Цитофизиологические механизмы длительной устойчивости к бурой ржавчине видов-нехозяев и мягкой пшеницы с интрогрессированными генами
На правах рукописи
КНАУС Юлия Константиновна ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЛИТЕЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ ВИДОВ-НЕХОЗЯЕВ И МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ИНТРОГРЕССИРОВАННЫМИ ГЕНАМИ 03.00.12 – физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2009 1
Работа выполнена на кафедре селекции, генетики и физиологии растений ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор биологических наук, доцент Плотникова Людмила Яковлевна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор Калашникова Елена Анатольевна кандидат биологических наук Бабоша Александр Валентинович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет
Защита диссертации состоится 29 октября 2009 г. в 16-00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.08 при ФГОУ ВПО «Российский государст венный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева».
Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ФГОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева».
Автореферат разослан 28 сентября 2009 года.
Автореферат размещен на сайте www.timacad.ru
Ученый секретарь диссертационного совета Белопухов С.Л.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Большие потери урожая сельскохозяйственных культур связаны с развитием грибных болезней. Устойчивость сортов регуляр но преодолевается в результате сопряженной эволюции патогенов с растения ми, что делает защиту культурных растений постоянно актуальной (Жуковский, 1965). В популяциях возбудителя бурой ржавчины Puccinia triticina Erikss. про исходят активные эволюционные процессы, приводящие к преодолению устой чивости основной зерновой культуры – мягкой пшеницы (Parlevliet, 1993).
Видовой иммунитет (устойчивость видов-нехозяев) обеспечивает дли тельную неспецифическую защиту растений от огромного числа микроорга низмов, в связи с этим его механизмы привлекают внимание исследователей (Heath, 2000). В настоящее время сорта защищают генами, интрогрессирован ными из устойчивых видов (McIntosh, 1998), но их проявление в геноме куль турных растений мало изучено.
В связи с этим актуально исследование цитофизиологических механиз мов устойчивости к Puccinia triticina видов-нехозяев, а также образцов пшени цы с интрогрессированными генами. Особенный интерес представляют меха низмы действия генов устойчивости, доказавших длительную эффективность в различных регионах мира.
Диссертационная работа выполнена на кафедре селекции, генетики и фи зиологии растений в ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный универ ситет» (ОмГАУ, г. Омск) с 2003 по 2008 г. в рамках темы «Изучение цитофи зиологических механизмов длительной и индуцированной устойчивости пше ницы к бурой ржавчине» (№ гос. регистрации 0120.0 509874).
Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение цитофизио логических механизмов устойчивости к бурой ржавчине видов-нехозяев и об разцов пшеницы с интрогрессированными генами.
При выполнении работы были поставлены задачи:
1. Исследовать цитологические проявления механизмов устойчивости к Puccinia triticina видов-нехозяев.
2. На примере пшенично-пырейных гибридов выявить комплекс меха низмов устойчивости, защищающий пырей удлиненный Agropyron elongatum (Host) Beauv. от бурой ржавчины пшеницы.
3. На примере набора образцов мягкой пшеницы изучить цитологические особенности действия интрогрессированных генов устойчивости.
4. Исследовать роль активных форм кислорода в защите от P. triticina ли нии сорта Тэтчер с геном Lr19.
5. Изучить влияние синтеза белков на развитие бурой ржавчины на линии сорта Тэтчер с геном Lr19.
6. Изучить роль синтеза каллозы и фенольных соединений в защите ли нии сорта Тэтчер с геном Lr19 от болезни.
7. Выявить цитологические особенности действия индукторов системной приобретенной устойчивости салициловой (СК), янтарной (ЯК), арахидоновой (АК) кислот на развитие бурой ржавчины пшеницы.
Научная новизна результатов заключается в том, что впервые выявле ны цитологические проявления несовместимости P. triticina с видами-нехозяе вами различных таксонов. На примере пшенично-пырейных гибридов установ лен набор цитологических механизмов, обеспечивающих иммунитет к бурой ржавчине вида Agropyron elongatum. Получены данные о цитологическом про явлении генов устойчивости видов Aegilops speltoides, A. biuncialis, Agropyron elongatum, Triticum dicoccum в геноме мягкой пшеницы. Впервые проведено комплексное исследование роли набора механизмов устойчивости (активных форм кислорода, защитных PR-белков, каллозы и фенолов) в защите пшеницы с высоко эффективным геном устойчивости Lr19 от бурой ржавчины. Продемон стрированы цитофизиологические особенности действия системной приобре тенной устойчивости (СПУ) на патогенез.
Теоретическая значимость работы определяется тем, что выявлены ме ханизмы несовместимости растений-нехозяев с P. triticina. Продемонстриро вано стабильное проявление интрогрессированных генов устойчивости в раз личной генетической среде. Выявлены характерные проявления действия генов, доказавших длительную эффективность в различных регионах мира. Показано значение окислительного взрыва, синтеза белков, реакции СВЧ, синтеза калло зы и фенолов в защите пшеницы от ржавчины. Продемонстрированы особен ности цитофизиологических проявлений СПУ, индуцированной набором хими ческих индукторов.
Практическое значение работы. На основании проведенных исследова ний установлены критерии для отбора высокоэффективных генов устойчиво сти. Выявлены и рекомендованы для использования в селекционной программе эффективные доноры устойчивости к бурой ржавчине. Результаты исследова ний внедрены в учебный процесс Омского государственного аграрного универ ситета. Практическая значимость работ подтверждена соответствующими до кументами (приложения).
