Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений
На правах рукописи
Жуков Дмитрий Вячеславович
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ
УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ
БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ
03.00.23 - биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва - 2007
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова
Научный руководитель:
доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, профессор Калюжный Сергей Владимирович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Нина Борисовна Градова кандидат химических наук, главный специалист Скляр Владимир Ильич
Ведущая организация:
Институт микробиологии РАН, Москва 1600 часов на заседании
Защита состоится « » 2008 года в диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан «29» декабря 2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Одними из наиболее опасных загрязнителей на Земле являются нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие отходы, ежегодное попадание которых в окружающую среду оценивается в сотни миллионов тонн.
В настоящее время биологические методы восстановления загрязненных углеводородами природных объектов (микробиологическая и фиторемедиации) справедливо признаны наиболее безопасными для окружающей среды и экономически целесообразными. В России и во всем мире предложено много различных микробиологических препаратов-деструкторов углеводородов. Одним из самых эффективных является препарат «Родер», состоящий из двух штаммов R. ruber Ac-1513 D и R. erythropolis Ac-1514-D, который имеется нашей лаборатории. Он был создан для ликвидации свежих аварийных разливов нефти и довольно успешно испытывался в различных регионах России и за рубежом для микробиологической очистки водных поверхностей и грунтов от загрязнений углеводородами нефти. В настоящее время востребованы биологические методы обезвреживания нефтяных шламов, в том числе отходов НПЗ, железнодорожных шламов, территорий, загрязненных мазутом.
Интересным представлялось применение препарата «Родер» для биоремедиации такого рода загрязнений.
Кроме того, в начале 90-х полностью прекратилось производство сырья (белково витаминный комплекс), которое использовалось для полупромышленного получения препарата «Родер» по ранее разработанному Регламенту (1994 г). Поэтому встал вопрос о поиске новой сырьевой базы и разработке нового регламента для получения препарата «Родер».
И наконец, очень злободневным, является разработка методов, которые позволили бы доказать, что в процессе биоремедиации работают именно микроорганизмы препаратов деструкторов углеводородов, а не аборигенная микрофлора, активизированная внесением удобрений и применением агротехнических мероприятий. Все изложенное являлось предпосылкой для проведения исследований, осуществленных в данной диссертационной работе.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование различных биотехнологических аспектов аэробной деградации углеводородных загрязнений под действием биопрепарата «Родер» и некоторых других микроорганизмов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) оптимизировать условия для наработки биопрепарата «Родер» в промышленных количествах;
2) исследовать биоразлагаемость различных углеводородных загрязнений (мазут, нефтешламы) под действием биопрепарата «Родер»;
3) изучить кинетические закономерности биодеградации ряда алифатических и ароматических углеводородов (УВ) штаммами, входящими в биопрепарат «Родер»
(R. ruber Ac-1513-D и R. erythropolis Ac-1514-D), выявив тем самым трудноразлагаемые для данных штаммов субстраты;
4) провести скрининг микроорганизмов, выделить, идентифицировать и изучить культуру, способную более активно разлагать полиароматические углеводороды (ПАУ), чем штаммы препарата «Родер»;
5) изучить кинетические закономерности биодеградации различных классов углеводородов консорциумом, состоящим из R. ruber и R. erythropolis и новой культуры;
6) разработь методику для количественного определения штаммов R. ruber и R.
erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
Научная новизна работы. В результате выполнения работы была проанализирована эффективность деградации углеводородных загрязнений (мазут, железнодорожный шлам) препаратом «Родер». Были изучены кинетические закономерности биодеградации различных классов углеводородов нефти штаммами, входящими в биопрепарат «Родер»
и было выяснено, что данные штаммы не обладают высокой активностью по отношению к ПАУ. Был проведен скрининг микроорганизмов, и была выделена культура, обладающая более высокой активностью к данному классу загрязнителей. Методами молекулярной биологии выделенная культура охарактеризована как Pseudomonas aeruginosa. Было показано, что данная культура не оказывает отрицательного влияния на рост R. ruber и R. erythropolis, а при совместном использовании трех культур биоразлагаемость ПАУ возрастает за счет присутствия P. aeruginosa. Таким образом, была показана принципиальная возможность использования консорциума трех штаммов при биодеградации загрязнений, содержащих повышенное количество ПАУ. Также была разработана методика для количественного определения штаммов R. ruber и R.
erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований были оптимизированы условия для наработки биопрепарата «Родер» в промышленных количествах. Кроме того, была показана возможность усовершенствования запатентованного биопрепарата «Родер» за счет добавления к имеющемуся консорциуму штамма P. aeruginosa, проявляющего повышенную активность по отношению к ПАУ, что позволит в дальнейшем проводить более полную и быструю биодеградацию углеводородных загрязнений. Разработанная в работе методика количественного определения штаммов R. ruber и R. erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в дальнейшем позволит исследовать взаимодействия используемых в биопрепарате штаммов друг с другом и с аборигенной микрофлорой, присутствующей в природных объектах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Таким образом, данные, полученные в работе, могут служить основой для будущих исследований биодеградации нефтяных загрязнений в лабораторных, пилотных и полевых условиях.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на следующих конференциях: III Московский Международный Конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003, Москва);
IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (12-16 марта 2005, Москва);
Международная Конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (14-16 сентября 2005, Саратов);
Всероссийский симпозиум с международным участием (памяти акад. РАН Е.Н.Кондратьевой) «Автотрофные микроорганизмы» (21-24 декабря, 2005, Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 129 источников. Общий объем работы – 122 страницы, включая 69 рисунков и 20 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение и литературный обзор В настоящее время нефть по-прежнему является одним из наиболее востребованных источников энергии в мире, и проблема очистки водных и почвенных ресурсов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами продолжает оставаться весьма острой. Россия в этом плане не является исключением. В результате интенсивного транспорта нефти к местам ее потребления, а также в условиях сурового климата, характерного для мест ее добычи и приводящего к быстрому износу и порывам нефтепроводов и емкостей для хранения, аварии и масштабные разливы нефти стали уже привычным явлением. В результате таких аварий на почву и болота ежегодно выливается от нескольких десятков до сотен тысяч тонн нефти. Миллионы тонн нефти ежегодно попадают в моря и океаны Повышенные концентрации нефти и нефтепродуктов в почве и воде нарушают дыхательную активность почвы и микробное самоочищение почвенных и водных ресурсов. Изменяя соотношения между отдельными группами почвенных микроорганизмов, крупные нефтяные загрязнения меняют направление почвенного метаболизма, подавляют процессы дыхания, азотфиксации, нитрификации, биодеградации целлюлозы, приводят к накоплению трудно-окисляемых продуктов.
Для очистки загрязненных природных поверхностей используются различные технологии, в том числе с применением специализированной техники, которые подразделяют на техническую и биологическую рекультивации. Техническая рекультивация применяется немедленно после аварийного разлива нефти для максимального снижение риска распространения загрязнения за пределы первичного очага.
При концентрации загрязняющего вещества ниже 20%, наиболее перспективным является биологический способ очистки, а именно, метод биоремедиации, основывающийся на использовании свойств ряда микроорганизмов окислять нефтяные углеводороды в процессе своей жизнедеятельности. Под действием уникальных ферментных систем, которыми обладают такие микроорганизмы, углерод из нефти переходит в углекислый газ и воду, гумус почвы, а также используется клетками бактерий в качестве источника энергии и строительного материала. Из литературных данных известно, что наиболее легко потребляются углеводороды алифатического ряда, другие углеводороды, в том числе полиароматические, несколько хуже подвержены биодеградации, при этом ПАУ являются наиболее опасными, благодаря их повышенному канцерогенному и мутагенному влиянию на живые организмы. Поэтому поиск микроорганизмов-активных деструкторов различных трудноразлогаемых углеводородов является важной задачей, интересующей исследователей всего мира.
Объекты исследования Исследования проводились с препаратом-нефтедеструктором «Родер» и индивидуальными штаммами, из которых состоит этот препарат (Rhodococcus ruber Ac 1513 D и Rhodococcus erythropolis Ac-1514 D), выделенных в начале 90-х годов ХХ века, из сырой нефти и песка, загрязненного нефтью, соответственно.
Кроме того, использовались накопительные культуры, выделенные из различных образцов почвы, загрязненных нефтью и хранимые в музее нашей лаборатории на скошенном мясопептонном агаре.
В качестве субстратов в работе использовались:
- смесь нормальных жидких парафинов, содержащая (об %): С13Н28 –7,5;
С14Н30 – 24,0;
С15Н32 –30,6;
С16Н34 –24,2;
С17Н36 –11,2;
примеси – 2,5;
- дизельное топливо;
- гексадекан;
- ПАУ: нафталин, антрацен, фенантрен, пирен (использовались в различной концентрации в зависимости от проводимых экспериментов).
Результаты исследования и их обсуждение Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»
Проанализировав используемые на данный момент среды для культивирования бактерий, в качестве оптимизируемой среды была выбрана среда Самойленко, которая создавалась для выращивания бактерий рода Rhodococcus. В состав этой среды входят:
пептон (10 г/л), дрожжевой автолизат (50 мл/л), глюкоза (10 г/л), гидрофосфат натрия ( г/л) и дигидрофосфат калия (1г/л). Было решено оптимизировать только питательные субстраты, входящие в состав среды, так как используемые фосфаты необходимы лишь для создания требуемой буферной емкости (их потребление на рост биомассы – незначительно). Для оптимизации были проведены полные факторные эксперименты (ПФЭ) для обоих штаммов препарата «Родер», в ходе которых варьировались концентрации пептона, автолизата и глюкозы. Используемые концентрации представлены в таблице 1, а целевыми параметрами были общее накопление биомассы и концентрация УВО.
