Активность и экспрессия генов некоторых ферментов энергетического и углеводного обмена и размерно-весовые характеристики рыб семейств лососевые (salmonidae) и сиговые (coregonidae)
На правах рукописи
ЧУРОВА
Мария Викторовна
АКТИВНОСТЬ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ НЕКОТОРЫХ
ФЕРМЕНТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И УГЛЕВОДНОГО
ОБМЕНА И РАЗМЕРНО-ВЕСОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
РЫБ СЕМЕЙСТВ ЛОСОСЕВЫЕ (SALMONIDAE) И
СИГОВЫЕ (COREGONIDAE)
Специальность 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Петрозаводск 2012
Работа выполнена в лаборатории экологической биохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии Карельского научного центра Российской академии наук
Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Немова Нина Николаевна
Официальные оппоненты:
Шпаков Александр Олегович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, заведующий лаборато рией молекулярной эндокринологии Андреева Алла Михайловна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии внут ренних вод им. И.Д. Папанина РАН, заведующая Центром коллективного пользования «Молекулярные технологии» ИБВВ РАН
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреж дение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Защита состоится 15 марта 2012 года в 15.00 на заседании объединен ного диссертационного совета ДМ 212.087.02 при Карельской государст венной педагогической академии по адресу: 185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельской го сударственной педагогической академии (185680, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17).
Автореферат разослан " " февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н., доцент А.И. Малкиель
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Важнейшим метаболическим фактором, определяющим функциональ ную активность клеток различных органов и, соответственно, процессы рос та и развития рыб, является уровень энергетического обмена. Достаточный уровень образования АТФ определяет активный рост и развитие организма рыб, особенно в период раннего онтогенеза, когда требуются большие энер гетические затраты на синтез структурных, функциональных и запасных со единений. Поэтому в исследованиях взаимосвязи биохимических парамет ров с размерными характеристиками рыб и темпами их роста большое вни мание уделяется изучению активности и экспрессии генов ферментов энер гетического обмена, участвующих в процессах аэробного и анаэробного син теза АТФ. Исследование биохимических и молекулярно-генетических пара метров энергетического метаболизма проводится главным образом в белых мышцах рыб, т.к. они составляют значительную часть тела (около 60% веса) и, таким образом, во многом определяют особенности метаболизма всего ор ганизма и отражают темпы роста рыб (Goolish, Adelman 1987;
Houlihan et al., 1993;
Burness et al., 1999;
Davies, Moyes, 2007;
Savoie et al., 2008). Кроме того, активность ферментов гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и дыхатель ной цепи митохондрий, наряду с молекулярно-генетическими показателями – индексом РНК/ДНК и уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина, мо гут использоваться как индикаторы темпов роста и состояния рыб в исследо ваниях по изучению влияния различных условий на рост рыб. Например, эти показатели применяются при изучении влияния на рыб загрязнения окру жающей среды, температуры, качества и количества пищи, паразитарной ин вазии (Buckley et al., 1999;
Overturf and Hardy, 2001;
Imsland et al., 2006;
Caldarone, 2006;
Dhillon R. et al., 2008;
Vinagre еt al., 2008). Ряд работ в этом направлении посвящен также изучению механизмов регуляции активности ферментов у рыб разного размера, а именно исследованию взаимосвязи уровня экспрессии генов ферментов с активностью этих ферментов и массой тела (Yang, Somero, 1996;
Burness et al., 1999;
Davies, Moyes, 2007).
Рост рыб представляет собой сложный многофакторный процесс, опре деляющийся взаимодействием организма с абиотическими и биотическими факторами среды в процессе онтогенеза (Дгебуадзе, 1993, 2001;
Павлов, 2010;
Huss, 2009). В отличие от млекопитающих, рыбы растут в течение всей жизни. При этом особи одной когорты могут значительно отличаться размерами в зависимости от соотношения генетической и негенетической составляющих процесса их роста и влияния различных факторов среды. В связи с этим, линейные и весовые показатели, характеризующие размер особи, являются одними из наиболее изменчивых характеристик организма рыб. Изучение биохимических и молекулярно-генетических закономерно стей и механизмов формирования изменчивости и дифференциации рыб по размерам позволит значительно расширить представления об особенностях процесса роста у рыб и способов его регуляции в различные периоды онто генеза, на разных стадиях жизненного цикла и при влиянии экологических условий. Несмотря на значительное число работ в этой области, ряд вопро сов остается неизученным. Так, недостаточно данных по оценке взаимосвя зи процессов энергетического и пластического обмена в мышцах и печени с размерами (длиной и массой рыб). Не исследован характер взаимосвязи показателей друг с другом, возрастные и половые особенности этой зави симости, влияние антропогенного фактора. Таким образом, исследование особенностей и механизмов роста рыб и формирования размерной измен чивости на биохимическом уровне является одним из важных вопросов биохимии и физиологии рыб, популяционной биологии, экологии.
Цель работы - исследовать взаимосвязь между активностью фер ментов энергетического и углеводного обмена белых мышц и печени, уровнем экспрессии ряда генов в белых мышцах и размерно-весовыми характеристиками рыб некоторых видов семейств Лососевые Salmonidae и Сиговые Coregonidae.
Задачи исследования:
1. Изучить взаимосвязь между активностью ферментов цитохром с окси дазы (ЦО), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), глюкозо 6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), 1-глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГФДГ), альдолазы в мышцах и печени, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миози на (МyHC), показателем РНК/ДНК в мышцах и размерно-весовыми характе ристиками особей различных видов лососевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращиваемой радужной форели.
2. Изучить возрастные и половые особенности взаимосвязи данных показателей с размерно-весовыми характеристиками рыб.
3. Сравнить характер взаимосвязи исследуемых показателей с размер но-весовыми характеристиками сигов, обитающих в водоемах с различ ной антропогенной нагрузкой.
4. Изучить взаимосвязь между уровнем экспрессии генов лактатде гидрогеназы субъединицы А (LDH-A), цитохром с оксидазы субъединиц I и IV (COX1 и СOX4) и активностью этих ферментов в мышцах у рыб раз ных размеров.
Положения, выносимые на защиту:
1. Активность исследуемых ферментов энергетического и углеводно го обмена, уровень экспрессии генов ферментов и тяжелой цепи миозина в белых мышцах и печени рыб изучаемых видов положительно коррели руют с длиной и массой их тела.