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представ лены: на Международной научно-практической конференции «Научные ре зультаты – агропромышленному комплексу» (г. Курган, 2004 г.);
на Межрегио нальной конференции молодых ученых, посвященной 50-летию освоения це линных и залежных земель (г. Омск, 2004 г.), на III научной конференции мо лодых ученых вузов «Агрообразования» Сибирского федерального округа (г.
Кемерово, 2005 г.), на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования» (г. Сама ра, 2005 г.);
на Всероссийской научно-практической конференции, посвящен ной 85-летию ТатНИИСХ и 1000-летию Казани «Пути мобилизации биологиче ских ресурсов повышения продуктивности пашни, энергоресурсосбережения и производства конкурентоспособной сельскохозяйственной продукции» (г. Ка зань, 2005);
на Международной научно-практической конференции молодых ученых (г. Краснообск, 2006 г.), на конференции профессорско преподавательского состава ОмГАУ (г. Омск, 2005, 2006, 2008 гг.);
на XIII Все российской научно-практической конференции «Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур» (г. Пенза, 2009).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 11 работ, в том числе: публикации в журналах, рекомендованных ВАК – 2;
материалы ме ждународных конференций – 3;
всероссийских съездов, совещаний, конферен ций – 4.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает:
введение, 4 главы, заключение, выводы и приложения. Работа изложена на 220 страницах текста, содержит 13 таблиц, 26 рисунков, иллюстрирована микрофотографиями, полученными с помощью световой микроскопии. Список литературы состоит из 306 наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Проблема придания сортам длительной устойчивости к болезням и защитные реакции растений в патогенезе В обзоре литературы освещены биологические особенности возбудителя бурой ржавчины пшеницы. Рассмотрена проблема придания культурным рас тениям длительной устойчивости к болезням и представления о способах ее решения. Описаны цитофизиологические процессы, происходящие при взаимо действии биотрофных патогенов с растениями.
Глава 2. Объекты и методы исследований Для изучения механизмов устойчивости к возбудителю бурой ржавчины пшеницы Puccinia triticina Erikss. был использован широкий набор образцов:
1) виды-нехозяева - горох посевной Pisum sativum L. (сорт Омский 7), томаты Licopercon esculentum Mill. (сорт Ляна), петрушка Petroselinum hortense Hoffm (сорт Листовая);
овес посевной Avena sativa L. (сорт Тарский 2), ячмень посев ной Hordeum sativum L. (сорт Омский 90);
пырей удлиненный Agropyron elon gatum (Host) Beuv.;
2) устойчивые виды семейства Poaceae: твердая пшеница Triticum durum Desf. (сорт Алтайская Нива), рожь посевная Secale cereale L.
(сорт Чулпан), тритикале (сорт Омская);
3) пшенично-пырейные гибриды (ППГ), созданные на основе A. elongatum;
4) устойчивые к бурой ржавчине изо генные линии мягкой пшеницы сортов Тэтчер (линии TcLr) и Новосибир ской 67 (линии АНК), аналоги сорта Саратовская 29 (линии АС) и линия Т3;
5) доноры устойчивости к заболеванию k54049 и Гибрид-21. В качестве кон троля в полевых и лабораторных исследованиях использовали восприимчивые сорта мягкой пшеницы Саратовская 29, Новосибирская 67 и Чернява 13.
Исследования проводили в полевых и лабораторных условиях. В поле вых условиях в 2003–2005 гг. оценивали тип реакции на заражение бурой ржав чиной в баллах («0» – иммунитет, «4» – восприимчивость) (Mains, 1926) и сте пень поражения растений (%) (Peterson, 1948).
В лабораторных условиях эксперименты проводили на 8–10-дневных проростках злаков либо молодых растениях видов-нехозяев. Для заражения ли стьев растений использовали моноспоровый инокулюм изолятов P. triticina, размноженный в лабораторных условиях. Эксперименты в лабораторных усло виях проводили на отсеченных листьях, жизнеспособность которых поддержи валась 0,004%-ным раствором бензимидазола (Михайлова, 1970).
Гистологические исследования развития мицелия и проявления реакции сверхчувствительности (СВЧ) проводили на целых листьях, окрашенных ани линовым синим в лактофеноле (Плотникова, 1990). Присутствие каллозы ( 1,3-глюкан) на стенках клеток определяли окрашиванием кораллином (Барыки на, 2004). Комплекс фенольных веществ в цитоплазме и лигнин на клеточных стенках выявляли окрашиванием листьев сернокислым анилином (Джапаридзе, 1953).
Подавление окислительного взрыва проводили обработкой растений 0,01% водным раствором верапамила, блокирующего поступление в клетку ио нов Са2+ необходимых для генерации активных форм кислорода (АФК) (Xu, 1998). Для индукции образования АФК растения пшеницы опрыскивали 0,01% салициловой, 0,01% янтарной и 0,1% арахидоновой кислотами (Тютерев, 2002).
Биосинтез белка ингибировали обработкой листьев раствором циклогексимида (2,5 мг/мл) и актиномицина D (5 мг/мл) (Heath, 1979). Синтез PR-белков стиму лировали опрыскиванием растений 0,00015%-ным раствором Биона (бензотиа диазол CGA245704) (Gorlach, 1996). Во всех экспериментах контролем служили растения, обработанные водой.