В результате проведенных экспериментов с использованием ПФЭ3 было установлено, что наибольшее количество накопленной биомассы как для одного, так и для другого штамма наблюдается в том случае, когда в среде присутствует наибольшая из взятых концентраций автолизата (75 мл/л) (табл 1. случаи 2, 6, 8). Таким образом, можно сделать вывод, что автолизат наиболее значимо влияет на рост данных культур.
Напротив, концентрации пептона и глюкозы в заметно меньшей мере оказывали влияние на данный процесс. При этом в наших экспериментах в случае R. erythropolis потребление глюкозы происходит примерно на 10%, а в случае R. ruber - на 87% в случае минимальной концентрации глюкозы и на 60% в случае максимальной концентрации (в обоих случаях). Поэтому в целях экономии было решено использовать в качестве среды для культивирования среду № 6 (табл. 1), но без пептона. В результате потребление глюкозы штаммом R. erythropolis увеличилось до 38%, а штаммом R. ruber до 88%. При этом численность углеводородокисляющих микроорганизмов осталась на том же (высоком) уровне. Таким образом, найденная минимальная среда (дрожжевой автолизат (75 мл/л), глюкоза (15 г/л), гидрофосфат натрия (4 г/л) и дигидрофосфат калия (1 г/л)) была включена в регламент по производству препарата «Родер» и использовалась нами в дальнейших опытах для культивирования углеводородокисляющих бактерий, входящих в препарат «Родер».
Таблица 1. Результаты ПФЭ, проведенного в целях подбора среды для культивирования штаммов препарата «Родер»
N Автолизат, Пептон, Глюкоза, R. ruber (36ч) R. erythropolis (28ч) мл/л г/л г/л Биомасса, г/л 1 25 2,5 5 2,0 2, 2 75 2,5 5 2,7 2, 3 25 7,5 5 2,1 2, 4 75 7,5 5 3,1 3, 5 25 2,5 15 2,7 2, 6 75 2,5 15 5,1 3, 7 25 7,5 15 4,4 3, 8 75 7,5 15 5,0 3, 9 50 5 10 3,1 2, На выбранной среде было наработано 10 кг сухого препарата, который использовался в дальнейших полевых экспериментах.
Применение препарата «Родер» для очистки реальных природных объектов Следующим этапом данной работы стало исследование способности препарата «Родер», полученного в соответствии с регламентом, деградировать различные типы нефтяных загрязнений.В качестве таких субстратов были выбраны реальные почвенные загрязнения нефтью, мазутом и нефтешламами. Результаты экспериментов представлены на рис. 1 и табл. 2.
Как показали проведенные а исследования, препарат «Родер» проявил 25 Окисленные в-ва Асфальтены высокую эффективность по снижению 0, Концентрация УВ, г/кг Ароматические УВ 4, концентраций алифатических (91-97%) Алифатические УВ 4,2 1, углеводородов. Несколько хуже 2, происходило потребление 0, 11 2, 5 0, ароматических соединений (48-64%).
6,6 2,2 2, 1, 1,9 0, Концентрацию смолисто-асфальтеновых 0 24 48 соединений препарат снижал на 0-49% в зависимости от типа загрязнения.
80 б Окисленные в-ва Таким образом, практически во всех 70 4, Асфальтены Концентрация УВ, г/кг 11, 60 случаях (наряду с высокой Ароматические УВ 50 14, биодеградацией алифатической Алифатические УВ составляющей субстрата), наблюдалась 12,2 1, 5, 12, 8, 20 40, значительно более слабая деградацию 11, 11, 10 17,2 7, полиароматической и смолисто 5,7 3, асфальтеновой фракций (которая также 0 24 48 содержит большое количество Рис. 1. Деградация компонентов застарелого мазута (а), железнодорожного конденсированных ароматических шлама (б) в процессе биоремедиации препаратом «Родер» загрязненной почвы соединений), что является довольно (ось абсцисс: время обработок в сутках).
серьезной проблемой, в связи с высокой токсичностью этих фракций.
Поэтому, было решено более детально изучить кинетические закономерности биодеградации отдельных составляющих нефти (алифатических и ароматических УВ) каждым штаммом отдельно и в консорциуме в лабораторных условиях.
Таблица 2. Сравнение эффективности деградации препаратом «Родер» различных загрязнений почвы и грунта.
Параметры Мазут ж/д шлам Начальное содержание УВ, г/кг 20,5 71, % деградации УВ 77 Алифатическая фракция 97 Ароматическая фракция 64 Смолисто-асфальтеновая фракция 49 Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов штаммами R. ruber (Ас-1513-D) и R. erythropolis (Ас-1514-D) Результаты изучения кинетики деградации нормальных алифатических углеводородов (С13-С17) индивидуальными штаммами R. ruber и R. erythropolis представлены на рис. 2. и табл. 3. Биоразложение субстрата составило 34% для R. ruber и 79% для R. erythropolis, после чего процесс деградации углеводородов практически остановился. Сведение баланса по углероду показало, что эквимолярного преобразования субстрата в углекислый газ в экспериментах не наблюдается. Наблюдаемый факт можно объяснить тем, что в результате адсорбции субстрата на клеточной стенке при его транспортировке и накоплении внутри клеток, он перестает быть доступным для экстракции.
