии.
Лимфоциты были выделены из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности. Полученные клетки ресуспензировались в инкубационном буферном растворе. В экспериментах с эритроцитами использовалась цельная кровь или отмытые эритроциты, которые ресуспензировались в фосфатном буфере (PBS).
Содержание клеток в суспензии определялось с помощью камеры Горяева.
2.5 Изготовление биочипов.
Капли (0,5 мкл) растворов антител с различными разведениями наносились на подложки автоматической пипеткой в заранее отмеченные участки. Подложки с нанесенными антителами помещались в камеру со 100% влажностью и инкубировались при +4С в течение ночи, после чего высушивались и замораживались при –26С. Биочипы могли храниться без потери свойств, по меньшей мере, в течение 12 месяцев. В некоторых случаях изготовление биочипов осуществлялось с помощью установки для микроконтактного нанесения (объем капель 0,01 мкл).
2.6 Проведение анализа.
Биочипы, закрепленные в чашках Петри, в течение часа инкубировали с 1% раствором сухого молока в PBS и отмывали раствором детергента. Затем в течение 30- минут осуществлялась инкубация с клеточной суспензией (оптимально 5,5106 клеток/мл) при комнатной температуре без перемешивания. После ее завершения для устранения не связавшихся с антителами клеток биочипы несколько раз ополаскивались PBS. Качество отмывки оценивалось при помощи инвертированного микроскопа. За пределами пятен биочипа связавшиеся клетки должны были отсутствовать. После завершения отмывки биочип высушивался на воздухе (если не планировалась окраска связавшихся клеток флюоресцентно мечеными антителами). Связавшиеся на биочипе клетки могли быть зафиксированы метанолом и окрашены по Романовскому-Гимзе. Затем проводилось морфологическое исследование клеток, связавшихся в области каждого пятна биочипа.
2.7 Определение процентного содержания в исследуемом образце клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены.
Каждое пятно биочипа фотографировалось через микроскоп с помощью цифрового фотоаппарата “Olimpus SP-350”. Для определения плотности связывания клеток на поверхности пятен биочипа на микрофотографии каждого пятна выбиралось не менее 3 участков (соответствующих областям 100х100 мкм), в которых проводился подсчет клеток. Полученные значения усреднялись. Плотность заполнения поверхности пятен связавшимися клетками выражались в [кл/мм2].
Для того чтобы результаты анализа клеток на биочипах можно было сравнивать с данными проточной цитофлюориметрии, полученные значения плотности заполнения поверхности пятен связавшимися клетками было необходимо перевести в проценты. За 100% принималась средняя плотность связывания клеток в области пятен с антителами анти-CD45. Исходя из этого, осуществлялся пересчет в проценты плотности связывания клеток в области других пятен.
2.8 Окраска связавшихся клеток флюоресцентно мечеными антителами.
Биочип со связавшимися клетками в течение 30 минут при комнатной температуре инкубировался с раствором флюоресцентно меченых антител, смешанных с инактивированной нагреванием человеческой сывороткой (10% по объему). Далее проводилась отмывка PBS. Затем осуществлялось исследование биочипа с помощью флюоресцентного микроскопа. Каждое пятно фотографировалось.
2.9 Проведение экспериментов с использованием проточной камеры.
Эксперименты по определению зависимости плотности связывания клеток на биочипе от скорости отмывки, а также эксперименты по концентрированию клеток в области пятен биочипа проводились с помощью самостоятельно изготовленной проточной камеры с поперечным сечением капилляра 8 мм2 (рис. 1).
Рис. 1 Устройство проточной камеры. 1) Корпус камеры;
2) Стекло;
3) Биочип;
4) Приводящая трубка;
5) Отводящая трубка;
6) Кран;
7) Трубка для дополнительного введения жидкости в капилляр камеры. Общая длина канала проточной камеры 33 мм, ширина - 6 мм, глубина - 1,3 мм. Внутренний диаметр приводящей и отводящих трубок 3 мм. Расстояние между краями отверстий трубок 21 мм.