Количество спор в пустулах учитывали с помощью камеры Горяева.
Жизнеспособность спор определяли по их прорастанию на увлажненном стекле.
Цитологические исследования проводили с помощью светового микро скопа МБИ–15. Фотосъемку осуществляли с помощью микрофотонасадки МФНЭ–IV-4.2 на пленку «Микрат–300» или с помощью цифровой фотокамеры марки Olympus SP-320 с разрешением 7,1 мегапикселя на дюйм.
Статистическую обработку данных проводили с помощью однофакторно го дисперсионного анализа либо рассчитывали средние значения опыта и ошиб ку средней (Доспехов, 1985).
Глава 3. Цитологические проявления устойчивости к бурой ржавчине видов-нехозяев Механизмы иммунитета видов-нехозяев считаются перспективными для стабильной защиты культурных растений. Проведенные нами цитологические исследования показали, что на листьях восприимчивого вида-хозяина мягкой пшеницы сорта Саратовская 29 доля проросших спор достигала 94%, более 90% ростковых трубок сформировали аппрессории на устьицах. Гриб проникал в устьица без нарушений и формировал мицелий в тканях листа. На поверхности листьев видов-нехозяев класса Двудольные – горохе, петрушке, томатах – было нарушено прикрепление спор к поверхности и их прорастание. Адгезия ростко вых трубок к листьям была слабой, их ориентация к устьицам была нарушена.
На листьях гороха и томатов аппрессории не образовывались, а на листьях пет рушки их формирование было сильно подавлено.
Наиболее заметные нарушения взаимодействия P. triticina с иммунными видами злаков – овсом, ячменем и пыреем удлиненным – происходили на эта пах образования аппрессориев и проникновения в устьица растений. На их ли стьях образование аппрессориев было подавлено по сравнению с контролем в 1,4-1,6 раза (рис. 1). Гриб отмирал на стадии аппрессориев или подустьичных везикул до внедрения в мезофильные клетки растений без реакции СВЧ. Об ак тивных реакциях растений свидетельствовали утолщения клеточных стенок за мыкающих клеток устьиц, контактирующих с некротическими аппрессориями или подустьичными везикулами. Ранее такой вариант взаимодействия с вида ми-нехозяевами для возбудителей ржавчинных болезней не описывался.
Рожь и тритикале считаются культурами, устойчивыми к бурой ржавчине пшеницы. Однако нами впервые показано, что в условиях Западной Сибири рожь Чулпан и тритикале Омская поражались P. triticina в средней степени ( балла/40% и 4 балл/60% соответственно), а твердая пшеница Алтайская Нива была устойчива (2 балла/25%). Цитологические исследования взаимодействия гриба с проростками показали, что на листьях этих видов было умеренно по давлено образование аппрессориев патогена (в 1,2-1,3 раза по сравнению с кон тролем), хотя проникновение в устьица практически не нарушалось. На устой чивых видах злаков уже через 24–36 час после инокуляции наблюдалось досто верное подавление развития инфекционных структур гриба в тканях листьев.
При этом в листьях ржи было подавлено образование материнских кле ток гаустория и гаусториев, а тритикале – образование гаусториев в клетках растений без проявления реакции СВЧ. Наиболее активное торможение разви тия инфекционных структур проявлялось в тканях твердой пшеницы, оно со провождалось реакцией СВЧ. Влияние факторов устойчивости растений приво дило к интенсивному подавлению развития пустул паразита. В них образовы валось в 2,1–3,6 раза меньше спор, чем на листьях восприимчивого сорта мяг кой пшеницы (контроль). Часть спор, образованных грибом на листьях ржи и твердой пшеницы была не жизнеспособной (рис. 2).
В настоящее время известно, что для успешного морфогенеза поверхно стных и внутритканевых структур необходимо получение грибом комплекса топографических, физических и химических стимулов со стороны растения (Heath, 1997;
Gold, 2001 и др.). Поскольку на филогенетически далеких от мягкой пшеницы видах- нехозяевах нами наблюдалось полное или частичное Доля, % 0 1 2 3 1 К К Горох Омский Тритикале Омская Томаты Ляна Петрушка Листовая Рожь Чулпан Овес Тарский 2 Ячмень Омский Твердая пшеница Алтайская Нива Пырей удлиненный Рожь Чулпан Тв. Пшеница Алтайская Нива Тритикале Омская Рис. 1. Развитие P. triticina Рис. 2. Характеристика развития на листьях видов-нехозяев: 1 – P. triticina в тканях культурных злаков, ростковые трубки, образовавшие 8 сут. после инокуляции: 1 – площадь ко лоний, мкм2 х10000;
2 – площадь пустул, аппрессории;
2 – аппрессории, по мкм2 х 10000;
3 – количество спор в пус гибшие на устьицах;
К – мягкая пшеница. туле, шт;
4 – жизнеспособность спор, %.
подавление развития P. triticina (нарушение прорастания спор, ориентации ро стковых трубок и образования аппрессориев) до активных реакций растений, то, вероятно, важной причиной ингибирования гриба было несоответствие сти мулов, получаемых грибом с поверхности листьев. При взаимодействии с ус тойчивыми видами злаков – рожью, тритикале, твердой пшеницей – наблюда лось подавление формирования структур, необходимых для биотрофного взаи модействия с клетками растений. Эти результаты показывают ключевые точки, определяющие взаимодействие патогена с растениями разных видов. За исклю чением комбинации с твердой пшеницей подавление развития P. triticina не со провождалась реакцией СВЧ.