По расположению кривых накопления биомассы и потребления субстрата (рис. 2б) видно, что в течение лаг-периода происходит потребление субстрата клетками штамма R.
ruber, которые, сначала накапливают его, и только затем деградируют. Для штамма R.
еrythropolis такого эффекта не наблюдается - заметное снижение концентрации углеводородов происходит только после завершения лаг-фазы. Основываясь на этих наблюдениях, можно предположить, что эти два штамма используют различные механизмы захвата углеводородов.
а Клетки R. ruber, по всей видимости, [С] Белок 0, производят прямой захват неполярных 0, [C], ммоль молекул субстрата одновременно с Белок, г/л 0, 6 синтезом необходимых ферментов, и уже 0, 4 затем начинается их расщепление. Клетки 0,02 R. erythropolis, напротив, в течение лаг фазы синтезируют необходимые ферменты 0 0 50 100 150 и ПАВ, после чего эмульгируют субстрат, Время,час и начинается его активная деградация.
б Наблюдаются отличия и в характере роста [С] Белок 0, клеток штаммов, так, если R. erythropolis 0, легко образует суспензию в водной фазе, 0, [C], ммоль Белок, г/л то R. ruber растет, прикрепляясь к 6 0, поверхности раздела фаз субстрат-водная 0, среда, или же к стенкам сосуда.
0, 0, Наблюдаемое различие в способе 0 захвата молекул субстрата клетками 0 50 100 150 Время, час каждого из штаммов можно объяснить разным составом их клеточной стенки и, в очевидно, ее большей липофильностью у [С] Белок 0, клеток штамма R. ruber. Так как действие 0, клеток этих двух штаммов на субстрат [C], ммоль Белок, г/л 0, различается, то, возможно, вместе эти два 0, штамма будут более успешно 0, 2 утилизировать углеводородный субстрат.
Для проверки этого предположения был 0 0 50 100 проведен также эксперимент по изучению Время, час биоразложения жидких парафинов Рис. 2. Кинетические кривые консорциумом этих двух штаммов (рис.
потребления субстрата и накопления биомассы, при росте R. erythropolis (а), 2в).
R. ruber (б) и консорциума (в) на смеси жидких парафинов в качестве единственного источника углерода.
И, действительно, из полученных данных по удельной активности видно (табл. 3), что два штамма в консорциуме более активно потребляют парафины, чем каждый из штаммов по отдельности. Таким образом, наблюдается синергическое взаимодействие штаммов, составляющих биопрепарат «Родер». Тем не менее, несмотря на то, что штамм R. ruber имеет значительно меньшую активность, проявляемые активности обоих штаммов по отношению к н-алканам находятся на довольно высоком уровне (Табл. 3).
Таблица 3. Кинетические характеристики процессов биодеградации исследуемых субстратов.
Потребление Уд. скорость роста Уд. активность q, Штаммы Субстрат, час- субстрата ммоль[C]/г/час R. еrythropolis Смесь парафинов 79% 0,032 ±0,003 24,6 ± 2, R. ruber Смесь парафинов 34% 0,074 ± 0,008 9,8 ± 1, R. erythropolis + R.
Смесь парафинов 85% 0,041 ± 0,005 30,0 ± 2, ruber Таким образом, проведя эксперименты с более или менее простыми субстратами, содержащим в основной своей части относительно легкобиоразлагаемые нормальные алифатические соединения, на следующем этапе работы было бы логичным выяснить, как поведут себя изучаемые штаммы при росте на таком токсичном и трудноразлагаемом субстрате как полиароматические углеводороды (ПАУ).
Изучение биодеградации ПАУ штаммами R. ruber и R. еrythropolis Кинетические кривые потребления смеси ПАУ (пирена, антрацена, фенантрена и нафталина) штаммами R. ruber и R. еrythropolis приведены на рис. 3. Из приведенных данных видно, что по отношению к нафталину оба штамма проявляют высокую активность, а по отношению к остальным ПАУ она находится на довольно низком уровне (табл. 6) по сравнению с литературными данными.
б а Пирен Фенантрен Пирен Фенантрен 1000 Нафталин Антрацен 1000 Нафталин Антрацен С, мкМ С, мкМ 0 0 100 200 300 0 100 200 Время,час Время,час Рис. 3. Кинетические кривые потребления смеси ПАУ (нафталина, антрацена, фенантрена и пирена) штаммами R. ruber (а) и R. еrythropolis (б).