2. Изменение уровня экспрессии генов цитохром с оксидазы и лактатде гидрогеназы является одним из возможных механизмов регуляции активно сти этих ферментов при формировании размерного разнообразия рыб.
Научная новизна. Получены новые данные о взаимосвязи активности некоторых ферментов углеводного и энергетического обмена мышц и пе чени, уровня экспрессии генов MyHC, CОХ1, COX4, LDH-А и показателя РНК/ДНК мышц и печени с длиной и массой особей различных видов ло сосевых и сиговых рыб естественных популяций и искусственно выращи ваемой форели, с учетом возраста и пола. Впервые проведено комплексное исследование взаимосвязи изучаемых показателей с массой и длиной сигов и при влиянии антропогенного фактора. Впервые определена взаимосвязь между уровнем экспрессии генов двух субъединиц цитохром с оксидазы и активностью этого фермента у рыб разных по размеру.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные ре зультаты и сделанные на их основании выводы расширяют существующие представления о биохимических и молекулярных механизмах и закономер ностях процесса роста у рыб с учетом видового, возрастного, полового и экологического аспектов. Знание особенностей процесса роста рыб может служить основой для разработки точных, удобных физиолого-биохимиче ских индикаторов роста рыб и оценки состояния их здоровья, что может быть использовано в мониторинговых исследованиях, определении ресурс ного потенциала водоемов и развитии новых технологий аквакультуры. Ре зультаты исследования могут быть использованы для разработки лекцион ных курсов по физиологии и биохимии рыб, экологической биохимии и эн зимологии для студентов биологических факультетов ВУЗов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представле ны в виде устных и стендовых докладов на российских и зарубежных конфе ренциях: Всероссийской конференции с международным участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008);
Международной научной конференции Arctic Frontiers 2009 “Arctic ma rine ecosystems in an era of rapid climate change” (Tromso, Norway, 2009);
Меж дународном симпозиуме 15th International Symposium on Pollutant Responses in Marine Organisms (Bordeaux, France, 2009);
XXVIII Международной конферен ции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейско го севера» (Петрозаводск, 2009);
III Международной конференции с элемента ми школы для молодых учёных, аспирантов и студентов «Современные про блемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010);
Международной школе-семинаре для молодых ученых «Биологические ресур сы Арктики и Субарктики – потенциал для биотехнологии: исследования и ин новации» (Петрозаводск, 2010);
I научно-практической конференции молодых ученых ФГУП «ВНИРО» «Современные проблемы и перспективы изуче ния мирового океана» (Москва, 2011);
V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), Научной конференции и школе моло дых ученых, посвященных 65-летию КарНЦ РАН «Фундаментальная и прикладная наука в Республике Карелия: современное состояние и пер спективы развития» (Петрозаводск, 2011);
Молодежном инновационном конкурсе "МИК - 2011" (Петрозаводск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 9 статей в других изданиях и 8 тезисов докладов.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 193 стра ницах машинописного текста, содержит 33 таблицы, 62 рисунка и состо ит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов ис следования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и вы водов. Список цитируемой литературы включает 235 источников, в том числе 186 работ зарубежных авторов.
Благодарности. Автор искренне благодарна научному руководителю член.-корр. РАН Н.Н. Немовой и научному консультанту к.б.н. О.В. Ме щеряковой, сотрудникам лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации, а также О.П. Стерлиговой, Н.В. Ильмасту и сотрудникам лаборатории эко логии рыб ИБ КарНЦ РАН за помощь при получении биологического ма териала и консультации. Автор выражает огромную благодарность со трудникам группы молекулярной биологии ИБ КарНЦ РАН Л.В. Топчие вой и лаборатории популяционной биологии ФГУП «ВНИРО» Н.С. Мюге за консультации по методам молекулярно-генетических исследований.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 08-04 01140-а, 11-04-00167-а), программы Президента РФ «Ведущие научные шко лы» НШ-306.2008.4, НШ-3731.2010.4, НШ-1642.2012.4, проекта программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России: оценка состояния и фундамен тальные основы мониторинга», 2009-2011 г. (рег. № 01200955241), гранта Правительства РФ (Постановление 220, ГК №11.634.31.0052, лаборатория молекулярной генетики врожденного иммунитета ПетрГУ, зав. лаборатори ей А.Н. Полторак).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы В обзоре литературы рассматривается роль аэробного и анаэробного энергетического обмена в процессах роста и развития рыб. Обобщены дан ные по взаимосвязи активности ферментов энергетического и углеводного обмена в органах рыб с темпами роста и размерами особей. Приведены сведения о регуляции активности ферментов на уровне транскрипции их генов при формировании размерного разнообразия. Представлены данные о молекулярно-генетических показателях, использующихся в оценке тем пов роста рыб. Рассмотрены особенности роста рыб и механизмы форми рования размерной изменчивости.
Глава 2. Материал и методы исследования Материал исследования. В качестве объектов исследования были выбраны рыбы разных возрастных групп четырёх видов двух семейств Сиговые (Coregonidae) и Лососёвые (Salmonidae): естественных популя ций, атлантический лосось Salmo salar L., обыкновенный сиг Coregonus lavareus L., ряпушка Coregonus albula L., а также искусственно выращи ваемая радужная форель Parasalmo mykiss Walb. В зависимости от задач количество экземпляров в одной возрастной группе составило от 7 до 30.
Определение активности исследуемых ферментов. Активность фер ментов определяли в белых мышцах и печени рыб. Ткань гомогенизировали в 0,01 М трис-HCl буферном растворе (рН 7,5). Общую активность фермен тов лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27), малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49), 1-глицерофосфат-дегидроге назы (КФ 1.1.1.8) определяли по общепринятым методам (Кочетов, 1980).
Активность альдолазы (КФ 4.1.2.13) определяли по методике Beck в моди фикации Ананьева и Обуховой (Колб, Камышников, 1976). Активность ука занных ферментов выражали в мкмоль субстрата/мин/г ткани. Активность цитохром с оксидазы (КФ 1.9.З.1.) в мышцах и печени определяли по методу Смита (Smith, 1955). Активность ЦО выражали в k/г ткани, где k – константа реакции 1-го порядка. Содержание белка в тканях определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта БСА.