На примере пшенично-пырейных гибридов (ППГ) различных поколений нами впервые был исследован комплекс механизмов, защищающих иммунный вид Agropyron elongatum от ржавчины. Ход получения ППГ и использованный в исследованиях материал показаны в таблице 1. На первом этапе был получен промежуточный межродовой гибрид (T. durum х A. elongatum), его скрестили с восприимчивым сортом мягкой пшеницы Пиротрикс 28 (В1), этот материал раз множали в течение 6 поколений путем самоопыления (С6В1). Для дальнейших скрещиваний с мягкой пшеницей были использованы иммунные линии с мно голетним образом жизни. После дополнительного скрещивания с восприимчи вым сортом пшеницы (В1[С6В1]) была получена популяция из устойчивых и восприимчивых растений (тип реакции 0-4 балла) (табл. 1).
Таблица 1 – Реакция растений Agropyron elongatum и пшенично пырейных гибридов на заражение бурой ржавчиной, шт.
Реакция, балл Образец 1 2 3 Без симптомов СВЧ Хлороз Triticum aestivum - - - - - - Чернява 13 ( контроль) 3 - - - - - Agropyron elongatum T. durum х A. elongatum 2 - - - - - В1 (T. durum х A. elongatum) х 2 - - - - - Пиротрикс С6В1 (T. durum х A. elongatum) 3 - - - - - х Пиротрикс В1[С6В1] [ (T. durum х A. elon 1 2 1 1 - 1 gatum) х Пиротрикс 28] х Чернява Для цитологических исследований были использованы растения A. elon gatum и ППГ различных поколений. Исследования показали, что на поверхно сти A. elongatum и гибридов: T. durum х A. elongatum, В1, С6В1 было подавлено образование аппрессориев. Гибель паразита происходила на этапах образования аппрессориев либо подустьичных везикул без реакции СВЧ. Об активных реак циях растений свидетельствовали утолщения замыкающих клеток устьиц. Ис следования взаимодействия P. triticina с индивидуальными ППГ гетерогенной популяции В1[С6В1] показали, что проявлялись несколько механизмов устойчи вости, приводящих: 1) к подавлению формирования аппрессориев и прекраще нию развития на стадии подустьичной везикулы (аналогично взаимодействию с A. elongatum);
2) к нарушению формирования гаусториев в клетках растений, сопровождающемуся реакцией СВЧ;
3) к подавлению развития мицелия за счет подавления образования инфекционных структур без реакции СВЧ;
4) к тормо жению развития патогена на поздних этапах патогенеза. Таким образом, нами впервые экспериментально выявлен комплекс цитологических механизмов ви дового иммунитета и продемонстрировано их разделение при создании ППГ.
Глава 4. Цитофизиологические особенности действия интрогрессированных генов устойчивости к бурой ржавчине Устойчивость 57 линий мягкой пшеницы к западносибирской популяции P. triticina была изучена в течение 2003–2005 г. Стабильный иммунитет про явили линии сорта Тэтчер: ТсLr9, ТсLr28, ТсLr38;
сорта Новосибирская 67:
АНК-39А, АНК-39В, АНК-39С, АНК-40;
АС238/89;
Т3, высокую устойчивость – линии TcLr19, TcLr24, TcLr36, АНК-39E и АС69/89. Все линии, кроме Т3, по лученной в культуре тканей пшеницы, несли интрогрессированные гены устой чивости разных видов злаков.
С помощью световой микроскопии было изучено взаимодействие линий пшеницы с двумя изолятами гриба, различающимися особенностями взаимо действия с линиями ТсLr19, TcLr24, АС69/89. На листьях всех образцов, за ис ключением линии ТсLr24, было подавлено образование аппрессориев (в 1,3–1, раз по сравнению с восприимчивым сортом пшеницы). На листьях линий TcLr9, TcLr19, AC26/89, АС35/89, АС210/90, АНК-39А гриб останавливался в развитии на стадии аппрессориев или подустьичных везикул. Такой результат развития гриба на интрогрессивных линиях был сходен с взаимодействием с видами-нехозяевами – овсом, ячменем и пыреем удлиненным. На линии ТсLr в 45% инфекционных мест паразит останавливался до внедрения в мезофилль ные клетки, в других случаях образовывал карликовые гаустории, внедрение которых приводило к реакции СВЧ, развитие гриба прекращалось через 1 сут после инокуляции.
Для доказательства стабильности эффекта отдельных генов было изучено развитие патогена на образцах, несущих широко используемый в селекции ген LrTr: на образце k54049 (австралийский гибрид), линии АНК-2А и сорте Сона та. Кроме того, исследовано развитие гриба на образцах с геном устойчивости от Aegilops speltoides: АС26/89, АС35/89, АНК-39А. Эксперименты показали, что перенос отдельных генов в другую генетическую среду не изменял их ос новные эффекты: подавление образования аппрессориев и ингибирование раз вития гриба на стадиях аппрессориев или подустьичной везикулы.
В тканях линии ТсLr24 и Гибрида 21 наблюдалось подавление образова ния инфекционных структур, сходное с наблюдавшимся в устойчивых видах злаков, а также проявлялась реакция СВЧ. В результате снижались размеры пустул (в 8–19 раз по сравнению с контролем), интенсивность образования спор (в 4,5–10 раз), споры имели пониженную жизнеспособность.