Скрининг эффективных биодеструкторов ПАУ В связи с тем, что активность по отношению к ПАУ (за исключением нафталина) штаммов R. ruber и R. еrythropolis оставляет желать лучшего (табл. 6), дальнейшим шагом наших исследований была попытка найти более активный деструктор этих соединений. Для этого был проведен скрининг имеющегося в нашей лаборатории музея микроорганизмов, выделенных из различных нефтезагрязненных природных объектов (табл. 4). Как видно из полученных результатов наибольшей активностью по отношению к смеси ПАУ обладала накопительная культура 2П3. Эта культура была выбрана для дальнейших исследований биодеградации ПАУ.
Таблица 4. Результаты скрининга музея микроорганизмов по оценке способности расти на среде Раймонда, содержащей ПАУ (антрацен, пирен, нафталин, фенантрен в концентрации 50 мкМ). – слабый рост или его отсутствие;
+ стабильно детектируемый рост;
++ - хороший рост;
+++ интенсивный рост Номер Культура Рост Номер варианта Культур Рост клеток варианта клеток а R. ruber - 13П3 1 R. erythropolis - 2П3 +++ 2 1.3 - 5-5 Коми ++ 3 4 Potl кон - 27 4 2П2Х15,13 - 1-3 5 26 - 4П 6 Таблица 4. (продолжение) 33 - Грин ++ 7 3,8Kevin + 4-11 8 15МГУ - 1П2 9 4-4 Коми - 4МГУ 10 Potl - 5МГУ 11 Sm.L. ++ 1П3 12 5П3 Выделение чистой культуры из накопительной культуры 2П3 и ее идентификация На следующем этапе работы было решено проверить, какие именно штаммы в культуре 2П3 отвечают за биодеградацию ПАУ. Для решения этой задачи культура 2П была высеяна на твердую селективную среду, содержащую ПАУ. Некоторые из выросших колоний были отобраны и помещены в жидкую минеральную среду Раймонда с ПАУ и гексадеканом в качестве косубстрата. Среди отобранных вариантов для дальнейшей работы были выбраны те, в которых наблюдалось наиболее активное потребление ПАУ. В конце концов, нами была выделена чистая культура микроорганизмов, проявляющая высокую биодеградирующую активность по отношению к ПАУ. Степень деградации ПАУ выделенной культурой приближалась к 100% (табл. 5).
Таблица 5. Степень деградации ПАУ чистой культурой, выделенной из 2П (косубстрат- гексадекан).
ПАУ Нач. конц., мкМ Биодеградация, % Время, сут 430 100 Нафталин 275 96 Фенантрен 240 95 Пирен Для того, чтобы точно идентифицировать выделенную культуру (и более уверенно убедиться в ее чистоте), был выбран метод анализа последовательности гена, кодирующего рибосомальную 16s РНК. Анализ полученной нуклеотидной последовательности показал 99% гомологию с аналогичными последовательностями штаммов Pseudomonas aeruginosa. На основании этой последовательности было построено филогенетическое дерево, представленное на рисунке 4.
Рис. 4. Филогенетическое положение штамма, (отмечено красным) выделенного из культуры 2П3.
Таким образом, было установлено, что выделенный нами штамм относится к виду Pseudomonas aeruginosa.
Характеристики культуры P. aeruginosa при росте на различных углеводородах.
С выделенной чистой культурой P. aeruginosa были проведены кинетические исследования по деградации ПАУ без добавления какого-либо косубстрата. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 6. Из полученных данных видно, что, наиболее активной деградации подвергается нафталин, остальные ПАУ потребляются несколько хуже, но, тем не менее, выделенная культура P. aeruginosa проявляет заметно большую активность по отношению к фенантрену, антрацену и пирену, чем штаммы R. ruber и R.
erythropolis (табл. 6).
Таблица 6. Потребление ПАУ при росте штаммов P. aeruginosa, R. ruber и R.
erythropolis на минеральной среде без добавления ко-субстратов.
R. ruber R. erythropolis P. aeruginosa ПАУ 49,6 ± 9,5 40,9 ± 6,1 36,2 ± 7, Активность, Нафталин мкмоль[C]/г(белка)/ч 96 95 Биодеградация*, % 3,4 ± 0,5 3,1 ± 0,5 12,5 ± 2, Активность, Фенантрен мкмоль[C]/г(белка)/ч 13 10 Биодеградация*, % 3,2 ± 0,4 1,9 ± 0,3 9,1 ± 1, Активность, Антрацен мкмоль[C]/г(белка)/ч 22 11 Биодеградация*, % 3,9 ± 0,7 4,8 ± 0,6 8,5 ± 1, Активность, Пирен мкмоль[C]/г(белка)/ч 15 16 Биодеградация*, % * за 300 ч эксперимента.
Таким образом, выделенная нами чистая культура P. aeruginosa является перспективной для ликвидации нефтяных загрязнений, содержащих повышенные концентрации ПАУ, которые зачастую остаются недоступными для потребления другими микроорганизмами при проведении биоремедиационных работ.