Определение концентрации нуклеиновых кислот. Тотальную РНК выделяли из белых мышц по Хомчински и Саччи (Chomczynski, Sacchi, 1987) с помощью набора «для выделения тотальной РНК Yellow Solve»
(Клоноген, С.-Петербург). ДНК белых мышц выделяли по методу Альа наби и Мартинеса (Aljanabi, Martinez, 1997). Концентрации РНК и ДНК определяли спектрофотометрически (спектрофотометр “SmartSpec Plus”, BioRad, США) (Маниатис и др, 1984).
Проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) (Силекс, Рос сия). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из препарата тоталь ной РНК с использованием MMLV-обратной транскриптазы и случайных гексонуклеотидов (набор «Синтез первой цепи ДНК», Силекс). Амплифи кацию проводили на приборе i-Cycler с оптической приставкой IQ5 (Bio Rad) с использованием реакционной смеси 2.5 х для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Синтол, Россия).
Праймеры к нуклеотидным последовательностям генов тяжелой цепи мио зина (MyHC), цитохром с оксидазы субъединицы IV (COX4) и субъедини цы I (COX1), лактатдегидрогеназы субъединицы А (LDH-A) и референсных генов фактора элонгации (EF-1) и -actin подбирали с помощью програм мы Beacon Designer 5.01 («Premier Biosoft», США). Концентрацию матрич ной РНК в виде кДНК определяли по стандартной кривой (Gahr et al., 2008). Данные выражались как отношение концентрации мРНК исследуе мого гена к концентрации мРНК референсного гена.
Секвенирование. Для подтверждения того, что продукты амплификации кДНК являются фрагментами исследуемых генов, проводили секвенирование.
Реакцию секвенирования ПЦР-продуктов выполняли с использованием набо ров реагентов GenomLabTM DTCS-Quick Start Kit (Beckman Coulter, Inc., США) и BigDye version 1.1 (Applied Biosystems, США). Продукты реакции се квенирования очищали от невключенных нуклеотидов с флуорофорами путем осаждения 96% этанолом. Разделение синтезированных фрагментов проводи ли методом автоматического капиллярного электрофореза в генетическом ана лизаторе Beckman Coulter CEQTM 8000 (Beckman Coulter, Inc, США) и ABI 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США) на базе ИБ КарНЦ РАН и ВНИРО. Для редактирования полученных последовательностей использовали программу ChromasPro (http://www.technelysium.com.au/ChromasPro.html). По лученные последовательности нуклеотидов сравнивали с базой данных NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Гомология полученных фрагмен тов с последовательностью генов из генетического банка была не ниже 96%.
Статистическая обработка данных. В работе использовали обще принятые методы статистической обработки данных с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics 2.5 for Windows. Сравнение выборок проводили с применением непараметрического критерия Вил коксона-Манна-Уитни. Cтепень влияния исследуемых факторов оценива ли при помощи многофакторного дисперсионного анализа МANOVA.
Взаимосвязь исследуемых показателей с размерами особей и между со бой оценивали при помощи линейной регрессии и корреляционного ана лиза (Коросов, Горбач, 2007).
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 1. Общие закономерности взаимосвязи исследуемых биохимиче ских и молекулярно-генетических показателей с длиной и массой особей изучаемых видов рыб По результатам анализа взаимосвязи между исследуемыми показателями мышц и печени и размерно-весовыми характеристиками особей рыб разного возраста, выловленных в летний нагульный период, были установлены некоторые общие тенденции. Установлена положительная корреляция активности ферментов мышц аэробного обмена - ЦО и анаэробного обмена - ЛДГ с длиной и массой особей внутри одновозрастных групп рыб из естественных водоемов: молоди лосося, сига и ряпушки (табл. 1). Аналогичная закономерность была показана и для искусственно выращиваемой форели. Положительная связь активности этих ферментов с размерами рыб объясняется необ ходимостью поддержания высокого уровня аэробного и анаэробного энергетического обмена для обеспечения необходимым количеством АТФ основных процессов жизнедеятельности, в том числе процессов синтеза структурных, функциональных и запасных соединений в мышцах, которые интенсивно протекают у активно растущих особей, особенно в раннем онтогенезе (Houlihan et al., 1995;
Savoie et al., 2008;
Gauthier et al., 2008). Установлена положительная корреляция массы рыб с активностью МДГ - фермента цикла трикарбоновых кислот, а также активностью альдолазы, характеризующей степень использова ния углеводов в гликолизе. Полученные результаты указывают на то, что более крупные особи имеют более высокие уровень аэробного и анаэробного обмена и степень использования углеводов в процессах энергетического метаболизма в мышцах рыб.
Таблица Корреляция активности ЦО (k/г) и ЛДГ (мкмоль субстрата/мин/г) мышц с длиной (AC) и массой особей у разных возрастных групп рыб Активность Возра Активность ЦО, r r Вид r (масса) r (масса) ЛДГ, ст M±m (AC) (AC) M±m 1,21 ± 0,03 98,8 ± 12, 0+ 0,56* 0,55* 0,73* 0,67* Лосось 1,88 ± 0,08** 120,4 ± 5,51** 1+ 0,60* 0,62* 0,58* 0,53* 1,02 ± 0,06** 132,2 ± 3,05** 2+ 0,69* 0,70* 0,79* 0,84* 1,55 ± 0,09 126,5 ± 10, 2+ 0,86* 0,75* 0,51* 0,79* Сиги 1,61 ± 0,05 133,2 ± 4, 3+ 0,71* 0,73* 0,46* 0,78* 2,12 ± 0,08 453,2 ± 11, 1+ 0,84* 0,75* 0,68* 0,73* Ряпушка 1,83 ± 0,09** 345,1 ± 21,2** 2+ 0,74* 0,65* 0,50* 0,65* 1,91 ± 0,07 318 ± 19, 3+ 0,44* 0,41 0,31 0,40* 2,16 ± 0,05 312,8 ± 12, 1+ 0,65* 0,78* 0,45* 0,69* Форель 1,82 ± 0,04** 369,1 ± 12,6** 2+ 0,52* 0,51* 0,53* 0,64* * - достоверные значения коэффициента корреляции при p 0, ** - различия между возрастными группами достоверны при p 0, Для всех исследуемых видов рыб внутри каждой возрастной группы уро вень экспрессии гена тяжелой цепи мио зина (MyHC) в белых мышцах возрастал с увеличением массы и длины тела (рис.