Гены устойчивости Lr9 (от Aegilops umbellulata), Lr19, Lr24 (от Agropyron elongatum) длительное время сохраняют эффективность в разных регионах ми ра. Полученные данные показывают, что механизмы длительной устойчивости могут проявляться как на поверхности листьев и устьицах, так и в мезофилле листа. Выявлены перспективные доноры с механизмами, сходными с наблю давшимися у линий с генами длительной устойчивости. На примере линии пшеницы Т3, продемонстрировано, что эффективные гены, сходные по дейст вию с интрогрессированными, могут быть получены за счет сомаклональной изменчивости в культуре ткани.
Роль активных форм кислорода в патогенезе Для выяснения причин остановки патогена на ранних этапах развития были проведены эксперименты на растениях линии ТcLr19, в которых: а) обра зование АФК – было подавлено предварительной обработкой растений препа ратом верапапилом, б) образование АФК усилено обработкой арахидоновой (АК), салициловой (СК), янтарной (ЯК) кислотами. Для экспериментов был ис пользован набор авирулентных изолятов гриба, к которым растения были им мунны (тип реакции 0 баллов) либо устойчивы (балл 1, 2). Роль АФК в устой чивости оценивалось по влиянию на развитие гриба растений, обработанных физиологически активными веществами.
Исследования показали, что обработка верапамилом растений восприим чивого сорта Саратовская 29 не влияла на развитие патогена на поверхности, но через 2–4 сут наблюдалось неспецифическое угнетение роста колоний. Поэтому исследования влияния препарата проводили в течение 1–2 сут после инокуля ции. После обработки растений линии TcLr19 верапамилом снизилось число погибших на устьицах аппрессориев гриба. Наиболее радикально подавление окислительного взрыва сказалось на развитии изолята с типом реакции 0. Если на контрольных иммунных растениях гриб останавливался в развитии на стадии аппрессориев или подустьичных везикул, то в обработанных расте ниях стал способен образовывать небольшие гаустории в мезофильных клет ках (рис. 3).
TcLr19-0 К TcLr19-0 Вер TcLr19-1 Вер TcLr19-1 К 7 К ол ичес тво, ш т 6 5 4 1 1 1 1 Время, сут Время, сут Время, сут Время, сут ИГ МКГ Г Рис. 3. Влияние обработки верапамилом на развитие инфекционных структур P. triticina в листьях пшеницы. TcLr19-0 К – заражение интактных рас тений изолятом с баллом 0, контроль;
TcLr19-1 К – заражение интактных расте ний изолятом с баллом 1, контроль;
Вер – обработка верапамилом. ИГ – инфек ционные гифы, МКГ – материнские клетки гаустория, Г – гаустории.
Изолят с типом реакции 1 балл в контрольных растениях образовывал маленькие пустулы, окруженные зоной некроза. После подавления окислитель ного взрыва гриб стал интенсивнее образовывать гаустории в клетках, а разру шение клеток в результате реакции СВЧ замедлилось.
Обработка растений физиологически активными кислотами АК, СК, ЯК усиливает окислительный взрыв и приводит к развитию СПУ (Тарчевский, 2000;
Тютерев, 2002). На обработанных индукторами растениях увеличивалось число отмерших аппрессориев и подустьичных везикул авирулентных изоля тов, развитие оставшихся колоний и пустул было сильно подавлено. Подавле ние развития колоний в тканях растений, обработанных АК и СК, сопровожда лось интенсивной реакцией СВЧ, а при обработке ЯК было подавлено образо вание материнских клеток гаусториев и гаусториев, но интенсивность реакции СВЧ менялась мало. Отрицательное влияние индукторов на рост мицелия в тканях восприимчивого сорта Саратовская 29 было выражено меньше, реакция СВЧ проявлялась слабо (рис. 4). Ингибирующее влияние индукторов усилива лось в ряду ЯК – СК – АК.
TcLr19 тип реакции Саратовская 29 TcLr19 тип реакции Площадь колонии, кв.
160 140 мкм х 120 120 100 100 80 60 40 20 0 1 2 4 1 2 1 2 Время, сут Время, сут Время, сут К СК ЯК АК Рис. 4. Развитие P. triticina в листьях растений, обработанных индуктора ми окислительного взрыва: К – контроль, АК – арахидоновая, СК – салицило вая, ЯК – янтарная кислоты.
Полученные данные доказывают роль АФК в предотвращении проникно вения авирулентных изолятов P. triticina в устьица и мезофилльные клетки рас тений линии ТсLr19, а также их участие в реализации реакции СВЧ. Вероятно, различия взаимодействия растений, обработанных физиологически активными веществами, с изолятами связано с частичной потерей грибом элиситоров в процессе микроэволюции.
Роль синтеза белков в защите растений Для изучения роли синтеза белков в защите пшеницы от ржавчины были проведены эксперименты на растениях, в которых: а) биосинтез белков был по давлен с помощью ингибиторов биосинтеза циклогексимида и актиномицина;
б) синтез PR-белков был усилен с помощью обработки индуктором СПУ с из вестным механизмом действия – Бионом (Gorlach, 1996). Для инфицирования растений использовали авирулентные и вирулентные к линии TcLr19 изоляты гриба.
Эксперименты показали, что обработка растений восприимчивого сорта Саратовская 29 ингибиторами биосинтеза белка не влияла на развитие гриба на поверхности листьев и на ранние этапы развития в тканях, но через 3-5 сут по сле инокуляции развитие колоний замедлялось (рис. 5).