Так как ПАУ в реальных загрязнениях обычно присутствуют совместно с алифатическими УВ, то следующим этапом нашей работы стало изучение биодеградации штаммом P. aeruginosa гексадекана как типичного представителя этих УВ. Кинетические кривые потребления гексадекана, накопления углекислого газа и накопления биомассы показаны на рис. 5. Как видно из полученных данных, процесс биодеградации гексадекана штаммом P. aeruginosa идет с довольно высокой активностью (в пересчете на эквивалентное количество углерода) (табл. 7.), сравнимой с активностью биодеградации жидких парафинов штаммом R. ruber (9, ммоль[C]/г(белка)/час), но все же заметно хуже, чем при биодеградации жидких парафинов штаммом R. erythropolis (24,6 ммоль[C]/г(белка)/час, табл. 3.).
б а 0, 5 1, 4 0, CO2 (газ), ммоль Белок, г/л [С], ммоль 0, 0, 0, 0, 0, 1 0, 0 0 0 50 100 150 200 0 50 100 150 Время,час Время,час Рис. 5. Кинетические кривые потребления субстрата (а), накопление углекислого газа (а), накопления биомассы (б) при росте P. aeruginosa на гексадекане в качестве единственного источника углерода.
Таблица 7. Кинетические характеристики биодеградации гексадекана штаммом P.
аeruginosa.
Уд.
Потребление Уд. скорость Штамм Субстрат активность, q, роста, ч- субстрата ммоль[C]/г(белка)/ч Гексадекан 94 % 0,035 ± 0,007 5,2 ± 0, P. aeruginosa Исследование влияния P. aeruginosa на рост R. ruber и R. erythropolis Для того чтобы проверить, как повлияет присутствие штамма P. aeruginosa на биодеградацию алифатических и полиароматических углеводородов штаммами R. ruber и R. erythropolis, были проведены эксперименты, в которых производилось культивирование консорциумов состоящих из смеси двух (R. ruber и R. erythropolis) и трех (P. aeruginosa, R. ruber и R. erythropolis ) штаммов в среде, содержащей антрацен, фенантрен и пирен - в качестве ПАУ и гексадекана - в качестве алифатической составляющей. Полученные результаты представлены на рис. 6., 7. и в табл. 8.
Видно (табл. 8), что консорциум трех штаммов проявляет почти в 2 раза большую активность по отношению ко всем используемым ПАУ, чем консорциум штаммов R.
ruber и R. erythropolis, что указывает на первостепенную роль P. aeruginosa в этом процессе. Кроме того, в течение 240 часов эксперимента при росте консорциума трех штаммов степень биодеградации ПАУ составило 87 – 90 %, а при совместном культивировании штаммов R. ruber и R. erythropolis всего 52 – 61 %.
а а 200 150 ПАУ, мкМ ПАУ, мкМ 100 50 0 0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 Время,час Время,час б б 5 0, 5 0, 4 0, 4 0, [С], ммоль [С], ммоль Белок, г/л Белок, г/л 3 0, 3 0, 2 0, 2 0, 1 0,02 1 0, 0 0,00 0 0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 Время,час Время,час Рис. 6. Кривые: (а) -потребления ПАУ Рис. 7. Кривые: (а) -потребления ПАУ ( – антрацена, - фенантрена, – ( – антрацена, - фенантрена, – пирена);
(б) – потребления гексадекана пирена);
(б) – потребления гексадекана () и накопления биомассы ();
при росте () и накопления биомассы ();
при росте консорциума штаммов R. ruber и R. консорциума штаммов R. ruber, R.
erythropolis на минеральной среде, erythropolis и P. aeruginosa на содержащей смесь ПАУ и гексадекана. минеральной среде, содержащей смесь ПАУ и гексадекана.
Стоит отметить, что добавление в консорциум штамма P. aeruginosa приводит к небольшому падению активности по отношению к гексадекану, но, тем не менее, она остается на довольно высоком уровне.
Таблица 8. Кинетические характеристики потребления полиароматических и алифатических субстратов при росте двух консорциумов микроорганизмов на минеральной среде, содержащей смесь ПАУ и гексадекана.
R. ruber + R. ruber + Субстрат R. erythropolis R. erythropolis + P. aeruginosa 5,3 ± 0,5 10,5 ± 1, Активность, мкмоль[C]/г(белка)/ч Фенантрен 61 Биодеградация, % 4,8 ± 0,4 8,6 ± 2. Активность, мкмоль[C]/г(белка)/ч Антрацен 52 Биодеградация, % 4,7 ± 0,7 8,5 ± 1, Активность, мкмоль[C]/г(белка)/ч Пирен 53 Биодеградация, % 15,3 ± 1,4 11,1 ± 2, Гексадекан Активность, ммоль[C]/г(белка)/ч 95 Биодеградация, % Таким образом, было показано положительное влияние штамма P. aeruginosa на биодеградацию ПАУ в консорциуме трех штаммов, что дает возможность в перспективе использовать подобный консорциум для борьбы с загрязнениями, содержащими повышенное количество ПАУ.