Камера подключалась к шприцевому насосу «Syringe pump Model 11 plus»
(«Harvard Apparatus, Inc.», USA), позволяющему получить объемную скорость потока жидкости до 40000 мкл/мин.
Проточная камера помещалась на предметном столике микроскопа таким образом, чтобы биочип, образующий одну из стенок ее канала, располагался внизу.
Камера заполнялась 1% раствором BSA или обезжиренного сухого молока в PBS.
Инкубация осуществлялась в течение 1 часа. Затем через камеру в течение 5 минут пропускался PBS с объемной скоростью 200 мкл/мин. После этого в капилляр камеры через дополнительную трубку вводилось 0,3 мл разбавленной PBS гепаринизированной крови с концентрацией эритроцитов не менее 1,5107 клеток/мл, и осуществлялась инкубация в течение 10-15 минут при отсутствии потока. Затем неспецифически связавшиеся клетки смывались потоком PBS, и проводилось фотографирование пятен биочипа. При исследовании прочности связывания клеток с биочипом скорость потока увеличивалась на определенную величину и после пропускания потока жидкости в течение одной минуты, и осуществлялось фотографирование каждого пятна. Это повторялось многократно до полного отрыва всех клеток или до достижения максимально возможной скорости потока. Определение количества клеток, связавшихся на единице площади поверхности пятна, проводилось так же, как описано выше.
2.10 Концентрирование клеток в области пятен биочипа.
При необходимости достижения максимально возможного заполнения поверхности пятен клетками, присутствующими в суспензии в небольших количествах, использовался циклический режим инкубации. Каждый цикл состоял из инкубации без потока в течение 10-15 мин и подачи потока в течение 3-5 секунд со скоростью, достаточной для отрыва неспецифически связавшихся клеток (500 мкл/мин для эритроцитов и 1000 мл/мин для лимфоцитов), но не вызывающей отрыв тех клеток, которые специфически связались с антителами. Количество необходимых циклов инкубации/отмывки зависело от процентного содержания в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие антигены. Все манипуляции проводились под контролем микроскопии.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Выбор материала подложки, способа нанесения и иммобилизации антител.
Первоначально возможность связывания клеток с антителами, иммобилизированными на твердых поверхностях, была определена в экспериментах с планшетами для ИФА. В дальнейшем были проведены эксперименты, в которых использовались подложки из различных материалов (в том числе с модифицированной поверхностью), позволяющие осуществлять как нековалентную (адсорбция), так и ковалентную иммобилизацию антител. (см. "Материалы и методы").
Была исследована зависимость плотности связывания клеток на поверхности с иммобилизированными антителами от концентрации клеток в суспензии. В качестве титра рассматривалось максимальное разведение антител, при котором плотность связывания клеток не уменьшалось по сравнению с плотностью связывания клеток в лунках с меньшими разведениями. Основными критериями выбора материала подложки являлись:
титр антител (характеризующий при прочих равных условиях прочность связывания антител с подложкой), прозрачность и оптическая однородность подложек и их стоимость.
Обязательным условием являлось отсутствие лизиса клеток при их контакте с подложкой.
Во всех экспериментах были использованы одни и те же антитела и клетки одних и тех же доноров. Приемлемые результаты были получены при использовании нескольких типов подложек. Клетки связывались в области пятен с иммобилизованными антителами, и при этом не разрушались (рис. 2).
а б Рис 2. Лимфоциты, связавшиеся на участке биочипа с иммобилизированными антителами анти-СD45. Микрофотографии сделаны при увеличении микроскопа а) в 37,5 раз, б) в 300 раз. Биочип изготовлен на подложке из ПВХ.
Наибольшие значения титров были получены при использовании подложек с покрытием Al/АПТЭС/окисленный декстран и подложек из пластифицированного ПВХ.