а б Площадь, тыс. кв. мкм Площадь, тыс. кв. мкм Цг АD К 50 0 1 2 3 5 1 2 3 Время, сут Время, сут Рис. 5. Развитие колоний P. triticina в растениях пшеницы с подавленным биосинтезом белка: а – Саратовская 29;
б – линия ТсLr19, инфицированная ави рулентным изолятом (тип реакции 1 балл). К – контроль, Цг – циклогексимид;
АD – актиномицин D.
Обработка растений линии ТсLr19 ингибиторами биосинтеза белка не усиливала развитие изолята, к которому растения были иммунны, его развитие прекращалось на стадиях аппрессориев или подустьичных везикул. Второй изолят был способен образовывать на контрольных растениях линии ТсLr небольшие пустулы, окруженные зоной некроза (балл 1). После обработки ин гибиторами развитие этого изолята в тканях растений линии ТсLr19 через 2– сут после инокуляции усилилось, но позже развитие мицелия подавлялось. Ре акция СВЧ в обработанных растениях стала менее интенсивной. Обработка циклогексимидом приводила к более сильному росту мицелия, чем актиноми цином D. Неспецифическое подавление развития патогена в восприимчивых и устойчивых растениях на более поздних стадиях патогенеза, вероятно, связано с общим угнетением метаболизма растений, нарушающим взаимодействие па разита с хозяином.
Известно, что через 24 ч после обработки Бионом PR-белки накапливают ся в тканях пшеницы в значительных количествах (Gorlach, 1996). Для изучения влияния PR-белков на развитие бурой ржавчины растения обрабатывали Био ном в трех вариантах: а) за 24 час до инокуляции;
б) за 1 час до инокуляции, в) через 24 час после инокуляции. С учетом изученной нами динамики развития Р. triticina предполагалось, что в первом варианте опыта PR-белки накаплива лись к моменту формирования аппрессориев на устьицах, во втором – в момент образования гаусториев в клетках, в третьем – в момент формирования мицелия в тканях. Для заражения использовали авирулентные и вирулентные изоляты.
Обработка Бионом повышала устойчивость растений к бурой ржавчине, подавление гриба усиливалось по мере увеличения интервала между обработ кой растений и заражением. Цитологические исследования показали, что обра ботка растений Бионом до заражения не влияла на образование аппрессориев, но усиливала их гибель на устьицах (табл. 2). В большей степени отмирание аппрессориев было выражено у изолята, к которому растения проявляли имму нитет (в 1,3–1,7 раз).
Наиболее сильно СПУ, индуцированная Бионом, влияла на развитие ави рулентного изолята в тканях линии ТсLr19 (рис.6). При обработке растений Бионом за 24 ч до инокуляции приводила к тому, что в 50% инфекционных мест гриб не образовывал гаустории. В остальных случаях развитие мицелия прекращалось через 2–3 сут после инокуляции с усилением реакции СВЧ. Ве роятно, усиление отмирания аппрессориев на устьицах и повышение интенсив Таблица 2 – Влияние обработки Бионом на развитие P. triticina в линии сорта Тэтчер с геном Lr Тип Доля погибших на устьицах Образец Вариант* реакции, балл аппрессориев, % К 0 4, Бион+24 0 7, TcLr Бион+1 0 5, Бион -24 0 4, НСР05 1, К 1 1, TcLr19 Бион+24 0 3, Бион+1 0 2, Бион -24 0 1, НСР05 1, К 3 1, TcLr 19 Бион+24 0 3, Бион+1 1 2, Бион -24 2 1, НСР05 1, * К – контроль, Бион+24 – обработка за 24 ч до инокуляции, Бион+1 – обработка за 1 ч до инокуляции, Бион -24 – обработка через 24 ч после инокуляции.
а б в 400 350 Площадь, тыс. кв.
300 250 250 мкм 200 200 150 100 100 50 50 0 0 1 2 3 1 2 3 5 1 2 3 Время, сут Время, сут Время, сут 1 2 3 Рис. 6. Динамика развития колоний P. triticina в листьях растений, обра ботанных Бионом: а – сорт Саратовская 29 (контроль - 4 балла);
б – линия TcLr19, зараженная авирулентным изолятом (контроль – 1 балл);
в – линия TcLr19, зараженная вирулентным изолятом (контроль – 3 балла). Варианты об работки Бионом: 1 – контроль;
2 – обработка за 24 ч, 3 – за 1 ч, 4 – через 24 ч после инокуляции.
ности реакции СВЧ связано с интенсивным окислительным взрывом, разви вающимся в результате выделения элиситоров под действием PR-белков с гид ролитическими функциями. В восприимчивых растениях сорта Саратовская замедление развития мицелия было связано с частичным подавлением образо вания материнских клеток гаусториев, вакуолизацией клеток мицелия и слабым проявлением реакции СВЧ. При инфицировании вирулентным изолятом расте ний линии TcLr19, наблюдались аналогичные закономерности, но подавление развития инфекционных структур и реакция СВЧ были выражены сильнее.
Таким образом, полученные данные показывают, что синтез белков, (включая PR-белки) не имеет существенного значения в защите от изолятов, к которым растения линии TcLr19 были иммунны. В то же время синтез белков важен для проявления устойчивости растений к авирулентным изолятам, спо собным образовывать колонии в тканях. Воздействие PR-белков на развитие авирулентных и вирулентных и изолятов различно. Вероятно, снижение интен сивности реакций связано с потерей изолятами гриба элиситоров в процессе микроэволюции.