Определение концентрации клеток родококков методом ИФА Одной из проблем, с которой сталкиваются исследователи при проведении биоремедиационных процедур, также является идентификация используемых микроорганизмов (как качественная, так и количественная). В нашей работе мы попытались разработать подход, который позволил бы нам количественно идентифицировать штаммы, входящие в препарат «Родер» в реальных загрязненных объектах. Для этого была разработана методика их иммунологического определения.
На рис. 8. показаны результаты титрования антисывороток на иммобилизованных клетках исследуемых культур. Видно, что антисыворотки имели достаточно высокие титры (превышение над фоном было семикратным) на своих антигенах, однако проявляли также перекрестную реактивность к антигенам родственного штамма, Что позволяет предположить наличие общих антигенных детерминант у обоих штаммов.
Однако, как видно на рис. 8, клетки исследуемых штаммов обладают и специфическими антигенными детерминантами, для которых надо было выделить соответствующие антитела. Поскольку известно, что в первые дни (через 3-4 дня после иммунизации) иммунного ответа преимущественно идет образование иммуноглобулинов класса М, но в процессе дальнейшего развития иммунного ответа появляются антитела G класса, которые, как считается, обладают более высокой специфичностью, мы путем градиентной преципитации попытались отделить антитела IgG класса от остальной сыворотки. Как видно из представленных результатов (рис 9.), IgG-фракции, выделенная из антисывороток против клеток штаммов R. ruber и R.
erythropolis, обладает строгой специфичностью по отношению к одному конкретному штамму. Эти результаты в целом соответствуют представлениям, что появляющиеся первыми антитела IgM взаимодействуют, в основном, с антигенами клеточной стенки и, по-видимому, именно они адсорбируются цельными клетками при истощении антисывороток перекрестно реагирующими микроорганизмами. Поэтому IgG-фракции использовались в дальнейших исследованиях по идентификации и определению численности клеток штаммов R. ruber и R. erythropolis, поскольку стояла задача их идентификации в почве в присутствии других микроорганизмов.
Далее нами были проведены эксперименты по определению численности родококков в модельных и реальных образцах почвы и сравнение с результатами классических микробиологических методов. В таблице 9. представлены результаты эксперимента на песке как модели почвы по апробации метода ИФА для идентификации и определения численности родококков, входящих в состав препарата «Родер». Видно, что наблюдается довольно высокая сходимость в численности родококков, определенная методом ИФА и классическими микробиологическими методами. Таким образом, была показана возможность использования иммуноферментного метода для оценки количества клеток на жидких средах и в почве.
Разработанная методика была апробирована в эксперименте по биодеградации загрязненной нефтью почвы при трехкратной обработке ее суспензией клеток штамма R.
erythropolis. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 10.
а а 2,5 0, 0, 0, 1, D 0, D 0, 0, 0, 0, 0 30 270 2400 28000 30 270 2430 Разведение (кратность) Разведение (кратность) б б 3 0, 0, 2, 0, D D 0, 1, 0, 0, 0,5 0, 0 30 270 2400 28000 30 270 2430 Разведение (кратность) Разведение (кратность) Рис. 8. Взаимодействие антисывороток к Рис. 9. Взаимодействие IgG-фракции, R. ruber (а) и R. erythropolis (б) с выделенной из антисыворотки к штамму интактными клетками ( – R. ruber (а) и R. erythropolis (б) с взаимодействие антисыворотки к одному интактными клетками (– штамму с иммобилизованными клетками взаимодействие IgG-фракции к одному того же штамма;
- взаимодействие штамму с иммобилизованными клетками антисыворотки к одному штамму с того же штамма;
- взаимодействие IgG иммобилизованными клетками другого фракции к одному штамму с штамма (перекрестная реактивность);
– иммобилизованными клетками другого взаимодействие неимунной сыворотки с штамма (перекрестная реактивность);
– иммобилизованными клетками одного из взаимодействие неимунной сыворотки с штаммов). иммобилизованными клетками одного из штаммов).
Таблица 9. Результаты определения численности клеток родококков двумя методами в модельном эксперименте на песке Варианты Внесено, кл/г Выделено, кл/г Классич.мето ИФА Классич. метод ИФА д (1,1 ± 0,5) *108 (1,5 ± 0,1)*108 (9,0 ± 0,4) *108 (5,4 ± 0,2)* R. ruber (1,2 ± 0,3) *108 (5,4 ± 0,1)*108 (1,5 ± 0,3) *108 (6,2 ± 0,1)* R.
erythropolis (8,5 ± 0,3) *108 (4,4 ± 0,2)*107 (R. (1,5 ± 0,4) *108 (3,2 ± 0,1)*107 (R.