Изготовление подложек с покрытием Al/АПТЭС/окисленный декстран оказалось дорогостоящим и трудоемким, а воспроизводимость результатов при их использовании была неудовлетворительной. Поэтому во всех последующих экспериментах использовались биочипы, изготовленные на подложках из ПВХ. Примеры результатов, полученных при их использовании, приводятся на рис. 3.
Плотность связывания клеток (кл/мм ) 14000 CD Плотность связывания клеток (кл/мм ) IV(AB)Rh+ CD CD А CD16 В CD19 (D)Rh CD45 2000 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/1281/256 - 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12801/25601/ 1/ 1/20480 - Разведение антител Разведение антител а. б.
Рис. 3. а) Зависимость плотности связывания лимфоцитов в области пятен биочипа от разведения антител (IgG) анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8, анти-CD16, анти-CD19, анти CD45. б) Зависимость плотности связывания в области пятен биочипа эритроцитов группы IV(AB)Rh+ от разведения антител (IgM) анти-А, анти-В и анти-Rh(D). Биочипы изготовлены на подложках из ПВХ. На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам измерений).
3.2 Определение процентного содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены.
Плотность связывания клеток могла быть выражена как в [кл/мм2] (рис. 3-а), так и в процентах (рис. 4). Для этого за 100% принималась плотность связывания клеток с антителами анти- CD45 (в области пятна с наибольшей концентрацией антител), исходя из чего, в процентах выражалась плотность связывания клеток в области других пятен CD Заполнение клетками поверхности пятен (%) CD CD 90 CD CD CD 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12801/25601/ 1/ 1/20480 - Разведение антител Рис. 4. Зависимость плотности связывания лимфоцитов в области пятен биочипа от разведения антител (IgG) анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8, анти-CD16, анти-CD19, анти-CD45.
Плотность связывания лимфоцитов (заполнение поверхности пятна) выражена в процентах относительно плотности связывания клеток в области пятна с антителами анти-CD45. На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).
Результаты сравнивались с данными, полученными при анализе образца крови того же донора с помощью проточной цитофлюориметрии. (таблица 1).
Таблица 1. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD45, определенное при анализе, проведенном с помощью проточной цитофлюориметрии и биочипов.
Поверхностные антигены метод CD3 CD4 CD8 CD16 CD19 CD Проточная 68% 48,9% 17% 17% 19% 100% цитофлюориметрия Анализ на биочипах 67±2% 47±3% 20±3% 16±2% 17±3% 100% Таким образом, выраженная в процентах, плотность заполнения пятен биочипа лимфоцитами, экспрессирующими различные CD антигены, хорошо соответствовала их фактическому процентному содержанию в суспензии. Этот факт может быть объяснен тем, что при инкубации биочипа с суспензией, содержащей различные типы клеток, в контакт с его поверхностью приходят как клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, и способные связываться с антителами, так и клетки, не имеющие этих антигенов. Они экранируют антитела от других (осевших позже) клеток и делают невозможным их связывание. При последующей отмывке биочипа на его поверхности остаются только связавшиеся с антителами клетки.
Поэтому отношение полученной плотности заполнения пятна связавшимися клетками к максимально возможной (при данных условиях) плотности заполнения, соответствует фактическому процентному содержанию в суспензии клеток, имеющих соответствующий поверхностный антиген. Данное соответствие справедливо, если присутствующие в суспензии клетки имеют примерно одинаковые размеры, а инкубация суспензии с биочипом осуществляется без перемешивания. Указанное соответствие наблюдалось в диапазоне от минимального разведения антител до титра, что позволяет при изготовлении биочипов использовать более разбавленные растворы антител (по сравнению с исходной концентрацией коммерчески доступных образцов данных антител).
3.3 Определение влияния концентрации клеток в суспензии на плотность заполнения пятен биочипа и на соотношение субпопуляций связавшихся клеток.