Значение синтеза каллозы и фенолов в устойчивости растений Дополнительно были изучены синтез защитного полисахарида каллозы (-1,3-глюкан) и фенолов в зоне инфекции. Установлено, что эти вещества в тканях восприимчивых растений накапливались только в зоне пустул к момен ту спороношения. При взаимодействии линии ТсLr19 c изолятом с типом реак ции 0 баллов соединения накапливались после остановки развития патогена и не имели защитного значения.
При заражении растений авирулентными изолятами с типом реакции 1 и балла наблюдался интенсивный синтез каллозы на клеточных стенках. В цито плазме клеток растений накапливались фенольные вещества, позже наблюда лась лигнификация клеточных стенок растений в зоне колоний. Время проявле ния реакции СВЧ, накопления цитоплазматических фенолов, синтеза лигнина и каллозы совпадало со временем замедления роста колоний. Вероятно, в ком плексе эти механизмы, определяли устойчивость растений к ржавчине. Интен сивность каллозных и лигниновых отложений коррелировала с интенсивностью реакции СВЧ. Таким образом, впервые было проведено комплексное исследо вание цитохимических реакций устойчивых растений в ответ на внедрение раз личных по патогенным свойствам изолятов возбудителя бурой ржавчины. Вы явлены различные механизмы устойчивости, индуцированные контактом с раз личающимися по патогенным свойствам изолятами P. triticina.
Проведенные эксперименты позволили также выявить особенности про явления СПУ вызванной обработкой растений различными индукторами. При обработке пшеницы индукторами окислительного взрыва усиливалась реакция СВЧ, синтез каллозы, фенолов и лигнификация тканей. Характерными чертами действия АК и СК было усиление окислительного взрыва, приводящее к гибели патогена на устьицах, интенсивное подавление формирования инфекционных структур в тканях и усиление реакции СВЧ. Обработка растений ЯК приводила к преимущественному подавлению образования гаусториев и синтезу каллозы.
Бион усиливал все защитные реакции при контакте с инфекционными структу рами авирулентных изолятов, а также подавлял формирование гаусториев ви рулентных изолятов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные результаты позволили выявить набор источников устойчи вости с разными механизмами взаимодействия с грибом. На примере линии с геном длительной устойчивости Lr19 выявлен комплекс цитофизиологических механизмов, обеспечивающий стабильную защиту растений к бурой ржавчине.
Выявлены особенности индукторов системной приобретенной устойчивости на развитие ржавчинного гриба. Эти данные расширяют представления о фунда ментальных основах иммунитета растений, а также могут быть использованы для создания растений с различными механизмами устойчивости и разработке новых средств защиты растений.
ВЫВОДЫ На основании проведенных исследований были сделаны выводы:
1. Механизмы иммунитета видов-нехозяев класса Двудольные к P. triticina обеспечивают подавление развития инфекционных структур на по верхности листьев. Действие защитных механизмов иммунных видов злаков Avena sativa, Hordeum sativum, Agropyron elongatum приводят к нарушению формирования аппрессориев и подавлению развития гриба на устьицах.
2. Рожь посевная Secale cereale и тритикале поражаются P. triticina в За падной Сибири. Факторы устойчивости ржи, твердой пшеницы и тритикале по давляют формирование инфекционных структур в тканях растений и спороге нез паразитического гриба.
3. На примере пшенично-пырейных гибридов продемонстрирован ком плекс механизмов, обеспечивающий иммунитет вида Agropyron elongatum к ржавчинному грибу: подавление образования аппрессориев, ингибирование проникновения гриба в устьица;
нарушение образования инфекционных струк тур в клетках;
реакция сверхчувствительности.
4. Интрогрессированные гены длительной устойчивости Lr9 и Lr19 обес печивают эффект, сходный с устойчивостью видов-нехозяев и подавляют раз витие инфекционных структур на поверхности или при внедрении в устьица растений. Аналогичное действие проявляют гены устойчивости Аegilops spel toides и А. biuncialis, интрогрессированные в иммунные аналоги сорта Саратов ская 29 и Новосибирская 67 (АС26/89;
АС35/1;
АС69/89;
АС238/89;
АНК-39А, АНК-40). Действие генов сохраняется при переносе в разную генетическую среду мягкой пшеницы. Действие гена длительной устойчивости линии ТсLr проявляется в клетках мезофилла листьев и приводит к нарушению развития инфекционных структур, сопровождающемуся реакцией СВЧ.
5. На примере линии пшеницы с геном Lr19 установлено, что причиной отмирания P. triticina является окислительный взрыв, развивающийся при кон такте аппрессориев с замыкающими клетками устьиц или в мезофилльных клетках при внедрении гаусториев.
6. Действие защитных PR-белков приводит к подавлению развития ин фекционных структур гриба в тканях растений. Повышение уровня PR-белков усиливает интенсивность реакции СВЧ, вероятно, за счет выделения элисито ров из клеток грибов.
7. Синтез полисахарида каллозы имеет защитное значение при развитии мицелия в тканях растений пшеницы. Интенсивность синтеза каллозы коррели рует с окислительным взрывом на устьицах и в мезофилле листьев растений.