«Родер»
erythropolis) + erythropolis) + (7,3 ± 0,1)*107 (R. (4,8 ± 0,2)*107 (R.
ruber) ruber) Как видно из рис. 10, в течение 50 суток, концентрация углеводородов снижалась на 17 %, при этом общая численность УВО микроорганизмов увеличивалась, причем именно за счет внесения и роста клеток R. erythropolis, которые присутствовали в довольно высокой концентрации. Этот факт говорит о том, что именно клетки R.
erythropolis (а не аборигенная УВО микрофлора) осуществляли биодеградацию загрязнения.
а б Lg(КОЕ/г(почвы)) г(УВ)/кг(почвы) Загрязнение, R. erythropolis УВО 450 400 0 20 40 60 0 10 22 36 Время, сутки Время, сутки Рис. 10. (а) Динамика снижения нефтяного загрязнения при действии штамма R.
erythropolis;
(б) концентрация клеток штамма R. erythropolis (по данным ИФА) и общая концентрация углеводородокисляющих микроорганизмов (метод предельных разведений) в ходе биодеградации.
Выводы 1. Оптимизирован состав питательных компонентов для масштабного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер», выход биомассы на оптимизированной среде стал в 1,5 раза больше по сравнению с исходной.
2. Показано, что в результате биодеградации нефтяных загрязнений почвы препаратом «Родер» практически полностью потребляются алифатические углеводороды, а в остатке находятся в основном смолисто-асфальтеновая и полиароматическая составляющие загрязнителя.
3. Были получены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммами R. ruber и R.
erythropolis, входящими в состав препарата «Родер».
4. В результате скрининга накопительных культур микроорганизмов, выделенных из различных образцов почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, была выбрана культура (2П3), обладающая повышенной активностью по отношению к ПАУ. Из накопительной культуры 2П3 был выделен чистый штамм, который методами молекулярной биологии идентифицирован как относящийся к виду Pseudomonas aeruginosa.
5. Были получены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммом Pseudomonas aeruginosa. Было установлено, что выделенный штамм обладал в 3 - 4 раза большей активностью по отношению к ПАУ.
6. Было показано, что штамм P. aeruginosa не оказывает отрицательного влияния на рост штаммов R. ruber и R. erythropolis и при совместном использовании трех штаммов активность к ПАУ возрастает в 2 раза за счет присутствия штамма P.
aeruginosa. Таким образом, была показана принципиальная возможность использования консорциума трех штаммов при биодеградации загрязнений, содержащих повышенное количество ПАУ.
7. Разработана методика для количественного определения штаммов R. ruber и R.
erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами. // Успехи современной биологии. - 2006. Т.126. - № 3. - с. 285-296.
2. Natalia A. Yemashova, Valentina P. Murygina, Dmitry V. Zhukov, Arpenik A.
Zakharyantz, Marina A. Gladchenko, Vasu Appanna, Sergey V. Kalyuzhnyi Biodeterioration of crude oil and oil derived products: a review. // Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 2007, V. 6. p. 315-337.
3. Жуков Д. В., Мурыгина В. П., Калюжный С. В. Изучение кинетических закономерностей биодеградации алифатических углеводородов бактериями Rhodococcus ruber и Rhodococcus erythropolis. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. -Т. 43. - № 6. - с. 657-663.
4. Zhukov D.V., Murygina V.P., Kalyuzhnyi S.V. Kinetics of n-alkanes biodegradation by Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. In: A.E. Kuznetsov and G.E. Zaikov (Eds). New Research on the Environment and Biotechnology, Nova Science Publisher, Inc. 2006, p. 93-97.
5. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Кинетические закономерности биодеградации н-алканов штаммами Rhodococcus ruber и Rhodococcus erythropolis // Материалы III Московского международного Конгресса «Биотехнология:
Состояние и перспективы развития», часть 2, 14-18 марта 2005, Москва, C. 105.
6. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Изучение биодеградации углеводородов нефти штаммами рода Rhodococcus // Материалы Международной Конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005, Саратов, С. 22.
7. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Изучение биодеградации МТБЭ бактериями биопрепарата «Родер» // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (памяти акад. РАН Е.Н.Кондратьевой), 21-24 декабря 2005, Москва, С. 90.
8. Белова О.М., Жуков Д.В., Калюжный С.В. Выделение штамма - активного деструктора полиароматических углеводородов (ПАУ), и изучение его кинетических характеристик. // Материалы IV Московского международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», часть 2, 12- марта 2007, Москва, C. 263.
9. Тумасянц А.И., Мурыгина В.П., Янкевич М.И., Жуков Д.В., Калюжный С.В.
Биоремедиация застарелого мазута и железнодорожного шлама препаратом нефтедеструктором «Родер» (полевые испытания) // Материалы IV Московского международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и перспективы развития», часть 2, 12-16 марта 2007, Москва, C. 132.