Представленные на рис. 5-а результаты демонстрируют линейную зависимость плотности связывания клеток в области пятен биочипа от концентрации клеток в суспензии в диапазоне от 0 кл/мл до определенного значения (в данном случае 5,5· кл/мл), после которого наступает насыщение. Дальнейшее увеличение концентрации клеток уже не оказывает влияния на плотность связывания. Это обусловлено тем, что клетки, осевшие на поверхность биочипа, образуют монослой и экранируют антитела от тех клеток, которые оседают поверх него.
Плотность связывания клеток (кл/мм ) CD Плотность связывания клеток (%) CD CD CD19 CD CD 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 Концентрация клеток (кл/мл х10 ) Концентрация клеток (кл/мл х10 ) а. б.
Рис. 5. Влияние концентрации клеток в суспензии а) на плотность заполнения связавшимися клетками (кл/мм2) пятен биочипа с антителами, специфичными к различным поверхностным антигенам;
б) на относительную плотность заполнения связавшимися клетками пятен с антителами, специфичными к различным поверхностным антигенам. Относительная плотность заполнения пятен выражена в процентах. За 100% принималась плотность связывания клеток в области пятен с антителами анти- CD45. Во время инкубации биочипы были закреплены на дне чашек Петри (площадь поверхности дна 961,6 мм2), объем образцов клеточной суспензии составлял 2,2 мл. На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).
Несмотря на различия абсолютных значений плотности связывания клеток в области пятен (кл./мм2) (рис. 5-а), выраженная в процентах относительная плотность связывания клеток с антителами, специфичными к разным поверхностным антигенам, (рис. 5-б) не зависела от концентрации клеток в исследуемой суспензии.
Таким образом, процентное содержание в суспензии клеток, экспрессирующих те или иные поверхностные антигены, может быть определено при различных концентрациях клеток в исследуемом образце.
Следует заметить, что при исследовании образцов суспензии с концентрациями менее 2х106 кл/мл из-за низкой плотности связывания подсчет количества клеток желательно проводить на участках большей площади 3.4 Окраска и морфологическое исследование связавшихся с биочипом клеток.
Связавшиеся на биочипе клетки могли быть зафиксированы и окрашены, например, по Романовскому-Гимзе. Это позволяло проводить их морфологическое исследование (рис. 6). Несмотря на то, что структура хроматина клеток выглядит несколько иначе (из-за меньшего распластывания клеток), чем при окраске в мазках или отпечатках, данный подход позволяет надежно определить, какие именно типы клеток связались в области того или иного пятна биочипа. Это особенно существенно в том случае, если один и тот же антиген присутствует на разных типах клеток (рис. 6-в).
а. б. в. г.
Рис. 6. Микрофотографии, демонстрирующие возможность морфологического исследования клеток, связавшихся на биочипе. Окраска по Романовскому-Гимзе. а.) эритроциты здорового донора, связавшихся в области пятна с антителами анти-D (увеличение в 600 раз);
б.) лимфоциты здорового донора, связавшихся в области пятна биочипа с антителами анти-CD (увеличение в 1350 раз);
в.) лимфоциты здорового донора, связавшихся в области пятна биочипа с антителами анти-CD45 (увеличение в 1350 раз);
г.) лимфоциты больного В-ХЛЛ, связавшиеся в области пятна с антителами анти-CD19 (увеличение в 1350 раз).
Следует заметить, что морфологическое исследование связавшихся на биочипе клеток, не заменяет, а дополняет морфологическое исследование клеток в мазках или отпечатках. На биочипе могут связаться только клетки, имеющие определяемые антигены.
Если в исследуемом образце будут присутствовать клетки, не имеющие этих антигенов, они будут удалены при отмывке биочипа.
3.5 Окраска связавшихся клеток флюоресцентно мечеными антителами.