8. Образование фенольных веществ и лигнификация клеточных стенок растений являются одним из механизмов защиты пшеницы от P. triticina. Син тез фенольных производных в тканях устойчивых растений активизируется на поздних этапах патогенеза и коррелирует с интенсивностью окислительного взрыва и реакции сверхчувствительности.
9. Выявлены характерные черты проявления системной приобретенной устойчивости, вызванной обработкой различными индукторами линий пшени цы с разными генами. Продемонстрировано различное действие индукторов на развитие вирулентных и авирулентных изолятов возбудителя бурой ржавчины.
Рекомендации и предложения производству.
1. Доноры с разными механизмами устойчивости рекомендованы для включения в программу создания сортов мягкой пшеницы в лаборатории се лекции яровой пшеницы и озимого тритикале ВГОУ ВПО ОмГАУ.
3. Селекционный материал, созданный с использованием этих образцов, проходит испытание в питомнике предварительного сортоиспытания.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК 1. Плотникова Л. Я., Кнаус Ю.К. Клеточные механизмы иммунитета к бурой ржавчине видов-нехозяев и устойчивых видов злаков // Микология и фи топатология. – 2007. – Т. 41. – № 5. – С. 461–470.
2. Плотникова Л. Я., Кнаус Ю.К., Мешкова Л.В. Цитофизиологические особенности проявления генов устойчивости к бурой ржавчине, перенесенных в мягкую пшеницу от дикорастущих злаков // Микология и фитопатология. – 2007. – Т. 41. – № 4. – С. 362–373.
Материалы съездов, совещаний и конференций, сборников 3. Плотникова Л.Я., Алексеева О.А., Кнаус Ю.К. Механизмы действия эффективных генов устойчивости мягкой пшеницы к бурой ржавчине // Науч ные результаты – агропромышленному комплексу: материалы междунар. науч. практ. конф.– Курган, 2004. – Т.1. – С. 362–364.
4. Плотникова Л.Я., Мешкова Л.В., Кнаус Ю.К., Алексеева О.А. Физио логические механизмы проявления действия генов длительной устойчивости мягкой пшеницы к бурой ржавчине// Полвека целине: сб. науч. тр. / РАСХН СО, СибНИИСХ. – Омск, 2004 – С. 236 –245.
5. Плотникова Л.Я., Кнаус Ю.К., Штубей Т.Ю. Цитологические механиз мы проявления действия перспективных генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине // Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования:
сб. тр. II Междунар. науч.-практ. конф. – Самара, 2005 – С. 237–240.
6. Кнаус Ю.К., Плотникова Л.Я. Изучение физиологических механизмов проявления генов длительной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине // Ин новационное развитие аграрного производства в Сибири: материалы III конф.
Молодых ученых вузов «Агрообразования» Сибирского федерального округа (Кемерово, 20-26 мая 2005г.). – Кемерово, 2005. – С. 39–45.
7. Плотникова Л.Я., Кнаус Ю.К., Мешкова Л.В., Коваль С.Ф. Механизмы проявления эффективных генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине // Пути мобилизации биологических ресурсов повышения продуктивности паш ни, энергоресурсосбережения и производства конкурентоспособной сельскохо зяйственной продукции: материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 85 летию ТатНИИСХ и 1000-летию Казани (Казань, 5–6 июля 2005 г.). – Казань, 2005. – С. 656–670.
8. Плотникова Л.Я., Шаманин В.П., Кнаус Ю.К., Мешкова Л.В. Меха низмы иммунитета к бурой ржавчине пшеницы видов-нехозяев, зерновых куль тур и линий пшеницы с интрогрессированными генами устойчивости // Фито санитарное оздоровление агроэкосистем: материалы II Всерос. съезда по защи те растений (С-Петербург, 5–10 декабря 2005 г.). – С-Пб., 2005. – С. 537–540.
9. Плотникова Л.Я., Кнаус Ю.К., Серюков Г.М., Соловьева Н.В. Изуче ние цитофизиологических механизмов устойчивости пырея удлиненного Agro pyron elongatum к бурой ржавчине // Фитосанитарное оздоровление агроэкоси стем: материалы II Всерос. съезда по защите растений (С-Петербург, 5–10 де кабря 2005 г.). – СПб., 2005. – С. 535–537.
10. Кнаус Ю.К., Плотникова Л.Я. Выявление множественных факторов видового иммунитета к бурой ржавчине пырея удлиненного Agropyron elonga tum // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых уче ных: тр. II Междун. науч.-практ. конф. молодых ученых (пос. Краснообск, 20– 21 апреля 2006 г.)/ РАСХН. Сиб.отд.-ние – Новосибирск, 2006. – С. 204–210.
11. Плотникова Л. Я., Кнаус Ю.К. Роль окислительного взрыва в защите пшеницы с высокоэффективным геном Lr 19 к бурой ржавчине // Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур: сб. статей XIII Всерос. науч. практ. конф. (Пенза, февраль 2009). – Пенза, 2009. – С. 91–94.
БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю докт. биол. наук, доценту кафедры селекции, генетики и физиологии растений ОмГАУ Л.Я. Плотниковой за помощь в подготовке диссертации, а также благо дарит зав. лабораторией иммунитета СибНИИСХа канд. биол. наук Л.В. Меш кову и зав. лабораторией селекции мягкой пшеницы и тритикале ОмГАУ канд.
с.-х. наук Г.М. Серюкова за предоставление материала для исследований.