1). Миозин является одним из основных белков в мышце и составляет 50% от ко личества всех мышечных белков (Wa tabe, Ikeda, 2006). Согласно ряду исследо вательских работ уровень экспрессии ге на MyHC коррелирует с темпами роста радужной форели Oncorhynchus mykiss (Overturf, Hardy, 2001), атлантического лосося Salmo salar (Hevroy et al., 2006), некоторых других видов рыб (Imsland et al., 2006;
Dhillon R. et al., 2008) и исполь зуется как показатель, отражающий тем пы прироста мышечной массы и темпы роста рыб в целом. Таким образом, со гласно результатам данного исследова ния более крупные особи отличаются высокими темпами прироста мышечной массы. Следует также отметить, что у ис следованных видов рыб уровень экспрес сии MyHC положительно коррелировал с активностью ЛДГ. Это указывает на то, что высокая активность ЛДГ у более крупных особей согласуется с высокими темпами прироста их мышечной массы.
В печени значения коэффициен Рис. 1. Зависимость уровня экспрес сии гена MyHC в белых мышцах от тов корреляции активности ЦО с мас массы тела у лосося (А), сига (Б), сой одновозрастных рыб составили форели (В) для лосося возраста 1+ и 2+: 0,46 и Условные обозначения: зависи- 0,52;
для сига 2+ и 3+: 0,69 и 0,85;
ря мость достоверна при p0,05;
------ зави пушки 1+, 2+, 3+: 0,78, 0,56 и 0,86, симость недостоверна соответственно (p0,05). Вероятно, рыбы большие по размерам имеют более высокий уровень процессов аэробного обмена в связи с большими энергетическими затратами на под держание функциональной активности печени на необходимом уровне.
Отмечены высокие значения положительной корреляции между ак тивностью ферментов печени 1-ГФДГ, Г-6-ФДГ и длиной и массой осо бей лосося, сига, ряпушки, форели (табл. 2). Указанные ферменты печени играют важную роль в процессах пластического обмена, синтезе струк турных и запасных липидов. Более высокая активность данных фермен тов у крупных особей указывает на более высокий уровень синтеза гли церофосфата из углеводов (Harmon, Sheridan, 1992), который может ис пользоваться для синтеза структурных и запасных липидов, и более вы сокий уровень окисления углеводов в пентозо-фосфатном пути, в резуль тате которого происходит образование пентоз и генерируется восстано витель в форме НАДфН для реакций биосинтеза (Gauthier et al., 2008).
Таким образом, отмеченная положительная корреляция активности фер ментов 1-ГФДГ и Г-6-ФДГ с размерно-весовыми характеристиками осо бей, возможно, косвенно свидетельствует о более высоком уровне ис пользования углеводов в реакциях биосинтеза, в том числе в реакциях синтеза запасных и структурных липидов.
Таблица Корреляция активности Г-6-ФДГ и 1-ГФДГ в печени (мкмоль субстрата/мин/г) с длиной (AC) и массой особей у разных возрастных групп рыб Активность Активность Вид Возраст r (AC) r (масса) r (AC) r (масса) Г-6-ФДГ 1-ГФДГ M±m M±m 1+ 16,7 ± 1,3 0,74* 0,73* 71,1 ± 2,2 0,72* 0,73* Лосось 2+ 14,1 ± 1,3 0,67* 0,74* 39,2 ± 3,11** 0,62* 0,75* 2+ 9,8 ± 0,9 0,75* 0,82* 17,5 ± 1,1 0,82* 0,64* Cиги 3+ 11,4 ± 1,1 0,65* 0,89* 36,2 ± 5,2** 0,77* 0,89* 1+ 10,9 ± 0,5 0,55* 0,69* 45,5 ± 2,21 0,50* 0,64* Ряпушка 2+ 13,1 ± 0,9** 0,59* 0,73* 56,2 ± 2,3** 0,53* 0,65* 3+ 15,5 ± 0,8** 0,59* 0,78* 69,1 ± 2,2** 0,54 0,69* 1+ 12,1 ± 0,9 0,53* 0,87* 56,8 ± 2,6 0,49* 0,54* Форель 2+ 14,6 ± 1,2** 0,34 0,93* 69,3 ± 2,1** 0,41 0,75* * - достоверные значения коэффициента корреляции при p 0, ** - различия между возрастными группами достоверны при p 0, 2. Возрастные особенности взаимосвязи биохимических и молеку лярно-генетических показателей с длиной и массой рыб Для большинства исследуемых видов рыб активность ЦО мышц с возрас том снижалась, что связано с общей закономерностью снижения уровня аэроб ного обмена, потребления кислорода, и, в целом, уровня стандартного обмена в онтогенезе (Озернюк, 1985;
Hinterleitner et al.;
1987, Goolish, 1995). Общей тенденции изменения активности ЛДГ с возрастом у исследованных видов рыб не обнаружено (табл. 1), что, вероятно, является следствием видовых осо бенностей, в том числе, различием образа жизни и физической активно сти. При этом возрастные вариации активности ЛДГ коррелировали с из менением активности альдолазы.
Это указывало на то, что изменение в степени использования углеводов с возрастом скорее всего связано с из менением уровня анаэробного обме на в мышцах.
Несмотря на существующие возрастные изменения в активно сти ферментов ЦО и ЛДГ, внутри всех возрастных групп взаимо связь активности этих показателей с размерами особей была положи тельной (табл. 1). Это указывает на то, что в первые годы жизни независимо от возраста более крупные особи характеризуются более высоким уровнем энергети ческого метаболизма.
Известно, что индекс РНК/ДНК отражает уровень синтеза белков в клетке (Buckley, 1984). Ранее было показано, что значение этого индек са положительно коррелирует с тем пами роста лососевых (Varnavskiy et al., 1991;
Peragon, 2001) и других ви дов рыб (Vinagre, 2008). Согласно результатам нашего исследования Рис. 2. Зависимость индекса РНК/ДНК характер взаимосвязи РНК/ДНК с в белых мышцах от массы тела у лосося размерами исследованных видов (А), сига (Б), форели (В) рыб различался в зависимости от ви Условные обозначениия: зависимость да и их возраста (рис. 2). Поскольку достоверна при p0,05;
------ зависимость данный показатель отражает уровень недостоверна синтеза всех белков в клетке, то мо жет значительно варьировать на разных стадиях онтогенеза, в зависимости от особенностей экологии вида и типа питания. Значение показателя также может зависеть от соотношения процессов гипертрофии и гиперплазии мышечных волокон (Peragon et al., 2001).