Связавшиеся на биочипе клетки могли быть окрашены флюоресцентно мечеными антителами. При исследовании с помощью флюоресцентной микроскопии неспецифического связывания лимфоцитов не выявлялось (рис. 7-в). Мечеными антителами окрашивались только клетки, связавшиеся в области строго определенных пятен биочипа (таблица 2, рис 7-а). Как видно из представленных в таблице результатов, определяется нормальная коэкспрессия антигенов CD3/CD4, CD3/CD8, СD3/CD45, CD20/19, CD20/CD45, CD16/CD45, CD16/CD56.
Таблица 2. Результат окрашивания FITC-мечеными антителами клеток, связавшихся в области различных пятен биочипа.
FITC- меченые антитела, антитела, иммобилизованные на биочипе использованные для окраски анти- анти- анти- анти- анти связавшихся клеток CD4 CD8 CD19 CD45 CD анти-CD3 FITC + + + анти-CD16 FITC + + анти-CD20 FITC + + Знаком (+) отмечено наличие окрашивания.
а. б. в. г.
Рис. 7. Результат окрашивания связавшихся с биочипом лимфоцитов FITC-мечеными антителами анти-CD20. Увеличение в 150 раз. а) Окрашивание клеток связавшихся в области пятна с антителами анти-СD19 (коэкспрессия CD19/CD20);
микрофотография выполнена при УФ освещении. б) тот же фрагмент пятна с антителами анти-СD19 (микрофотография в проходящем белом свете). в) Отсутствие окраски клеток, связавшихся в области пятен с антителами анти-CD4 (микрофотография выполнена при УФ освещении). г) тот же фрагмент пятна с антителами анти-СD4 (микрофотография в проходящем белом свете).
Само по себе связывание клеток на биочипе не позволяет определять наличие коэкспрессии нескольких антигенов у каждой отдельно взятой клетки. Окраска связавшихся на биочипе клеток флюоресцентно мечеными антителами позволяет устранить этот недостаток. Она может быть использована для выявления диагностически значимых вариантов коэкспрессии антигенов при исследовании опухолевых клеток.
Кроме того, этот подход делает возможным дополнительное определение ядерных и цитоплазматических антигенов у связавшихся на биочипе клеток. Представляется перспективной окраска препарата несколькими антителами мечеными различными флюорохромами.
3.6 Оценка чувствительности анализа, проводимого с помощью биочипов.
В экспериментах с суспензиями эритроцитов с известным иммунофенотипом, на биочипах с антителами (IgM) анти-А, анти-В, анти-D, анти-С, анти-с, анти-Е, анти-е после отмывки ополаскиванием связавшиеся эритроциты оставались только в области пятен с антителами анти-А, анти-В и анти-D, а в области пятен с антителами анти-С, анти-с, анти Е, анти-е практически отсутствовали. Следовательно, связывание эритроцитов с данными антителами было менее прочным. Скорости потоков жидкости, возникающие при отмывке биочипов, были слишком высокими, что приводило к отрыву клеток. Таким образом, при отмывке биочипа путем ополаскивания, чувствительность метода в ряде случаев оказывается недостаточной для обнаружения некоторых антигенов при использовании имеющихся антител.
Чувствительность анализа могла быть повышена при проведении отмывки биочипа в проточной камере. При этом могли быть созданы такие скорости потока, при которых происходил отрыв только не связавшихся с антителами клеток. Эритроциты, экспрессирующие антигены С,с,Е,е оставались связанными в области пятен с соответствующими антителами (рис.8) а. б.
Рис. 8. Эритроциты с иммунофенотипом ccDEe, связавшиеся в области пятна с антителами анти-с. Отмывка биочипа осуществлялась в проточной камере. а.) увеличение в 37,5 раз б.) увеличение в 600 раз.
3.7 Исследование процесса отрыва клеток при отмывке биочипа в проточной камере.
Отрыв неспецифически связавшихся эритроцитов (за пределами пятен) происходил при скорости потока 400-550 мкл/мин (сдвиговая скорость потока 4.5-6 с-1), что соответствует действующему на эритроцит напряжению сдвига 18-24 мПа.
Эритроциты, не имеющие тех или иных поверхностных антигенов, но неспецифически связавшиеся на поверхности пятен с антителами, специфичными к данным антигенам, отрывались при таких же скоростях что и эритроциты, связавшиеся вне пятен биочипа (фон) (рис. 9). Таким образом, перекрестная реактивность антител не выявлялась.
Фон Плотность связывания клеток (кл/мм2) анти-А анти-В 0 2 4 6 - Сдвиговая скорость потока (с ) Рис. 9 Зависимость от сдвиговой скорости потока отмывающей жидкости плотности связывания эритроцитов группы О(I)Rh+ неспецифически связавшихся с подложкой биочипа в области пятен с антителами анти-A и анти-B, а также вне этих пятен (фон). На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).
Отрыв эритроцитов, специфически связавшихся с иммобилизированными антителами анти-С, анти-с, анти-Е, анти-е, происходил при скоростях, больших, по крайней мере, на 1 - 2 порядка (рис. 10) по сравнению с неспецифически связавшимися клетками. Было отмечено влияние разведения антител на динамику отрыва. Чем большим было разведение антител, тем меньшие скорости требовались для отрыва клеток из области пятен.
Плотность связывания клеток (кл/мм ) Разведение Плотность связывания клеток (кл/мм ) 180 Разведение антител 18000 антител анти-е анти-С 1/1 140 1/ 1/ 14000 1/ 1/ 1/ 1/8 100 1/ 1/ 10000 1/ 1/ 1/ фон фон 0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 - Сдвиговая скорость потока (с ) - Сдвиговая скорость потока (с ) а. б.
Рис. 10 Зависимость от сдвиговой скорости потока отмывающей жидкости а) количества эритроцитов с иммунофенотипом ccDEe, остающихся связанными в области пятен биочипа с антителами анти-е;
б) количества эритроцитов с иммунофенотипом CCDee, остающихся связанными в области пятен с антителами анти-С Плотность связывания клеток (кл/мм ) Плотность связывания клеток (кл/мм ) Разведение 20000 Разведение антител антител анти-А анти-D 1/ 14000 1/ 1/8 1/ 12000 фон 1/ 1/32 фон 4000 0 0 100 200 300 400 500 600 0 100 200 300 400 500 -1 - Сдвиговая скорость потока (с ) Сдвиговая скорость потока (с ) а. б.
Рис. 11 Зависимость от сдвиговой скорости потока отмывающей жидкости а) количества эритроцитов группы I(0)Rh+ с иммунофенотипом CCDee, остающихся связанными в области пятен биочипа с антителами анти-D;
б) количества эритроцитов группы А(II), остающихся связанными в области пятен биочипа с антителами анти- А. На представленных кривых обозначены ошибки среднего (по результатам 3 измерений).
Для отрыва эритроцитов из области пятен с антителами анти-D (рис 11-а) требовались значительно большие скорости потока, чем для отрыва эритроцитов из области пятен с антителами анти-С, анти-с, анти-Е, анти-е. Количество молекул антигена D на поверхности эритроцитов с иммунофенотипом ССDеe не превышает количества антигенов С. По этому можно сделать предположение о более высокой аффинности антител анти-D по сравнению с антителами анти-С.
Из области пятен с антителами анти-А (рис. 11-б) и анти-В в данном диапазоне скоростей потока отрыва эритроцитов соответственно A(II) и B(III) групп не происходило.
Это может быть обусловлено большей экспрессией молекул данных антигенов (810- тыс. молекул на 1 эритроците), и (или) большей аффинностью антител.
3.8 Концентрирование клеток в области пятен биочипа.
С помощью проточной камеры может осуществляться концентрирование клеток в области пятен биочипа (рис. 12). Для этого используется циклический режим инкубации биочипа с клеточной суспензией. Каждый цикл включает инкубацию без потока (5- минут) и подачу потока жидкости (3-5 секунд) со скоростью, достаточной для отрыва неспецифически связавшихся клеток. Количество циклов инкубации/отмывки, необходимых для достижения максимально возможной плотности связывания клеток в области пятна с антителами зависит от содержания в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующий антиген. Таким образом, биочипы могут использоваться для сортировки клеток.