С возрастом увеличивается активность ферментов 1-ГФДГ и Г-6-ФДГ, что было установлено как для естественных видов рыб - ряпушки, сигов, так и для искусственно выращиваемой форели (табл. 2). При этом активность этих ферментов в большей степени коррелировала с массой, чем с длиной, особенно в старших возрастных группах, что, возможно, связано с усилени ем процессов липогенеза с возрастом.
3. Половые различия во взаимосвязи между активностью фермен тов энергетического и углеводного обмена, уровня экспрессии гена тяжелой цепи миозина, индексом РНК/ДНК и размерно-весовыми ха рактеристиками рыб При исследовании неполовозрелых особей сига (2+ и 3+) различий в характере взаимосвязи изучаемых показателей с длиной и массой особей между самцами и самками выявлено не было. У половозрелых особей си га (возраст 4+ и 5+) наблюдалось изменение характера и степени взаимо связи исследуемых показателей с длиной и массой особей. Так, напри мер, обнаруженная у неполовозрелых сигов взаимосвязь уровня экспрес сии гена тяжелой цепи миозина и индекса РНК/ДНК с длиной и массой особей (рис. 1Б), у половозрелых рыб, как самцов, так и самок отсутство вала. Это вероятно связано с тем, что на поздних стадиях созревания го над и преднерестовый период процессы роста замедляются, что непо средственно связано с большими энергетическими затратами на синтез половых продуктов (Решетников, 1980, Шатуновский, 2001). Кроме того, в характере взаимосвязи показателей с размерами особей возникают раз личия между самцами и самками. Для самцов установлена положитель ная взаимосвязь активности ЦО мышц только с длиной (r=0,59, p0,05).
У самок взаимосвязь ЦО с длиной особей не показана, а с массой была отрицательной (рис. 3 А). В печени сига корреляция активности ЦО с массой особей была положительной для самцов и отрицательной для са мок (рис. 3 Б). Таким образом, можно заключить, что крупные половозре лые самки имеют более низкий уровень аэробного обмена в энергообес печении печени и мышц, что, вероятно, связано с большими энергетиче скими затратами на генеративный обмен. Для ферментов печени 1-ГФДГ и Г-6ФДГ установлены различия между самцами и самками в степени взаимосвязи этих показателей с размерами особей. Так, положительная связь активности 1-ГФДГ с массой особей установлена только для сам цов (r=0,79, p0,05). Для самок, в отличие от самцов, показана положи тельная корреляция Г-6-ФДГ с массой (r=0,92, p0,05). Таким образом, изменение в характере взаимосвязи исследуемых показателей с размера ми рыб при наступлении половой зрелости, а также различия в этой взаи мосвязи между самцами и самками связаны со специфичным изменением интенсивности и направления путей энергетического и углеводного мета болизма в период созревания гонад и нерестовый период.
Рис. 3. Зависимость активности ЦО мышц (А) и печени (Б) от массы тела половозрелых самцов и самок сига возраста 5+ Условные обозначения: зависимость достоверна при p0,05;
------ зависимость недостоверна;
ЕА – единицы активности фермента 4. Сравнение исследуемых показателей и оценка их взаимосвязи с длиной и весом особей сига, обитающих в чистом озере и антропоген но-трансформированном водоеме Сравнивали сигов, обитающих в чистом озере Каменное и озере Косто мукшское (Республика Карелия), преобразованном в технологический водоём Костомукшского горно-обогатительного комбината (хвостохранилище). Водо ём служит для захоронения отходов производства (хвостов обогащения, кото рые в виде пульпы поступают в водоём) и оборотного водоснабжения. Вода в озере характеризуется высоким содержанием ионов К+, Na+, Ca+, SO42-, HCO3, высокой минерализацией (до 645 г/мл), высоким значением рН (около 8,4), большим количеством мелкодисперсной минеральной взвеси (1,34 мг/л) (Состояние природных вод…2007). В белых мышцах сига из хвостохранили ща отмечалась более низкая активность ЦО и более высокая активность ЛДГ по сравнению с сигами из оз. Каменное (рис. 4), что указывало на низкий уро вень аэробного энергетического обмена и высокий уровень анаэробного про цесса синтеза АТФ в этой ткани. Кроме того, у сигов из сравниваемых озер наблюдались различия в корреляции между активностью ЦО и активностью ЛДГ: у сига из чистого озера она была положительной (r=0,82, p0,05), а у сига из хвостохранилища – отрицательной (r=-0,71, p0,05). Это свидетельствовало о том, что в норме аэробный и анаэробный пути синтеза АТФ функционируют однонаправленно, а в неблагоприятных условиях снижение интенсивности аэробного метаболизма частично компенсируется увеличением уровня ана эробного (Richards, 2009). Активность альдолазы в мышцах сигов из озера Костомукшское была ниже по сравнению с сигами из относительно чистого озера (рис. 4). При этом в мышцах сига из чистого водоема была отмечена по ложительная корреляция активности альдолазы с активностью ЦО и ЛДГ (rЦО=0,88, rЛДГ=0,82, p0,05), а для сига из техногенного озера установлена взаимосвязь активности альдолазы только с активностью ЛДГ (rЛДГ=0,76, p0,05). Это может свидетельствовать о том, что в мышцах сига из озера Кос томукшское происходило перераспределение использования углеводов между аэробным и анаэробным энергетическим метаболизмом в сторону усиления их использования в анаэробном синтезе АТФ. Значение показателя РНК/ДНК в белых мышцах сигов, обитающих в хвостохранилище, составило 0,61±0,07, что было ниже по сравнению с таковым в мышцах рыб из чистого водоема 1,09±0,05 (p0,05). Это указывает на снижение уровня синтеза белков, ухудше ние состояния рыб и снижение темпов их роста (Mohapatra, Noble, 1992;
Audet, Couture, 2003;
Varo et al., 2007;
Mankiewicz-Boczek et al., 2010). Эти выводы подтверждаются и данными по линейно-весовым характеристикам рыб, свиде тельствующими о меньших размерах сигов из неблагоприятного водоема. При исследовании взаимосвязи исследуемых показателей с размерами сигов были установлены как общие тенденции, так и различия. В частности, для сигов из обоих озер была характерна положительная взаимосвязь активности ЦО, уров ня экспрессии гена миозина и индекса РНК/ДНК белых мышц с размерами особей (рис. 5 А, Б, В). Таким образом, несмотря на снижение темпов роста си га из хвостохранилища, закономерности формирования вариаций по размерам, установленные по перечисленным показателям мышц, аналогичны таковым для сига из чистого водоема.
Рис. 4. Активность ферментов (ЕА) мышц (А) и печени (Б) сига из озер Каменное и Костомукшское, (мкмоль субстрата/мин/г (для ЛДГ и альдолазы - ЕА*10-1), k/г – для ЦО), m±M * - различия достоверны при p0, В отличие от сига из озера Каменное, для сига из хвостохранилища не установлена взаимосвязь ЛДГ мышц с размерами особей (рис. 5 Г), что, вероятно, связано с изменением интенсивности путей аэробного и ана эробного синтеза АТФ в общем энергообеспечении клеток мышц и уси лением роли анаэробного обмена как компенсаторного механизма.
Рис. 5. Зависимость активности ЦО (А), уровня экспрессии гена MyHC (Б), индекса РНК/ДНК (В), активности ЛДГ (Г) белых мышц от массы тела особей сига из озер Каменное и Костомукшское Условные обозначения: как на рисунке В печени сига из озера Костомукшское установлены более низкие зна чения активности ЦО и высокие значения альдолазы, ЛДГ, Г-6-ФДГ по сравнению с таковыми у сига из озера Каменное. Это указывает на более низкий уровень аэробного обмена, более высокую степень окисления уг леводов в гликолизе и пентозо-фосфатном пути в печени рыб из неблаго приятного водоема. Корреляция активности ЦО, Г-6-ФДГ, 1-ГФДГ пече ни с размерами сигов из хвостохранилища была положительной, что со ответствовало характеру взаимосвязи этих ферментов с длиной и массой сигов из чистого озера.
5. Соотношение активности ферментов ЦО и ЛДГ и уровня экс прессии генов СOX1, COX4 и LDH-A в белых мышцах при формиро вании размерного разнообразия рыб исследуемых видов Исследовали взаимосвязь уровня экспрессии генов цитохром с оксидазы субъединиц I и IV (COX1 и COX4) и лактатдегидрогеназы субъединицы А (LDH-A) с размерно-весовыми характеристиками особей и активностью самих ферментов. У млекопитающих и рыб молекула цитохром с оксидазы состоит из 13 субъединиц: 3 основных каталитических, в том числе COX1, кодируе мых митохондриальным геномом, и 10 минорных, в том числе COX4, которые кодируются ядерным геномом. Вместе с тем, мало изучен вопрос о том, с ка кими субъединицами связана регуляция активности фермента ЦО на уровне транскрипции (Davies, Moyes, 2007;
LeMonie et al., 2008;
Duggan et al., 2011).
На примере лосося было показано, что взаимосвязь экспрессии гена ядерной субъединицы СOX4 с размерами особей и активностью ЦО была положитель ной для всех возрастных групп (рис. 6 А и 7 А). Корреляция уровня экспрессии гена митохондриальной субъединицы COX1 с размерами особей установлена только для лосося возраста 0+ и 1+, а с активностью ЦО – только для воз растных групп 1+ и 2+ (рис. 6 Б и 7 Б). В целом, степень взаимосвязи гена Рис. 6. Зависимость уровня экспрессии генов COX1 (A) и COX4 (Б) в белых мышцах от массы особей лосося разных возрастных групп Условные обозначения: зависимость достоверна при p0,05;
------ зависимость недостоверна Рис. 7. Зависимость активности цитохром с оксидазы от уровня экспрессии генов COX1 (A) и COX4 (Б) в белых мышцах лосося разных возрастных групп Условные обозначения: как на рисунке субъединицы COX1 с размера Таблица ми особей была ниже, чем та Уровень экспрессии генов COX1 и COX ковая для экспрессии гена в мышцах лососей COX4. Был исследован уро трех возрастных групп вень экспрессии генов COX1 и мРНК COX1/ мРНК COX4/ COX4 в разных возрастных Возраст мРНК EF-1 мРНК EF- группах. Уровень экспрессии 0+ 2,48 ± 0,21 1,62 ± 0,1 гена митохондриальной субъе диницы СOX1 во всех возрас 1+ 2,79 ± 0,19 1,98 ± 0,14* тных группах лосося остава 2+ 2,74 ± 0,51 1,24 ± 0,16* лся на одинаковом уровне.
* - различия между возрастными группами Возрастное изменение актив ности ЦО (табл. 1) в белых достоверно, p0. мышцах лосося соответствова ло изменению уровня экспрессии гена ядерной субъединицы СOX4 (табл.
3). Как известно, субъединицы, кодируемые митохондриальным геномом, непосредственно принимают участие в катализе и, вероятно, представле ны в избыточном количестве (Kadenbach et al., 2000;
Duggan, 2010). Воз можно, этим и объясняется наблюдаемое нами постоянство уровня экс прессии гена субъединицы СOX1 в исследованных возрастных группах и меньшая степень взаимосвязи с активностью ЦО и размерами особей.
Ядерная субъединица COX4 является регуляторной, имеет аллостериче ский центр (сайт связывания с АТФ) (Kadenbach et al., 2000;
Little, 2010).
Можно полагать, что количество COX4 влияет также на уровень синтеза ЦО, так как она первой из ядерных субъединиц включается в формирова ние структуры фермента (Duggan, 2010). Видимо, участие субъединицы COX4 в регуляции активности фермента, а также в формировании струк туры фермента и определяет ее более сильную взаимосвязь с активно стью ЦО. Поскольку аналогичная взаимосвязь экспрессии гена ЦО субъе диницы IV c размерами особей и активностью фермента установлена и для других исследованных видов рыб - сига и форели, то, вероятно, изме нение активности ЦО при формировании размерного разнообразия рыб в первые годы жизни регулируется, главным образом, на уровне транс крипции гена ядерной субъединицы COX4.