а. б.
Рис. 12. Лимфоциты, связавшиеся в области пятна с антителами анти- CD19 при инкубации биочипа в проточной камере в циклическом режиме. Увеличение в 300 раз. а) после проведения 1 цикла инкубации/отмывки (заполнение клетками поверхности пятна составляет 15%). б) после проведения 17 циклов инкубации/отмывки (заполнение клетками поверхности пятна составляет 94%). Фактическое содержание CD19+ лимфоцитов в суспензии 16%.
3.9 Примеры использования биочипов для исследования клеток здоровых доноров и больных хроническим В-лимфолейкозом.
С помощью биочипов были исследованы клетки здоровых добровольцев и ряда больных, страдающих хроническим В-лимфолейкозом (В-ХЛЛ). Полученные результаты (рис. 13 и 14) сравнивались с данными клинических исследований, проведенных с помощью проточной цитофлюориметрии. При этом отмечалось их хорошее соответствие (в пределах ошибки среднего).
Содержание клеток (%) HLA-DR IgM CD45RA CD CD CD CD CD CD CD CD CD11a CD11b CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD Антиген биочип проточная цитофлюориметрия Рис. 13. Сопоставление результатов исследования клеток здорового донора с помощью биочипов, с результатами, полученными с помощью проточной цитофлюориметрии.
Содержание клеток (%) IgM HLA-DR CD45RA CD CD CD CD CD CD CD CD CD11a CD11b CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD Антиген Биочип Проточная цитофлюориметрия а.
Содержание клеток (%) IgM HLA-DR CD45RA CD CD CD CD CD CD CD CD CD11a CD11b CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD Антиген Биочип Проточная цитофлюориметрия б.
Рис. 14. Сопоставление результатов исследования клеток больных В-ХЛЛ, проведенного с помощью биочипов, с результатами клинического исследования, проведенного методом проточной цитофлюориметрии. а) больной А., б) больная К.
При клинических исследованиях, проведенных с помощью проточной цитофлюориметрии, определялось значительно меньшее число поверхностных антигенов по сравнению с анализом, проводимым на биочипе. Поэтому могла быть сопоставлена только часть полученных данных. С помощью биочипов возможно одновременное определение (на разных клетках) значительно большего количества поверхностных антигенов по сравнению с методом проточной цитофлюориметрии. Количество антител, которые могут быть иммобилизированы на подложке биочипа, лимитируется только размерами подложки и диаметром пятен.
3.10 Биочипы для определения антигенов I класса системы HLA.
Были проведены эксперименты с биочипами, для изготовления которых использовались неочищенные человеческие сыворотки, применяемые для лимфоцитотоксического теста. Использовались лимфоциты двух добровольцев с известным HLA иммунофенотипом (ранее установленным в лимфоцитотоксическом тесте): А2, А32, В44, В51 и А2, А11,В44, В62. При отмывке биочипов ополаскиванием происходил отрыв всех клеток со всей поверхности биочипа. Следовательно, чувствительность анализа при отмывке биочипов ополаскиванием оказалась недостаточной из-за очень низкой прочности связывания клеток в области пятен. При отмывке биочипов в проточной камере (скорость потока 2000 мкл/мин) клетки, несущие определяемые антигены оставались связанными в области пятен после полного устранения клеток, не связавшихся с антителами. Иммунофенотип, определенный при анализе на биочипах (рис.15), соответствовал данным лимфоцитотоксического теста.
А2 А10 А11 А32 В62 А2 А10 А11 А32 В а б.
В40 В41 В44 В51 В40 В41 В44 В Рис. 15. Результаты определения антигенов HLA I класса с помощью биочипов у добровольцев (а. и б.). На представленных схемах биочипов цветом выделены ячейки, соответствующие тем пятнам, где произошло связывание клеток.
Таким образом, была показана принципиальная возможность использования биочипов для определения антигенов системы HLA. Кроме того, дополнительно было продемонстрировано, что применение проточной камеры позволяет осуществлять анализ на биочипах даже при использовании неочищенных сывороток, обеспечивающих очень низкую прочность связывания клеток.
ВЫВОДЫ.
1. Отработана методика изготовления биочипов на выбранных прозрачных и оптически однородных пластиковых подложках, обеспечивающих иммобилизацию антител за счет адсорбции. Созданы экспериментальные биочипы, позволяющие определять до различных поверхностных антигенов лимфоцитов, а также биочипы для определения поверхностных антигенов эритроцитов (А, В, D, с, С, е, Е) 2. Продемонстрировано специфическое связывание на биочипах эритроцитов, а также лимфоцитов здоровых доноров и больных В-ХЛЛ. При этом может быть определено процентное содержание в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие поверхностные антигены.
3. Показана возможность проведения морфологического исследования связавшихся на биочипе клеток.
4. Чувствительность анализа, проводимого с помощью биочипов, может быть значительно повышена за счет использования отмывки в проточной камере.
5. Разработан способ концентрирования в области пятен биочипа клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены, основанный на использовании предложенного циклического режима инкубации/отмывки биочипа в проточной камере при его взаимодействии с клеточной суспензией.
Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах.
1. А.В. Шишкин. Разработка микрочипов для иммунофенотипирования клеток опухолей системы крови. Материалы II Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины». Ижевск 25-28 апреля 2005. С.92- 2. А.В. Шишкин. Разработка иммунологических биочипов для определения поверхностных антигенов клеток. Материалы IV Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» Ижевск 23-27 апреля 2007. - часть I.- С. 83-87.
3. А.В. Шишкин, И.И. Шмырев. Новые подходы к использованию иммунологических «клеточных» биочипов. Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино 29 октября-2 ноября 2007.- С.223.
4. А.В. Шишкин, И.И. Шмырев. Разработка иммунологических биочипов для исследования поверхностных антигенов клеток крови. Материалы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино октября-2 ноября 2007.- С. 223-224.
5. А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина. Разработка иммунологических биочипов для исследования нормальных и опухолевых клеток крови. Материалы школы-конференции молодых ученых аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия-2007» Пущино 2007.- С. 8-13.
6. А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина. Способ повышения чувствительности анализа, проводимого с помощью иммунологических биочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов клеток. Материалы V Межрегиональной межвузовской научно практической конференции молодых ученых и студентов «Современные аспекты медицины и биологии» Ижевск, 21-24 апреля 2008.- часть I.-С.77- 7. А.В. Шишкин. Создание клеточного сортировщика на основе иммунологических биочипов. Материалы V Межрегиональной межвузовской научно- практической конференции молодых ученых и студентов «Современные аспекты медицины и биологии» Ижевск, 21-24 апреля 2008.- часть I.-С.79- 8. А.В. Шишкин. Иммунологические биочипы для определения поверхностных антигенов нормальных и опухолевых клеток крови. Материалы V Межрегиональной межвузовской научно- практической конференции молодых ученых и студентов «Современные аспекты медицины и биологии» Ижевск, 21-24 апреля 2008.- часть I.-С.75- 9. N Ovchinina, A Shishkin, Yu Lednev. Methods for increasing the biochip immunological sensitivity//Tissue Antigens.- 2008.-Vol.71.- p. 10. А.В. Шишкин. Иммунологический биочип для определения иммунофенотипа клеток и их морфологического исследования//Морфологические ведомости.- 2008.- №1-2. С. 135-137.
11. А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина, А.А. Бутылин, Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев. Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека//Биологические мембраны.- 2008.- №4-С.267-276.
12. А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина, А.А. Бутылин, Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев. Иммунологические биочипы для параллельнго определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток//Биологические мембраны.- 2008.- №4.-С.277-284.