При изучении уровня экспрессии гена LDH-A в белых мышцах лосося разного возраста показана положительная корреляция этого показателя как с длиной и массой особей, так и с активностью фермента (рис. 8). Ве роятно, различие в активности ЛДГ мышц у рыб разного размера опреде ляются регуляцией на уровне транскрипции гена анаэробной субъедини цы А лактатдегидрогеназы, характерной для этой ткани. Такая же взаи мосвязь установлена нами и для сига из чистого озера. Полученные ре зультаты согласуются с аналогичными исследованиями механизмов регу ляции активности пируваткиназы (ПК, фермента гликолиза), в результате которых была установлена взаимосвязь экспрессии гена ПК с активно стью ПК и массой тела годовиков заводской форели (Burness et al., 1999) и четырёх видов морских окуней (Davies, Moys, 2007).
Рис. 8. Зависимость уровня экспрессии гена LDH-А от массы особей (А), зависимость активности ЛДГ от уровня экспрессии гена LDH-А (Б) лосося разных возрастных групп Условные обозначения: как на рисунке Следует отметить, что для сигов из хвостохранилища взаимосвязь экс прессии гена LDH-A с длиной и массой особей и активностью ЛДГ не обна ружена, что, видимо, связано с изменением регуляции активности фермента и изменением интенсивности и направления реакции, катализируемой ЛДГ.
ВЫВОДЫ 1. Установлена положительная взаимосвязь между активностью цитохром с оксидазы, лактатдегидрогеназы, уровнем экспрессии гена тяже лой цепи миозина в мышцах, активностью ферментов цитохром с окси дазы, 1-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени и массой особей одновозрастных групп всех исследованных видов рыб. Такая взаимосвязь характерна как для рыб естественных популяций (ряпушка, лосось, сиг), так и для искусственно выращиваемой форели в летний нагульный период в первые годы жизни.
2. Взаимосвязь индекса РНК/ДНК в мышцах с размером и массой особей неоднозначна, она зависит от вида рыб и их возраста.
3. Для сига взаимосвязь между активностью цитохром с оксидазы, индек сом РНК/ДНК, уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина в мышцах, активностью цитохром с оксидазы, 1-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо 6-фосфатдегидрогеназы в печени и размерно-весовыми характеристиками рыб существенно различается у половозрелых и неполовозрелых особей. Для по ловозрелых особей сига взаимосвязь активности цитохром с оксидазы мышц и печени с длиной и массой, а также активности 1-глицерофосфатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы печени с длиной и массой рыб зависит от пола.
4. Для сига из чистого и техногенного водоемов активность цитохром с оксидазы, индекс РНК/ДНК и уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина в мышцах и активность цитохром с оксидазы, 1-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени повышаются с увеличением размера и массы особей. Различия наблюдаются только во взаимосвязи длины и массы особей с активностью лактатдегидрогеназы и альдолазы мышц.
Это связано с возрастанием интенсивности анаэробного обмена и его роли в компенсаторных механизмах поддержания энергетического гомеостаза при более низком уровне аэробного обмена, наблюдавшегося у сигов в условиях антропогенного воздействия.
5. Для одновозрастных особей сига, лосося, радужной форели уровень экспрессии генов COX4 и LDH-A, также как и активность ферментов цитохром с оксидазы и лактатдегидрогеназы в белых мышцах, повыша ется с увеличением размера и массы. Это свидетельствует о регуляции активности ферментов при формировании размерного разнообразия рыб на уровне транскрипции соответствующих генов. У рыб, обитающих в условиях техногенного водоема, взаимосвязи уровня экспрессии LDH-A с активностью фермента лактатдегидрогеназы не выявлено.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ЛДГ – лактатдегидрогеназа ЦО – цитохром с оксидаза МДГ – малатдегидрогеназа 1-ГФДГ – -глицерофосфатдегидрогеназа Г-6-ФДГ – глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа БСА - бычий сывороточный альбумин MYHC – (myosin heavy chain) тяжелая цепь миозина СOX – (cytochrome c oxidase) цитохром с оксидаза LDH-A – (lactate dehydrogenase - A) лактатдегидрогеназа ЕF-1 – (elongation factor-1) фактор элонгации – Список работ, опуликованных по теме диссертации:
1. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н., Шатуновский М.И. Соотно шение роста и некоторых биохимических показателей рыб на примере микижи Parasalmo mykiss Walb. // Известия РАН. Сер. Биол. – 2010. – № 3. – С. 289 – 299.
2. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н. Взаимосвязь активности фер ментов энергетического обмена с темпами роста и размерами рыб // Ученые за писки ПетрГУ. – 2011. – № 4. – С. 31 – 37.
3. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Ильмаст Н.В., Немова Н.Н. Оценка состоя ния сигов Coregonus Lavaretus L., обитающих в хвостохранилище горнообогати тельного комбината, по некоторым биохимическим и молекулярно-генетическим показателям // Труды КарНЦ РАН. Сер. Экспериментальная биология. – 2011. – №3. – С. 137–145.
4. Мещерякова О.В., Чурова М.В., Немова Н.Н. Биохимические методы оцен ки роста и развития рыб. Корреляции активности некоторых ферментов метабо лизма с показателями веса и длины особей у разных возрастных групп ряпушки оз. Сямозеро (Республика Карелия) // Организмы, популяция, экосистемы: про блемы и пути сохранения биоразнообразия. Матер. всерос. конф. с междунар.
участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследова ний» Вологда, 24–28 ноября 2008 г. – Вологда, 2008. – С. 71–75.
5. Мещерякова О.В., Чурова М.В., Шатуновский М.И., Немова Н.Н. Перспек тивы использования некоторых биохимических показателей в оценке скорости роста ценных видов лососевых рыб – объектов товарного производства // Высокие технологии, фундаментальные исследования, промышленность. Сборник трудов шестой междунар. научно-практической конф. «Иследование, разработка и приме нение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 16-17.10.2008. – Санкт-Петербург, 2008. – С. 160–161.
6. Мещерякова О.В., Чурова М.В., Немова Н.Н. Особенности энергетическо го обмена молоди лосося при заболевании некрозом плавников // Садковое рыбо водство. Технология выращивания. Кормления рыб и сохранения их здоровья.
Матер. науч.конф. Петрозаводск, 13-17 октября 2008 г. – Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2008. – С. 73–76.
7. Мещерякова О.В., Унжаков А.Р., Хижкин Е.А., Чурова М.В., Немова Н.Н.
Окисление лактата в митохондриях животных: механизм и значение // 4-й Меж дунар. симпозиум: Современные проблемы и методы экологической физиологии и патологии млекопитающих введенных в зоокультуру. Матер. симпозиума. Пет розаводск. 23-25 сенября 2009 г. – Петрозаводск, 2009. – с.175 – 181.
8. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Шатуновский М.И. Корреляция биохими ческих показателей с линейно-весовыми параметрами особей некоторых видов рыб // Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского севера: матер. XXVIII междунар. конф. Петрозаводск, 5-8 октября 2009 г. – Пет розаводск: изд-во КарНЦ РАН, 2009 – С. 612 – 617.
9. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н. Использование показателя РНК/ДНК и уровня экспрессии гена тяжелой цепи миозина в оценке интенсивно сти роста некоторых видов рыб // Биология – наука ХХI века: 13-я Пущинская ме ждунар. школа-конф. молодых ученых. Сборник тезисов. Пущино, 28 сентября — 2 октября 2009. – Пущино, 2009. – С. 10. Churova M.V., Mescheryakova O.V., Shatunovsky M.I., Nemova N.N. The search of biochemical indicators for estimation of growth and development of fish under anthropogenic influence on water ecosystems of the North-west part of Russia // Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change: abstracts of the internat.
scient. conf. «Arctic Frontiers». 18 – 23 January, 2009. – Tromso, 2009 – P.122.
11. Churova M.V., Mescheryakova O.V., Nemova N.N. Energy and carbohydrate metabolism enzymes as bioindicators of fish health under anthropogenic transformation of lake ecosystem // 15th international symposium on Pollutant Responses in Marine Organisms. 17-20 May, 2009. – Bordeaux, France, 2009. – P.113.
12. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н.. Влияние сточных вод гор но-обогатительного комбината на некоторые ферменты энергетического и угле водного обмена рыб // Природа морской Арктики: современные вызовы и роль науки: Тез. докл. Междунар.науч.конф. (г.Мурманск, 10-12 марта 2010 г.). – Апа титы: Изд-во Кольского научного центра РАН, 2010. – с. 221-223.
13. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н. Изменение уровня экспрес сии генов и активности некоторых ферментов углеводного и энергетического об мена у сигов (Coregonus lavaretus L.), обитающих в хвостохранилище горно-обо гатительного комбината // Современные проблемы физиологии и биохимии вод ных организмов: Матер. III Междунар. конф. с элементами школы для молодых учёных, аспирантов и студентов. Петрозаводск, 22 июня – 26 июня 2010 года. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. – С. 193 – 195.
14. Мещерякова О.В., Чурова М.В., Немова Н.Н. Изменение активности не которых митохондриальных ферментов органов рыб при антропогенной нагрузке // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов: Матер. III Междунар. конф. с элементами школы для молодых учёных, аспирантов и сту дентов. Петрозаводск, 22 июня – 26 июня 2010 года. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. – С. 116 – 117.
15. Чурова М. В., Мещерякова О. В., Немова Н. Н. Взаимосвязь линейно-ве совых характеристик с активностью некоторых ферментов и молекулярно-генети ческими показателями в белых мышцах сигов разных возрастных групп из озера Каменное (Республика Карелия) / Современные проблемы физиологии и биохи мии водных организмов организмов. Том I. Экологическая физиология и биохи мия водных организмов: сборник научных статей. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. – С. 304 – 312.
16. Мещерякова О. В., Чурова М. В., Немова Н. Н. Митохондриальный лактат окисляющий комплекс и его значение для поддержания энергетического гомеостаза клеток / Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Том I.
Экологическая физиология и биохимия водных организмов: сборник научных статей. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2010. 163-172 с.
17. Churova M.V., Mescheryakova O.V., Veselov A.E., Sterligova O.P., Nemova N.N.
Myosin expression level in white muscle as a marker of fish growth // Current problems of physiology and biochemistry of aquatic organisms. Vol.II. Arctic and subarctic biological resourses – potential for biotechnology: collected scientific papers of the first International seminar and PhD workshop (6-9 september, 2010, Petrozavodsk). – Petrozavodsk: Karelian Research Centre RAS, 2010. – p. 18 – 22.
18. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н. Корреляция биохимических и молекулярно-генетических показателей с размерами сигов Coregonus Lavaretus L. из оз. Каменное (Республика Карелия) // Современные проблемы и перспекти вы изучения мирового океана. I Научно-практическая конфер. молодых ученых ФГУП «ВНИРО»: тезисы. – М.: Изд-во «ВНИРО», 2010. – С. 24 – 27.
19. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Немова Н.Н Активность цитохром с ок сидазы и уровень экспрессии генов субъединиц COX1 и COX4 в белых мышцах атлантических лососей (Salmo Salar L.) разного возраста // V Российский симпо зиум «Белки и пептиды» Петрозаводск, 8-12 августа, 2011. – Петрозаводск: Ка рельский научный центр РАН, 2011. – С. 354.
20. Чурова М.В., Мещерякова О.В., Веселов А. Е., Немова Н.Н. Использова ние некоторых биохимических и молекулярно-генетических показателей в иссле довании процессов роста рыб на примере молоди лосося Salmo salar L разных возрастных групп из реки Индёра (Кольский полуостров) // Современное состоя ние биоресурсов внутренних водоемов. Материалы докладов I Всероссийской конференции с международным участием. 12-16 сентября 2011 г., Борок, Рос сия. – М.: АКВАРОС, 2011. – Том 2. – С. 809 – 816.
Формат 60х84 1/16 Бумага офсетная. Гарнитура «Times».
Уч.-изд. л. 1,2. Усл. печ. л. 1,3. Подписано в печать 10.02.12.
Тираж 100 экз. Изд. № 274. Заказ № 27.
Карельский научный центр РАН Редакционно-издательский отдел 185003, Петрозаводск, пр. А. Невского,